Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017. This thesis was fully performed at the National Reference Laboratory for Gastrointestinal Infections, Department of Infectious Diseases, of the National Health Institute Doutor Ricardo Jorge, Lisbon, Portugal under the direct supervision of Dr. Mónica Oleastro in the scope of the Master in Applied Microbiology of the Faculty of Sciences of the University of Lisbon. Clostridium difficile affects patients in hospitals and communities worldwide, is responsible for significant annual mortalities and represents a considerable economic burden on healthcare systems. This bacterium might also be carried asymptomatically in the gut, potentially leading to ‘silent’ onward transmission. Treatment has always been difficult, because the disease is both caused and resolved by antibiotic intake. The two main C. difficile virulence factors are toxins A and B, both of which are pro-inflammatory and enterotoxic in human intestine. Clinically relevant toxin A-negative/toxin B-positive strains that cause diarrhoea and colitis in humans have been isolated with increasing frequency worldwide, namely the multidrug resistant PCR-ribotype (RT) 017. Previous studies documented changes in C. difficile infection (CDI) epidemiology associated with the rapid emergence of antibiotic-resistant strains, highlighting the importance of antimicrobial susceptibility surveillance. The present work describes epidemiological and antimicrobial susceptibility data of C. difficile strains isolated in Portugal. A total of 378 C. difficile strains from 11 Portuguese hospital centres were characterized regarding toxin profile and RT, and part of these strains were also evaluated for its susceptibility to moxifloxacin, vancomycin, metronidazole, rifampicin and imipenem and determinants of antimicrobial resistance. Multilocus variable tandem repeat analysis (MLVA) and whole genome sequencing (WGS) analysis was also performed in a subgroup of epidemic, multidrug isolates. Most of the isolates were toxigenic (91.3%), of which 94.2% had both toxins A and B and 25.8% of them also had a binary toxin. Seventy-five different RTs were identified. RT027, RT014, RT106 and RT017 were the most frequently isolated. There was no evidence of resistance to vancomycin among the 183 tested strains, and reduced susceptibility to metronidazole was rare (2.2%). Resistance to moxifloxacin was evident in multiple RTs, and were mainly from RTs positive for the three toxins, RT027 (18/18), RT126 (8/9) and RT078 (6/12), except the RT017 (19/19), which is toxin A-negative/toxin B-positive. All moxifloxacin-resistant strains exhibited a known mutation in GyrA (Thr82Ile). Rifampicin resistance was found in 11.5% of the 183 strains tested, most from RT017 (19/19) but also in one strain from RT241 and other from RT043. Most rifampicin-resistant strains harbour the previously described mutations in RpoB (His502Asn and Arg505Lys), although one mutation, Ser507Leu, found alone in a resistant strain was not previously described. Of the 181 strains belonging to 57 RTs tested for imipenem susceptibility, only strains from RT017 showing high level of resistance to this antibiotic (MIC > 32 mg/L). The resistance determinants, ermB and tetM genes were present in 34 (10.1%) and in 63 (20.12%) strains, respectively, being that 22 (6.5%) contained both genes. Twenty strains were toxin A-negative/toxin B-positive, 19 of them belonging to the well-known emerging RT017, 11 from hospital A isolated in a short period of time suggesting that an outbreak have occurred, the remaining eight from hospital B, isolated between 2016 and 2017, where this RT seems to be endemic. Overall, these strains were multiresistant, presenting resistance to six of the 10 antibiotics tested: moxifloxacin, rifampicin, imipenem, tetracycline, clindamycin and erythromycin (these two belonging to the MLSB group), with high level of resistance. PCR screening of the resistance determinants showed that all strains harboured the tetM gene, but only the eight strains from hospital B were positive for ermB. Analysis by WGS revealed the presence of the ermG gene in the ermB-negative/MLSB-resistant strains. This gene was found to be in a putative mobile element of 63 kb exclusive of the hospital A clonal cluster. Transformation of a susceptible strain (C. difficile 630Δerm), with a plasmid containing the ermG gene, proved that the presence of this gene provides high resistance to clindamycin and erythromycin in C. difficile. Mutations in penicillin-binding proteins were also observed in all imipenem resistant strains. Phylogenetic analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of RT017 isolates collected from 2012 to 2017 revealed three clusters, each from a single hospital. Subtyping MLVA was also applied to detect the clonal spread of C. difficile belonging to toxin A-negative/toxin B-positive, and the results were overall similar with the WGS analysis. In addition, 74 SNPs variations were found among RT017 strains, namely in proteins involved in antimicrobial resistance and in hypothetical proteins. The current work gives a contribution to the knowledge of the molecular epidemiology and resistance patterns of C. difficile in Portugal. The results presented herein alert to the presence of multidrug resistant strains of RT017 in Portuguese hospitals in endemic and outbreak situations, and indicates the need for adequate use of antimicrobial agents, especially carbapenems, whose resistance was only observed among the strains of this emerging RTs. The lineage of strains from RT017 appears to be constantly evolving, acquiring new resistance determinants, which highlights the need for continued epidemiological and antimicrobial surveillance. The wide variety of RTs found suggests that there are other routes of transmission beyond nosocomial transmission, raising concern about the epidemiological change in this pathogen. As such, other potential sources, particularly in animals, which may also act as a reservoir for C. difficile and antimicrobial resistance determinants, should be investigated in the future. Finally, this study provides the basis for investigating important factors for the spread and persistence of toxin A-negative/toxin B-positive strains, such as studies on the importance of proteins that distinguish these strains, namely the hypothetical proteins. Clostridium difficile é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia estrita e formadora de esporos, que coloniza o cólon. A infeção por C. difficile (ICD) encontra-se principalmente associada ao meio hospitalar e consumo recente de antibiótico, representando um fardo económico considerável para os sistemas de saúde. No entanto, este quadro tem estado a alterar-se, verificando-se um acréscimo na incidência de infeção em populações anteriormente pensadas em baixo risco e sem contacto prévio com o ambiente hospitalar. Esta bactéria foi descoberta em 1935 como parte da microdiota intestinal normal de recém-nascidos, no entanto, a sua importância em doenças em humanos só foi identificada mais tarde, na sequência de múltiplos trabalhos conduzidos na década de 1970, quando esta patologia se tornou mais frequente devido ao aumento no consumo de antibióticos. O espectro da doença clínica varia de diarreia leve a megacólon tóxico, perfuração do colón e morte. No entanto, esta bactéria também pode ser transportada de forma assintomática no intestino, potencialmente levando a transmissão silenciosa. O tratamento da ICD sempre foi difícil, porque a doença é causada e resolvida pela toma de antibióticos. Até a recente introdução da fidaxomicina, o tratamento estava limitado a toma de metronidazol e vancomicina. Nos últimos anos, a ICD surgiu como uma doença proeminente devido a um aumento súbito na ocorrência de surtos, acompanhada por um aumento da gravidade da doença e mortalidade. Esta alteração foi principalmente associada à disseminação de uma estirpe epidémica denominada ribotipo (RT) 027, principalmente caracterizada por uma elevada resistência às fluoroquinolonas, cujo pico de consumo coincidiu com o início da sua propagação epidémica. Ao mesmo tempo, porém, outras estirpes também começaram a emergir com maior virulência. Os dois principais fatores de virulência, e responsáveis pelo desenvolvimento da doença, são as toxinas A e B, ambas pró-inflamatórias e enterotóxicas no intestino humano, algumas estirpes são também caracterizadas pela produção de uma toxina binária. No entanto estirpes de C. difficile clinicamente relevantes com fenótipo toxina A-negativa/toxina B-positiva que causam diarreia e colite, têm sido isoladas com maior frequência em todo o mundo, nomeadamente pertencentes ao RT017, resistentes a múltiplos antibióticos. Embora os agentes antimicrobianos sejam fatores de grande relevância para o desenvolvimento da ICD, a resistência da bactéria não é um pré-requisito para tal, podem sim antecipar uma rápida disseminação dessas estirpes resistentes em ambiente hospitalar, uma vez que um fenótipo de resistência pode conferir uma vantagem seletiva significativa dentro do ecossistema intestinal, facilitando o on-set da ICD logo no início da toma de antibióticos. Deste modo, em termos de prevenção da ICD, é imperativo limitar a propagação de estirpes resistentes de C. difficile, para tal, uma vigilância de fenótipos e genótipos de resistência é essencial. O presente trabalho tem como objetivo fornecer informação atualizada relativamente à epidemiologia molecular e suscetibilidade antimicrobiana de estirpes de C. difficile isoladas de hospitais Portugueses. Para esse fim, um total de 378 amostras de fezes (correspondentes a 374 pacientes diagnosticados com ICD) provenientes de 11 centros hospitalares portugueses foram sujeitas a cultura anaeróbica. As estirpes de C. difficile isoladas destas amostras foram caracterizadas em relação ao perfil de toxinas e RTs; um subgrupo dessas estirpes foi também avaliado quanto à suscetibilidade à moxifloxacina, vancomicina, metronidazol, rifampicina e imipenemo. Alguns determinantes de resistência foram também estudados. A maioria dos isolados eram toxigénicos (91,3%), dos quais 94,2% apresentavam as toxinas A e B sendo que 25,8% desses também possuíam a toxina binária; no total 33 estirpes eram não-toxigénicas. Foram identificados 75 RTs diferentes, sendo os RTs mais frequentes o RT027 (13,8%), RT014 (8,2%), RT106 (6,1%) e RT017 (5,1%). Não houve evidência de resistência à vancomicina entre 183 estirpes toxigénicas testadas, a menor suscetibilidade ao metronidazol também foi rara verificando-se em apenas 4 estirpes (2,2%). A resistência à moxifloxacina foi evidente em múltiplos RTs, 55 de 183 (30,1%) estirpes testadas apresentaram resistência, pertencentes principalmente a RTs positivos para três toxinas, RT027 (18/18), RT126 (8/9) e RT078 (6/12), exceto o RT017 (19/19), toxina A-negativa/toxina B-positiva. Todas as estirpes resistentes à moxifloxacina continham uma mutação já descrita na GyrA (Thr82Ile). A resistência à rifampicina foi encontrada em 11,5% das 183 estirpes testadas, na sua maioria do RT017 (19/19), mas também numa estirpe do RT241 e uma do RT043. A maioria das estirpes resistentes à rifampicina continham mutações na RpoB já descritas (His502Asn e Arg505Lys); a mutação, Ser507Leu, descrita neste trabalho pela primeira vez, foi a única encontrada numa estirpe resistente do RT043. De 181 estirpes, pertencentes a 57 RTs diferentes, testadas quanto à suscetibilidade ao imipenemo, apenas as estirpes do RT017 (19/19) apresentaram resistência a este antibiótico com alto nível de resistência (concentração mínima inibitória ≥ 32 mg/L). Os genes ermB e tetM, determinantes da resistência aos MLSB e à tetraciclina, respetivamente, estavam presentes em 34 (10,1%) e 68 (20,12%) das estirpes testadas, respetivamente, sendo que 22 estirpes (6,5%) continham ambos os genes; a maioria das estirpes (258/338) não continham nenhum destes genes nomeadamente, as estirpes do RT027 (40/41). O gene catD, que confere resistência ao cloranfenicol, não foi encontrado em nenhuma estirpe. Foram identificadas 20 estirpes toxina A-negativa/toxina B-positiva, 19 delas pertencentes ao RT emergente RT017, 11 do hospital A isoladas num curto período de tempo sugerindo que ocorreu um surto, as oito restantes do hospital B, isoladas entre 2016 e 2017 onde esta estirpe parece ser endémica. No geral, essas estirpes revelaram-se multi-resistentes, apresentando resistência a seis dos 10 antibióticos testados: moxifloxacina, rifampicina, imipenemo, tetraciclina, clindamicina e eritromicina (os dois últimos pertencentes ao grupo MLSB). A triagem por PCR dos determinantes de resistência mostrou que todas possuíam o gene tetM, mas apenas os oito isolados do hospital B eram positivos para o ermB. A análise dos dados gerados por sequenciação total do genoma (WGS) das estirpes ermB-negativas/MLSB-resistentes revelou a presença do gene ermG, pela primeira vez descrito em estirpes clínicas toxigénicas de C. difficile. Este gene foi encontrado num putativo elemento móvel de 63 kb e somente nas estirpes associadas ao surto no hospital A. Foi possível verificar que este gene está associado a um alto nível de resistência à clindamicina e eritromicina em C. difficile através da inserção de um plasmídeo contendo o ermG em uma estirpe sensível (C. difficile 630Δerm). Outros genes associados a resistências foram também encontrados neste elemento móvel, como os genes mefA e msrD que conferem resistência aos macrólidos, e um gene que codifica para uma estreptogramina A acetiltransferase que confere resistência à estreptogramina A em outras bactérias, no entanto este grupo de antibióticos não foi aqui testado. Também foram observadas mutações em genes que codificam para as proteínas de ligação à penicilina (PBPs) nas estirpes resistentes ao imipenemo; estas mutações localizam-se próximo dos motivos conservados da PBP1 (Ala555Thr) e da PBP3 (Tyr721Ser). A análise filogenética de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) de isolados do RT017 obtidos de 2012 a 2017 revelou a existência de três grupos clonais, cada um com isolados de um único hospital. A análise de multilocus variable number tandem repeat (MLVA) também foi aplicada para detetar a disseminação clonal de C. difficile toxina A-negativa/toxina B-positiva, e os resultados foram concordantes com a análise de WGS. Além disso, 74 variações de SNPs foram encontradas entre as estirpes do RT017, compreendendo mutações sinónimas e não-sinónimas, nomeadamente em proteínas envolvidas em resistência a antimicrobianos e em proteínas hipotéticas. Em conclusão, embora grande parte do foco de C. difficile tenha sido o RT027, novas estirpes virulentas continuam a emergir, o que requer consideração na vigilância futura. Os resultados aqui apresentados alertam para a presença de estirpes multirresistentes do RT017 nos hospitais portugueses, sugerindo um potencial epidémico para as mesmas. A presença destas estirpes multirresistentes indica a necessidade de uma utilização adequada dos agentes antimicrobianos, nomeadamente dos carbapenemos, cuja resistência só foi observada entre as estirpes deste RT. A linhagem das estirpes do RT017 parece estar em constante evolução, adquirindo novos determinantes de resistência, o que realça a necessidade de uma vigilância epidemiológica e antimicrobiana contínua, bem como a imposição de medidas de prevenção da transmissão de C. difficile no contexto hospitalar, nomeadamente através do diagnóstico e tratamento de todos os pacientes com ICD e restrição de alguns antibióticos. Contudo, a grande variedade de RTs encontrada no geral, sugere que existem outras vias de transmissão para além da transmissão nosocomial, suscitando preocupação com a mudança na epidemiologia deste agente patogénico. Como tal, outras potenciais fontes de infeção, nomeadamente em animais, que também podem atuar como um reservatório de C. difficile e de determinantes da resistência antimicrobiana, devem ser investigadas futuramente. Por fim, este estudo proporciona a base para investigar fatores importantes para a disseminação e persistência de estirpes toxina A-negativa/toxina B-positiva, como por exemplo estudos futuros sobre a importância das proteínas que distinguem estas estirpes, nomeadamente as proteínas hipotéticas. N/A