Search

A process development from a traditional grain-based fermentation to a defined water kefir fermentation using a co-culture of one lactic acid bacterium and one yeast was elaborated as a prerequisite for an industrially scalable, controllable, and reproducible process. Further, to meet a healthy lifestyle, a low ethanol-containing product was aimed for. Five microbial strains���Hanseniaspora valbyensis, Dekkera bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae, Liquorilactobacillus nagelii, and Leuconostoc mesenteroides���were used in pairs in order to examine their influence on the fermentation progress and the properties of the resulting water kefir products against grains as a control. Thereby, the combination of H. valbyensis and L. mesenteroides provided the best-rated water kefir beverage in terms of taste and low ethanol concentrations at the same time. As a further contribution to harmonization and reduction of complexity, the usage of dried figs in the medium was replaced by fig syrup, which could have been proven as an adequate substitute. However, nutritional limitations were faced afterward, and thus, an appropriate supplementation strategy for yeast extract was established. Finally, comparative trials in 5-L scale applying grains as well as a defined microbial consortium showed both water kefir beverages characterized by a pH of 3.14, and lactic acid and aromatic sensory properties. The product resulting from co-culturing outperformed the grain-based one, as the ethanol level was considerably lower in favor of an increased amount of lactic acid. The possibility of achieving a water kefir product by using only two species shows high potential for further detailed research of microbial interactions and thus functionality of water kefir.

In bioanalytics, the aim is to monitor or identify biological processes. The analytical tools employed depend on nature and concentration of the respective target analytes, as well as the matrix and system under investigation. In beer production, sometimes referred to as humankind’s oldest biotechnology, the goal is to produce a beverage with consistent flavor, which is the result of hundreds of volatiles present in the beverage. In order to quantify flavor compounds in beer and brewing samples, targeted HS SPME-GC-MS assays are most common. However, with the multiplicity of compounds present in brewing samples, the low concentration and reactivity of key aroma compounds, beer flavor analysis remains challenging. In order to improve beer flavor analysis, and in particular to increase sensitivity, robustness, and stability, three novel HS-SPME-GC-MS/MS assays were introduced and validated. Publication A “Analysis of Selected Hop Aroma Compounds in Commercial Lager and Craft Beers Using HS-SPME-GC-MS/MS” deals with the analysis of 16 selected hop aroma compounds covering the most relevant substance classes (terpenes, terpenoids, esters) commonly associated with hoppy beer flavor. With the industry standard HS SPME-GC-MS methods, sufficient extraction and enrichment of volatiles requires maximizing sample volume and extraction times that stresses fiber material and limits fiber lifetime. Using tandem-mass spectrometry, sample volumes can be decreased, which reduces the amount of volatiles adsorbed onto the fiber and consequently prolonged the fiber lifetime. This study indicated that the combination of HS-SPME-GC-MS/MS with suitable stable isotope labelled ISTDs provides an assay with excellent stability that is not affected by e.g. fiber-to-fiber variations. The method development focused on the individual steps of MRM optimization and discussed them in detail. Moreover, the advantages of MRM in the reduction of matrix effects were illustrated. In Publication B “Analysis of Selected Staling Aldehydes in Wort and Beer by GC EI MS/MS Using HS-SPME with On-Fiber Derivatization”, an assay to quantify 15 analytical markers for beer flavor (in)stability was developed. The list of analytes includes lipid oxidation products (e.g., (E) 2-nonenal), products of Strecker degradation (e.g., methional), and so-called heat indicators (e.g., furfural). While the established methodology HS-SPME-GC-MS combined to on fiber derivatization is a good approach regarding a fast sample preparation, the quantification of low abundant aldehydes in GC-MS must be performed in the lowest technically achievable level of quantification. The direct comparison of GC-EI-MS/MS and GC-EI-MS revealed that due to the lower selectivity of SIM mode the quantification of these low abundant aldehydes by MRM mode is more reproducible. As this method is designed to quantify and monitor staling aldehydes from both wort and fresh as well as aged beers, the assay covers a wide concentration range (0.01 1000 µg/L) and should also provide good long-term stability. Hence, the long-term stability, herein defined as peak area consistency of two ISTDs over 24 weeks, across different beer matrices was determined and evaluated as excellent. Publication C “Analysis of Hop-Derived Thiols in Beer Using On-Fiber Derivatization in Combination with HS-SPME and GC MS/MS” is the most complex of the three assays. This relates to the fact that thiols appear in ng/L levels and are very prone to oxidation. In order to achieve quantification via GC-MS, time-consuming multi-step sample preparation procedures, which in some cases involve the handling of mercury containing solvents, are used. By taking advantage of the noise filtering by MRM mode and by using an automated on-fiber derivatization approach, the sample preparation requires minimal manual handling, which improves analysis quality as shown by validation. Whilst in the two above-mentioned publications method development was performed in a stepwise procedure, this method development used a central composite design. Validation of the optimized assay proves its sensitivity (limits of quantification below the sensory threshold of 4MMP, 3MH, and 3MHA) while being more rapid than any of the previously published methods. In conclusion, the three developed HS-SPME-GC-MS/MS assays improved throughput, robustness, and sensitivity of beer flavor analysis. The improved detection sensitivity and selectivity offered by use of triple quadrupole GC-MS/MS resulted in prolonged fiber lifetimes and improved HS-SPME calibration consistency for hop aroma analysis, more reproducible results for low-abundant staling aldehydes as well as excellent long-term stability of the assay. Additionally, the required sensitivity for thiol quantification without extensive sample preparation was achieved. The publications demonstrate that the use of HS-SPME-GC-MS/MS in beer flavor analysis is highly beneficial, thus probably encouraging brewing chemists to adapt these published methodologies. In der Bioanalytik besteht das Ziel darin, biologische Prozesse zu überwachen oder zu identifizieren. Die eingesetzten Analyseverfahren hängen von der Art und Konzentration der jeweiligen Zielanalyten sowie von der Matrix und dem zu untersuchenden System ab. Bei der Bierherstellung, die mitunter als die älteste Biotechnologie der Menschheit bezeichnet wird, ist es das Ziel, ein Getränk mit konstantem Geschmack herzustellen, der das Ergebnis hunderter im Getränk vorhandener volatiler Substanzen ist. Um Aromastoffe in Bier- und Brauereiprozessproben zu quantifizieren, werden meist targeted HS-SPME-GC-MS Assays eingesetzt. Aufgrund der Vielzahl von Verbindungen, die in Brauereiprozessproben vorhanden sind, der geringen Konzentration und der Reaktivität bedeutender Aromastoffe bleibt die Aromaanalytik von Bier eine Herausforderung. Um die Bieraromaanalytik zu verbessern und insbesondere die Empfindlichkeit, Robustheit und Stabilität zu erhöhen, wurden drei innovative HS SPME-GC-MS/MS Assays entwickelt und validiert. Die Publikation A “Analysis of Selected Hop Aroma Compounds in Commercial Lager and Craft Beers Using HS-SPME-GC-MS/MS” beschreibt die Analyse von 16 ausgewählten Hopfenaromastoffen, die die wichtigsten Substanzklassen (Terpene, Terpenoide, Ester) abdecken und die gemeinhin mit einem hopfenbetonten Bieraroma verbunden sind. Die branchenüblichen HS-SPME-GC-MS Methoden erfordern für eine ausreichende Extraktion und Anreicherung von flüchtigen Bestandteilen eine Maximierung des Probenvolumens und der Extraktionszeiten, was das Fasermaterial belastet und die Lebensdauer der Fasern begrenzt. Durch den Einsatz der Tandem-Massenspektrometrie können die Probenvolumina verringert werden, sodass die Menge der an der Faser adsorbierten volatilen Substanzen reduziert und die Lebensdauer der Faser folglich verlängert wird. Im Rahmen dieser Studie konnte nachgewiesen werden, dass die Kombination von HS-SPME-GC-MS/MS und geeigneter, stabil isotopenmarkierter ISTDs einen Assay mit hervorragender Stabilität gewährleistet, der beispielsweise nicht durch Faser-zu-Faser-Schwankungen beeinflusst wird. Die Methodenentwicklung hat sich auf die einzelnen Schritte der MRM-Optimierung fokussiert und diese detailliert erläutert. Außerdem wurden die Stärken des MRM-Modus hinsichtlich der Reduzierung von Matrixeffekten dargestellt. In der Publikation B “Analysis of Selected Staling Aldehydes in Wort and Beer by GC EI MS/MS Using HS-SPME with On-Fiber Derivatization” wurde ein Assay zur Quantifizierung von 15 Analyten zur Beurteilung der (In-)Stabilität des Bieraromas entwickelt. Die Analytliste umfasst Lipid-Oxidationsprodukte (z. B. (E)-2-Nonenal), Produkte des Strecker-Abbaus (z. B. Methional) und so genannte Hitze-Indikatoren (z. B. Furfural). Während die bestehende Messmethodik, HS SPME-GC-MS in Verbindung mit on fiber Derivatisierung, ein guter Ansatz hinsichtlich einer schnellen Probenvorbereitung ist, muss gleichwohl die Quantifizierung von gering konzentrierten Aldehyden mittels GC-MS im untersten technisch zu realisierenden Bereich erfolgen. Der direkte Vergleich von GC-EI-MS/MS und GC-EI-MS zeigte, dass aufgrund der geringeren Selektivität des SIM-Modus der MRM-Modus eine reproduzierbarere Quantifizierung dieser gering konzentrierten Aldehyde ermöglicht. Da diese Methode für die Quantifizierung und Kontrolle von Alterungsaldehyden sowohl aus Würze als auch aus frischen und gealterten Bieren entwickelt wurde, deckt der Assay einen breiten Konzentrationsbereich (0,01-1000 µg/L) ab und sollte zudem eine gute Langzeitstabilität bieten. Daher wurde die Langzeitstabilität, hier definiert als Beständigkeit der Peakflächen zweier ISTDs über 24 Wochen, in verschiedenen Biermatrixen ermittelt und als ausgezeichnet bewertet. Die Publikation C “Analysis of Hop-Derived Thiols in Beer Using On-Fiber Derivatization in Combination with HS-SPME and GC MS/MS” ist der komplexeste der drei Assays. Dies liegt daran, dass Thiole in Konzentrationen von wenigen ng/L vorliegen und sehr anfällig für Oxidation sind. Um eine Quantifizierung mittels GC-MS zu erreichen, werden zeitaufwändige, mehrstufige Verfahren zur Probenvorbereitung eingesetzt, die in manchen Fällen den Einsatz von quecksilberhaltigen Lösungsmitteln beinhalten. Durch die Ausnutzung der Rauschfilterung im MRM-Modus und durch die Verwendung eines automatisierten on-fiber Derivatisierungsansatzes erfordert die Probenvorbereitung nur einen minimalen manuellen Aufwand, wodurch die Qualität der Analyse erhöht wird, wie die Validierungsergebnisse belegen. Während in den beiden zuvor genannten Publikationen die Methodenentwicklung in einem schrittweisen Verfahren erfolgte, wurde bei dieser Methodenentwicklung ein Central Composite Design eingesetzt. Die Validierung des optimierten Assays bestätigte seine Sensitivität (Bestimmungsgrenze unterhalb der sensorischen Schwelle von 4MMP, 3MH und 3MHA) und zugleich seine Schnelligkeit im Vergleich zu allen zuvor veröffentlichten Methoden. Zusammenfassend betrachtet, verbesserten die drei entwickelten HS SPME GC MS/MS Assays den Durchsatz, die Robustheit und die Empfindlichkeit der Bieraromaanalytik. Die verbesserte Nachweisempfindlichkeit und Selektivität, die durch den Einsatz eines Triple-Quadrupol GC MS/MS ermöglicht wurde, führte zu höheren Lebensdauern der Fasern und zu einer verbesserten Konstanz der Kalibrierung mittels HS SPME bei der Hopfenaromen Analyse, zu reproduzierbareren Ergebnissen von gering konzentrierten Alterungsaldehyden sowie zu einer hervorragenden Langzeitstabilität des Assays. Zusätzlich wurde für die Thiolquantifizierung die erforderliche Sensitivität ohne aufwändige Probenvorbereitung erreicht. Die Veröffentlichungen verdeutlichen, dass der Einsatz von HS SPME GC MS/MS in der Aromaanalytik von Bier sehr lohnenswert ist, wodurch Brauereichemiker dazu angeregt werden dürften die veröffentlichten Methoden entsprechend zu nutzen.