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La presencia de contaminantes orgánicos peligrosos en los suelos, tales como los pesticidas, representa una amenaza para los seres humanos, los animales y la salud ambiental. Entre ellos, la atrazina (herbicida selectivo) es el segundo pesticida más usado en el mundo, caracterizándose por un elevado potencial de lixiviación y siendo capaz de permanecer en los suelos y las aguas subterráneas durante largo tiempo. Aunque la Unión Europea prohibió la atrazina en 2004, actualmente sigue siendo uno de los pesticidas más frecuentemente encontrados en los suelos y aguas de diferentes ecosistemas europeos. La fitorremediación se define como el uso de plantas para la eliminación de contaminantes del ambiente mediante diferentes mecanismos: absorción, acumulación, inmovilización y/o degradación de contaminantes. Por otra parte, la tecnología de recuperación electrocinética es un tratamiento físicoquímico basado en la aplicación de campos eléctricos de baja intensidad entre diferentes electrodos distribuidos en el suelo de forma adecuada. El campo eléctrico aplicado provoca distintos procesos físicos y químicos (electromigración, electroforesis, electroósmosis, electrólisis y calentamiento electrocinético) que conducen a la separación y extracción de los contaminantes contenidos en el suelo (metales y /o especies orgánicas). La fitorremediación asistida electrocinéticamente (electro-fitorremediación) consiste en la combinación de la fitoremediación y la recuperación electrocinética con objeto de obtener una tecnología capaz de superar las limitaciones de las tecnologías individuales. Esta técnica ya ha mostrado prometedores resultados para la eliminación de metales, aunque, hasta la fecha, no había sido evaluada en profundidad para los suelos contaminados con compuestos orgánicos. Dentro de este marco, en la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la aplicabilidad de la electro- fitorremediación para la eliminación de atrazina de suelos contaminados artificialmente usando diferentes especies vegetales, condiciones de aplicación del campo eléctrico y escalas experimentales. La atrazina fue escogida tanto por su amplia dispersión como por sus propiedades físicoquímicas (se trata de un compuesto moderadamente polar y parcialmente soluble en agua). Junto con la selección de especie vegetales tolerantes a la atrazina y la corriente eléctrica, también se estudió la influencia de los diferentes parámetros relacionados con la aplicación de la corriente eléctrica al suelo (gradiente de voltaje, tiempo de aplicación y modos unidireccional y con cambio de polaridad) en la absorción, degradación y acumulación de atrazina mediante electro-fitorremediación, así como en los cambios sobre las características del suelo (pH, conductividad eléctrica). Por último, otro avance importante realizado en esta investigación fue el escalado (desde la escala de maceta hasta mesocosmos) de la tecnología electro-fitorremediación, aspecto este que no había sido estudiado con anterioridad. Para la consecución de estos objetivos se llevaron a cabo cuatro series experimentales. La Serie Experimental 1 consistió en un ensayo de fitorremediación en maceta cuyo propósito era la selección de especies vegetales capaces de degradar y/o acumular atrazina a diferentes dosis (2, 5 y 10 mg por kg de suelo); se ensayaron cuatro especies: festuca (Festuca arundinacea), raigrás (Lolium perenne), cebada (Hordeum vulgare) y maíz (Zea mays). Como resultado, maíz y raigrás fueron las especies seleccionadas para llevar a cabo los siguientes experimentos de electro-fitorremediación en macetas. La Serie Experimental 2 usó maíz para estudiar la electro- fitorremediación de atrazina a diferentes concentraciones en suelo (0, 5 y 10 mg kg-1) y distintos gradientes de voltaje (0, 2 y 4 V cm-1); el campo eléctrico se aplicó durante 14 días a razón de 4 h al día y cambiando la polaridad cada 2 horas. El raigrás se usó en la Serie Experimental 3, el cual consistió en un experimento cinético de electro-fitorremediación (aplicado a un suelo contaminado con 2 mg kg-1 de atrazina) usando un gradiente de voltaje 1 V cm-1 aplicado durante 20 días a razón de 6 y 24 h al día (con cambio de polaridad cada 2 horas). Finalmente, la última serie experimental (Serie Experimental 4) consistió en el escalado de la tecnología de electro- fitorremediación mediante un experimento a escala de mesocosmos usando raigrás. Las maquetas utilizadas, construidas con PVC reforzado con fibra de vidrio, tenían unas dimensiones de 2.25 (longitud) x 0.49 (anchura) x 0.50 (altura) m y contenían 0.386 m3 de suelo. Se usaron cuatro tratamientos diferentes, a saber, electro-fitorremediación con aplicación de corriente continua unidireccional y con cambio de polaridad, así como remediación electrocinética con los mismos tipos de aplicación del campo eléctrico. La dosis inicial de atrazina usada en todos los tratamientos fue de 2 mg kg-1 mientras que el campo eléctrico fue de 0.6 V cm-1 aplicado de forma continua (en los tratamientos con cambio de polaridad, esta se cambió cada 24 h). Los resultados de la Serie Experimental 1 mostraron que la atrazina puede ser extraída y degradada en los suelos contaminados por las cuatro especies vegetales ensayadas, demostrando que la fitorremediación es más efectiva, en aproximadamente un 10-36%, que la atenuación natural para la eliminación de atrazina del suelo. El maíz fue la especie vegetal con mayor capacidad para acumular la atrazina y sus derivados, alcanzando valores de hasta un 38.4% de la atrazina inicialmente añadida al suelo. La conclusión más relevante de los experimentos de electro-fitorremediación en maceta usando maíz y raigrás (Series Experimentales 2 y 3) fue que la eficacia de eliminación de atrazina del suelo aumentó hasta el 36.5y el 7% para maíz y raigrás, respectivamente, en comparación con los rendimientos obtenidos para la fitorremediación; esto demostró, por tanto, la hipótesis inicial en la cual está basada esta investigación. Solamente 6-34% de la atrazina total eliminada del suelo permaneció en los tejidos de las plantas al final de los experimentos; este hecho, junto con la detección en suelos y tejidos vegetales de concentraciones significativas demetabolitos dealquilados (desetilatrazina y deisopropilatrazina), procedentes de la degradación bioquímica de la atrazina por las plantas y los microorganismos de la rizosfera, sugirieron que la fitodegradación y la rizodegradación en el sistema planta-rizosfera eran los mecanismos más importantes para la descontaminación del suelo. El estudio cinético llevado a cabo con raigrás (Serie Experimental 3) permitió ajustar los datos de concentración de atrazina en el suelo frente al tiempo a una ecuación de pseudo-primer orden; como resultado, se obtuvieron valores de vida media para la atrazina de 8.2, 7.1 y 5.4 días para los tratamientos correspondientes, respectivamente, a tiempos de aplicación de la corriente eléctrica de 0, 6 y 24 h por día. La mejora en la eliminación de atrazina aplicando corriente continua tuvo la contrapartida el descenso en la biomasa observada para las especies vegetales ensayadas. De hecho, esta disminuyó en el rango 9.1-32% dependiendo del gradiente de voltaje eléctrico, el tiempo de aplicación y la especie vegetal. Esto fue atribuido a los cambios observados en el pH del suelo y a la mayor disponibilidad (y toxicidad) de la atrazina provocados por la aplicación de la corriente eléctrica. Sin embargo, la utilización de cambios periódicos de polaridad evitó alcanzar los valores de pH extremos que se observan habitualmente en los experimentos de remediación electrocinética. Los resultados de los experimentos de electro-fitorremediación a escala de maqueta (Serie Experimental 4) mostraron, de forma más clara que los experimentos en maceta, que la atrazina y sus metabolitos fueron transportados de forma efectiva tras aplicar corriente continua, tanto por electroósmosis (desde el ánodo al cátodo) como por electromigración (desde el cátodo al ánodo); de estos dos flujos electrocinéticos, la electroósmosis fue el más significativo a escala de mesocosmos. Además, la presencia de las raíces de las plantas influyó en gran medida en los perfiles 3-D del pH, contenido de agua y concentración de atrazina del suelo, mostrando el papel relevante de las plantas en el proceso. Los resultados de esta serie experimental fueron comparados con los obtenidos anteriormente en los ensayos en maceta. A pesar de las dificultades encontradas para lograr la adecuada semejanza geométrica y operacional entre las instalaciones experimentales de diferente escala, se llevó a cabo un análisis preliminar de los valores de salida de los principales parámetros del proceso de electro-fitorremedación (corriente eléctrica aplicada, carga específica de corriente, atrazina total eliminada, eficiencia específica de eliminación de atrazina, relación de raíz/peso de suelo). Se demostró que, aunque los procesos que tienen lugar en las diferentes escalas son esencialmente los mismos, su extensión podría ser bastante diferente; ello pone de manifiesto las limitaciones de los experimentos a pequeña escala para predecir adecuadamente los resultados en condiciones de campo.

Atrazine (ATR) continues being one of the most frequently detected pesticides in natural waters and soils. In this work, an electrokinetic-assisted phytoremediation pot test (EKPR) was performed for the remediation of an atrazine-spiked soil; a low electric voltage gradient (1 V cm−1) with two different electric field operation times (6 and 24 h per day) was used in combination with ryegrass (Lolium perenne L.). EKPR increased up to 27% and 7% the overall ATR removal from soil as compared to natural attenuation and phytoremediation treatments, respectively. ATR soil concentration vs time curves were fitted to a pseudofirst-order kinetic equation, obtaining ATR half-life values of 8.2, 7.1 and 5.4 days for the treatments corresponding, respectively, to 0, 6 and 24 h day−1 of electric current application. It clearly showed that the ATR removal from soils was enhanced by the electric field. ATR plant accumulation was significantly improved with respect to phytoremediation when the electric current was continuously applied throughout the experiment (24 h day−1); most of the ATR residues were accumulated in the shoot biomass of the ryegrass plants.

El fotoenvejecimiento es un tema de enorme interés socio-sanitario (Kawada, 2011) al ser un proceso patológico común Su manejo clínico y terapéutico implica un alto presupuesto sanitario (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Los países desarrollados invierten sumas millonarias en la investigación de sustancias que eviten o retrasen sus efectos (Gil Ortega,2014). De ahí el interés del desarrollo de modelos experimentales para su estudio, así como el de nuevas medidas de fotoprotección. El primer objetivo de nuestro trabajo correspondió al establecimiento de un modelo de fotoenvejecimiento cutáneo en ratones SKH-1 mediante exposición crónica a RUV; el segundo fue evaluar los posibles efectos protectores de la Astaxantina. Utilizamos 60 ratones SKH1/CRL, expuestos a RUV (98,6% UVA y 1,4% UVB) / 60 minutos / sesión / 3 veces a la semana / 80 sesiones, con un total de 1.688 J/cm2 por animal. Los ratones se dividieron en dos grupos (N= 30): El Control sólo recibió RUV y el segundo, RUV más Astaxantina / oral / 0,05 mg / animal / dia. Dado que en la mayoría de los animales de este grupo no se originaron lesiones neoplásicas al final del experimento (80 sesiones), seguimos aplicando hasta un total de 113 sesiones (2.384,3 J/cm2) a 10 ratones,. Los animales expuestos exclusivamente a RUV Grupo Control presentaron las alteraciones características descritas en el fotoenvejecimiento (100% de carcinomas escamosos), por lo que lo consideramos un modelo experimental idóneo para el estudio de estas patologías. No obstante, encontramos diferencias entre las lesiones de los animales tratados con Astaxantina, respecto a las del Control: el eritema se hacía fijo con aspecto reticulado, 15-16 sesiones mas tarde que en el Control; la presentación del marcado patrón geométrico de la piel (8-10 sesiones); arrugas (15-16 sesiones); engrosamiento cutáneo-lesiones queratósicas (10-12 sesiones) y de las lesiones eritemato-erosivas (5-6 sesiones). Las diferencias más destacables fueron en las lesiones tumorales, ya que solo las presentaron 10 animales del grupo tratado. De los 20 que recibieron 80 sesiones, solo 2 presentaron tumores; y de los 10 que recibieron 113 sesiones, se presentaron solo en 6 a partir de la sesión 100 y en 2 tras la 113. Todas las neoplasias correspondían a carcinomas de células escamosas. Microscópicamente, también encontramos diferencias en las lesiones precancerosas: la displasia en: el 60% de los animales tras la sesión 80 y en el 80% tras la 113; el carcinoma “in situ” en el 25% y el 75% respectivamente, mientras que en los animales del grupo Control se observaban ambos en el 100% de los animales. En el estudio inmunohistoquímico, constatamos un incremento significativo de la tasa de proliferación celular en los tumores del grupo control respecto a los tratados. La expresión de MMP-9 resultó más alta en los tumores de los animales tratados que en los del control. Sin embargo, el inhibidor de metaloproteinasas TIMP-1, se expresó de forma más intensa en el estroma de los tumores de los animales tratados que en los controles, sugiriendo que el tratamiento con astaxantina podría inhibir la progresión tumoral, mediante la inducción de la síntesis de inhibidores de metaloproteinasas en el estroma tumoral. ABSTRACT Photoaging, a common pathological process, is of enormous socio-sanitary interest (Kawada, 2011) and its clinical and therapeutic treatment is expensive (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Developed countries invest enormous sums of money in research into substances to prevent or delay the effects of the process (Gil Ortega, 2014) – hence the interest in developing experimental models for its study and new protection methods. The first objective of our study was to establish a model of cutaneous photoaging in SKH-1 mice chronically exposed to UVR, and the second to evaluate the possible protective effects of Astaxanthin. Sixty SKH1/CRL mice were exposed to 80 sessions of UVR (98.6% UVA and 1.4% UVB) for 60 minutos/session, 3 times per week (total of 1,688 J/cm2 per animal). The mice were divided into two groups (N= 30): the control group, which only received UVR, and a second group, which received UVR and Astaxanthin adminsitered orally at 0.05 mg / animal / day. Since most of the animals of the second group showed no neoplastic lesions at the end of the 80 sessions, the treatment was continued in 10 mice to reach 113 sessions (2,384,3 J/cm2). The control group animals showed the alterations characteristic of photoaging (100% squamous carcinomas), so that the experimental model can be considered ideal for studying such pathologies. However, there were differences in the lesions treated with Astaxanthin compared with the control group: erythema became permanent and showed a reticulated pattern 15-16 sessions later than in the control group; a marked geometric pattern of the skin (8-10 sessions later); swelling and/of queratósicas cutáneo-lesiones (10-12 sessions later); wrinkling (15-16 sessions) and eritemato-erosivas lesions (5-6 sessions later). The most pronounced differences concerned the tumoral lesions, which only appeared in 10 animals of the treated group. Of the 20 animals that received 80 sessions, only 2 showed tumours, while, of the 10 animals that received 113 sessions, tumour growth was evident in 6 after 100 sessions and another 2 after 113 sessions. All the neoplasias corresponded to squamous cell carcinomas. Microscopically, there were also differences in the precancerous lesions observed: dysplasia in 60% of animals after 80 sessions and in 80% after 113 sessions. “In situ” carcinomas were observed in 25 and 75%, respectively of the treated animals. In the control group, on the other hand, both were observed in 100% of the animals. An immunohistochemical study pointed to a significantly higher cell proliferation rate in the tumours of the control group, while MMP-9 expression was higher in the tumours of the treated group. Metaloproteinase TIMP-1 inhibitor expression was greater in the stroma of the tumours of the treated animals, suggesting that treatment with astaxanthin may inhibit tumour progression by inducing the synthesis of inhibitors of metaloproteinases in the tumoral stroma.

El fotoenvejecimiento es un tema de enorme interés socio-sanitario (Kawada, 2011) al ser un proceso patológico común Su manejo clínico y terapéutico implica un alto presupuesto sanitario (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Los países desarrollados invierten sumas millonarias en la investigación de sustancias que eviten o retrasen sus efectos (Gil Ortega,2014). De ahí el interés del desarrollo de modelos experimentales para su estudio, así como el de nuevas medidas de fotoprotección. El primer objetivo de nuestro trabajo correspondió al establecimiento de un modelo de fotoenvejecimiento cutáneo en ratones SKH-1 mediante exposición crónica a RUV; el segundo fue evaluar los posibles efectos protectores de la Astaxantina. Utilizamos 60 ratones SKH1/CRL, expuestos a RUV (98,6% UVA y 1,4% UVB) / 60 minutos / sesión / 3 veces a la semana / 80 sesiones, con un total de 1.688 J/cm2 por animal. Los ratones se dividieron en dos grupos (N= 30): El Control sólo recibió RUV y el segundo, RUV más Astaxantina / oral / 0,05 mg / animal / dia. Dado que en la mayoría de los animales de este grupo no se originaron lesiones neoplásicas al final del experimento (80 sesiones), seguimos aplicando hasta un total de 113 sesiones (2.384,3 J/cm2) a 10 ratones,. Los animales expuestos exclusivamente a RUV Grupo Control presentaron las alteraciones características descritas en el fotoenvejecimiento (100% de carcinomas escamosos), por lo que lo consideramos un modelo experimental idóneo para el estudio de estas patologías. No obstante, encontramos diferencias entre las lesiones de los animales tratados con Astaxantina, respecto a las del Control: el eritema se hacía fijo con aspecto reticulado, 15-16 sesiones mas tarde que en el Control; la presentación del marcado patrón geométrico de la piel (8-10 sesiones); arrugas (15-16 sesiones); engrosamiento cutáneo-lesiones queratósicas (10-12 sesiones) y de las lesiones eritemato-erosivas (5-6 sesiones). Las diferencias más destacables fueron en las lesiones tumorales, ya que solo las presentaron 10 animales del grupo tratado. De los 20 que recibieron 80 sesiones, solo 2 presentaron tumores; y de los 10 que recibieron 113 sesiones, se presentaron solo en 6 a partir de la sesión 100 y en 2 tras la 113. Todas las neoplasias correspondían a carcinomas de células escamosas. Microscópicamente, también encontramos diferencias en las lesiones precancerosas: la displasia en: el 60% de los animales tras la sesión 80 y en el 80% tras la 113; el carcinoma “in situ” en el 25% y el 75% respectivamente, mientras que en los animales del grupo Control se observaban ambos en el 100% de los animales. En el estudio inmunohistoquímico, constatamos un incremento significativo de la tasa de proliferación celular en los tumores del grupo control respecto a los tratados. La expresión de MMP-9 resultó más alta en los tumores de los animales tratados que en los del control. Sin embargo, el inhibidor de metaloproteinasas TIMP-1, se expresó de forma más intensa en el estroma de los tumores de los animales tratados que en los controles, sugiriendo que el tratamiento con astaxantina podría inhibir la progresión tumoral, mediante la inducción de la síntesis de inhibidores de metaloproteinasas en el estroma tumoral., Photoaging, a common pathological process, is of enormous socio-sanitary interest (Kawada, 2011) and its clinical and therapeutic treatment is expensive (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Developed countries invest enormous sums of money in research into substances to prevent or delay the effects of the process (Gil Ortega, 2014) – hence the interest in developing experimental models for its study and new protection methods. The first objective of our study was to establish a model of cutaneous photoaging in SKH-1 mice chronically exposed to UVR, and the second to evaluate the possible protective effects of Astaxanthin. Sixty SKH1/CRL mice were exposed to 80 sessions of UVR (98.6% UVA and 1.4% UVB) for 60 minutos/session, 3 times per week (total of 1,688 J/cm2 per animal). The mice were divided into two groups (N= 30): the control group, which only received UVR, and a second group, which received UVR and Astaxanthin adminsitered orally at 0.05 mg / animal / day. Since most of the animals of the second group showed no neoplastic lesions at the end of the 80 sessions, the treatment was continued in 10 mice to reach 113 sessions (2,384,3 J/cm2). The control group animals showed the alterations characteristic of photoaging (100% squamous carcinomas), so that the experimental model can be considered ideal for studying such pathologies. However, there were differences in the lesions treated with Astaxanthin compared with the control group: erythema became permanent and showed a reticulated pattern 15-16 sessions later than in the control group; a marked geometric pattern of the skin (8-10 sessions later); swelling and/of queratósicas cutáneo-lesiones (10-12 sessions later); wrinkling (15-16 sessions) and eritemato-erosivas lesions (5-6 sessions later). The most pronounced differences concerned the tumoral lesions, which only appeared in 10 animals of the treated group. Of the 20 animals that received 80 sessions, only 2 showed tumours, while, of the 10 animals that received 113 sessions, tumour growth was evident in 6 after 100 sessions and another 2 after 113 sessions. All the neoplasias corresponded to squamous cell carcinomas. Microscopically, there were also differences in the precancerous lesions observed: dysplasia in 60% of animals after 80 sessions and in 80% after 113 sessions. “In situ” carcinomas were observed in 25 and 75%, respectively of the treated animals. In the control group, on the other hand, both were observed in 100% of the animals. An immunohistochemical study pointed to a significantly higher cell proliferation rate in the tumours of the control group, while MMP-9 expression was higher in the tumours of the treated group. Metaloproteinase TIMP-1 inhibitor expression was greater in the stroma of the tumours of the treated animals, suggesting that treatment with astaxanthin may inhibit tumour progression by inducing the synthesis of inhibitors of metaloproteinases in the tumoral stroma.