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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A pathological condition with a high level of severity, caused by drug resistance, is one of the major public health problems worldwide and has worrying consequences. This scenario becomes more complex when we mention the infections caused by the pathogens ESKAPE - Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter spp. - (because they are microorganisms with high multiresistance and virulence). Thus, repositioning has been a trending topic in the literature and consists of finding new uses for drugs approved for clinical use. In this sense, the present study aimed, in the published articles, to present to the scientific community the current research on treatment alternatives for infections caused by ESKAPE pathogens and perspectives on the anti-infective activities of proton pump inhibitors (PPIs). In the manuscripts, the biological activities of the benzodiazepines clonazepam and diazepam and PPIs omeprazole and esomeprazole as candidate drugs for redirection were verified. Scientific database searches were carried out on treatment alternatives for ESKAPE pathogens and anti-infective activities of PPIs. In addition, the in vitro antibacterial activities of clonazepam, diazepam, omeprazole and esomeprazole against American Type Culture Collection (ATCC) standard bacterial strains and clinical isolates of ESKAPE pathogens were analyzed, determining the minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC), its interactions with the standard antibacterial ciprofloxacin by the checkerboard method and determination of the fractional inhibitory concentration index (FICI). For clonazepam and diazepam, the clinical impact of the use of these drugs in repositioning was analyzed, and for omeprazole and esomeprazole, the ability to cleave plasmid DNA was verified, and molecules capable of cleavage can act as antibacterials. In the treatment alternatives for infections caused by ESKAPE pathogens, drugs from the pharmacological classes of antineoplastic, anti-inflammatory, antidepressant and antialcoholic have been reported. In the study covering the anti-infective activities of PPIs, activities of these drugs against 17 infectious agents were described, some of them Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans and SARS-CoV-2. In antibacterial activity assays, the combination of clonazepam and diazepam with ciprofloxacin was synergistic against 10 strains and five strains of ESKAPE pathogens (FICI

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The substantial increase in multidrug resistant (MDR) bacteria makes efforts to find more effective antimicrobial therapies urgent. Drug repositioning, defined as the process of investigating new uses for drugs that have already been clinically approved, has offered a number of advantages in the face of the current lack of therapeutic innovations. As it is a faster, safer and more economical technique than the conventional development of active substances, repositioning has shown advantages. Also, synergism resulting from the combination of two or more drugs can improve drug efficacy, reduce toxicity, and provide an expanded spectrum of activity compared to monotherapeutic regimens. Thus, this study presents candidate drugs for redirection in bacterial infections and in the face of the pandemic caused by the new coronavirus (SARS-CoV-2). The present study investigated the biological activity of antidepressants belonging to the class of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) fluoxetine (FX) and paroxetine (PX). The analysis of antibacterial activity was performed in vitro using American Type Culture Collection (ATCC) standard bacterial strains and MDR clinical isolates, determining the minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC), interaction with the antibacterial ceftriaxone (CTX) using the Checkerboard method and determination of the fractional inhibitory concentration index (FICI). It was observed that, against five ATCC standard strains and 72 MDR clinical isolates collected in 2019 and 2021 in a university hospital in southern Brazil, FX presented MIC values between 4 and 256 µg/ml, while PX ranged from 1 to 256 µg /ml. CTX, on the other hand, presented MIC ≥4096 µg/ml against most strains evaluated. The association of CTX with FX/PX using the Checkerboard method caused CTX to reduce the MIC by up to 32,000 times. FICI values < 0.5 against all strains tested ratified the synergism of the combination of drugs. FX and PX were also able to promote the cleavage of double-stranded plasmid DNA through a hydrolytic mechanism at the three concentrations tested, showing greater efficiency at pH 7,4 at 37 °C. Faced with SARSCoV-2, different studies have found that antidepressant drugs belonging to the class of SSRIs were able to reduce the risk of intubation or death related to Covid-19, reduce the need for intensive medical care, in addition to inhibiting viral titers in up to 99%. This means that, after additional studies, the repositioning of this class of drugs could be a promising alternative in the treatment of patients with Covid-19, especially fluoxetine and fluvoxamine. The antimicrobial activity of several non-antibiotic drugs belonging to different pharmacological classes was also systematically evaluated, in order to present probable candidates for repositioning in infectious diseases, especially antidepressant, antihypertensive, anti-inflammatory, antineoplastic, hypoglycemic drugs, among others. We conclude that drug repositioning is currently a promising approach against bacterial infections and in the fight against Covid-19, and that the antidepressants fluoxetine and paroxetine prove to be promising alternatives that have significant antibacterial and antiviral properties. O aumento substancial das bactérias multidroga resistentes (MDR) tornam urgentes os esforços na descoberta por terapias antimicrobianas mais eficazes. O reposicionamento de medicamentos, definido como o processo de investigar novos usos para medicamentos, já foi aprovado clinicamente e tem oferecido uma série de vantagens diante da atual carência de inovações terapêuticas. Por ser uma técnica mais rápida, segura e econômica que o desenvolvimento convencional de substâncias ativas, o reposicionamento tem apresentado vantagens. Também, o sinergismo resultante da combinação de dois ou mais medicamentos pode melhorar a eficácia dos fármacos, reduzir a toxicidade e fornecer um espectro de atividade ampliado em comparação aos regimes monoterapêuticos. Assim, esse estudo apresenta fármacos candidatos ao redirecionamento em infecções bacterianas e frente à infecção ocasionada pelo novo coronavírus (SARS-CoV-2). O presente estudo investigou a atividade biológica dos antidepressivos pertencentes à classe dos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) fluoxetina (FX) e paroxetina (PX). A análise da atividade antibacteriana foi realizada in vitro utilizando cepas bacterianas padrão American Type Culture Collection (ATCC) e isolados clínicos MDR, determinando-se a concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM), interação com o antibacteriano ceftriaxona (CTX) utilizando o método Checkerboard e determinação do índice de concentração inibitória fracionada (FICI). Foi observado que, frente a cinco cepas padrão ATCC e 72 isolados clínicos MDR coletados em 2019 e 2021 em um hospital universitário no Sul do Brasil, FX apresentou valores de CIM entre 4 e 256 µg/ml, enquanto PX variou de 1 a 256 µg/ml. Já CTX apresentou CIM ≥4096 µg/ml frente a maioria das cepas avaliadas. A associação de CTX com FX/PX utilizando o método Checkerboard fez com que CTX reduzisse a CIM em cerca de até 32 mil vezes. Valores de FICI < 0,5 frente a todas as cepas testadas ratificaram o sinergismo da associação dos medicamentos. FX e PX também foram capazes de promover a clivagem do DNA plasmidial fita dupla por meio de mecanismo hidrolítico nas três concentrações testadas, apresentando maior eficiência em pH 7,4 a 37 °C. Frente a SARS-CoV-2, diferentes estudos constataram que medicamentos antidepressivos pertencentes à classe dos ISRS foram capazes de diminuir o risco de intubação ou morte relacionada à Covid-19, reduzir a necessidade de cuidados médicos intensivos, além de inibir os títulos virais em até 99%. Isso faz com que, após estudos adicionais, o reposicionamento dessa classe de medicamentos possa ser uma alternativa promissora no tratamento de pacientes com Covid-19, especialmente FX e fluvoxamina. Também foi avaliado de modo sistemático a atividade antimicrobiana de diversos fármacos não-antibióticos pertencentes a diferentes classes farmacológicas, a fim de apresentar prováveis candidatos ao reposicionamento em doenças infecciosas, destacando-se fármacos antidepressivos, anti-hipertensivos, anti-inflamatórios, antineoplásicos, hipoglicemiantes, entre outos. Concluímos que o reposicionamento de fármacos é atualmente uma abordagem promissora frente a infecções bacterianas e no combate à Covid-19, e que os antidepressivos FX e PX demonstram ser alternativas promissoras que apresentam propriedades antibacterianas significativas.

Orientador: Rafael Elias Marques Pereira Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Arbovírus (arthropod-borne virus) são organismos de grande importância médica que causaram impactos significativos à saúde humana no Brasil e no mundo nas últimas décadas. Entre eles, o gênero Flavivirus destaca-se por compreender importantes patógenos humanos, tais quais o vírus da Dengue, Febre Amarela e Zika. Além destes, há outros com potencial risco de emergência, como o vírus da encefalite de St. Louis (SLEV), capaz de causar neuropatias que podem levar a morte ou causar sequelas. Ainda não há vacinas ou tratamentos específicos para a encefalite causada por SLEV. Como o processo de desenvolvimento de novas drogas é demorado e oneroso, o reposicionamento de fármacos figura como uma boa estratégia para a descoberta de potenciais tratamentos contra SLEV visto que, com os testes toxicológicos dos compostos já realizados, o tempo e o custo das pesquisas é reduzido. A partir disso, foi padronizado e validado um ensaio fenotípico de High Throughput Screening através da biblioteca Covid Box para a triagem de compostos protetores contra a infecção por SLEV. Dos oitenta compostos triados em três concentrações diferentes, nove deles apresentaram efeito protetor contra a infecção, em diferentes níveis. Uma vez que a classe farmacológica dos hits foi distinta, o estudo sugere que pode haver diferentes vias moleculares relevantes na infecção e, portanto, possibilidade de diferentes alvos terapêuticos no desenvolvimento de tratamentos. Sendo assim, busca-se melhor compreender os mecanismos patogênicos do vírus para o desenvolvimento futuro de estratégias viáveis de tratamento desta e outras arboviroses relacionadas Abstract: Arthropod-borne viruses are organisms of great medical importance that have caused significant impacts on human health in the last decades. The Flavivirus genus stands out among them for comprising important human pathogens such as Dengue, Yellow fever, and Zika virus. In addition, there are others with the potential to emerge, such as St. Louis encephalitis virus (SLEV), which is present in the Americas and may cause a neurological disease that leads to death or sequelae. There is no specific treatment or vaccine against SLEV. As drug discovery is an expensive and time-consuming process that can take several years to be accomplished, drug repurposing figures as a viable strategy in the searching for new treatments for diseases once it requires less time and money because the compounds have already been tested and approved for human use. Hence, a phenotypic High-Throughput Screening assay was developed and validated using the MMV Covid-Box compound library. Of eighty compounds screened at three different concentrations, nine showed a protective effect against infection at different levels. Since they belong to distinct pharmacological classes, our study suggests there may be different relevant molecular pathways in SLEV infection, and thus multiple possibilities of therapeutic targets to be explored in the development of treatments. From this, we seek to have a deeper understanding of the virus and its pathogenic mechanisms for the future development of viable treatment strategies for this and other related arboviruses Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES 88887.351846/2019-00

Neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's and Parkinson's disease, are characterized by the progressive loss of neuronal cells, resulting in different clinical symptoms according to the affected brain region. Although there are drugs available for the treatment of these diseases, they present relatively low efficacy and are not capable of modifying the course of the disease or stopping its progression. In the field of drug development, drug repurposing could be an interesting strategy to search new therapeutic options against neurodegenerative diseases, since it involves lower costs and time for development. In this review, we discuss the search of new treatments for Alzheimer's and Parkinson's disease through drug repurposing. A focus was given to drugs that modulate neuroinflammation, since it represents a common point among neurodegenerative diseases and has been explored as a target for drug action.

Bactérias multirresistentes são causas de diversas enfermidades em todo o globo. A Organização Mundial da Saúde estima que dentre as bactérias multirresistentes, Staphylococcus aureus é a segunda maior causa de infecções e ônus econômico no continente europeu. Infecções persistentes, oriundas da formação de biofilme são responsáveis por parte significativa de progressão da doença para sepse em indivíduos hospitalizado que fazem uso de material biomédico. Diante dessa prerrogativa, estratégias para viabilizar uma resposta a resistência antimicrobiana vem sendo traçada, como o reposicionamento de fármacos e interações farmacológicas de antimicrobianos. Nesse contexto de reposicionamento, a propafenona um antiarrítmico 1c bloqueador dos canais de sódio e com atividade βadrenérgico, surgiu como um fármaco recentemente avaliado com propriedade antimicrobianas, sendo assim um alvo a ser reposicionado para a antibioticoterapia. Diante disso, esse estudo buscou aprofundar o entendimento do mecanismo de ação antimicrobiana da propafenona em cepas Staphylococcus aureus resistentes a meticilina na forma planctônica e em biofilme, além de avaliar a interação da sustância quando associada a oxacilina e determinar se a propafenona apresentou presença de atividade citotóxica em células eucarióticas. Para determinar o efeito antibacteriano em células planctônicas, foram utilizadas metodologias referentes ao protocolo M7-A9 do CLSI em diluições em caldo na placa de 96 poços. A determinação da ação bactericida da droga foram realizadas pela razão da Concentração Bactericida Mínima (CBM) com a Concentração Inibitória Mínima (CIM) definida pelo Nível de Tolerância e através do ensaio Curva de Morte. Para determinar a interação farmacológica com a oxacilina foi utilizado o checkerboard. A fim de elucidar mecanismos de ação da droga, utilizou-se a citometria de fluxo para determinação da permeabilidade de membrana e da fragmentação do DNA bacteriano. Os ensaios de toxicidade foram realizados em gel de agarose no ensaio Cometa Alcalino e em placa de 96 poços para o Ensaio Hemólise. Os ensaios in sílico foram realizados em software: Lamarkian Genetic algorithm. A CIM da propafenona ficou definida em 250 em das cepas e 500 ug/mL para o restante. A propafenona apresentou ação sinérgica com a oxacilina contra biofilme e em células planctônicas. Foram evidenciados o aumento da permeabilidade da membrana em decorrência da propafenona, assim como dano ao DNA e ligações moleculares do tipo ponte de hidrogênio na PBP2a e em proteínas nucleares. Não foram evidenciados indícios de citotoxicidade em células eucarióticas de murinos induzidos pela propafenona. A propafenona nesse estudo confirmou sua atividade antimicrobiana em células planctônicas e em biofilme, além de determinar um provável mecanismo de ação envolvendo a desestabilização do revestimento bacteriano com fragmentação do DNA em MRSA, sem apresentar indícios de citotoxicidade a células eucarióticas. A identificação de um provável mecanismo de ação facilita os estudos posteriores com a droga, na busca por uma futura alternativa de uso como adjuvante na terapia antimicrobiana.

Objective: To present an overview of the pathophysiology of Covid-19 and drug treatments used in Brazil. Methodology: This is a narrative bibliographic review. Searches were performed on official websites (Ministry of Health of Brazil; Butantan); Cochrane, Google Scholar, Pubmed and Scielo databases and supplementary texts. Searches took place between February and June 2021 under the terms 'Covid-19', 'Coronavirus' 'Pandemia', 'Covid-19 vaccines', 'SARS-CoV-2' and 'Covid-19 drug therapies'. Texts in English, Portuguese and Spanish, published from 2020, were included and texts that were not related to the theme were excluded. Results: Azithromycin, corticosteroids, antiretrovirals and anticoagulants exemplify drugs used in the treatment of Covid-19, in addition to prevention with vaccines. Conclusion: During the period of this review, the effort of the scientific community in the repositioning of drugs to treat the disease was noted, but no evidence was found to prove the effectiveness of a specific treatment. Vaccines become a great ally in preventing the disease. Objetivo: Presentar una visión general de la fisiopatología del Covid-19 y los tratamientos farmacológicos utilizados en Brasil. Metodología: Se trata de una revisión bibliográfica narrativa. Las búsquedas se realizaron en sitios web oficiales (Ministerio de Salud de Brasil; Butantan); Bases de datos Cochrane, Google Scholar, Pubmed y Scielo y textos complementarios. Las búsquedas se realizaron entre febrero y junio de 2021 bajo los términos 'Covid-19', 'Coronavirus', 'Pandemia', 'Vacunas Covid-19', 'SARS-CoV-2' y 'Terapias farmacológicas Covid-19'. Se incluyeron los textos en inglés, portugués y español, publicados a partir de 2020 y se excluyeron los textos que no estaban relacionados con el tema. Resultados: La azitromicina, los corticosteroides, los antirretrovirales y los anticoagulantes ejemplifican los fármacos utilizados en el tratamiento de Covid-19, además de la prevención con vacunas. Conclusión: Durante el período de esta revisión se notó el esfuerzo de la comunidad científica en el reposicionamiento de fármacos para tratar la enfermedad, pero no se encontró evidencia que demuestre la efectividad de un tratamiento específico. Las vacunas se convierten en un gran aliado para prevenir la enfermedad. Objetivo: Apresentar um panorama sobre a fisiopatologia da Covid-19 e tratamentos medicamentosos utilizados no Brasil. Metodologia: Trata-se de uma revisão bibliográfica narrativa. Foram realizadas buscas em sites oficiais (Ministério da Saúde do Brasil; Butantan); bases de dados Cochrane, Google Scholar, Pubmed e Scielo e textos complementares. As buscas ocorreram entre fevereiro e junho de 2021 com os termos ‘Covid-19’, ‘Coronavírus’ ‘Pandemia’, ‘Vacinas Covid-19’, ‘SARS-CoV-2’ e ‘Terapias medicamentosas Covid-19’. Foram inclusos textos em inglês, português e espanhol, publicados a partir de 2020 e excluídos textos que não se relacionavam à temática. Resultados: Azitromicina, corticosteroides, antirretrovirais e anticoagulantes exemplificam fármacos usados no tratamento de Covid-19, além de prevenção com vacinas. Conclusão: No período desta revisão notou-se o esforço da comunidade científica no reposicionamento de fármacos para tratar a doença, mas não foram encontradas evidências que comprovassem a efetividade de um tratamento específico. As vacinas tornam-se um grande aliado na prevenção da doença.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As leishmanioses são um complexo de doenças causadas por parasitos protozoários do gênero Leishmania, e podem ser divididas em dois grandes grupos, a leishmaniose tegumentar e a leishmaniose visceral. O tratamento atual da leishmaniose visceral (LV) apresenta limitações devido à toxicidade das drogas e/ou alto custo, juntamente com o surgimento de resistência dos parasitos. O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro e, portanto, o reposicionamento de fármacos pode representar uma alternativa. Cardenolídeos são usados no tratamento de doenças cardíacas, especialmente, aqueles obtidos em espécies do gênero Digitalis. No presente estudo, os cardenolídeos β-acetil-digitoxina (b-AD) e digitoxigenina (DIGI), obtidos do extrato metanólico de folhas de Digitalis lanata, foram avaliados in vitro e in vivo contra Leishmania infantum. Os resultados mostraram ação direta de b-AD e DIGI contra os parasitos, bem como eficácia no tratamento de macrófagos infectados. A investigação do mecanismo de ação mostrou que b-AD e DIGI induziram alterações no potencial da membrana mitocondrial, aumentaram os níveis de espécies reativas de oxigênio e causaram o acúmulo de corpos lipídicos nos parasitos. DIGI e b-AD foram incorporados em um sistema de micelas poliméricas à base de Pluronic® F127 (DIGI/Mic e b-AD/Mic, respectivamente) e foram usados para tratar camundongos infectados com L. infantum. A miltefosina foi usada como controle. Os animais tratados com miltefosina, b-AD ou b AD/Mic e DIGI ou DIGI/Mic apresentaram reduções significativas da carga parasitária no baço, fígado, medula óssea (BM) e linfonodos drenantes (dLN), além do desenvolvimento de uma resposta específica do tipo Th1, atestada pelos altos níveis de IFN-, IL-12, TNF α, GM-CSF, nitrito e anticorpos dos isotipos IgG2a, além de baixos níveis de IL-4 e IL-10, juntamente com maior frequência de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-, quando comparados aos controles. Os resultados obtidos um dia após o tratamento foram corroborados com os dados encontrados 15 dias após o mesmo. Em conclusão, os resultados sugerem que b-AD/Mic e DIGI/Mic poderiam ser considerados para a realização de novos estudos para o tratamento contra a LV. Leishmaniasis is a complex of diseases caused by protozoan parasites of the genus Leishmania, and can be divided into two major groups, cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis. The current treatment of visceral leishmaniasis (VL) has limitations due to drug toxicity and/or high cost, along with the emergence of parasite resistance. Drug development is a long and expensive process and, therefore, drug repositioning may represent an alternative. Cardenolides are used in the treatment of heart disease, especially those obtained from species of the genus Digitalis. In the present study, β-acetyl-digitoxin (b-AD) and digitoxigenin (DIGI), obtained from the methanolic extract of leaves of Digitalis lanata, were evaluated in vitro and in vivo against Leishmania infantum. The results showed direct action of b-AD and DIGI against the parasites, as well as efficacy in the treatment of infected macrophages. The investigation of the mechanism of action showed that b-AD and DIGI induced changes in the potential of the mitochondrial membrane, increased the levels of reactive oxygen species and caused the accumulation of lipid bodies in the parasites. DIGI and b-AD were incorporated into a polymeric micelle system based on Pluronic® F127 (DIGI/Mic and b-AD/Mic, respectively) and were used to treat mice infected with L. infantum. Miltefosine was used as a control. Animals treated with miltefosine, b-AD or b-AD/Mic and DIGI or DIGI/Mic showed significant reductions in parasitic load on the spleen, liver, bone marrow (BM) and draining lymph nodes (dLN), as well as the development of a specific Th1-type response, attested by the high levels of IFN-, IL 12, TNF-α, GM-CSF, nitrite and IgG2a isotype antibodies, in addition to low IL-4 and IL-10 contents, along with higher IFN--producing CD4+ and CD8+ T-cell frequency, when compared to controls. The results obtained one day after the treatment were corroborated with the data found 15 days after the treatment. In conclusion, the results suggest that b-AD/Mic and DIGI/Mic could be considered for additional studies for the treatment against VL.

Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a neoplasm among the most common for adult patients and the chemotherapy of this disease faces the problem of chemoresistance. Redirection and drug combination are powerful tools in this context and bring attention to families of compounds such as benzimidazoles, known for their antiparasitic effect, but which has already been studied for some neoplasms. Thus, the present work aims to attest to the cytotoxic potential of a benzimidazole derivative isolated and in combination with drugs used in the treatment of sensitive and resistant CML. It is worth mentioning that the name of the compound under study will be kept confidential until obtaining its legal protection, remaining on the acronym of BNZ for that purpose. Thus, the cell viability assay by Alamar blue of the treatments was carried out, in addition to the assessment of cell membrane integrity and mitochondrial membrane potential, by double marking IP / Rho123, and the analysis of cell cycle by cytometry. In addition, an in silico search for pharmacokinetic and pharmacodynamic characteristics was carried out, with the servers admetSAR, Molinspiration and SwissTarget Prediction, as well as molecular anchoring with Autodock 4.2.6. The isolated BNZ showed an IC50 of 106 nM for the sensitive strain (K562) and 1917 nM for the resistant strain (FEPS). The combination with Imatinib provided a 6-fold dose reduction index for the drug alone, demonstrating the effectiveness of this combination. Cytometry revealed that the isolated BNZ and its combination with Imatinib reduced the percentage of cells in the G0 / G1 phases, suggesting a washer for the Sub-G1 phase. In addition, the double label assay showed a reduction in the number of viable cells and an increase in the population of cells in late apoptosis / necrosis for treatments with BNZ. In silico assays revealed the ABL1 protein as a potential target for BNZ. Molecular docking against 3 ABL1 structures deposited in the protein structure database (PDBID: 2GQG, 2HYY and 5MO4), using Autodock 4.2.6, presented better results for the allosteric site (2GQG: -7.04 kcal / mol; 2HYY: -8.9 kcal / mol; 5MO4: -6.98 kcal / mol). This methodology also highlighted residues Ala433, Glu462 and Gly463 as the main ones for the interaction with BNZ at the allosteric site. Therefore, to date, the findings of this study suggest the anticancer potential of BNZ in CML through its interaction with ABL1 protein, as well as its synergistic effect in combination with Imatinib and Dasatinib. A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma neoplasia dentre as mais comuns para pacientes adultos e a quimioterapia dessa doença enfrenta a problemática da quimiorresistência. O redirecionamento e a combinação de fármacos são ferramentas poderosas nesse contexto e que trazem atenção para famílias de compostos como os benzimidazóis, conhecida pelo efeito antiparasitário, mas que já possui estudos para algumas neoplasias. Assim, o presente trabalho tem como objetivo atestar o potencial citotóxico de um derivado de benzimidazol isolado e em combinação com fármacos usados no tratamento da LMC sensível e resistente. Vale destacar que o nome do composto em estudo será mantido em sigilo até a obtenção de sua proteção legal, permanecendo sobre o acrônimo de BNZ para tanto. Dessa forma, foi realizado o ensaio de viabilidade celular por Alamar blue dos tratamentos, além da avaliação da integridade de membrana celular e potencial de membrana mitocondrial, pela dupla marcação IP/Rho123, e a análise de ciclo célula por citometria. Ademais, foi feito a busca in silico das características farmacocinéticas e farmacodinâmicas, com os servidores admetSAR, Molinspiration e SwissTarget Prediction, bem como a ancoragem molecular com o Autodock 4.2.6. O BNZ isolado apresentou IC50 de 106 nM para a linhagem sensível (K562) e 1917 nM para a resistente (FEPS). A combinação com o Imatinibe proporcionou um índice de redução de dose de 6 vezes para o fármaco isolado, demonstrando a eficácia dessa combinação. A citometria revelou que o BNZ isolado e sua combinação com Imatinibe reduziu a porcentagem de células nas fases G0/G1, sugerindo um araste para a fase Sub-G1. Além disso, o ensaio de dupla marcação evidenciou uma redução na quantidade de células viáveis e um aumento na população de células em apoptose tardia/necrose para os tratamentos com BNZ. Os ensaios in silico revelaram a proteína ABL1 como um alvo potencial do BNZ. O docking molecular frente a 3 estruturas da ABL1 depositadas no banco de dados de estruturas de proteínas (PDBID: 2GQG, 2HYY e 5MO4), por meio do Autodock 4.2.6, apresentou melhores resultados para o sítio alostérico (2GQG: -7,04 kcal/mol; 2HYY: -8,9 kcal/mol; 5MO4: -6,98 kcal/mol). Essa metodologia também destacou os resíduos Ala433, Glu462 e Gly463 como os principais para a interação com o BNZ no sítio alostérico. Portanto, até o presente momento os achados desse trabalho sugerem o potencial anticâncer do BNZ na LMC por meio da sua interação com a proteína ABL1, bem como seu efeito sinérgico na combinação com o Imatinibe e Dasatinibe.

Orientador: Karina Cogo Müller Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: Introdução: A sinvastatina é um fármaco hipolipemiante associado a melhorias nas condições cardiovasculares de pacientes afetados por dislipidemias. Em células humanas, atua inibindo a enzima 3-Hidroxi-3-MetilGlutaril Coenzima-A Redutase (HMG-CoA Redutase), reduzindo a síntese de colesterol, em uma via conhecida como "via do mevalonato". Nos últimos anos, têm sido reportados vários efeitos não-lipídeo relacionados, associados à sinvastatina, os chamados efeitos pleiotrópicos como a atividade antimicrobiana, sendo o Staphylococcus aureus uma das bactérias mais sensíveis ao fármaco. Objetivo: Investigar o efeito da sinvastatina sobrea via de produção de mevalonato e sobre a expressão de genes relacionados à síntese de peptidoglicanos e à produção de fatores de virulência em resposta ao estresse de parede celular em cepas de S. aureus. Material e Métodos: S. aureus ATCC 29213 e ATCC 33591 foram expostos a concentrações inibitórias e subinibitórias de sinvastatina na presença de mevalonato exógeno em diferentes concentrações (25 µM, 100 µM, 200 µM, 500 µM e 1 mM) e o crescimento bacteriano foi acompanhado durante 24 horas. Ainda, S. aureus ATCC 29213 foi submetido ao tratamento com uma concentração subinibitória de sinvastatina (7,8 µg / mL) durante 6 horas e ensaios de análise de expressão gênica relativa foram conduzidos para avaliar a influência do tratamento nos genes envolvidos na síntese de peptidoglicano (uppS, uppP e murG), bem como na resposta ao estresse de parede celular (vraX, sgtB e tcaA). Resultados: A adição de mevalonato conseguiu reverter de maneira parcial ou total a inibição causada pela sinvastatina em cepas de S. aureus ATCC 29213 e ATCC 33591 (p < 0,05. ANOVA 2 fatores – Bonferroni). Para as concentrações inibitórias de sinvastatina (31,25 µg / mL para S. aureus ATCC 29213 e 62,5 µg / mL para ATCC 33591), as maiores concentrações de mevalonato (1 mM, 500 µM e 200 µM na cepa 29213 e 1 mM, 500 µM, 100 µM e 25 µM para 33591) reverteram de forma parcial o crescimento bacteriano. Para as concentrações subinibitórias de sinvastatina (15,62 µg / mL e 7,8 µg / mL para ATCC 29213, e 31,25 µg / mL para ATCC 33591), a adição de menores concentrações de mevalonato (500 µM, 200 µM, 100 µM e 25 µM) promoveu reversão total ou parcial do crescimento bacteriano. A concentração de sinvastatina a 15,65 µg / mL, não promoveu efeito inibitório na cepa 33591. Adicionalmente, foi observado aumento de 28 vezes na expressão do gene vraX (p < 0,001. Teste t de student) e uma redução de 30% na expressão de murG (p < 0,05. Teste t). Foi observada, ainda, uma redução de 10% na expressão do gene tcaA e um aumento de 2 vezes em uppS, porém sem significância estatística, não havendo alteração na expressão de sgtB e uppP. Conclusão: A inibição causada pela sinvastatina foi revertida total ou parcialmente pela adição de diferentes concentrações de mevalonato. Ainda, sinvastatina promoveu aumento na expressão do gene vraX e redução em murG. Os resultados do presente estudo fornecem evidências adicionais para o entendimento do mecanismo de ação antimicrobiano da sinvastatina Abstract: Background: Simvastatin is a lipid-lowering drug associated with improvements in cardiovascular conditions in patients affected by dyslipidemia. In human cells, it acts by inhibiting the enzyme 3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl Coenzyme-A Reductase (HMG-CoA reductase), reducing cholesterol synthesis, in a pathway known as the "mevalonate pathway". In recent years, several non-lipid related effects associated with simvastatin have been reported, the so-called pleiotropic effects such as antimicrobial activity, with Staphylococcus aureus being one of the most sensitive bacteria to the drug. Objective: To investigate the effect of simvastatin on the mevalonate pathway and on the expression of genes related to peptidoglycan synthesis and the production of virulence factors in response to cell wall stress in S. aureus strains. Material and Methods: S. aureus ATCC 29213 and ATCC 33591 were exposed to inhibitory and subinhibitory concentrations of simvastatin in the presence of exogenous mevalonate at different concentrations (25 µM, 100 µM, 200 µM, 500 µM and 1 mM) and growth bacterial was followed for 24 hours. Furthermore, S. aureus ATCC 29213 was subjected to treatment with a sub-inhibitory concentration of simvastatin (7.8 µg / mL) for 6 hours and relative gene expression analysis assays were conducted to evaluate the influence of the treatment on genes involved in the synthesis of peptidoglycan (uppS, uppP and murG) as well as in response to cell wall stress (vraX, sgtB and tcaA). Results: The addition of mevalonate was able to partially or completely reverse the inhibition caused by simvastatin in S. aureus ATCC 29213 and ATCC 33591 strains (p < 0.05. 2-way ANOVA – Bonferroni). For inhibitory concentrations of simvastatin (31.25 µg / mL for S. aureus ATCC 29213 and 62.5 µg / mL for ATCC 33591), the highest concentrations of mevalonate (1 mM, 500 µM and 200 µM in strain 29213 and 1 mM, 500 µM, 100 µM and 25 µM for 33591) partially reversed bacterial growth. For subinhibitory concentrations of simvastatin (15.62 µg / mL and 7.8 µg / mL for ATCC 29213, and 31.25 µg / mL for ATCC 33591), the addition of lower concentrations of mevalonate (500 µM, 200 µM, 100 µM and 25 µM) promoted total or partial reversion of bacterial growth. Simvastatin concentration at 15.65 µg / mL did not promote an inhibitory effect on strain 33591. Additionally, a 28-fold increase in vraX gene expression was observed (p < 0.001. Student t test, unpaired, two-tailed) and a 30% reduction in murG expression (p < 0.05. t-test). It was also observed a 10% reduction in tcaA gene expression and a 2-fold increase in uppS, but without statistical significance, with no change in sgtB and uppP expression. Conclusion: The inhibition caused by simvastatin was totally or partially reversed by the addition of different concentrations of mevalonate. Furthermore, simvastatin promoted an increase in the expression of the vraX gene and a reduction in murG. The results of the present study provide additional evidence for understanding simvastatin's antimicrobial mechanism of action Mestrado Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica Mestre em Odontologia CAPES 88887.480037/2020-00 CNPQ 131737/2019-8

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2021. As lesões nervosas periféricas geram um impacto negativo na qualidade de vida dos indivíduos. Ainda não existe um tratamento totalmente eficaz e que acelere a recuperação sensório-motora e promova melhora funcional e alívio da dor após uma lesão nervosa. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com diacereína (DIA) no modelo experimental de esmagamento do nervo isquiático em camundongos. A DIA é um fármaco com atividade analgésica e anti-inflamatória que já é utilizada na clínica para o tratamento da osteoartrite. Neste estudo foram utilizados camundongos Suiços machos, separados aleatoriamente em seis grupos (n= 8 por grupo): FO (Falso-operado + veículo); FO + DIA (Falso-operado + DIA 30 mg/kg); LNI (Lesão do nervo isquiático + veículo); LNI + DIA 3, 10 e 30 mg/kg (lesão do nervo isquiático + tratamento com DIA nas doses de 3-30 mg/kg). A DIA ou veículo foram administrados 24 horas após procedimento cirúrgico, por via intragástrica (gavagem), duas vezes por dia. A lesão do nervo isquiático direito foi gerada pelo esmagamento por 30 s com uma pinça hemostática. Na primeira etapa do estudo verificamos que a lesão do nervo provocou um quadro álgico intenso (hiperalgesia/alodinia) e déficits funcionais nos animais em comparação aos grupos falso-operados, sendo que o tratamento com diacereína, principalmente na dose de 30 mg/kg, acelerou a recuperação sensório-motora do animal e apresentou redução da hiperalgesia e melhora da função motora. Além disso, os animais do grupo LNI apresentaram um comportamento de desesperança, anedonia e falta de bem-estar que foi significativamente inibido pelo tratamento com DIA (30 mg/kg). Em outra etapa dos experimentos, foi verificado histologicamente que no 15º dia após a lesão os animais submetidos ao esmagamento do nervo isquiático apresentaram destruição tecidual, degeneração das fibras nervosas e presença de células inflamatórias, em contraste com os animais falso-operados, em que foram visualizadas fibras nervosas intactas e organização tecidual. Nos animais submetidos à lesão e tratados com DIA 30 mg/kg (LNI+DIA 30 mg/kg) observou-se ainda diminuição das áreas em degeneração e do processo inflamatório. Na morfometria, o grupo LNI apresentou redução significativa dos diâmetros das fibras nervosas, dos axônios e da bainha de mielina comparados aos grupos falso-operados, sendo que o grupo LNI+DIA 30 mg/kg apresentou recuperação significativa de todos os parâmetros analisados em relação ao grupo LNI. Em adição, foi observado no nervo isquiático direito 7 dias após a lesão o aumento significativo da concentração da interleucina 1 beta (IL-1ß) e redução do fator de crescimento derivado do encéfalo (BDNF) nos animais operados (grupo LNI), sendo que o tratamento dos animais com DIA evitou o aumento de IL-1ß e a redução de BDNF. Conclui-se que a diacereína, administrada terapeuticamente pela via oral, promoveu redução da hiperalgesia e do comportamento de desesperança, anedonia e falta de bem-estar. Além disto, foi observado que a DIA também acelerou a regeneração nervosa periférica promovendo a recuperação funcional por um mecanismo de ação que depende, pelo menos em parte, da redução da concentração da IL-1ß e aumento do BDNF. Esses dados analisados e conjunto, fornecem evidências científicas para o uso terapêutico incremental da DIA nas condições patológicas associada a lesões nervosas periféricas. Abstract: Peripheral nerve injuries have a negative impact on individuals' quality of life. There is still no fully effective treatment that accelerates sensorimotor recovery and promotes functional improvement and pain relief after a nerve injury. This study aimed to evaluate the effect of diacerein treatment (DIA) on the experimental model of sciatic nerve crush in mice. DIA is a drug with analgesic and anti-inflammatory activity that is already used in the clinic for treat osteoarthritis. In this study, male Swiss mice were used, randomly separated into six groups (n = 8 per group): FO (False-operated + vehicle); FO + DIA (False-operated + diacerein 30mg/kg); SNI (Sciatic nerve injury + vehicle); SNI + DIA in doses of 3, 10 and 30mg/Kg (sciatic nerve injury + treatment with diacerein in doses of 3-30 mg/kg). DIA or vehicle was administered 24 hours after the surgical procedure, intragastrically (gavage), twice a day. The lesion of the right sciatic nerve was generated by crush for 30 s with a hemostat. In the first stage of the study, we found that the nerve injury caused intense pain (hyperalgesia/allodynia) and functional deficits in animals compared to the false-operated groups. Moreover, the treatment with diacerein, mainly at the dose of 30mg/kg, it accelerated the animal's sensorimotor recovery and showed a reduction in hyperalgesia and improved motor function. Also, the SNI group's animals showed a behavior of hopelessness, anhedonia, and lack of well-being that was significantly inhibited by treatment with DIA (30 mg/kg). In another stage of the experiments, it was histologically verified that on the 15th day after the injury, the animals submitted to sciatic nerve crush presented tissue destruction, degeneration of nerve fibers and the presence of inflammatory cells, in contrast to the false-operated animals, in which intact nerve fibers and tissue organization were seen. In animals submitted to the lesion and treated with DIA 30mg/kg (SNI + DIA 30mg/kg), there was also a decrease in the areas in degeneration and in the inflammatory process. In morphometry, the SNI group showed a significant reduction in the diameters of nerve fibers, axons and myelin sheath compared to the false-operated groups. The SNI + DIA 30mg/kg group showed significant recovery of all parameters analyzed to the SNI group. Besides, a considerable increase in the concentration of interleukin 1 beta (IL-1ß) and a reduction in the brain-derived growth factor (BDNF) in the operated animals (SNI group) was observed in the right sciatic nerve 7 days after the injury. The treatment of animals with DIA prevented an increase in IL-1ß and a reduction in BDNF. It is concluded that diacerein, administered therapeutically orally, reduced hyperalgesia and the behavior of hopelessness, anhedonia, and lack of well-being. In addition, it was observed that DIA also accelerated peripheral nerve regeneration, promoting functional recovery by a mechanism of action that depends, at least in part, on reducing the concentration of IL-1ß and increasing BDNF. These data analyzed and taken together provide scientific evidence for the incremental therapeutic use of DIA in pathological conditions associated with peripheral nerve injuries.

COVID-19 é uma doença viral aguda causada pelo novo coronavírus SARS-CoV-2. Com milhões de casos de COVID-19 em todo o mundo, opções terapêuticas são urgentemente necessárias para mitigar a sua morbidade e mortalidade, mas atualmente permanecem limitadas. Uma estratégia promissora para obter informações relevantes sobre sua fisiopatologia que possam ter aplicações terapêuticas é investigar os mecanismos regulatórios envolvidos na progressão para COVID-19 severa. Este trabalho tem como objetivo reconstruir a rede regulatória de COVID-19 severa e encontrar seus Reguladores Mestres (chamados de assinatura da doença). Usamos séries de conjuntos de dados de expressão gênica, disponíveis publicamente, derivados de autópsias pulmonares de pacientes para inferir a rede regulatória associada a COVID-19 severa. Identificamos um conjunto de seis fatores de transcrição (TAL1, TEAD4, EPAS1, ATOH8, ERG e ARNTL2) como potenciais Reguladores Mestres da doença. Após, pela abordagem de Mapa de Conectividade para o reposicionamento de drogas, encontramos 52 drogas diferentes (anti-inflamatórios, anti-infecções, psicotrópicos, reguladores da pressão arterial e do ritmo cardíaco) que potencialmente revertem a assinatura COVID-19 severa, e podem representar novas alternativas terapêuticas para a doença. Além disso, usando o índice de Jaccard, avaliamos a sobreposição entre a assinatura clínica severa de COVID-19 inferida e os medicamentos com os resultados obtidos da análise de amostras de esfregaço (swab) nasofaríngeo de pacientes infectados e células Vero, A549 e NHBE infectadas com diferentes MOI (multiplicity of infection) de SARS-CoV-2, modelos pré-clínicos celulares amplamente usados para pesquisar novas opções terapêuticas potenciais. Nossos dados demonstram uma semelhança significativa de células NHBE com assinatura COVID-19 clínica severa, enquanto as células A549 e Vero foram mais semelhantes às amostras de swabs nasofaríngeos. Usando uma abordagem de transcritômica integrada, identificamos candidatos a reguladores mestres envolvidos com COVID-19 severa, bem como várias drogas que potencialmente revertem esse padrão de expressão e também fornecem novas perspectivas sobre alvos moleculares e reposicionamento de drogas para futura investigação e validação na doença. Ademais, nosso estudo demonstra a limitada sobreposição entre os dados clínicos e pré-clínicos na pesquisa COVID-19 e destaca ainda a necessidade crítica de escolher o melhor modelo pré-clínico disponível para orientar a pesquisa sobre a fisiopatologia e o reposicionamento de drogas em potencial. COVID-19 is an acute viral illness caused by the novel SARS-CoV-2 coronavirus. With millions of COVID-19 cases worldwide, therapeutic options are urgently needed to mitigate morbidity and mortality, but currently remain limited. A promising strategy to gain relevant information regarding its pathophysiology that could have therapeutic applications is to investigate the regulatory mechanisms involved in severe COVID-19 progression. This work aims to reconstruct the severe COVID-19 regulatory network and find its transcriptional master regulators (so called disease signature). We use a series of gene expression datasets, publicly available, from patient lung biopsies to infer the co-expression network associated with severe COVID-19. We identified a set of six transcription factors as potential master regulators (TAL1, TEAD4, EPAS1, ATOH8, ERG, and ARNTL2). After, by Connectivity Map drug repositioning approach, we found 52 different drugs (anti-inflammatories, anti-infections, psychotropics, blood pressure, and heart rhythm regulators) that potentially revert severe COVID-19 signature, and could be a new therapeutic venue for the disease. In addition, using Jaccard index, we evaluated the overlap between the inferred clinical severe COVID-19 signature and drugs with the ones obtained from infected patients nasopharyngeal swab samples of, and Vero, A549 and NHBE cells infected with different MOI (multiplicity of infection) of SARS-CoV-2, preclinical cell models widely used to research for new potential therapeutic options. Our data demonstrate a significant similarity of NHBE cells with clinical severe COVID-19 signature, whereas A549 and Vero cells were more similar to nasopharyngeal swabs samples. Using an integrated transcriptomics approach, we identified master regulators candidates involved with severe COVID-19, as well as several drugs that potentially reverse these expression patterns, and provides new perspectives on molecular targets and drug repositioning for future investigation and validation in severe COVID-19 management. Moreover, our study demonstrates how limited is the overlap between clinical and preclinical data in COVID-19 research and further highlights the critical need to choose the best preclinical model available to guide research into the pathophysiology and potential drugs repositioning.

Much has been discussed recently about fungal infections superficial and thorough has increased significantly and such as consequence end up cause increase of rates of morbidity and mortality of individuals nowadays although increase development of antibiotics, arsenal antifungals found for market for the treatment of fungal infection still low, as soon end up limiting patient’s treatment and may cause resistance to strains. Species of the genus Candida are the most common opportunistic agents in candidiasis-related fungal infections in species in different groups of immunodeficiency patients. Therefore, drug redirection is an important means of prospecting for new therapeutic alternatives, as these drugs have well-characterized pharmacological and toxicological properties, thus reducing the time and cost of drug development. The present study investigates the antifungal action of dexamethasone sodium phosphate (DEXA), a type of glucocorticoid whose main pharmacological actions include anti-inflammatory, anti-allergic, and anti-rheumatic. Sensitivity tests were carried out using the broth microdilution method (CLSI; M27-A3) and the checkerboard technique applied to mature and developing biofilms of two strains of C. albicans, along with the hyphal production test and analysis of the mechanism of cell death through flow cytometry. The results showed activity of dexamethasone phosphate (DEXA) against strains resistant to fluconazole (FLU), with minimum inhibitory concentrations (MIC) varying from 31.25 to 500 μg/mL, while DEXA and FLU together had a synergistic effect, causing 100% inhibition of all strains in relation to the developing biofilm. In turn, DEXA alone reduced the cell viability of the developing biofilm by 89%, while the mature biofilm showed no reduction when treated with DEXA alone or in combination with FLU. The combination also caused a decrease in the production of hyphae and changes in the level of mitochondrial depolarization, an increase in the generation of reactive oxygen species, and an increase in the externalization of phosphatidylserine. In addition, it DEXA interacted with ALS3 and SAP5, important in virulence processes. Dexamethasone disodium phosphate showed antifungal activity against strains of Candida albicans resistant to fluconazole and caused a decrease in the production of hyphae, so it can be considered a potential drug to help fight fungal infections caused by Candida albicans. Muito se tem discutido recentemente sobre infecções fúngicas superficiais e profundas que aumentaram significativamente aumentando as taxas de morbimortalidade na atualidade. Embora aumentem o desenvolvimento de drogas antimicrobianas, o arsenal encontrado no mercado para o tratamento de infecções fúngicas ainda são baixos, logo acabam limitando o tratamento do paciente. Espécies do gênero Candida são os agentes oportunistas mais comuns em infecções fúngicas em espécies de diferentes grupos de pacientes com imunodeficiência. Portanto, o redirecionamento de medicamentos é um importante meio de prospecção de novas alternativas terapêuticas, visto que esses medicamentos apresentam propriedades farmacológicas e toxicológicas bem caracterizadas, reduzindo o tempo e o custo de desenvolvimento dos medicamentos. O presente estudo investiga a ação antifúngica do fosfato de dexametasona dissódico um tipo de glicocorticoide cujas principais ações farmacológicas incluem atividade antiinflamatório, antialérgico e antirreumático. Os testes de sensibilidade foram realizados utilizando o método de microdiluição em caldo (CLSI; M27-A3) e a técnica checkerboard aplicada a biofilmes maduros e em desenvolvimento de duas cepas de C. albicans, juntamente com o teste de produção de hifas e análise do mecanismo de morte celular por citometria de fluxo. Os resultados mostraram atividade do fosfato de dexametasona contra cepas resistentes ao fluconazol (FLC), com concentrações inibitórias mínimas (CIM) variando de 31,25 a 500 μg / mL, enquanto fosfato dissódico de dexametasona e FLC juntas tiveram efeito sinérgico, causando 100% de inibição de todas as cepas em relação ao biofilme em desenvolvimento. Por sua vez, o fosfato dissódico de dexametasona sozinho reduziu a viabilidade celular do biofilme em desenvolvimento em 89%, enquanto o biofilme maduro não mostrou redução quando tratado com o fosfato dissódico de dexametasona sozinho ou em combinação com a FLC. A combinação também causou uma diminuição na produção de hifas e mudanças no nível de despolarização mitocondrial, um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio e um aumento na externalização da fosfatidilserina. Além disso, fosfato dissódico de dexametasona interagiu com ALS3 e SAP5, importantes em processos de virulência. O fosfato dissódico de dexametasona apresentou atividade antifúngica contra cepas de Candida albicans resistentes ao fluconazol e causou diminuição na produção de hifas, podendo ser considerado um medicamento potencial para auxiliar no combate a infecções fúngicas por Candida albicans.

In recent years, an increase in the incidence of infections caused by bacteria has been reported, including Staphylococcus aureus which corresponds to 50% of infections found in various regions of the world. Currently, the drugs available for the treatment of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are limited and this microorganism has developed resistance to practically all antibiotics indicated for its treatment. This fact is mainly associated with some of its virulence factors, such as hemolysins, staphylococcal enterotoxins, toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1), Panton–Valentine leukocidin (PVL) and its ability to form biofilm that presents up to a thousand times more resistance when compared to its plactonic form. Therefore, it is necessary to search for new therapeutic options and an adequate repositioning of drugs. Drug repositioning is a therapeutic alternative, as it optimizes time and reduces costs when compared to the implantation of a new molecule on the market. The aim of the study was to evaluate the antimicrobial activity of diclofenac sodium alone and in combination with oxacillin against plactonic cells, antibiofilm and biofilm formed in clinical strains of SARM. For this, the antibacterial effect was demonstrated through microdilution, following the recommendations of the protocol M07-A10, Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) and to determine its possible mechanism of action, flow cytometry was used. MRSA strains showed Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) ranging from 156.25 to 1250 μg/mL, synergism with oxacillin occurred in 13 strains (80%) and synergism was also seen against antibiofilm and in biofilm formed from MRSA. Cytometry tests showed that these drugs alter the integrity of the membrane and promote damage to the DNA of SARM cells, leading them to a possible apoptotic process. Nos últimos anos, tem sido relatado um aumento na incidência de infeções causadas por bactérias, dentre elas Staphylococcus aureus que corresponde a 50% das infecções constatadas em várias regiões do mundo. Atualmente, os fármacos disponíveis para o tratamento de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) são limitados e esse microrganismo desenvolveu resistência a praticamente todos os antibióticos indicados para seu tratamento. Este fato está associado, principalmente, a alguns de seus fatores de virulência, tais como as hemolisinas, as enterotoxinas estafilocócicas, a toxina-1 do choque tóxico estafilocócico (TSST-1), a citotoxina Panton-Valentine leucocidina (PVL) e a sua capacidade de formar biofilme que apresenta até mil vezes mais resistência se compararmos a sua forma plactônica. Diante disso, faz-se necessária a busca por novas opções terapêuticas e um reposicionamento adequado de fármacos. O reposicionamento de fármacos é uma alternativa terapêutica, já que otimiza o tempo e reduz os custos se comparamos com a implantação de uma nova molécula no mercado. O objetivo do estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana do diclofenaco sódico isolado e em combinação com a oxacilina frente a células plactônicas, antibiofilme e em biofilme formado em cepas clínicas de SARM. Para isso, o efeito antibacteriano foi demonstrado por meio da microdiluição, seguindo as recomendações do protocolo M07-A10, Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) e para determinar seu possível mecanismo de ação utilizou-se a citometria de fluxo. As cepas de SARM apresentaram Concentrações Inibitórios Mínimas (CIMs) variando entre 156,25 e 1250 μg/mL, o sinergismo com a oxacilina ocorreu em 13 cepas (80%) e o sinergismo também foi visto frente a antibiofilme e em biofilme formado de SARM. Os ensaios de citometria mostrou que esses fármacos alteram a integridade da membrana e promove danos ao DNA das células de SARM, levando-as a um possível processo apoptótico.

The occurence of invasive candidiasis in tertiary hospitals has increased significantly in recent decades, covering approximately 80% of nosocomial fungal infections. One of the factors that contribute to this percentage is the appearance of the resistance to antifungals, which can be influenced by the ability of some species of Candida spp. to form biofilms and also by the reduced therapeutic arsenal, makes it necessary to search for new alternatives to overcome this limitation. The objective of the work was to evaluate the antifungal activity of midazolam isolated and in association with azolics in relation to clinical isolates of Candida spp. resistant to fluconazole in planktonic form and in biofilm. The microdilution broth technique described by the Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, M27-A3) was used to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Flow cytometry tests were also performed to investigate the probable mechanism of action, evaluation of DNA damage by the comet test and cytotoxicity test on L929 murine fibroblasts. Midazolam showed MIC ranging from 125 to 250 μg/mL. Midazolam showed no cytotoxicity when evaluated at concentrations of 31.5 to 500 μg/mL. It showed significant reduction in cellular viability of Candida albicans biofilm by 500 μg/mL, Candida tropicalis by 1000 μg/mL and Candida parapsilosis by 125 μg/mL. It was also found that midazolam promotes decreased cell density, damage to the mitochondrial membrane and that it provided phosphatidylserine externalization but was not able to produce reactive oxygen species and cause DNA damage. The interaction of midazolam and Candida spp. biofilm was also observed through scanning electron microscopy (SEM), where the treated cells presented alteration in their appearance, which may have been caused by the loss of rigidity of the fungal cell wall. Therefore, midazolam proved to be an antifungal potential against the isolates tested in this study. A ocorrência da candidíase invasiva em hospitais terciários vem aumentando significativamente nas últimas décadas, abrangendo aproximadamente 80% das infecções fúngicas nosocomiais. Um dos fatores que contribuem com essa porcentagem é o aparecimento de resistência aos antifúngicos, que pode ser influenciada pela capacidade que algumas espécies de Candida spp. apresentam de formar biofilmes e também pelo reduzido arsenal terapêutico, busca-se novas alternativas que visem driblar essa limitação. O objetivo do trabalho foi avaliar a atividade antifúngica do midazolam isolado e em associação com azólicos frente a isolados clínicos de Candida spp. resistentes ao fluconazol na forma planctônica e em biofilme. Utilizou-se a técnica de microdiluição em caldo, descrita pelo Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, M27-A3), com o intuito de determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM). Realizou-se também ensaios de citometria de fluxo para a investigação do provável mecanismo de ação, avaliação de dano ao DNA pelo ensaio do cometa e teste de citotoxicidade na linhagem L929 de fibroblastos murino. O midazolam apresentou CIM que variou de 125 a 250 μg/mL. O midazolam não demonstrou citotoxicidade quando avaliada nas concentrações de 31,5 a 500 μg/mL. Apresentou redução significativa da viabilidade celular do biofilme de Candida albicans em 500 μg/mL, de Candida tropicalis em 1000 μg/mL e de Candida parapsilosis em 125 μg/mL. Verificou-se também que o midazolam promove diminuição da densidade celular, danos na membrana mitocondrial e que propiciou externalização da fosfatidilserina, mas não foi capaz de produzir espécies reativas de oxigênio e causar danos ao DNA. Observou-se também a interação do midazolam e do biofilme de Candida spp. através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), onde as células tratadas apresentaram alteração em sua aparência, o que pode ter sido ocasionado pela perda da rigidez da parede celular fúngica. Portanto, o midazolam mostrou-se como potencial antifúngico frente aos isolados testados nesse estudo.

Orientador: Catarina Raposo Dias Carneiro Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: DCs com função defeituosa encontradas em pacientes com câncer possuem relação direta com o pobre prognóstico da doença. Com o desenvolvimento de novas imunoterapias, percebeu-se que alguns fármacos podem reduzir a ação supressora do microambiente tumoral (TME) e serem úteis como imunoadjuvantes no tratamento do câncer. O sildenafil (Viagra®?) é um inibidor de fosfodiesterase 5 (PDE5-I) que aumenta a resposta antitumoral de linfócitos T, quando administrado sistemicamente. Porém, os efeitos desse medicamento nas DCs, células que determinam o fenótipo dos linfócitos T, ainda não são conhecidos. Portanto o objetivo geral dessa pesquisa foi avaliar o efeito do sildenafil como um modulador de DCs in vitro, visando o uso desse fármaco como um adjuvante em vacina de DCs contra adenocarcinoma mamário (EO771); foi objetivo paralelo padronizar um modelo experimental mais adequado, caracterizando o efeito do GM-CSF e do sobrenadante de L929 na diferenciação das DCs. DCs geradas da medula óssea de camundongos foram expostas ao lisado tumoral de EO771 e/ou ao sidenafil (0,1, 1 e 10 µM) por 24 h in vitro, e posteriormente foi avaliada a expressão de marcadores de superfície (MHCII, CD11c e CD80) e a liberação de citocinas (IL1-?, IL-10 e TNF-?). Também foram analisadas as populações de linfócitos (CD4+ e CD8+) mantidas em cocultura com as DCs moduladas e, por fim, a capacidade desses linfócitos em matar a linhagem tumoral (EO771), quando colocados em cocultura, para avaliar a eficácia in vitro da modulação das DCs. O sildenafil aumentou a expressão de MHCII e de CD80, a secreção de IL-1? e de TNF-?, enquanto diminuiu a expressão de de IL-10, indicando a indução de um perfil ativado dessas células. O tratamento aumentou o percentual das populações de linfócitos duplo-positivos CD4+CD8+. Entretanto, não houve aumento da morte celular de EO771 em 24 h de cocultura com linfócitos diferenciados pelas DCs tratadas com o sildenafil. Como resultado paralelo, a concentração de 10 ng/mL de GM-CSF foi considerada a mais eficaz para diferenciar populações CD11c+ MHCII+ F4/80-. Nosso trabalho sugere que o sildenafil modulou as DCs para um perfil fenotípico e funcional ativado, porém não melhorou a capacidade dessas células em induzir uma reposta antitumoral in vitro, nas condições de tempo, linhagem tumoral e concentração estudadas. Outros testes são necessários para indicar se esse fármaco pode ser reposicionado como um imunoadjuvante em vacinas de DCs para o tratamento do câncer, o que pode representar uma estratégia de menor custo e tempo em comparação com o desenvolvimento de novos fármacos Abstract: Defective function of DCs found in cancer patients are directly related to the poor prognosis of the disease. With the development of new immunotherapies, it was realized that some drugs can reduce the suppressive action of the tumor microenvironment (TME) and be useful as immunoadjuvants in the treatment of cancer. Sildenafil (Viagra®) is a phosphodiesterase 5 (PDE5-I) inhibitor that increases the T lymphocyte antitumor response when administered systemically. However, the effects of this drug on DCs, cells that determine the phenotype of T lymphocytes, are not yet known. Therefore, the general objective of this research was to evaluate the effect of sildenafil as a DC modulator in vitro, aiming at the use of this drug as an adjuvant in a DC vaccine against breast adenocarcinoma (EO771); it was a parallel objective to standardize a more adequate experimental model, characterizing the effect of GM-CSF and L929 supernatant on the differentiation of DCs. DCs generated from the bone marrow of mice were exposed to the tumor lysate of EO771 and/or to sidenafil (0.1, 1 and 10 µM) for 24 h in vitro, and subsequently the expression of surface markers (MHCII, CD11c and CD80) and the release of cytokines (IL1-?, IL-10 and TNF-?). Lymphocyte populations (CD4 and CD8) maintained in co-culture with modulated DCs were also analyzed, and finally, the capacity of these lymphocytes to kill the tumor line (EO771), when placed in co-culture, to evaluate the in vitro efficacy of the modulation of the DCs. Sildenafil was able to increase the expression of MHCII in 24 h of treatment and CD80 in 1 h, the secretion of IL-1? in 1 h, that of TNF-? in 24 h and the percentage of CD4 + CD8 + populations. It also decreased the expression of CD11c in 1h, the secretion of IL-10 and was not related to cell death of EO771 in coculture with DCs and lymphocytes in 24 h of treatment. Our work suggests that sildenafil acts positively on the phenotype and function of DCs and has no chemotherapeutic action. Therefore, further studies may result in the repositioning of this drug as an immunoadjuvant in the treatment of cancer and this would represent a viable means in terms of cost and time to provide an improved immunotherapy for cancer patients Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 158888/2018-9 CAPES 001 FAPESP 2015/04194-0

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Infections caused by multiresistant microrganisms have increased considerably in recent years, reaching approximately one fifth of worldwide mortality, becoming a public health problem. Another worrying factor is the resistance to antitumor drugs that lead to therapeutic failure in cancer patients. Thus, the search for more potent and selective drugs with antibacterial and antitumor action is essential, through faster and more effective alternatives, such as drug repositioning, in order to overcome these challenges and limitations. Different non-antibiotics are reported in the literature with potential antibacterial and antitumor activity, among them the antihypertensive class. Amlodipine and valsartan are non-antibiotic drugs commonly used in the medical clinic to treat high blood pressure. Thus, the aim of this study, in the first article, was to present to the scientific community a selection of studies that address the repositioning of the non-antibiotic amlodipine and its synergistic effects in the treatment of infectious diseases. The aim of the manuscript was to evaluate the antibacterial activity in vitro alone and in association with ciprofloxacin of the amlodipine and valsartan drugs, as well as to evaluate the cleavage activity of the plasmid DNA of the studied drugs, as well as their probable mechanism of action involved. In the first article, we present sixteen studies involving anlodipine repositioning as an alternative in the treatment of microbial and neoplastic infections, demonstrating significant synergistic activity when associated with ten different drugs. In the manuscript, antibacterial activity was evaluated against ten standard American Type Culture Collection (ATCC) reference bacterial strains and thirty-one multiresistant clinical isolates (MDR) from patients admitted to the University Hospital of Santa Maria, where anlodipine alone was active against all bacteria, especially against Gram-positive as the Coagulase-negative methicillin-resistant Staphylococcus (MRSCoN). Unlike with valsartan, which was active only against two strains and one isolate. When combined with ciprofloxacin, amlodipine resulted in nine synergistic isolates, whereas valsartan did not yield significant results. Also, both drugs were able to cleave the plasmid DNA under the defined conditions of pH and temperature, and in the investigation of the probable mechanism of action involved, it is suggested that both act through the hydrolytic mechanism because they were unable to inhibit the activity of cleavage in the presence of free radical scavengers. Thus, we highlight the repositioning of these drugs as an effective way to treat infections caused by multiresistant microrganisms. Infecções causadas por microrganismos multirresistentes têm aumentado consideravelmente nos últimos anos, chegando aproximadamente um quinto da mortalidade mundial, tornando-se um problema de saúde pública. Outro fator preocupante é a resistência a medicamentos antitumorais que levam ao fracasso terapêutico em pacientes com câncer. Assim, é essencial a busca por medicamentos mais potentes e seletivos com ação antibacteriana e antitumoral, através de alternativas mais rápidas e eficazes, como o reposicionamento de medicamentos, a fim de contornar estes desafios e limitações. Diferentes não antibióticos são relatados na literatura com potencial atividade antibacteriana e antitumoral, dentre eles a classe dos anti-hipertensivos. O anlodipino e valsartana são medicamentos não antibióticos comumente utilizados na clínica médica para tratamento da hipertensão arterial. Sendo assim, o objetivo deste estudo, no primeiro artigo, foi apresentar à comunidade científica uma seleção de estudos que abordem o reposicionamento do não antibiótico anlodipino e seus efeitos sinérgicos no tratamento de doenças infecciosas e neoplásicas. No manuscrito, objetivou-se avaliar a atividade antibacteriana in vitro isoladamente e em associação ao ciprofloxacino dos fármacos anlodipino e valsartana, e ainda, avaliar a atividade de clivagem do DNA plasmidial dos medicamentos em estudo, bem como seu provável mecanismo de ação envolvido. No primeiro artigo, apresentamos dezesseis pesquisas envolvendo reposicionamento do anlodipino como alternativa na terapêutica de infecções microbianas e neoplásicas, demonstrando atividade sinérgica significativa quando associado a dez diferentes fármacos. No manuscrito, a atividade antibacteriana foi avaliada frente a dez cepas bacterianas padrão de referência American Type Culture Collection (ATCC) e trinta e um isolados clínicos multirresistentes (MDR) provenientes de pacientes admitidos no Hospital Universitário de Santa Maria, onde anlodipino sozinho foi ativo frente a todas as bactérias, especialmente frente as Gram-positivas como os Staphylococcus coagulase negativos resistentes à meticilina (MRSCoN). Diferente do que ocorre com valsartana, que foi ativa apenas frente a duas cepas e um isolado. Quando associados ao ciprofloxacino, anlodipino resultou em nove isolados sinérgicos, enquanto que valsartana não obteve resultados significativos. Ainda, ambos os medicamentos foram aptos a clivar o DNA plasmidial nas condições definidas de pH e temperatura, sendo que na investigação do provável mecanismo de ação envolvido, sugere-se que ambos atuem através do mecanismo hidrolítico pois não foram capazes de inibir a atividade de clivagem na presença de sequestradores de radicais livres. Sendo assim, evidenciamos o reposicionamento destes fármacos como forma eficaz na terapêutica de infecções ocasionadas por microrganismos multirresistentes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The emergence of multiresistance to commercially available antimicrobials today is likely to continue to be one of the major global public health problems, as it has worrying clinical and economic consequences. Concomitant with the increase in infections caused by multidrugresistant microorganisms (MDR), there has been a drastic reduction of new antibacterials in the market, as well as investments for their creation. In addition to antimicrobial resistance, resistance to antitumor drugs is already a reality. Thus, it is essential to search for new substances and / or compounds that exhibit antibacterial and / or antitumor activity. With this, drug repositioning has emerged as an alternative approach for the faster identification of effective drugs. In this sense, the present study aimed, in the first article, to present to the scientific community the current research on the repositioning of antidepressants for the treatment of infections caused by microorganisms. In the second manuscript, the individual antibacterial activity and in combination with antibacterials of the non-antibiotics escitalopram oxalate and clonazepam were analyzed against standard strains and clinical isolates multiresistant. In addition, the chemical nuclease ability of these drugs was analyzed. In the first article, we report that antidepressant drugs, highlighting the class of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), have significant activity against several microorganisms. We present 14 studies covering the repositioning of antidepressant drugs to treat infections. Among the antidepressants, escitalopram oxalate was reported with activity reported in vitro against standard bacterial strains. In the second manuscript, we report the antibacterial and chemical nuclease activity of the drugs oxalate of escitalopram and clonazepam. The first was active against a standard Gram-negative strain and eight Grampositive MDR clinical isolates. The second drug showed activity against both Gram-positive and Gram-negative, with four standard Gram-positive strains and all Gram-positive and Gram-negative MDR clinical isolates. Escitalopram oxalate and clonazepam showed activity in vitro when individually associated with ciprofloxacin and sulfamethoxazole-trimethoprim against standard strains and clinical MDR Gram-positive isolates. Clonazepam was also active against a gram-negative bacterium. Clonazepam was able to cleave the plasmidial DNA. Further studies should be performed by our research group, in order to verify the activity of clonazepam against tumor cell lines. Therefore, in this work we show that these two drugs constitute a promising alternative to redirection in the treatment of infectious diseases and also for neoplasias. Further studies, using different techniques, are needed to elucidate the mechanisms of action involved. A emergência da multirresistência aos antimicrobianos disponíveis comercialmente na atualidade é provavelmente e continuará a ser um dos grandes problemas de saúde pública mundial, dado que apresenta consequências clínicas e econômicas preocupantes. Concomitante ao aumento das infecções ocasionadas por microrganismos resistentes a múltiplas drogas (MDR) ocorreu uma redução drástica de novos antibacterianos no mercado, bem como, investimentos para sua criação. Além da resistência aos antimicrobianos, a resistência aos medicamentos antitumorais também já é uma realidade. Assim, é essencial a pesquisa de novas substâncias e/ou compostos que apresentem atividade antibacteriana e/ou antitumoral. Com isso, o reposicionamento de fármacos surgiu como uma abordagem alternativa para a identificação mais rápida de medicamentos eficazes. Nesse sentido, o presente estudo objetivou, no primeiro artigo, apresentar à comunidade científica a pesquisa atual do reposicionamento de antidepressivos para o tratamento de infecções ocasionadas por microrganismos. No segundo manuscrito, analisou-se a atividade antibacteriana individual e em combinação com antibacterianos dos não-antibióticos oxalato de escitalopram e clonazepam frente a cepas padrão e isolados clínicos multirresistentes. Além disso, foi analisada a capacidade de nuclease química desses medicamentos. No primeiro artigo, relatamos que medicamentos antidepressivos, destacando a classe dos inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRSs), apresentam atividade significativa contra vários microrganismos. Foram apresentados 14 estudos abrangendo o reposicionamento de medicamentos antidepressivos para tratamento de infecções. Dentre os antidepressivos, foi citado o oxalato de escitalopram com atividade relatada in vitro frente a cepas bacterianas padrão. No segundo manuscrito, relatamos a atividade antibacteriana e de nuclease química dos medicamentos oxalato de escitalopram e clonazepam. O primeiro foi ativo frente a uma cepa padrão Gram-negativa e oito isolados clínicos MDR Gram-positivos. O segundo medicamento apresentou atividade tanto frente a Gram-positivas quanto a Gram-negativas, sendo quatro cepas padrão Gram-positivas e todos os isolados clínicos MDR Gram-positivos e Gram-negativos. Oxalato de escitalopram e clonazepam apresentaram atividade in vitro quando associados, individualmente, com ciprofloxacino e sulfametoxazol-trimetoprima frente a cepas-padrão e isolados clínicos MDR Gram-positivos. O clonazepam também foi ativo frente a uma bactéria Gram-negativa. Clonazepam foi capaz de clivar o DNA plasmidial. Mais estudos devem ser realizados pelo nosso grupo de pesquisa, com objetivo de verificar a atividade do clonazepam frente a linhagens celulares tumorais. Portanto, nesse trabalho evidenciamos que estes dois medicamentos constituem uma alternativa promissora ao redirecionamento no tratamento de doenças infecciosas e também para neoplasias. São necessários estudos adicionais, utilizando diferentes técnicas, para a elucidação dos mecanismos de ação envolvidos.

O reposicionamento de fármacos aprovados é uma alternativa importante para a identificação e desenvolvimento de terapias, agilizando a aprovação de medicamentos com perfis de segurança e eficácia previamente estabelecidos em um contexto para novas aplicações terapêuticas. Novas indicações podem ser identificadas para moléculas de diferentes origens que mostram potencial de reposicionamento agindo sobre um alvo novo ou previamente conhecido. Nesta tese, abordamos aspectos de reposicionamento do dipiridamol em duas aplicações diferentes. O dipiridamol é um fármaco vasodilatador e antitrombótico e seus efeitos decorrem da sua atividade de inibição de transportadores de nucleosídeos e de fosfodiesterases. Primeiro, relatamos que em células de câncer de próstata o dipiridamol promove o aumento de marcadores da autofagia devido ao bloqueio do fluxo autofágico, interferindo no processo de maturação e/ou fechamento dos autofagossomos, prejudica a degradação de substratos da autofagia e reduz os níveis intracelulares de ATP. O bloqueio do fluxo autofágico mediado pelo dipiridamol pode ser revertido pelo tratamento com um inibidor de PKA, sugerindo que a inibição do fluxo autofágico resulta do aumento dos níveis intracelulares de cAMP. O tratamento com dipiridamol apresenta efeitos antiproliferativos in vitro isoladamente ou em combinação com quimioterápicos em linhagens celulares de câncer de próstata. Com isso, esse trabalho demonstra que o dipiridamol pode inibir o fluxo autofágico e pode ser útil na terapia antineoplásica onde a autofagia desempenha um papel pró-tumoral. Na segunda parte do trabalho abordamos o potencial antiviral da inibição do transporte de nucleosídeos com dipiridamol. A replicação viral é um evento que depende das fontes de nucleotídeos das células hospedeiras, os quais podem ser provenientes da reciclagem de nucleosídeos extracelulares através da via de salvamento. Mostramos que o dipiridamol inibe a reativação do vírus Epstein-Barr em linhagens de linfócitos B, reprimindo a transcrição gênica, a replicação do genoma viral e liberação de vírions, principalmente através de sua capacidade de inibir a captação de nucleosídeos. Considerando a segurança do seu uso clínico e perfil farmacológico bem conhecido, o reposicionamento do dipiridamol pode ser considerado para tratamento, isolado ou em combinação com outras terapias, para tratar 8 neoplasias e doenças relacionada à infecção pelo vírus Epstein-Barr e buscar aplicações para outras famílias de vírus. Repurposing approved drugs is an important approach to the identification and development of therapeutics for many applications, expediting the approval of effective and safe drugs. New indications can be identified for molecules of different origins showing repurposing potential by acting against a previously known or a new target. In this thesis, we approached aspects of dipyridamole repurposing for two different applications. Dipyridamole is a vasodilator and antithrombotic drug and its major effects involve the block of nucleoside uptake and phosphodiestesase inhibition. First, we report that in prostate cancer cells dipyridamole increases autophagic markers due to autophagic flux blockage, resembling autophagosome maturation and/or closure impairment. Treatment with dipyridamole results in an increased number of autophagosomes and autolysosomes and impairs degradation of autophagic substrates, reducing the intracellular ATP levels in cancer cells. Autophagic flux blockage could be prevented by treatment with a PKA inhibitor, suggesting that autophagic flux failure mediated by dipyridamole results from increased intracellular levels of cAMP. The treatment presents antiproliferative effects in vitro alone and in combination with chemotherapy drugs. Collectively, these data demonstrate that dipyridamole can impair autophagic degradation, by preventing the normal autophagosomes maturation, and might be useful in combination anticancer therapy where autophagy plays a pro-survival role. In the second work, we address the antiviral potential of targeting nucleoside transport with dipyridamole. The viral replication relies on the sources of nucleotides from the host cells and cellular nucleotide pools can be refueled by recycling extracellular nucleosides through the salvage pathway. We show that dipyridamole inhibits Epstein-Barr Virus reactivation from B-cell lines, repressing immediate early and early genes expression mostly through its ability to inhibit nucleoside uptake. Considering its wide clinical use, dipyridamole repurposing could shortly be evaluated, alone or in combination with other therapies, to treat cancer and EBV-related diseases or to investigate applications in other families of viruses.

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Causada por protozoários do gênero "Plasmodium", a malária é uma das principais parasitoses da história, alcançando mais de 200 milhões de novos casos por ano. Apesar de avanços globais significativos no controle da doença, a presença de cepas de parasitos menos suscetíveis aos medicamentos disponíveis é recorrentemente observada para diferentes espécies de "Plasmodium". Frente aos desafios encontrados pela indústria farmacêutica de desenvolvimento de novos fármacos, o reposicionamento de fármacos aparece como uma nova estratégia com riscos reduzidos para a busca por antimaláricos. Estratégias quimiogenômicas in silico conduzidas previamente identificaram, com base na semelhança de alvos e ligantes, a Epirrubicina como potencial candidato ao reposicionamento como fármaco antimalárico. A Epirrubicina, originalmente desenvolvida para tratamento do câncer, é uma antraciclina aprovada pela FDA. O presente projeto buscou validar a ação antimalárica da Epirrubicina. A validação experimental iniciou-se com ensaios fluorimétricos in vitro (SybrGreen) utilizando cepas de "P. falciparum" sensíveis à cloroquina (3D7) e multi-resistente (W2 e Dd2). A Epirrubicina apresentou atividade antiplasmodial "in vitro" em escala nanomolar (EC50 = 110,7, 68,9 e 99,5 nM respectivamente). Ensaios de viabilildade celular em linhagens de células mamíferas (redução de MTT) mostraram que o composto apresenta baixa toxicidade (linhagens COS-7 e CHO, CC50 = 5,48 e 4,45µM respectivamente), com índices de seletividade de 49,4 e 40,1. Ensaios de maturação de esquizontes identificou o potencial da Epirrubicina de inibir isolados de "P. vivax" com tanta potência quanto a cloroquina. Foi também avaliada a capacidade do fármaco de bloquear a transmissão do parasito utilizando uma linhagem de P. berghei modificada (expressão de luciferase sob promotor específico de oocineto). A Epirrubicina inibiu cerca de 80% da formação de oocinetos a 1 µM (EC50 = 0,39 µM). Ainda, ensaios de alimentação de mosquitos em sangue de pacientes infectados por P. vivax por meio de membrana mimetizando a pele corroboraram o potencial de bloqueio de transmissão demonstrando que mosquitos A. aquasalis apresentaram significativamente menos oocitos em seu intestino médio pós-repasto sanguíneo em amostras tratadas com Epirrubicina. Ainda, a atividade esquizonticida do composto foi avaliada "in vivo" em camundongos C57BL/6JUnib infectados com "P. yoelii" 17XNL, tratados com 6 mg/kg de Epirrubicina por 4 dias. Este regime inibiu aproximadamente 90% da parasitemia até o último dia de tratamento, mantendo a inibição acima de 60% até o sexto dia pós-infecção. Finalmente, utilizando ferramentas de biologia sintética, particularmente uma triagem em biblioteca de leveduras mutantes heterozigotas, foram levantados outros possíveis alvos e vias moleculares afetados pela Epirrubicina além do inicialmente predito, uma girase do apicoplasto. Assim, os resultados não apenas mostram que a Epirrubicina apresenta relevante atividade antiplasmodial contra diferentes cepas do parasito – incluindo resistentes, mas também validam a estratégia de reposicionamento como uma opção adequada e consistente para a descoberta de fármacos Abstract: Caused by protozoan of the genus "Plasmodium", malaria is one of the most important parasitic diseases in history, reaching more than 200 million new cases every year. Besides significant global advances in disease control, the presence of parasites strains less susceptible to the drugs available is recurrently observed for different "Plasmodium" species. Facing the challenges met by the pharmaceutical industry towards drug development, drug repositioning rises as as a new strategy with reduced risks on the search for antimalarial drugs. In silico chemogenomic approaches previously conducted have identified, based on ligand and target similarity, Epirubicin as a candidate for repositioning as an antimalarial drug. Epirubicin, originally developed to treat cancer, is an anthracyclin approved by the FDA. The present study aimed to validate Epirubicin’s antimalarial activity. Experimental validation started with in vitro fluorimetric assays (SybrGreen) using chloroquine-sensitive (3D7) and multi-resistant (W2 and Dd2) "P. falciparum" strains. Epirubicin demonstrated antiplasmodial activity "in vitro" in nanomolar range (EC50 = 110.7, 68.9 and 99.5 nM, respectively). Cell viability assays in mammalian cell lines (MTT reduction) showed that Epirubicin presents low toxicity (COS-7 and CHO cell lines, CC50 = 5.48 and 4.45µM, respectively), with selectivity indexes of 49.4 and 40.1. Schizont maturation assays identified Epirubicin’s potential to inhibit "P. vivax" isolates with as much potency as chloroquine. We also evaluated the drug’s potential to block parasite transmission using a modified P. berghei line (luciferase expression under specific ookinete promoter). Epirubicin inhibited around 80% of ookinete formation at 1 µM (EC50 = 0.39 µM). Also,mosquito feeding assays in "P. vivax" infected blood by a membrane mimicking skin corroborated Epirubicin’s transmission blocking potential by demonstrating that A. aquasalis mosquitoes had significantly less oocysts found in their midgut after taking a blood meal on an Epirubicin-treated sample. In addition, schizonticidal activity of Epirubicin was evaluated "in vivo" in C57BL/6JUnib mice infected with "P. yoelii" 17XNL, treated with 6 mg/kg of Epirubicin for 4 days. This regimen inhibited approximately 90% of mice parasitemia until the last day of treatment, keeping this inhibition above 60% until the sixth day post-infection. Finally, using synthetic biology, particularly a library screening of heterozygous mutant yeast strains, other possible molecular targets and pathways affected by Epirubicin were introduced beyond the one predicted at first, a gyrase in the apicoplast. Therefore, the results obtained not only show that Epirubicin presents relevant antiplasmodial activity against several parasite strains - including chemorresistant ones, but also validates the drug repurposing strategy as a consistent and suitable option in drug discovery Mestrado Imunologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES 001 FAPESP 2017/02031-1 CNPQ 132980/2071-7

This thesis aims to discuss the relations between the off-label use of medicine and the regulatory procedures by Anvisa. The off-label use is any use and purpose other than that approved in the product registration, a different dosage, posology, route of administration, indication or group of patients. While it is an unavoidable reality in modern health systems, off-label medical prescriptions should meet the needs of a single patient, but eventually results in a medical error. There is no specific regulation for off-label use in Brazil so far, and this situation raises issues especially about the ethical, legal and regulatory implications involved. Understanding the off-label use of medicines is harmonized among the main regulatory agencies, the difference lies in the regulatory treatment given, which in the case of Brazil is not consolidated yet. In this pathway of clarifying the relationship between evidence and regulation regarding the off-label use of drugs within Anvisa, drug redirection arises as a valid strategy that aims to assign new uses to existing, in use or obsolete drugs. The first proposal of regulation on this subject is being presented in this thesis in the form of Technical Note, a regulatory path of mediation and for the moment, necessary and enough. Esta dissertação pretende discutir as relações entre o uso off-label de medicamentos e a regulação pela Anvisa. O uso ¬off-label é qualquer uso e finalidade diferente do aprovado no registro sanitário, diferente dosagem, posologia, via de administração, indicação ou grupo de pacientes. Enquanto constitui uma realidade inevitável nos sistemas de saúde modernos, a prescrição off-label deve atender às necessidades de um determinado paciente, mas pode eventualmente vir a caracterizar erro médico. Não há até o momento, regulamentação específica para o uso off-label no Brasil, e esta situação suscita questionamentos especialmente sobre as implicações éticas, jurídicas e regulatórias envolvidas. A compreensão do que seja o uso off-label de medicamentos se apresenta harmonizada entre as principais agências reguladoras, a diferença consiste no tratamento regulatório dado, o que no caso do Brasil ainda não está consolidado. No caminho do esclarecimento das relações entre evidência e regulação acerca do uso off-label de medicamentos no âmbito da Anvisa, surge o redirecionamento de fármacos como uma estratégia válida que objetiva atribuir novos usos a fármacos existentes, em uso ou obsoletos. A primeira proposta de regulamentação sobre o tema está sendo apresentada neste trabalho em forma de Nota Técnica, um caminho regulatório de mediação e para o momento, necessário e suficiente.

A crise epiléptica prolongada é acompanhada por neurodegeneração, alterações nos biomarcadores relacionados ao dano celular e prejuízos comportamentais, e os antiepilépticos clássicos geralmente não são eficazes em proteger contra estas consequências. O reposicionamento de fármacos, com foco em um medicamento com ação multialvo, é uma solução viável para lidar com a epilepsia refratária e pode fornecer uma alternativa para o gerenciamento das consequências indesejáveis das crises. Antagonistas do receptor de N-metil-D-aspartato exibem ação anticonvulsivante e atuam como neuroprotetores. No entanto, estes compostos demonstraram muitos efeitos adversos inaceitáveis. Apesar disso, a memantina (MN), um antagonista do NMDAR de baixa afinidade, é clinicamente bem tolerado e não produz efeitos colaterais consideráveis. Portanto, o objetivo da presente tese foi investigar o efeito protetor da MN contra a degeneração neuronal, padrão convulsivo, marcadores neuroquímicos e alterações comportamentais a longo prazo, induzidos por modelos químicos de crises prolongadas. Ratos Wistar filhotes receberam MN (20 mg / kg i.p.) em diferentes regimes de tratamento antes e após a indução da crise no modelo de LiCl-pilocarpina. A neurodegeneração foi quantificada por fluoro jade C 24 horas após a crise. Os peixeszebra foram pré-tratados com veículo ou MN (20 ou 50 mg / kg; i.p.) 1 h ou 2 h antes da imersão em solução de PTZ a 10 mM. As análises comportamentais e neuroquímicas foram realizadas 24 horas após a crise. Em CA1, a neurodegeneração diminuiu significativamente quando os ratos jovens receberam MN nos tempos de 0h e 0,25 h. Além disso, o pós-tratamento foi capaz de proteger contra a neurodegeneração na amigdala. O pré-tratamento com MN mostrou uma redução na morte celular no tálamo nos roedores. Já em peixe-zebra, a administração de MN reduziu a expressão relativa do gene grin2A. As crises induzidas com PTZ aumentam a carbonilação de proteínas e a atividade da SOD, e o tratamento com MN impediu essa alteração no estado redox. O peixe-zebra submetido às crises com PTZ apresentou aumento no tempo gasto na zona branca do aparato claro / escuro e a MN preveniu essa anormalidade comportamental. Nossos resultados demonstraram o efeito neuroprotetor da MN na morte neuronal induzida pelas crises no início da vida em ratos. Este efeito foi dependente do tempo e da região cerebral estudada. De fato, a ação anticonvulsivante da MN previne as alterações comportamentais e neuroquímicas relacionadas ao PTZ em peixe-zebra, reforçando o seu uso off-label para tratar as consequências neurocomportamentais da epilepsia. Prolonged epileptic seizure is accompanied by neurodegeneration, damage-related biomarkers alterations and impaired behavior, and the classical antiepileptic drugs are not effective in protect these consequences. Repurposing with focus in a multi-target drug is a viable solution to deal with refractory epilepsy and may provide an alternative for management of undesirable consequences of seizures. Typical N-methyl-D-aspartate receptor antagonists exhibit anticonvulsant action and are currently able to provide neuroprotection against neuronal death. However, these compounds have demonstrated many side effects. Despite this, memantine (MN), a low-affinity NMDA antagonist, is clinically well tolerate and does not induce considerable side effects. Therefore, the aim of the present thesis was to investigate the protectives effect of the MN against neuronal degeneration, seizures pattern, neurochemical seizure markers and long-term behavioral alterations induced by chemical models of prolonged seizures. Wistar pup rats received MN (20 mg/kg i.p.) at different treatment regimens before and after seizure induction in Li-pilocarpine model. Neurodegeneration was quantified by fluoro jade C staining. Zebrafish were pre-treated with vehicle or MN (20 or 50 mg/kg; i.p.) 1h or 2h before immersion into PTZ solution at 10 mM. Behavioral and neurochemical analyses was performed 24 h after seizure. In CA1 subfield neurodegeneration was significantly decreased when animals received MN at 0h and 0.25h post-treatment regimens. Additionally, post-treatment was able to protect against neurodegeneration in amygdala region. MN pre-treatment showed a reduction of cell death in thalamus. MN reduced the relative grin2A gene expression. PTZ-seizure induction increase protein carbonylation and SOD activity, and MN treatment prevented this state redox imbalance. PTZchallenged zebrafish presented increases in time spent in white zone into light/dark apparatus and MN prevented this behavioural abnormality. Our results demonstrated the neuroprotective effect of MN on neuronal loss induced by seizure early in life. This effect was time- and region-dependent. Indeed, anticonvulsant action of MN ameliorates behavioral and neurochemical PTZ-related changes in zebrafish seizure model, reinforcing the off-label use to treat neurobehavioral consequences of epilepsy.

O reposicionamento de fármacos é o estudo da utilização de fármacos para outra indicação do que a originalmente aprovada. Este processo apresenta o potencial de identificação rápida de terapia eficaz contra doenças como câncer e Alzheimer (DA). Vários estudos demonstraram o efeito antitumoral da doxazosina, um bloqueador a1- adrenérgico, e os bloqueadores β1-adrenérgicos têm sido associados à neuroproteção em doenças neurodegenerativas. O câncer e a DA têm uma relação inversa em muitos aspectos, com vários fatores que contribuem para a inibição da apoptose e a proliferação celular sendo aumentados nos cânceres, mas diminuídos na DA. O neuroblastoma (NB) é um tumor pediátrico derivado de células da crista neural embrionária, com uma taxa de cura em torno de 40%, apesar do tratamento agressivo. Os hemangiomas infantis (HIs) são os tumores vasculares mais comuns em bebês. A morbidade pode incluir desfiguração e cicatrizes e, em casos mais graves, perda da visão, comprometimento das vias aéreas, insuficiência cardíaca congestiva, e morte. O NB, o HI e a DA apresentam alterações na via de sinalização de EGFR/Akt/GSK-3b e a descoberta de novos fármacos para o tratamento dessas doenças tem se apresentado como um grande desafio. Assim, no presente estudo investigamos o potencial terapêutico da doxazosina como agente antitumoral contra NB e HI, e como agente neuroprotetor contra a DA. Primeiro, analisamos os efeitos do fármaco em células NB humano SH-SY5Y diferenciadas e indiferenciadas com ácido retinóico e em um modelo in vitro de Da, utilizando culturas organotípicas de hipocampo expostas ao peptídeo b-amiloide (Ab). A doxazosina demonstrou efeito antitumoral em células indiferenciadas de NB por meio da indução de apoptose, necrose, parada no ciclo celular e diminuição dos níveis de p-EGFRTyr1048. Em células diferenciadas, a doxazosina foi menos citotóxica e aumentou os níveis de p- EGFRTyr1048, p-AktSer473 e p-GSK-3bSer9. Além disso, o fármaco foi capaz de proteger as fatias do hipocampo da toxicidade do Ab, através da prevenção da ativação da GSK-3b e da hiperfosforilação da Tau. Em relação ao HI, utilizamos a linhagem celular murina EOMA como modelo. O fármaco foi citotóxico para as células EOMA, mas baixas concentrações de doxazosina aumentaram a migração dessas células. O processo de metástase tumoral envolve diversas fases, entre elas a migração celular e a invasão. Para avaliar se este aumento de migração celular tem relevância biológica para a patologia do HI, é necessário avaliar também o potencial de invasão dessas células. Neste estudo, também padronizamos culturas 3D de esferoides tumorais de células EOMA, o que ainda não foi descrito na literatura. Os esferoides tumorais se assemelham mais ao que ocorre com o tumor in vivo em comparação com as culturas 2D. Observamos que a doxazosina foi capaz de reduzir o tamanho do esferoide tumoral. Ainda, apresentamos nesse estudo resultados preliminares do potencial antitumoral da doxazosina em células WEHI-3B, que são representativas de leucemia mielomonocítica (LMM). A doxazosina foi capaz de induzir a morte das células WEHI-3B após 48h de tratamento. Desse modo, na presente tese demonstramos que a doxazosina apresenta potencial terapêutico não só para tumores como NB, HI e LMM, como também é neuroprotetora em um modelo in vitro da DA. Os nossos estudos estão baseados no reposicionamento da doxazosina para doenças de difícil tratamento, como NB de alto risco e DA, assim como uma doença negligenciada na literatura, como o HI. Drug repurposing is the study of the identification of novel indications for existing compounds. This process holds the potential of rapid identification of effective therapeutics against diseases such as cancer and Alzheimer’s (AD). Several studies have demonstrated the antitumor effect of doxazosin, an alpha-adrenergic blocker, and β1-adrenergic blockers have been associated with neuroprotection in neurodegenerative diseases. Cancer and AD have an inverse relationship in many respects, with several factors contributing to inhibition of apoptosis and cell proliferation being increased in cancers but decreased in AD. Neuroblastoma (NB) is a pediatric tumor derived from embryonic neural crest cells, with a cure rate of about 40%, despite aggressive treatment. Infantile hemangiomas (IHs) are the most common vascular tumors in infants. Morbidity may include disfigurement and scarring and, in more severe cases, loss of vision, impairment of the airways, congestive heart failure and death. NB, IH and DA present alterations in the EGFR/Akt/GSK-3b signaling pathway and the discovery of new drugs for the treatment of these diseases has presented itself as a major challenge. Thus, in the present study we investigated the therapeutic potential of doxazosin as an antitumor agent against NB and IH, and as a neuroprotective agent against AD. First, we examined the effects of the drug on undifferentiated and retinoic-acid differentiated human SH-SY5Y NB cells, and on an in vitro model of organotypic hippocampal cultures exposed to b-amyloid peptide (Ab). Doxazosin demonstrated an antitumor effect in undifferentiated NB cells through induction of apoptosis, necrosis, cell cycle arrest and decreased levels of p-EGFRTyr1048. On differentiated cells, doxazosin was less cytotoxic and increased levels of p- EGFRTyr1048, p-AktSer473 and p-GSK-3bSer9. In addition, the drug was able to protect the hippocampal slices from Ab toxicity by preventing the activation of GSK-3α and of Tau hyperphosphorylation. Regarding IH, we used the EOMA murine cell line as a model. The drug was cytotoxic to EOMA cells, but low concentrations of doxazosin increased the migration of these cells. The process of tumor metastasis involves several phases, with cell migration and invasion among them. To assess whether this increase in cell migration has biological relevance for IH pathology, it is also necessary to evaluate the potential of these cells for invasion. In this study, we also standardized 3D cultures of tumor spheroids from EOMA cells, which has not yet been described in the literature. Tumor spheroids resemble more closely the tumor in vivo compared to 2D cultures. We observed that doxazosin was able to reduce the size of the tumor spheroid. Furthermore, we present preliminary results of the antitumor potential of doxazosin on WEHI-3B cells, which are representative of myelomonocytic leukemia (MML). Doxazosin was able to induce death of WEHI-3B cells after 48 hours of treatment. Thus, in the present thesis we demonstrated that doxazosin presents therapeutic potential not only for tumors such as NB, IH and MML, but it is also neuroprotective on an in vitro model of AD. Our studies are based on the repurposing of doxazosin for difficult-to-treat diseases such as high-risk NB and AD, as well as a neglected disease in the literature, such as IH.

Evidence from previous experimental research has demonstrated the strong relationship between oxidative imbalance and the presence of various symptoms of schizophrenia. The antioxidant properties of alpha-lipoic acid (ALA), used as a adjuvant therapy for schizophrenia, produced positive results in these same studies. The objective of this clinical study was to demonstrate the repositioning of ALA in the treatment of psychotic symptoms, as well as to promote a two-way study from a translational perspective. In this clinical trial, we recorded the evolution of eleven patients diagnosed with schizophrenia and chronic disease who used ALA (100mg / kg) combined with previously prescribed atypical antipsychotic for four consecutive months. At regular intervals, symptoms typical of schizophrenia were assessed using symptom quantification scales (BPRS) and extrapyramidal effects (SAS). We compared cognitive performance at different times (Pre-ALA and Post-ALA) through neuropsychological tests. Oxidative alterations (Glutathione, Nitrite, TBARS / MDA) were measured for evidence of lipid peroxidation. We observed a significant reduction of the negative or disorganized symptoms and of the symptoms of excitation or aggressiveness. There was a significant reduction of extrapyramidal effects after the use of ALA. The performance of working memory was significantly improved at the post-ALA stage. The TBARS / MDA levels had a significant reduction associated with antioxidant action. The results of this study reinforce the therapeutic action of ALA for schizophrenic patients, as well as the transversal research methodology for new drugs involved in the treatment of psychiatric disorders. Evidências de pesquisas experimentais anteriores demostraram a forte relação entre desequilíbrio oxidativo e a presença de diversos sintomas da esquizofrenia. As propriedades antioxidantes do ácido alfa-lipóico (ALA), utilizado como uma proposta de terapia adjuvante para a esquizofrenia, produziram resultado positivos nessas mesmas pesquisas. O objetivo deste trabalho clínico foi demonstrar o reposicionamento do ALA no tratamento dos sintomas psicóticos, além de promover um estudo bidirecional dentro de uma perspectiva translacional. Nesse ensaio clínico, registramos a evolução de onze pacientes com diagnóstico de esquizofrenia e curso crônico da doença, que fizeram uso de ALA (100mg/Kg) combinado com antipsicótico atípico previamente prescrito, durante quatro meses ininterruptos. Em intervalos regulares, os sintomas típicos da esquizofrenia foram avaliados através de escalas de quantificação de sintomas (BPRS) e de efeitos extrapiramidais (SAS). Foram comparados os desempenhos cognitivos em diferentes momentos (Pré-ALA e Pós-ALA) através de testes neuropsicológicos. Alterações oxidativas (Glutationa, Nitrito, TBARS/MDA) foram medidas para evidências de peroxidação lipídica. Observamos redução significativa dos sintomas negativos ou desorganizados e dos sintomas de excitação ou agressividade. Houve redução significativa dos efeitos extrapiramidais após o uso de ALA. O desempenho da memória de trabalho houve significativa melhora no momento Pós-ALA. Os níveis de TBARS/MDA tiveram significativa redução associada à ação antioxidante. Os resultados desse estudo reforçam a ação terapêutica do (ALA) para pacientes esquizofrênicos, assim como a metodologia de pesquisa transversal para novos medicamentos envolvidos no tratamento de transtornos psiquiátricos.

Background: Alzheimer’s disease (AD) is a multifactorial and complex neuropathology that involves impairment of many intricate molecular mechanisms. Despite recent advances, AD pathophysiological characterization remains incomplete, which hampers the development of effective treatments. In fact, currently, there are no effective pharmacological treatments for AD. Integrative strategies such as transcription regulatory network and master regulator analyses exemplify promising new approaches to study complex diseases and may help in the identification of potential pharmacological targets. Methods: In this study, we used transcription regulatory network and master regulator analyses on transcriptomic data of human hippocampus to identify transcription factors (TFs) that can potentially act as master regulators in AD. All expression profiles were obtained from the Gene Expression Omnibus database using the GEOquery package. A normal hippocampus transcription factor-centered regulatory network was reconstructed using the ARACNe algorithm. Master regulator analysis and two-tail gene set enrichment analysis were employed to evaluate the inferred regulatory units in AD case-control studies. Finally, we used a connectivity map adaptation to prospect new potential therapeutic interventions by drug repurposing. Results: We identified TFs with already reported involvement in AD, such as ATF2 and PARK2, as well as possible new targets for future investigations, such as CNOT7, CSRNP2, SLC30A9, and TSC22D1. Furthermore, Connectivity Map Analysis adaptation suggested the repositioning of six FDA-approved drugs that can potentially modulate master regulator candidate regulatory units (Cefuroxime, Cyproterone, Dydrogesterone, Metrizamide, Trimethadione, and Vorinostat). Conclusions: Using a transcription factor-centered regulatory network reconstruction we were able to identify several potential molecular targets and six drug candidates for repositioning in AD. Our study provides further support for the use of bioinformatics tools as exploratory strategies in neurodegenerative diseases research, and also provides new perspectives on molecular targets and drug therapies for future investigation and validation in AD.

Drug discovery is a very expensive and time-consuming endeavor. Fortunately, recent omics technologies and Systems Biology approaches introduced interesting new tools to achieve this task, facilitating the repurposing of already known drugs to new therapeutic assignments using gene expression data and bioinformatics. The inherent role of transcription factors in gene expression modulation makes them strong candidates for master regulators of phenotypic transitions. However, transcription factors expression itself usually does not reflect its activity changes due to post-transcriptional modifications and other complications. In this aspect, the use of high-throughput transcriptomic data may be employed to infer transcription factors-targets interactions and assess their activity through co-expression networks, which can be further used to search for drugs capable of reverting the gene expression profile of pathological phenotypes employing the connectivity maps paradigm. Following this idea, we argue that a module-oriented connectivity map approach using transcription factors-centered networks would aid the query for new repositioning candidates. Through a brief case study, we explored this idea in bipolar disorder, retrieving known drugs used in the usual clinical scenario as well as new candidates with potential therapeutic application in this disease. Indeed, the results of the case study indicate just how promising our approach may be to drug repositioning.

Apresenta-se o desenvolvimento de um método para recuperar proteínas que são alvos drogáveis. A partir da representação desses alvos como vetores definidos a partir das anotações do InterPro, instrumentos da álgebra linear relacionados com a decomposição por valores singulares são utilizados para organizar semanticamente o espaço vetorial e permitir a recuperação eficiente das proteínas similares a uma dada consulta. Relações não observadas prima facie são descortinadas indicando, oportunidades para reposicionamento de fármacos conhecidos, estratégias para o desenvolvimento racional de novos compostos e a predição de potenciais alvos drogáveis e de efeitos colaterais latentes. As assinaturas do InterPro mais relevantes para discriminar alvos drogáveis e não-drogáveis foram determinadas por regressão logística. Os resultados são avaliados estatisticamente por análise de curvas ROC e dados corroborados em outros trabalhos. This work presents the development of a method for recovering target proteins that are druggable. From the representation of drug targets defined as vectors by using InterPro annotations, tools of linear algebra related to singular value decomposition are used to organize the semantic vector space and allow the efficient recovery of proteins related to a given query. Not prima facie relationships arise and indicate drug repositioning opportunities, rational development strategies and, the prediction of potential druggable targets and latent side-effects. The InterPro signatures which are most relevant to drug target/non-drug target discriminating were selected by logistic regression. The results are statistically evaluated by ROC curves analysis and data corroborated in the literature.