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Fig. S25-S2-S19 final. Data plots. (PDF 102 kb)

Country-specific summaries 25–2-19 Tables. (PDF 280 kb)

Questionnaire 27–11-18 final. Clean printout of on-line questionnaire document. (PDF 969 kb)

Table S15 ver 25–2-19 final. (DOCX 43 kb)

Table S1 to S14 ver 25–2-19 final. Tabulated results. (PDF 445 kb)

The leader peptide of a recombinant MnSOD, conjugated to cisplatin, facilitates delivery of cisplatin into endometrial adeno-carcinoma cells (HBT-112) cells. Clonogenic tests on both, normal (MRC-5) and (HBT-112) cancer cells were made in the presence of rMnSOD-Lp, cisplatin alone or cisplatin conjugated to the rMnSOD-Lp (rMnSOD-Lp-CC). The amount of platinum delivered into the cells was measured through atomic spectrophotometric absorbance. The effects of drug treatments on tumor cells were finally evaluated by light (LM) and (TEM) microscopy. By using 0.5 ,M cisplatin alone on tumor cells, its cytotoxic effect resulted minimal, while in the same concentration of rMnSOD-Lp-CC, no tumor cells survived. The atomic absorbance analysis showed that rMnSOD-Lp-CC delivered approximately 5 times more cisplatin into HTB-112 cells than the amount delivered using cisplatin alone. It is worthy to note that rMnSOD-Lp resulted not toxic at all on all tested cells. By observation at LM, the cells treated with rMnSOD-Lp-CC proved signs of nuclear and cytoplasmic fragmentation, i.e. apoptosis induced by the treatment, as confirmed by TEM analysis. We retain that rMnSOD-Lp deserves to be considered as a molecular carrier to deliver cisplatin directly into tumor cells, and transforming its antireplicative activity in a specific and selective antitumor agent.

Purpose: The subgroup of High-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL) remains one of the greatest challenges in pediatric oncology. Current treatments are still based on chemotherapy whose mechanism of action is non specific and which has a narrow therapeutic index. The LSA-rMnSOD, is an isoform of MnSOD secreted by liposarcoma cells and produced as recombinant form, showing an oncosuppressive action in some cancer cells. In this study, we have investigadet a potential imbalance in pro survival signaling at diagnosis and after rMnSOD treatment on both B and T leukemic cells of high-risk pediatric patients to define the mechanisms underlying the semi-autonomous proliferation leading to leukemia. Method: Lymphoblastic cells, cultured in RPMI medium, supplemented with 1% PEN STREP and 10% BSA, at 370 C were treated for 5 hours with rMnSOD. The internalization of the rMnSOD (scalar concentrations tested: 20-0.2 μg/μL,), in leukemic cells, was demonstrated by the immunocytochemistry at light and electron microscopy. Proliferation tests (MTT and Tripan Blue assay) and western blot were used to evaluate the modulation of proteins (Bcl-2, Bax, AKT,pAKT, ERK, and pERK) after treatment. Results: Optical and electronic observations confirmed , in the samples treated with 2 μg/mL, the early signs of apoptosis such as an initial nuclear and cytoplasmic fragmentation, major modulation of proapoptotic Bax and a negative modulation of anti apoptotic Bcl2. Conversly, we observed in ALL B-HR a down phosphorylation of AKT and ERK respect to diagnosis with a decrease in proliferation (MTT= 27%) In ALL T-HR none variation was observed after treatment. Conclusion: rMnSOD could be an innovative anti-cancer drug expecially for the treatment of high-risk leukemia in emerging target therapies because of its action in pro survival signaling.

High-risk (HR) pediatric acute lymphoid leukemias (ALL) B and T cells have poor prognosis: a complete remission can be achieved with complex protocols1. In this study, the rMnSOD action was tested on pediatric B and T high-risk ALL cells. LSA-rMnSOD, the recombinant isoform of SOD secreted by liposarcoma, exerts an oncosuppressive action5. The internalization of rMnSOD at scalar concentrations (20- 0.2 μg/mL) in leukemic cells was demonstrated by LM and TEM immunocytochemistry. Proliferation tests was studied by TB and MTT assay. The intense immunolabeling after 20 μg/mL rMnSOD-treatment decreased as concentrations were reduced. Early signs of apoptosis were detectable with a major modulation of proapoptotic Bax and a negative modulation of anti apoptotic Bcl-2. Conversely, we observed in ALL B-HR a down phosphorylation of AKT and ERK respect to diagnosis, with a decrease in proliferation (MTT= 27%). In ALL T-HR none significative variation was observed after treatment. Thus, rMnSOD enters in leukemic cells, suppressing, by high concentrations of H2O2, their proliferation 6. Biomolecular detection of apopototic proteins showed that the 2μg/mL was most effective dose of rMnSOD able to trigger apoptosis of leukemic cells. rMnSOD could become an innovative anti-cancer drug for treatment of high-risk leukemia in emerging target therapies because of its action in pro survival signaling.

Allo scopo di valutare l’efficienza della risposta immunitaria nella tartaruga marina Caretta caretta, specie a rischio di estinzione, frequentemente soggetta ad infezioni di varia natura, si è proceduto alla iniziale identificazione citofluorimetrica delle sottopopolazioni linfocitarie e alla rivelazione immunocitochimica del marcatore molecolare per i linfociti T. Strisci di sangue periferico da 5 esemplari, sono stati colorati con MGG. Il buffy coat, ottenuto mediante Ficoll, è stato utilizzato per l’analisi citofluorimetrica, per l’identificazione immunocitochimica e per Western blotting con Ab anti-CD3 dei linfociti T e per l’osservazione ultrastrutturale delle popolazioni linfocitarie al TEM. L’analisi citofluorimetrica del sangue in toto ha evidenziato 6 popolazioni cellulari, tra cui linfociti piccoli e grandi, rotondi ad elevato N/C (4-8 μm), oppure con maggiore estensione citoplasmatica (9-12 μm). Circa il 75% dei linfociti CD3+. Al TEM, sono osservabili gli organuli tipici dei linfociti dei mammiferi.I linfociti di Caretta caretta, al MO ed al TEM, presentano morfologia simile a quella dei linfociti dei mammiferi e degli altri vertebrati studiati. La presenza di linfociti CD3+ e CD3- dimostra che anche in Caretta caretta sono presenti le 2 sottopopolazioni linfocitarie B e T.

La leucemia linfoblastica acuta(LLA) è la neoplasia pediatrica più frequente. Sebbene molti progressi siano stati fatti ancora oggi il 30% va incontro a ricadute dopo un primo trattamento. Le basi molecolari della farmacoresistenza non sono ancora del tutto note.Dati recenti indicano che l’upregulation di Bcl-xL,Erk1 e AKT attivate possa essere associata alle neoplasie ematologiche (1). Di recente è stata isolata un'isoforma della Manganese Superossido Dismutasi (rMnSOD)con funzione oncosoppressiva, facilmente iniettabile ed in grado di essere internalizzata in tutte le cellule, normali e tumorali dove, trasforma i radicali liberi in H2O2. Solo le cellule normali possono convertire il perossido in ossigeno molecolare ed acqua, mentre quelle tumorali ,carenti di catalasi, muoiono per apoptosi Anche nelle leucemie è stata osservata una carenza di catalasi.La proteina rMnSOD è risultata protettiva per le cellule e tessuti normali e citotossica per quelle tumorali(2). Essa entra nelle cellule attraverso il suo peptide leader, non clivato,che costituisce perciò il suo carrier molecolare. Studi recenti effettuati su cellule di carcinoma ovarico, mammario e polmonare utilizzato come carrier coniugato al cisplatino, mostrano che le cellule muoiono per apoptosi rapidamente. Obiettivi 1) Valutare la capacità della rMnSOD o del peptide carrier coniugato al cisplatino o alla epirubicina di essere internalizzati nei blasti leucemici di bambini affetti da LLA e di svolgere una funzione citotossica, come dimostrato su linee tumorali 2) Valutare la modulazione del livello d’espressione di alcuni geni coinvolti nella regolazione dell'apoptosi quali Bax, Bcl2, Bcl-xL e la fosforilazione di AKT e ERK1 prima e dopo trattamento con peptide-cisplatino, peptide-epirubicina e rMnSOD. Materiali e Metodi I blasti leucemici sono stati separati da sangue midollare di bambini affetti da Leucemia Linfoblastica Acuta (LLA) B(n°4) e T (n°4)e 1 campione di linfoma non Hodgkin leucemizzato. Le cellule sono state coltivate in RPMI, FBS 10% e PENSTREP 1%. I test di vitalità utilizzati sono:Trypan Blue e Saggio MTT. Con tecniche immunocitochimiche è stata valutata la internalizzazione delle molecole mediante l’uso di un anticorpo policlonale diretto contro la sequenza del peptide leader della rMnSOD sia in M.O che al TEM. L'analisi quantitativa delle proteine è stata effettuata mediante Western Blotting. Risultati:I dati ottenuti al M.O. e TEM evidenziano una marcata positività citoplasmatica che dimostra l'ingresso del peptide-cisplatino,peptide-epirubicina e della sola proteina rMnSOD nelle cellule leucemiche. L’analisi molecolare sulle cellule leucemiche trattate in vitro in presenza della rMnSOD indica chiaramente che essa esplica un effetto citotossico in maniera dose-dipendente, inducendo l’apoptosi nelle cellule. In particolare nei blasti leucemici di pazienti ad alto rischio e di linfoma leucemizzato ,clinicamente chemioresistente ,provoca una significativa modulazione del gene Bax, principale responsabile del processo apoptotico. La fosforilazione di AKT non sembra essere influenzata dal trattamento con rMnSOD mentre quella di ERK1 è attivata dopo trattamento con rMnSOD nelle LLA a cellule B a basso rischio. Conclusione. Le osservazioni preliminari ottenute in questo studio lasciano ipotizzare un possibile impiego della rMnSOD e del peptide leader quale veicolo piu' efficace di citostatici nel trattamento delle LLA pediatriche. Inoltre l'impiego di citostatici con dosaggi farmacologici minori potrebbe condurre ad una terapia più specifica, selettiva e priva di effetti collaterali.

The manganese superoxide dismutase from lyposarcoma (LSA-MnSOD) is a tumor protein isolated and sequenced, for the first time, in human lyposarcoma cells (LSA) in the Laboratory of Experimental Oncology, Cancer Institute of Naples, G. Pascale, by Dr. Aldo Mancini. This protein showed a rapid and effective anti-cancer activity consisting of a selective cytotoxicity on certain human breast cancer cells (MCF-7), and no cytotoxic effect on normal cells, such as normal human mammary epithelium (MCF-10) and fibroblasts (MRC-5). This protein was sequenced and produced as recombinant form (rMnSOD). The rMnSOD demonstrated the ability to enter both normal and cancer cells and to perform antioxidant activity by neutralizing free radicals, turning them into hydrogen peroxide that only normal cells are able to transform into molecular oxygen and water, due to their normal levels of catalase. In cancer cells – by their well known catalase underproduction, up to 10-100 times, as compared to normal cells – the peroxide can not be converted in oxygen, so that only cancer cells will reach the threshold of toxicity that will cause apoptotic death. The surprising effect of this molecule is, however, due to its ability, following injection in vivo, to penetrate all cells giving off its antioxidant potential, through its enzymatic activity. Both LSA-MnSOD and the rMnSOD were sequenced and compared to the common mitochondrial form. The difference lies in the presence of a leader peptide detected only in LSA–MnSOD, thus explaining the unusual characteristic of the protein of entering cells, while the native protein remains confined to the mitochondrial compartment. So the leader peptide has been synthesized (rMnSOD-LP) and injected in vitro and in vivo, thus demonstrating its ability to enter cells. These experiments highlighted its role as a molecular carrier. Further studies about its carrier function were performed by conjugation of this peptide to radioactive 68Ga and its subsequent injection into animals affected by mammary tumors. PET analysis, performed two hours after injection in animals (dogs and cats), demonstrated internalization of the synthetic construct in the tumor and in its metastasis, thus allowing a more accurate identification in the body. Experiments in progress are demonstrating the ability of the leader peptide to deliver a conjugated cysplatin directly inside the tumor cells (as quantitatively demonstrated by atomic absorption spectrophotometry) and delivering cisplatin toxic load . This internalization rapidly leads to cell death in vitro and in vivo . As a further demonstration of the ability of rMnSOD to repair the damage caused by radical excess, its topical formulation has been used to treat animals affected by extended necrotic lesions, which quickly returned to the structural and functional integrity of all tissues affected by necrosis. More recently, a significant reduction of tissue injury from X ray damage was demonstrated by using MnSOD-plasmid/liposome treatments in the protection of murine lung. The latter studies demonstrated that rMnSOD not only exerts radioprotective effect on normal cells, but it is also radiosensitizing for tumor cells

Lo studio comparato del sangue di vertebrati non mammiferi marini (Golfo di Napoli) e terrestri (Regione Campania) ha evidenziato che Haemogregarina è il parassita più comune in Pesci (Raja clavata, Torpedo marmorata, Scyliorhinus stellaris), Anfibi (Rana esculenta) e Rettili (Lacerta viridis, Podarcis muralis e sicula), osservabile nello 0,2 - 3,0% degli eritrociti. Haemogregarina (6x3 - 12x4 μm) può assumere una forma allungata con nucleo centrale o ad un polo e granuli citoplasmatici o una forma ovale meno frequente. In Raja clavata è stato osservato anche Tripanosoma rajae, plasmatico (33x3 μm) nello 0,2% degli eritrociti. In Rana esculenta sono state osservate anche rickettsie Aegyptianella ranarum (4 μm) nel 2% degli eritrociti. In Python regius è stato osservato Hepatozoon ayorgbor (14x3 μm) nel 2% degli eritrociti. Per la prima volta, sono stati osservati due casi di Teileriosi in Caretta caretta nel 25% degli eritrociti circolanti. In Uccelli (Columba livia) è frequente Haemoproteus (6x3 μm) nel 3% degli eritrociti. Tutti questi parassiti endoeritrocitari causano decentramento del nucleo e, per lo più, aumento del MCV. L’infezione abituale e lo sviluppo di un parassitismo in genere non patogenetico nei vertebrati non mammiferi, rende ragione del numero elevato di eosinofili circolanti in queste specie, anche non parassitate, che nei mammiferi invece è indice di eosinofilia.

The manganese superoxide dismutase (MnSOD) isolated from a human liposarcoma cell line (LSA) was able to kill cancer cells expressing oestrogen receptors, while it did not have cytotoxic effects on normal cells. The oncotoxic activity of the recombinant MnSOD (rMnSOD) was due, likely, to an increase in the level of oxidants in the tumor cells, which have low levels of catalase and, consequently, reach the threshold of toxicity before normal cells. The effectiveness of the rMnSOD in repairing the damage caused by radical excess was further shown by its topical application on necrotic skin. Together with its oncotoxic activity, the rMnSOD exerts a radioprotective effect on normal cells irradiated with X rays. The rMnSOD is characterized by the presence of a leader peptide, which allows the protein to enter cells: this unique property can be used in the radiodiagnosis of cancer or chemotherapy, conjugating radioactive substances or chemotherapic drugs to the leader peptide of the MnSOD. Compared to traditional chemotherapic agents, the drugs conjugated with the leader peptide of MnSOD can selectively reach and enter only the cancer cells, thus reducing the side effects of the traditional treatments.

Theileria è un parassita, phylum Apicomplexa, che infetta prevalentemente bovini, ovini, caprini e pesci, attraverso zecche e sanguisughe, quali vettori. Nell’ambito dello screening ematologico delle tartarughe marine Caretta caretta pervenute presso il Turtle Point della Stazione Zoologica di Napoli, nel sangue circolante di 2 esemplari è stato osservato un parassita, con caratteristiche della famiglia Th eileriidae. I 2 esemplari sono stati monitorati nel tempo con l’esame mocromocitometrico. Sugli strisci di sangue colorati con May Grünwald-Giemsa, sono stati riscontrati vari stadi maturativi del parassita in eritrociti e leucociti; questi ultimi sono stati caratterizzati da reazioni immunocitochimiche per la mieloperossidasi (per gr. eterofi li) e la proteina basica maggiore (per eosinofi li). Nella fase iniziale dell’infezione, sono state osservate solo forme rotondeggianti, simili agli schizonti di Th eileria, negli eterofi li e nei linfociti. Dopo ca. 30 gg, sono state ritrovate forme plasmatiche libere, rotondeggianti, simili ai merozoiti; forme intraeritrocitarie, bacilliformi, presumibilmente merozoiti, in numero mai superiore a quattro per singolo eritrocito, e forme ricurve, simili ai trofozoiti. Negli eritrociti erano presenti anche forme a semiluna, di dimensioni maggiori, tipo gametociti. In ogni caso, non sono state mai osservate alterazioni morfologiche degli eritrociti o decentramento del nucleo. Questo modello di sviluppo, con i merozoiti che non producono mai più di quattro cellule fi glie all’interno di un singolo eritrocito, è caratteristico della famiglia di Th eileria (Levine, 1988). Non sono stati osservati arrangiamenti a croce o a rosetta del parassita, ma il riscontro di forme nei linfociti e negli eterofi li, già osservate in un Osteitto e la progressione temporale dell’infezione (endoleucocitaria in fase iniziale, plasmatica ed endoeritrocitaria in seguito), altra caratteristica della famiglia Th eileriidae (Lainson, 2007), hanno portato alla conclusione che il parassita, rilevato per la prima volta nella tartaruga marina, sia Theileria.

I corpi di Heinz sono inclusioni intraeritrocitarie costituite da precipitati di emoglobina denaturata prevalentemente addossati alla membrana cellulare. In condizioni fi siologiche questi precipitati si osservano nelle emazie giunte al termine del loro ciclo vitale; in condizioni patologiche si riscontrano in caso di anemie emolitiche causate da emoglobine instabili, nella -talassemia o in caso di defi cit di enzimi essenziali ai sistemi ossidoriduttivi del globulo rosso (Spandrio, 1987). Quando i corpi di Heinz derivano da Hb instabili, secondo Winterbourne et al. (1974), precipita l’intera molecola a causa della formazione di emicromi irreversibili. In alcuni casi (Hb Christchurch) i corpi di Heinz non si legano alla membrana plasmatica. È noto, nei Mammiferi, che i macrofagi splenici rimuovono dal circolo gli eritrociti con corpi di Heinz. In alcuni casi, gli eritrociti riescono ad attraversare la milza subendo solo l’asportazione del precipitato (pitting), assumendo un aspetto a lacrima, per essere poi distrutti in seguito (Silvestroni, 1998). Nell’ambito dello screening ematologico della tartaruga marina del Mediterraneo, fi nora condotto su 88 esemplari, è stata riscontrata la presenza di corpi di Heinz negli eritrociti. Con il sangue, prelevato dal seno venoso cervicale con litioeparina, sono stati eseguiti l’emocromo, l’osservazione al MO di strisci colorati con May Grünwald-Giemsa, Rosso Neutro e Blu Brillante di Cresile, e l’osservazione al TEM. I corpi di Heinz sono stati rinvenuti in una percentuale di eritrociti variabile dal 3 all’82% su 28 esemplari in cui sono state studiate le frazioni di Hb. L’osservazione morfologica è stata correlata con l’instabilità dell’Hb in Caretta, precedentemente caratterizzata mediante elettroforesi, HPLC, tests di denaturazione al calore e all’isopropanolo. Solo in 9 esemplari sono stati osservati rari eritrociti dal caratteristico aspetto a lacrima: ciò lascia supporre che, anche nella tartaruga marina, possa avvenire un fenomeno di pitting splenico, con l’eliminazione della sola inclusione dalla cellula che la contiene.

Nell’ambito della sperimentazione clinica, che viene svolta nei paesi industrializzati, si rende necessario porre una specifica attenzione ai criteri etici di riferimento affinché siano salvaguardati i beni e i valori umani fondamentali. Il rischio è che gli interessi commerciali possano nascondersi dietro gli interessi scientifici, danneggiando il benessere psichico del malato e la sua dignità di essere umano. Nei pazienti oncologici la sofferenza fisica, che rappresenta soltanto un sintomo della malattia, determina necessariamente un’alterazione della qualità di vita e può condizionare la vita di relazione. Tutto questo viene ovviamente amplificato quando il malato è un bambino che, talora, è incapace di esprimere, localizzare e quantificare la sua sofferenza. Gli oncologi pediatrici lamentano la mancanza di farmaci antitumorali studiati per i bambini, in considerazione del fatto che i chemioterapici utilizzati nei protocolli di cura degli adulti non sono spesso egualmente efficaci in età pediatrica. Le aziende farmaceutiche hanno poco interesse a sviluppare farmaci per la popolazione pediatrica oncologica per motivi di natura economica, dipendenti dalla esiguità del numero di pazienti pediatrici rispetto alla popolazione adulta. In generale la produzione di farmaci antitumorali alternativi trova resistenza nell’ambito della industria farmaceutica coinvolta nei profitti relativi al mercato dei chemio e radioterapici. Obiettivo primario del mio progetto di ricerca è stato, pertanto, la messa a punto di una terapia non tossica, o a ridotta citotossicità, per la cura delle neoplasie ematologiche in età pediatrica. In particolare l’obiettivo di tale progetto è stato, nella prima fase, testare l’efficacia d’azione, sulle cellule di Leucemia Linfoblastica Acuta (LLA), la patologia più frequente in età pediatrica, del peptide leader della rMnSOD (manganese superossido dismutasi ricombinante) quale carrier di citostatici (cisplatino ed epirubicina) allo scopo di ridurre la dose di citostatico necessaria per una efficace internalizzazione dello stesso nelle cellule tumorali e per ottenerne quindi la morte riducendo gli effetti collaterali. Nella seconda fase, è stata studiata l’azione, sulle cellule in coltura di LLA B e T ex vivo e su una linea stabilizzata, della r-MnSOD, una proteina isolata e sequenziata, per la prima volta, da cellule di liposarcoma umano (LSA) presso il laboratorio di Oncologia Sperimentale dell’Istituto dei Tumori di Napoli, G. Pascale, dal Dott. A. Mancini. Tale molecola ha dimostrato attività antitumorale su altri tipi di tumore. I dati ottenuti in questo lavoro hanno dimostrato che il peptide leader è un buon carrier di citostatici all’interno delle cellule leucemiche, tuttavia i citostatici legati al suddetto peptide non si sono rivelati efficaci nell’indurre la morte delle cellule leucemiche in coltura. Sarà necessario quindi, quale proseguimento della ricerca, testare l’azione di altri citostatici legati al peptide. L’utilizzo del peptide leader coniugato a dosi micro molari di un diverso citostatico, efficace nella LLA pediatrica, potrà, se confermato dai risultati, ottenere una riduzione notevole degli effetti collaterali migliorando la qualità di vita e la prognosi dei pazienti leucemici pediatrici ad alto rischio. Diversamente, il trattamento con l’intera molecola rMnSOD ha dimostrato sia la sua capacità di internalizzazione (dovuta alla presenza del peptide leader) nelle cellule leucemiche di LLA B e T in coltura, che la sua potente azione antitumorale, avendo indotto la morte di un alto numero di cellule leucemiche trattate. É stato, così, dimostrato l’effetto citotossico di tale proteina nei confronti delle cellule neoplastiche trattate e la mancanza di effetti tossici sulle cellule sane di controllo, sulle quali svolge, invece, una benefica ossigenazione. L’entità delle alterazioni morfologiche osservate in microscopia ottica ed elettronica nelle cellule trattate con rMnSOD alla concentrazione di 2 µg/mL ha suggerito che questa sia la concentrazione più efficace, tra quelle sperimentate. Tale dato è stato confermato dai risultati di biologia molecolare: è stata riscontrata, infatti, a seguito del suddetto trattamento, la massima espressione dei geni proapoptotici (Bax) e la minima espressione dei geni antiapoptotici (Bcl-2); ciò a conferma dell’attivazione della via apoptotica nelle cellule leucemiche. Pertanto, la rMnSOD potrebbe rivelarsi un efficace farmaco antitumorale, non tossico come i chemioterapici, per il trattamento delle leucemie ad alto rischio.