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A acromegalia é doença insidiosa e desfigurante caracterizada por um crescimento desproporcional dos ossos das mãos, pés e do crânio devido à exposição crônica a altos níveis de hormônio de crescimento (GH) e de seu efetor insuline growth factor 1 (IGF-1). Trata-se de uma doença rara, com incidência estimada de 3-4 casos por milhão, com prevalência de aproximadamente 50 casos por milhão de pessoas. A principal causa da acromegalia é a presença de um tumor hipofisário secretor de GH (somatotropinoma). Caso o somatotropinoma ocorra durante a infância ou adolescência, antes do fechamento das epífises dos ossos longos, a criança crescerá longitudinalmente de forma descontrolada, caracterizando a forma clínica gigantismo. Na grande maioria dos casos a acromegalia se apresenta na forma esporádica, entretanto casos familiais da doença podem ocorrer associados à Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (NEM-1), ao complexo de Carney (CNC) e à acromegalia familial isolada (IFS). Os genes responsáveis pela NEM-1 (MEN1) e CNC (PRKAR1A) foram clonados há mais 10 anos, entretanto etiologia molecular da IFS permaneceu desconhecida até recentemente. Vierimaa et al. (2006) combinaram estudos de ligação por análise de polimorfismos e estudos de expressão gênica e identificaram mutações no gene AIP em famílias com acromegalia não-NEM-1 e não-CNC; além de perda de heterozigose (LOH) nos somatotropinomas dos pacientes com mutação AIP. No presente estudo, investigamos o gene AIP em três famílias brasileiras com IFS e em seus tumores (hipofisários e não-hipofisários). Descrevemos uma nova mutação AIP (Y268X) em uma família brasileira com IFS, confirmando o papel desse novo gene na predisposição a tumores hipofisários. A partir de dados gerados em uma extensa revisão da literatura, sugerimos que os tumores hipofisários familiais isolados são doenças multigênicas que possuiriam um gene principal, mas que sofreriam influência de outros genes/loci ainda pouco caracterizados. Assim, investigamos também o envolvimento de diversos genes/loci candidatos (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 e 2p16) como possíveis moduladores do fenótipo na IFS. Nossos dados sugerem que além da mutação AIP, há necessidade da co-segregação de marcadores localizados em regiões com potencial oncogênico para o desenvolvimento da doença hipofisária. Também apresentamos nesta Tese as primeiras análises de tumores nãohipofisários em pacientes com mutação AIP e encontramos evidências do possível envolvimento de AIP na tumorigênese de um carcinoma funcionante do córtex adrenal de paciente com IFS. Acromegaly is a rare disfigurating and insidious disease characterized by enlargement of hands, feet and skull bones due to excess of growth hormone (GH) secreted by a pituitary tumor (somatotropinoma). The majority of the cases with acromegaly is sporadic, however it may occur in association with inherited disorders as Multiple Endocrine Neoplasia type 1 (MEN1), Carney complex (CNC) and Isolated Familial Somatotropinoma (IFS). The genes associated with MEN1 syndrome (MEN1) and CNC (PRKAR1A) have been described more than a decade ago, however until very recently the molecular etiology of IFS remained unknown. Using a combined strategy of single nucleotide polymorphism (SNP) analysis and gene expression analysis, Vierimaa et al. (2006) described mutations in the AIP gene occurring in families with acromegaly not associated with MEN1 and CNC. In the current study, we investigated three Brazilian families with IFS and were able to describe two germline mutations in the AIP gene, confirming the role of this new gene in the predisposition to familial somatotropinoma. We revised the literature of genetic studies of isolated pituitary adenoma syndromes, which indicated a genetic heterogeneity as well as possible multigenic inheritance for these diseases. Thus, we investigated the role of several genes/loci (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 and 2p16) selected as potentially acting as phenotypic modulators in IFS. Our data indicate that AIP-mutated patients are prone to pituitary disease, however it is necessary the co-segregation of markers located at oncogenic regions to the development of the pituitary tumors and manifestation of the disease. Herein, we also present the first somatic analysis of non-pituitary tumors of AIP-mutated patients. A potential role of AIP, which is implicated in the cAMP pathway, could not be excluded in the development of an adrenocortical carcinoma.

A Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (NEM1, OMIM 131100) é uma doença essencialmente caracterizada por sua complexidade clínica. A NEM1 afeta tanto tecidos endócrinos quanto tecidos não-endócrinos; apresenta tanto tumores malignos quanto tumores benignos; e apresenta extensa variabilidade clínica inter e intra-familiar quanto aos tipos de tumores e quanto à ordem de desenvolvimento e detecção clínica desses tumores. Em sua forma familiar, a NEM1 é transmitida por um padrão de herança autossômico dominante com elevada penetrância e é identificada pela presença de um parente de primeiro grau apresentando ao menos um tumor NEM1-relacionado. A realização do diagnóstico de NEM1 pode ser: a) clínico, pelo reconhecimento em único paciente de tumores em pelo menos duas das três glândulas endócrinas-alvo principais (paratireóides, hipófise e pâncreas endócrino) e/ou b) genético, pela identificação de mutação germinativa no gene responsável pela doença (MEN1). A grande maioria dos casos NEM1 (90%) apresentam mutações inativadoras no gene MEN1. Não há correlações descritas até o momento entre o genótipo e o fenótipo. Não há também regiões preferenciais (hot-spots) para as mutações no gene MEN1. Além disto, há perda de heterozigose nos tumores NEM1, corroborando com a hipótese que o MEN1 seja um gene supressor de tumor. No presente trabalho, objetivamos a) identificar mutações germinativas no gene MEN1 em pacientes índices com NEM1 típica; b) rastrear parentes dos pacientes que se apresentavam sob-risco para NEM1; c) adicionalmente, estimamos preliminarmente alguns dos possíveis impactos deste do rastreamento gênico familiar no seguimento clínico desses pacientes no Hospital das Clínicas, SP. Para identificação das mutações nos casos-índices com NEM1, foi realizado seqüenciamento automático de todas as regiões codificadoras (éxons 2-10) e fronteiras éxon/íntron do gene MEN1. Para o rastreamento gênico dos familiares, foi realizado seqüenciamento direcionado ao éxon mutado no casosíndices. Quatorze (14) famílias brasileiras com NEM1 e 141 familiares sob risco foram estudados clinica e geneticamente. Doze (12) diferentes mutações MEN1 causadoras de doença foram aqui identificadas, sendo que sete (7) dentre estas mutações não haviam sido previamente descritas: 308delC, 375del21, 1243del1, I147F, L413R, L414P e W471C. As famílias com as mutações recorrentes, 360del4 e L413R, não eram relacionadas. Pela análise evolutiva, viu-se que as quatro mutações novas de ponto aqui relatadas estavam localizadas em resíduos altamente conservados, enquanto que as três novas mutações do tipo deleção ocorriam em regiões repetitivas ricas em GCs. Estas mutações são preditas codificarem proteínas truncadas, o que leva a inativação da ação anti-tumorigênica da proteína menin, e portanto, à doença NEM1. Cento e quarenta e um (141) parentes de pacientes sob-risco de apresentarem NEM1 participaram desse rastreamento. Ao todo, 53 indivíduos foram documentados serem portadores de mutação germinativa no MEN1. Os casos geneticamente diagnosticados foram convidados a aderirem ao rastreamento clínico para NEM1. De modo preliminar, estimamos também os eventuais impactos do rastreamento gênico familiar na conduta clínica da NEM1. Assim, os casos afetados foram subdivididos em 3 grupos e analisados separadamente: casos-índices (grupo I), familiares diagnosticados clinicamente (grupo II) e genicamente (grupo III). A idade média ao diagnóstico no grupo III (27±14,0 anos) foi significativamente menor que a dos grupos II (39.5±15.7; p = 0.03) e III (42.4±15.0; p = 0.01). A maioria dos pacientes dos grupos I e II apresentou 2 ou 3 tumores, enquanto que 81,8% dos casos do grupo III apresentavam 1 ou nenhum tumor relacionado à NEM1. Além disto, 45,4% dos casos no grupo III eram assintomáticos, não sendo observados nenhuma metástase ou óbito. Contrariamente, nos grupos I e II havia ocorrência de metástases provindas de tumores NEM1-relacionados e quatro mortes ligadas a tumores NEM1-relacionados foram relatadas. Os 102 familiares que não herdaram mutação MEN1 foram excluídos do rastreamento clínico. Um caso de fenocópia NEM1 foi também localizado. Em conclusão, relatamos no presente trabalho, a) a identificação de sete (7) novas mutações causadoras de doença no gene MEN1, todas elas localizadas ou em regiões evolutivamente conservadas ou em áreas repetitivas em GCs. b) foi aqui relatado o primeiro rastreamento genético sistemático de famílias com NEM1 na América do Sul, no qual 141 parentes de pacientes com NEM1 foram genotipados. Ao todo, 53 pacientes foram caracterizados como portadores de mutações germinativas no gene MEN1. c) estimamos preliminarmente os eventuais impactos do rastreamento gênico familiar na conduta clínica da NEM1. Os dados desse trabalho suportam a necessidade de se implementação de um sistemático programa de rastreamento na NEM1 em nosso País. Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1; OMIM 131100) is a high-penetrance tumor syndrome mainly characterized by the triad: parathyroid (95-100%), pituitary (30%) and enteropancreatic tumors (50%). MEN1 is clinically diagnosed by the occurrence of MEN1-related tumors in at least two of these endocrine glands in a same patient. The familial form of the disease has an autosomal dominant pattern of inheritance and it is identified when a first-degree relative presents at least one MEN1-related tumor. High prevalence of inactivating mutations in the MEN1 has been reported leading to MEN1 syndrome. No mutation hot-spots or genotypephenotype correlations have been observed. In addition, loss of heterozygosity has been found, indicating that MEN1-tumorigenesis is in accordance with Knudson´s classical hypothesis for tumor suppressor genes. This study aimed to characterize clinical features and identify MEN1 germline mutations in Brazilian families with MEN1. Fourteen Brazilian families with MEN1 and 141 at-risk relatives were clinically and genetically studied. Twelve (12) different MEN1 disease-causing mutations were identified, seven of them were previously unreported: 308delC, 375del21, 1243del1, I147F, L413R, L414P and W471C. Families with the recurrent mutations 360del4 and L413R were shown to be unrelated. The four novel missense mutations were found to be located at highly conserved residues by evolutionary analysis, whereas the three novel deletion/frameshift mutations occurred at GC-rich repetitive regions. Familial genetic screening was performed by direct sequencing. Taken together, 53 subjects were found to carry MEN1 germline mutation. To gain preliminary insights on the possible impacts of such familial genetic screening on clinical management of these MEN1 cases, they were separated in three groups: MEN1 index-cases (group I), MEN1 clinically diagnosed at-risk relatives (group II) and genetically diagnosed at-risk family members (group III). The age at the diagnosis in group III (27.0±14.0 y-old) was significantly lower than in groups I (39.5±15.7; p = 0.03) and II (42.4±15.0; p = 0.01). Patients in groups I-II mostly presented two or three MEN1 tumors, while 81.8% of cases in group III presented one or no one MEN1-related tumor. Further, in group III 45.4% of cases were asymptomatic and no metastasis or death were verified. Conversely, in groups I and II, metastases from MEN1-related tumors were frequent and four deaths due to MEN1-related tumors were reported. Moreover, one hundred and two (102) no mutation carriers were excluded of MEN1 surveillance, including one MEN1 phenocopy. In conclusion, it is reported the first systematic genetic screening of MEN1 families in South America and seven novel MEN1 disease-causing mutations were identified. Also, this study underscores the need for implementing a systematic MEN1 screening program in Brazil. At our Institution, we have begun to establish such program.

Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN-2) is an inherited tumor syndrome that includes medullary thyroid carcinoma (MTC), primary hyperparathyroidism, pheochromocytoma and other non-endocrine diseases. Since the first RET missense mutations in association with MEN-2 were identified, RET mutation analysis had a great impact in the clinical management of MEN-2, such as in early diagnosis and treatment of MTC. Presently, early total thyroidectomy provides real cure of MTC for cases in which molecular diagnosis has been performed at early ages. After RET mutation identification, family members should be screened for this mutation by using methods as DGGE, SSCP, restriction enzyme, genetic sequencing or mini-sequencing. In this paper, we briefly review our experience with the direct RET gene sequencing and DGGE approaches. In 50 typical MEN-2 patients analyzed using both methods, we found no false results suggesting that DGGE is a reliable screening method for RET proto-oncogene mutation analysis.

Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN2) is an autosomal dominant disease characterized by the presence of medullary thyroid carcinoma, primary hyperparathyroidism, and pheochromocytoma. Multiple endocrine neoplasia type 2 is still an underdiagnosed, or late-diagnosed condition in many areas of the world. Since 1993, when the first missense RET proto-oncogene (RET) mutations were reported in MEN2, up to 46 different RET-causing disease mutations have been described. Since a strong genotype-phenotype correlation exists for MEN2, the detection of RET mutations has produced a major impact in early recognition and treatment of MTC and MEN2. Presently, RET mutation analysis should be performed for all MEN2 cases and their at-risk familial relatives. Further, prophylactic total thyroidectomy is indicated in all cases harboring activating gametic RET mutations. In most RET mutation carriers, prophylactic total thyroidectomy is indicated at ages as early as a few months to 4 years of age, promoting longer survival and improvement of quality of life or even definitive cure. We discuss the large impact of RET proto-oncogene analysis on the clinical management of MEN2 and the role of early RET molecular DNA diagnosis in providing clinicians and surgeons with valuable information that enables them to indicate early total thyroidectomy.

A Neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (NEM1; OMIM 131100) é uma síndrome endócrina hereditária, que envolve tumores nas glândulas paratireóides, pâncreas endócrino/duodeno e hipófise. Mutações germinativas no gene supressor de tumor MEN1 são identificadas em aproximadamente 80% dos casos familiais. Os casos restantes podem apresentar grandes deleções no gene MEN1 (raras), não identificáveis ao seqüenciamento direto, ou mutações em outros genes, ainda pouco conhecidos. Recentemente, mutações germinativas em genes que codificam quinases dependentes de ciclinas, como o gene supressor de tumor p27Kip1, foram identificadas em cerca de 1-2% dos pacientes NEM1 sem mutação no gene MEN1. Esses pacientes apresentam uma clínica similar à NEM1, sendo chamada de NEM-like ou NEM4. Estudos in vitro mostraram que a proteína codificada pelo gene MEN1, MENIN, controla a expressão gênica de p27Kip1, indicando que ambos os genes fazem parte da mesma via celular supressora de tumor. Devido à correlação genótipo-fenótipo ser muito fraca nessa síndrome e à grande variabilidade fenotípica encontrada em pacientes com NEM1 (mesmo entre indivíduos/familiares que possuem mesma mutação no gene MEN1), no presente estudo investigamos a hipótese do envolvimento do gene p27Kip1, e de outro gene supressor de tumor recentemente associado com um fenótipo tumores hipofisários famílias, o gene AIP, como possíveis moduladores de fenótipo entre os pacientes com NEM1 de uma extensa família brasileira com a mutação germinativa MEN1 c.308delC e ampla variabilidade fenotípica. Dentre uma série de variáveis clínicas investigadas, observamos um possível papel modulador de fenótipo do gene p27Kip1 nesta família com NEM1. Foi encontrada associação significante entre o genótipo do polimorfismo p.V109G do gene p27Kip1, localizado em um domínio de ligação com a proteína p38 (que é um regulador negativo de p27 por levar à degradação dessa proteína), com os seguintes aspectos clínicos: maior agressividade do tumor hipofisário (macro vs. microadenomas), precocidade no desenvolvimento do tumor pancreático, e presença de carcinóides e metástases nos pacientes analisados (p< 0,05). Não foi observada nenhuma associação do gene AIP e o fenótipo dos pacientes com NEM1. O presente estudo investigou, pela primeira vez, o status germinativo do gene p27Kip1 em pacientes com mutação MEN1 e identificou uma associação significante em relação à susceptibilidade e agressividade dos tumores na coorte estudada Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) is an inherited tumoral syndrome that involves tumors in the parathyroids, anterior pituitary and in the pancreatic islet(s) cells. Germline mutations in the tumor suppressor gene MEN1 are detectable through direct sequencing in the majority (80%) of the patients with familial MEN1. The remaining patients may present large MEN1 gene deletions, not detectable through direct sequencing, or mutations in other genes, so far largely unknown. Recently, rare mutations in genes that encode cyclin-dependent kinases, as p27Kip1, have been reported in approximately 1-2% of the patients without a MEN1 mutation. These patients were reported as presenting a MEN1-like (or the MEN4) syndrome phenotype. In vitro studies have demonstrated that the protein encoded by the MEN1 gene, MENIN, controls the expression of the p27Kip1 gene and, therefore, these two genes seem to act in the same intracellular tumor suppressor pathway. Due to the lack of genotype-phenotype correlation in MEN1 and the large clinical variability usually observed within unrelated patients carrying the same MEN1 mutation, we hypothesized that p27Kip1 (as well as AIP gene, recently associated with familial predisposition to pituitary tumors) may act as phenotypic modifying gene(s) in the MEN1 syndrome. Herein, we analyzed possible correlations between p27Kip1 genotype and a number of clinical features. We identified significant statistic associations between the p.V109G p27Kip1 polymorphism and phenotype manifestations, indicating a potential role of p27Kip1 in modifying MEN1 phenotype, as follows: pituitary tumor size; early development of pancreatic tumors, and presence of carcinoids and metastasis (p< 0,05). In addition, a possible association with the AIP gene was excluded. The present study analyzed, for the first time, the germline status of p27Kip1 gene in MEN1-mutated patients and identified a potential interaction between the genotype of this tumor suppressor gene in regulating susceptibility and the tumor aggressiveness in MEN1 patients