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Las proteínas son elementos clave para la vida celular que realizan una amplia variedad de funciones, que normalmente dependen de mantener una estructura tridimensional definida. La estructura plegada nativa está en un equilibrio con un gran número de conformaciones desplegadas. Este equilibrio, como cualquier otro, se caracteriza por una constante de equilibrio y una diferencia de energía libre de Gibbs de desplegamiento. El análisis del efecto de las mutaciones sobre este equilibrio tiene enormes implicaciones prácticas y ha sido el principal objetivo del campo de la estabilidad de las proteínas. La comprensión de la estabilidad de las proteínas no solamente sería relevante in vivo para avanzar hacia la medicina personalizada, al entender la desestabilización en variantes proteicas que causan enfermedad, sino también ex vivo, ya que la gran variedad de funciones proteicas permite su uso en procesos industriales, diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, el aumento de la estabilidad de las proteínas permitirá un uso industrial eficiente, aumentando las tasas de conversión, facilitando condiciones de almacenamiento menos exigentes y aumentando la vida útil de los productos basados en proteínas. Inicialmente, la investigación en la estabilidad de proteínas y los efectos de las mutaciones era mayoritariamente experimental, con especial énfasis en la determinación estructural y las medidas termodinámicas de mutantes de interés. Con el avance del entendimiento en este campo, la estabilización de proteínas avanzó en dos direcciones diferentes: estabilizar usando reglas racionales o generar mutantes al azar seguido de una selección de los mismos, siendo esta última aproximación objeto de un Premio Nobel. Con las mejoras en la computación y en el conocimiento del campo, las aproximaciones computacionales para predecir la estabilidad proteica desde la secuencia o la estructura son cada vez más comunes, aunque su capacidad predictiva aún tenga que mejorarse. Esta tesis se centra en estas técnicas computacionales, usando diferentes aproximaciones para diversas aplicaciones, desarrollando nuevos métodos de análisis y evaluando su viabilidad para el uso en la vida real. Dos grupos principales de aplicaciones se distinguen en esta tesis: los relacionados con estabilización y los relacionados con desestabilización. Al tratar la estabilización, su aplicación estaría más relacionada con la producción industrial o con el diagnóstico y tratamiento. Para este objetivo, se ha desarrollado el servidor web Protposer para predecir mutantes potencialmente estabilizantes desde la estructura de una proteína usando principios racionales de estabilización, mostrando un poder predictivo mayor que el software actualmente utilizado. En el caso de la desestabilización, su principal meta es predecir patogenicidad. En este sentido, se han desarrollado en esta tesis aproximaciones con diferente grado de complejidad. La más simple es PirePred, un servidor web pensado para guiar la interpretación de variantes que contiene un metapredictor de la patogenicidad de variantes proteicas basado en un algoritmo de voto mayoritario modificado que mejora los resultados de los programas con el mismo fin. De todas formas, como el poder predictivo de los predictores actuales es limitado, se han desarrollado aproximaciones más complejas basadas en Dinámica Molecular (MD). Las simulaciones de MD son cada vez más populares, pero esta tesis ha mostrado algunas de sus limitaciones principales. Un primer estudio tratando de determinar una conformación parcialmente desplegada, la del glóbulo fundido a pH ácido de la apoflavodoxina de Helicobacter pylori, ha mostrado que las simulaciones clásicas de MD dependen mucho en la selección de campos de fuerza y modelos de agua y que, aun con la selección más realista, no están al nivel de resultados de técnicas de simulación que combinan datos experimentales como los valores φ con las simulaciones, como en las Dinámicas Moleculares Sesgadas (BMD). Además, una estimación del tiempo necesario para simular todas las variantes que surgen de un SNP de todas las proteínas lo suficiente como para predecir su patogenicidad mostró que usando una temperatura de simulación de 25 oC y la potencia de los supercomputadores del Top Ten, el momento óptimo para comenzar estas simulaciones aún queda lejos, en 2052. Sin embargo, simulaciones de Dinámica Molecular de relajación (rMD) preliminares se han realizado en tres escenarios reales (la proteína MeCP2, causante del síndrome de Rett; la proteína c-MyBP-C, causante de la cardiomiopatía hipertrófica; y la proteína Chk2, que predispone a diferentes tipos de cancer), mostrando resultados prometedores, pero que aún necesitan ser pulidos. En general, esta tesis ha mostrado tanto la potencialidad como las limitaciones actuales de los predictores computacionales de la estabilidad de las proteínas, a la par que ha desarrollado nuevas herramientas potentes para la ingeniería de proteínas y el avance hacia la medicina personalizada. Los resultados son prometedores, pero aún no son lo suficientemente buenos como para aplicarse al diagnóstico clínico. Las mejoras en los conjuntos de datos, campos de fuerza, algoritmos de análisis y potencia de cálculo ayudarán a alcanzar ese objetivo. De manera remarcable, esta tesis señala que hay un vacío en la predicción de patogenicidad que no se puede superar sin combinar las predicciones de estabilidad de proteínas con las de función de la misma. Una combinación de ambos métodos permitiría una predicción precisa que podría revolucionar el concepto de medicina personalizada genómica de precisión. Proteins are key elements for cellular life, performing a wide variety of functions, which usually rely on keeping a defined structure. The native folded structure is in an equilibrium with an ensemble of unfolded states and, as every equilibrium, it is characterized by an equilibrium constant and a Gibbs free energy of unfolding. Characterizing these equilibria and how mutations affect them has been the main goal of the protein stability field of study, due to its huge practical implications. Not only would it be relevant in vivo, to understand the destabilization of some disease-inducing protein variants, advancing towards personalized medicine, but also ex vivo, as the wide variety of functions of proteins allow for their use in industrial processes, diagnostics, and therapeutics. A higher protein stability ex vivo would allow for more extreme operation conditions in an industrial workflow, increasing the conversion rate, or for a less demanding storage, increasing the shelf life of protein-based products. Initially, research in protein stability and mutational effects was mostly experiment-driven, with a strong focus on structural determination and thermodynamic measurements of mutants of interest. With progress in understanding this field, protein stabilization advanced in two different directions: stabilization using rational rules and random mutant generation followed by mutant selection, being the latter approach recently awarded a Nobel prize. With the improvements in computation and knowledge, computational approaches for predicting protein stability from sequence or structure are becoming increasingly common, even though their predictive performance yet needs to be improved. This thesis focuses on these computational techniques, using different approaches as suited for different applications, developing new methods of analysis and assessing their viability for real-life use. Two main groups of applications are distinguished in this thesis: those related to stabilization, and those related to destabilization. When dealing with stabilization, their application would be mostly related to industrial production or to diagnostics and therapeutics. For this purpose, the web server Protposer for predicting potentially stabilizing mutants from the structure of a protein using rational stabilization principles has been developed, showing a higher predictive power than currently used software. In the case of destabilization, its main goal is predicting pathogenicity. In this line, approaches of different degree of complexity have been developed along this thesis. The most simple one is PirePred, a web server conceived to guide variant interpretation, which contains a meta-predictor of the pathogenicity of protein variants based on a modified majority vote algorithm that outperforms similar purpose software. However, as the predictive power of current predictors is limited, more complex approaches have been developed based on Molecular Dynamics (MD). MD simulations are becoming increasingly popular, but this thesis has shown some of its main limitations. A first study on determining a partially unfolded conformation, that of the molten globule at acidic pH of the apoflavodoxin of Helicobacter pylori, showed that classical MD simulations rely heavily on the selection of force fields and water models and that even with the most realistic selection, are not in the performance level of simulation techniques that combine experimental data, such as φ values, with simulation, as in Biased Molecular Dynamics (BMD). Additionally, an estimation of the time needed to simulate all variants arising from a SNP of all proteins long enough to predict their pathogenicity showed that, using a simulation temperature of 25 oC and the computational power of the Top Ten supercomputers, the optimal time for starting those simulations is still far, in 2052. However, preliminary relaxation Molecular Dynamics simulations were performed in three real-case scenarios (protein MeCP2, causing Rett Syndrome; protein c-MyBP-C, causing hypertrophic cardiomyopathy; and protein Chk2, predisposing to different types of cancer) and showed promising results, but still need to be polished. As a whole, this thesis showed both the potentiality and the current limitations of protein stability computational predictors, while developing new powerful tools for protein engineering and stepping towards personalized medicine. The results are promising, but they are not good enough yet to be applied in clinical diagnosis. Improvements in datasets, force fields, analysis algorithms and computational power will help these methods to get there. Most importantly, this thesis highlights that there is a predictive gap for predicting pathogenicity that cannot be overcome without combining protein stability predictors with protein functionality predictors. A combination of both methods would allow for an accurate prediction that could revolutionize the concept of precision genomic personalized medicine.

In the present study, a method for detecting protein unfolding events and evaluating protein stability and kinetics from relaxation Molecular Dynamics (rMD) simulations has been fine tuned. In particular, a 2D root mean square deviation (RMSD)-based clustering was performed on trajectories generated by rMD simulations for the protein α3D under a broad range of temperatures and two different force fields: CHARMM27 and AMBER99SB-disp. The half-life of unfolding was measured from the clustering plots and its value was used to compute the conformational stability of the protein extrapolated at 298 K by means of an empirical model previously developed by the research group. Ladder- and ramp-based temperature scanning simulations were also explored to assess the optimum simulation approach in terms of computational resources, accuracy, and adequacy for the kind of protein stability and unfolding kinetics analyses here envisioned. Furthermore, the performance (accuracy and reliability) of the above-mentioned force fields was assessed in estimating protein stability.

La información energética de simulaciones de Dinámica Molecular (DM) ha sido previamente utilizada para el cálculo preciso in silico de la estabilidad proteica de dos proteínas modelo, simplemente simulando sus estados nativo y desplegado. En este trabajo, se utiliza este método testado para el cálculo de la estabilidad proteica de una proteína modelo con un paisaje de estabilidad más complejo, con un intermediario de desplegamiento: la apoflavodoxina de Anabaena sp. PCC 7119. Se han conseguido reproducir in silico, de forma considerablemente exacta (dentro del margen de error), los parámetros termodinámicos de la proteína determinados in vitro, aunque para los cálculos realizados se necesitan las temperaturas medias de desnaturalización, fácilmente medibles in vitro (método “semi-computacional”). Además, la similitud entre los datos in silico e in vitro obtenida contribuye a demostrar tanto la precisión del campo de fuerzas y modelo molecular del agua utilizados en la DM (CHARM22/CMAP Y TIP3P) como la correcta representación del apenas poblado estado intermediario de la apoflavodoxina por parte de un mutante diseñado (PDB ID: 2KQU) y también del estado desplegado de las proteínas por parte de los ensembles generados por ProtSA. Sin embargo, al intentar extender el método al cálculo de la energética de unión de un ligando a una proteína (el FMN a la apoflavodoxina), no se han logrado obtener unos buenos resultados. A pesar de esto, se espera que las herramientas in silico continúen aumentando su precisión en el futuro y también se va a completar la validación de este método utilizando más proteínas modelo, además de volviendo a intentar la simulación de la unión de ligando, aplicando las distintas correcciones propuestas. Con todo, este método constituye una forma precisa y asequible de calcular la estabilidad proteica in silico, con importantes implicaciones en investigación básica y el campo de las proteínas terapéuticas y comerciales.

The increasing ease with which massive genetic information can be obtained from patients or healthy individuals has stimulated the development of interpretive bioinformatics tools as aids in clinical practice. Most such tools analyze evolutionary information and simple physical–chemical properties to predict whether replacement of one amino acid residue with another will be tolerated or cause disease. Those approaches achieve up to 80–85% accuracy as binary classifiers (neutral/pathogenic). As such accuracy is insufficient for medical decision to be based on, and it does not appear to be increasing, more precise methods, such as full-atom molecular dynamics (MD) simulations in explicit solvent, are also discussed. Then, to describe the goal of interpreting human genetic variations at large scale through MD simulations, we restrictively refer to all possible protein variants carrying single-amino-acid substitutions arising from single-nucleotide variations as the human variome. We calculate its size and develop a simple model that allows calculating the simulation time needed to have a 0.99 probability of observing unfolding events of any unstable variant. The knowledge of that time enables performing a binary classification of the variants (stable-potentially neutral/unstable-pathogenic). Our model indicates that the human variome cannot be simulated with present computing capabilities. However, if they continue to increase as per Moore’s law, it could be simulated (at 65°C) spending only 3 years in the task if we started in 2031. The simulation of individual protein variomes is achievable in short times starting at present. International coordination seems appropriate to embark upon massive MD simulations of protein variants.

La α-sinucleína es una proteína intrínsecamente desordenada que puede plegarse de forma errónea y formar agregados amiloides, esto es, estructuras depositadas en el tejido neuronal de afectados por la enfermedad neurodegenerativa de Parkinson. Para que se formen estos agregados se debe dar el auto-ensamblaje de monómeros de proteína en forma, inicialmente de oligómeros y, finalmente, de fibras. El proceso se ha asociado a la inducción y progresión de neurodegeneración, con un papel muy relevante de las especies oligoméricas intermedias en la inducción de toxicidad. Actualmente, se están centrando todos los esfuerzos en encontrar biomarcadores para un diagnóstico precoz de Parkinson, ya que en la actualidad el diagnóstico es por una serie de características fenotípicas que aparecen cuando la enfermedad está ya muy avanzada y sólo se puede confirmar post-mortem. Por este motivo, en este trabajo abordamos el estudio cinético de una serie de compuestos previamente testados que pueden ser adecuados para inhibir la agregación de α-sinucleína y, de esta manera, atrapar algunas de las conformaciones oligoméricas con las que poder desarrollar biomarcadores específicos para un diagnóstico temprano de la enfermedad. Nuestros resultados indican que el compuesto flavonoide quercitina podría ser un candidato plausible para inhibir la agregación amiloide.

El síndrome de Rett es un trastorno neurológico que afecta principalmente al desarrollo y maduración de las neuronas, siendo éste exclusivo para las niñas. Dicho síndrome toma origen en disfuncionalidades de la proteína codificada por el gen MeCP2, provocado por mutaciones deletéreas que afectan directamente a su estructura nativa, y al mal funcionamiento de ésta. Provocando así, efectos tóxicos en la célula por la mala transcripción de proteínas, ya que la función de la proteína afectada es el sileciamiento de otros genes.para estudiar el origen de este trastorno, se eligieron 10 mutaciones en total a lo largo de la hélice alfa, presente en el dominio MBD de la proteína, entre las cuales 8 son patogénicas y 2 benignas. Se modelaron a nivel atómico las mutaciones propuestas y la proteína nativa por medio del método de dinámica molecular, para así optimizar las condiciones de trabajo (en concreto la temperatura, con un óptimo de 360K), utilizando un proceso estándar de preparación, calentamiento, equilibrado y producción. Se analizaron los resultados a partir de dos técnicas distintas de análisis (análisis de las propiedades generales y clustering basado en RMSD-2D). En las 7 mutaciones con resultados fiables, se ha obtenido un acierto en la predicción del 85%.

Increasing the stability of proteins is important for several applications, such as the production and storage of diagnostic kits and antibodies for therapeutic use or the industrial enzymatic catalysis in processes at high temperature. For this reason, several approaches have been used to predict the effects on stability of a mutation. However, all current programs can only predict the effect of a mutation given by the user. In this Master thesis, a method based on simple rational and empirical rules that both proposes mutations and predicts qualitatively their effect in stability is developed. Rules used for this program focus both on structural features (composition of alpha-helices, disulphide bonds, exposed acidic hydrogen-bonded residues, overexposed apolar residues, buried polar residues, steric clashes and internal cavities) and on the sequence of the protein (calculation of a consensus and an ancestral sequences). Mutations are then evaluated with a logistic regression model trained using machine learning techniques with a training group obtained from ProTherm database. The accuracy of the model is tested with another group of mutations obtained in ProTherm, reaching a higher accuracy than current methods. Finally, a user-friendly input and output format is developed for a general use of the program in research. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Aumentar la estabilidad proteica es importante para diversas aplicaciones, como la producción y almacenamiento de kits diagnósticos y anticuerpos con uso terapéutico o la catálisis enzimática en procesos industriales a alta temperatura. Por ello se han usado diversas aproximaciones para predecir los efectos en la estabilidad de una mutación. Sin embargo, los programas actuales solo predicen el efecto de una mutación introducida por el usuario. En este trabajo fin de Máster, se ha desarrollado un método basado en reglas empíricas y racionales simples que propone mutaciones y predice cualitativamente su efecto en la estabilidad. Las reglas utilizadas en el programa comprenden tanto propiedades estructurales (composición de hélices alfa, puentes disulfuro, residuos ácidos expuestos con puentes de hidrógeno, residuos apolares hiperexpuestos y polares enterrados, choques estéricos y cavidades internas) como de la secuencia (cálculo de las secuencias consenso y ancestral). Posteriormente, las mutaciones son evaluadas con un modelo de regresión logística entrenado mediante machine learning con un grupo de mutaciones obtenido de la base de datos ProTherm. La precisión del programa se calcula con otro grupo de mutaciones de ProTherm, alcanzando valores superiores a los de los métodos actuales. Finalmente, se han desarrollado formatos de entrada y salida de información sencillos para que cualquier usuario básico del campo de la investigación lo pueda usar.

Streptococcus pneumoniae, causante de neumonía, otitis media, meningitis y bacteremia provoca más de un millón de muertes anuales y en un 25% de los casos, secuelas a nivel neurológico. Actualmente, la terapia contra este patógeno se basa en la administración de antibióticos y vacunas polivalentes dirigidas contra los serotipos más comunes, conocidos como “serotipos pediátricos”. La elevada diversidad genotípica y fenotípica de Streptococcus pneumoniae impide su erradicación, por ello es necesaria la búsqueda de una nueva diana terapeútica para combatir las infecciones causadas por este patógeno. En este proyecto de investigación, se realiza un cribado de 1120 compuestos dirigidos contra una proteína implicada en el metabolismo de metionina de Streptococcus, flavodoxina. La expresión del gen de flavodoxina se ha reportado como esencial en la supervivencia e invasividad de la bacteria a través de estudios de expresión génica durante la fase infectiva de Streptococcus. Su función esencial en el metabolismo bacteriano, la inexistencia de un homólogo proteico en humanos y la ausencia de variabilidad genotípica conducen a la elección de flavodoxina como posible diana terapeútica. A través del estudio de interacción proteína-ligando efectuado mediante el análisis de sus curvas de desnaturalización térmica (thermal-shift assay) se consigue identificar un compuesto que aumenta la estabilidad proteica de flavodoxina (Tm), L-Tiroxina. Los estudios de ITC (isothermal titration calorimetry) realizados para confirmar la interacción entre L-Tiroxina – SpFld fueron favorables, obteniendo valores de KD razonablemente buenos.

This PhD Thesis titled "A Bioinformatics Study of Protein Conformational Flexibility and Misfolding: a Sequence, Structure and Dynamics Approach" comprises the results and conclusions obtained by us from the study of three different but somehow related research projects, covering aspects of the phenomenon of protein local conformational instability, its relationship with protein function, evolvability and aggregation, and the effect of genetic variations on protein conformational instability related to Conformational Diseases. These projects include the prediction of putative prion proteins in complete proteomes and the study of prion biology from a genomic perspective, the prediction of conformationally unstable protein regions and the existence of a structural framework for linking conformational instability to folding and function, and the establishment of a rationale for assessing the connection among mutations and disease phenotypes in Conformational Diseases. Esta tesis doctoral comprende los resultados y conclusiones obtenidos por nosotros a partir del estudio de tres proyectos de investigación diferentes pero de alguna manera relacionados, cubriendo los aspectos del fenómeno de la inestabilidad conformacional local de la proteína, su relación con la función de la proteína, la capacidad de evolución y agregación, y el efecto de las variaciones genéticas en la inestabilidad conformacional de la proteína relacionados con las enfermedades conformacionales. Estos proyectos incluyen la predicción de presuntas proteínas priónicas en proteomas complejos y el estudio de la biología de priones desde una perspectiva genómica, la predicción de las regiones de proteínas conformacionalmente inestables y la existencia de un marco estructural para la vinculación de la inestabilidad conformacional del plegado y la función, y el establecimiento de una razón fundamental para la evaluación de la relación entre las mutaciones y fenotipos de la enfermedad en enfermedades conformacionales.

Helicobacter pilori es una bacteria que coloniza el epitelio gástrico con una alta prevalencia. Su infección no suele producir trastornos, pero cuando lo hace abarcan desde gastritis y úlceras gastricas hasta cancer de estómago. La aparición de resistencias a antibióticos hace del desarrollo de nuevos fármacos una empresa necesaria. La flavodoxina de H pylori es crucial para la supervivencia del microorganismo y tiene particularidades estructurales que la distinguen de otras flavodoxinas, convirtiendo a esta proteína en una diana terapéutica muy interesante. Este trabajo busca complementar las investigaciones previas realizadas in vitro con anterioridad utilizando métodos computacionales para aportar luz acerca del mecanismo de unión-disociación del cofactor con la proteína.

El receptor de lipoproteínas de baja densidad (rLDL) es una proteína de membrana que juega un papel crucial en el mantenimiento de concentraciones adecuadas de colesterol en el organismo. Su disfunción se asocia con la aparición de Hipercolesterolemia Familiar (HF), una enfermedad común caracterizada por altos niveles de colesterol en los vasos sanguíneos. El mecanismo por el cual el receptor lleva a cabo la internalización de las lipoproteínas a las células y su posterior liberación en los endosomas sigue siendo hoy en día de gran interés para entender en segundo lugar disfunciones del receptor asociadas a HF. Entre los distintos dominios del receptor, se encuentra el dominio de unión a ligando, compuesto a su vez por 7 repeticiones homólogas de unos 40 aminoácidos, conocidas como módulos LR (1-7) de los cuales los números 4 y 5 son los directamente implicados en la unión con las lipoproteínas. Todos ellos requieren la presencia de Ca2+ para adoptar una conformación estable y mantener a las LDL unidas. En este trabajo se expone un estudio de las propiedades del módulo 4 y el tándem 4-5 con objeto de estudiar sus diferencias conformacionales en presencia y ausencia de Ca2+ y Mg2+ tanto en condiciones extracelulares (pH 7) como endosomales (pH 5.5), donde se produce la liberación. Entre los estudios llevados a cabo en este trabajo, se encuentran en su mayoría ensayos cinéticos de asociación y disociación, realizado mediante el sistema de flujo detenido, de los módulos LR4 y LR5 con Ca2+y Mg2+en ambas condiciones que en algunos casos se complementan con otras técnicas termodinámicas. Por otro lado, en el trabajo también se lleva a cabo la purificación y una caracterización espectroscópica preliminar del dominio de unión a ligando completo LR (1-7).

Las proteínas son las encargadas de llevar a cabo un gran diversidad de funciones en lo seres vivos, pero solamente serán capaces de realizarlas si adoptan la conformación adecuada. Conocer cómo es su estabilidad y cómo poder aumentarla, tiene gran interés desde varios puntos de vista: biológico (conocimiento de la Biología molecular), industrial (es común la utilización de enzimas en condiciones no fisiológicas) y biomédico (numerosas enfermedades están causadas por proteínas mal plegadas). La proteína de estudio seleccionada para este trabajo fin de máster fue la flavodoxina de Anabaena PCC7119, la cual se ajusta a un modelo de 3 estados en el proceso de desnaturalización térmico, presentando un intermediario, mientras que en el proceso de desnaturalización químico con urea se ajusta a un modelo de 2 estados. Se diseñaron de manera racional una batería de mutantes (unos basados en la WT y otros en el triple mutante E20K/E72K/D126K), con los que se pretendió conseguir de una flavodoxina mutante en la que ya no se poblara el intermediario. Se realizaron estudios de caracterización espectroscópica mediantes espectros de absorbancia UV-Visible, dicroísmo circular en el cercano, lejano y emisión de fluorescencia a 25ºC y 90ºC. También se realizaron estudios comparativos de su estabilidad, tanto de manera química como térmica, en relación con la de la WT y la del triple mutante E20K/E72/D126K. Las proteínas que se ajustaron a un modelo de 2 estados en el proceso de desnaturalización térmica mediante técnicas espectroscópicas fueron seleccionadas para realizar un estudio mediante calorimetría diferencial de barrido, obteniéndose claramente una flavodoxina mutante en la que ya no se poblaba el intermediario.