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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2021. Este estudo avaliou a presença de mutações no genoma de isolados de Neisseria gonorrhoeae após indução de resistência com cefixima e caracterizou o genoma de Neisseria elongata isolada de paciente com endocardite infecciosa (EI). Para o estudo de indução de resistência, foram selecionados seis isolados clínicos com diferentes genótipos da região da grande Florianópolis e duas cepas de referência (WHO F e WHO Y). Os isolados foram subcultivados com concentrações crescentes do antimicrobiano cefixima. Após a indução, foi determinada a concentração inibitória mínima (MIC) para seis antimicrobianos pelo método de ágar diluição. Os isolados clínicos foram sequenciados antes e após a indução e as cepas de referência somente após a indução utilizando a plataforma MiSeq Illumina. Os genomas dos isolados clínicos antes da indução de resistência foram montados utilizando SPAdes e anotados com Prokka. Para as cepas de referência, foram utilizados os genomas disponíveis no NCBI. Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs), inserções e deleções foram analisados por meio do mapeamento das leituras após a indução nos genomas montados, utilizando bwa. Samtools foi utilizado para manipulação do mapeamento. As variantes foram obtidas com o programa BCFtools e anotadas com o programa SnpEff. A indução foi finalizada após 138 subcultivos, com crescimento de todos os isolados em concentração do antimicrobiano acima do ponto de corte de resistência à cefixima de acordo com o BrCAST. Os isolados M111 e M128 (ST1407) apresentaram diversas mutações na proteína ligadora de penicilina (PBP2) e exibiram os maiores valores de MIC para cefixima dentre os isolados clínicos. M107 e M110 (ST338) não apresentaram mutações nos principais determinantes de resistência às cefalosporinas de espectro estendido (ESC), mas aumentaram em 127 vezes a MIC para cefixima. WHO Y, inicialmente resistente à cefixima, apresentou mutações no gene penB (porina) e nos genes mtrC e mtrD da bomba de efluxo MtrCDE. Para o estudo com N. elongata, foram avaliados os dados clínicos de um paciente com EI (M001) que foi a óbito durante a internação e realizado o sequenciamento do genoma completo do isolado. As leituras do sequenciamento foram utilizadas para recuperar 16 sequências desta espécie disponíveis no NCBI. Os genomas foram montados com SPAdes e Gfinisher e anotados utilizando Prokka. A análise de diversidade entre os isolados foi avaliada utilizando o programa PYANI. O core genoma foi obtido com o programa Roary e os SNPs foram extraídos com SNP-site. A filogenia do core genoma e de proteínas ortólogas foi realizada com o programa RAxML. A presença de genes de resistência e de virulência foi realizada com as bases de dados CARD e VFDB. Os isolados apresentaram uma grande diversidade genética. Dezessete diferentes genes de resistência foram encontrados em todos os isolados de N. elongata, com maior predominância de genes relacionados a sistemas de efluxo. Genes duplicados de pili foram encontrados somente no isolado M001, o que pode predizer uma maior capacidade de virulência. Os resultados obtidos no estudo apontam para aquisição de resistência às ESC por diferentes mecanismos e reforçam a importância do programa de vigilância antimicrobiana de N. gonorrhoeae no Brasil, devido a recente mudança de tratamento e prevalência de STs que podem adquirir resistência a esses antimicrobianos. O estudo genômico de N. elongata associado ao relato de caso, alerta a necessidade de rápida identificação microbiológica e intervenção médica para evitar desfechos desfavoráveis e fornece evidências que podem contribuir para outras investigações biológicas em espécies de Neisseria comensais. Abstract: This study evaluated the presence of mutations in the genome of Neisseria gonorrhoeae isolates after resistance induction to cefixime and characterized the genome of Neisseria elongata isolated from patient with infective endocarditis (EI). For the resistance induction study, six clinical isolates with different genotypes were selected from Florianopolis region and two reference strains (WHO F and WHO Y). The isolates were subcultured with increasing concentrations of the antimicrobial cefixime. After induction, the minimum inhibitory concentration (MIC) for six antimicrobials was determined by agar dilution method. Clinical isolates were sequenced before and after induction and reference strains only after induction using the Illumina MiSeq platform. The genomes of the clinical isolates before resistance induction were assembled using SPAdes and annotated with Prokka. For the reference strains, the genomes available at NCBI were used. Single nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions, and deletions were analyzed by mapping reads after induction onto the assembled genomes using bwa. Samtools was used for mapping manipulation. Variants were obtained with the program BCFtools and annotated with the program SnpEff. Induction was completed after 138 subcultures, with the growth of all isolates at an antimicrobial concentration above the cutoff point for cefixime resistance according to BrCAST. Isolates M111 and M128 (ST1407) had several mutations in the penicillin-binding protein (PBP2) and exhibited the highest MIC values for cefixime among the clinical isolates. M107 and M110 (ST338) showed no mutations in key determinants of resistance to extended-spectrum cephalosporins (ESC) but increased the MIC for cefixime by 127-fold. WHO Y, initially resistant to cefixime, showed mutations in the penB (porin) gene and in the mtrC and mtrD genes of the MtrCDE efflux pump. For the study with N. elongata, the clinical data of one patient with EI (M001) who died during hospitalization were evaluated and the whole genome sequencing of the isolate was performed. The sequencing reads were used to retrieve 16 sequences of this species available at NCBI. Genomes were assembled with SPAdes and Gfinisher and annotated using Prokka. Diversity analysis among isolates was evaluated using the PYANI program. The core genome was obtained with the program Roary and SNPs were extracted with SNP-site. Phylogeny of the core genome and orthologous proteins was performed with the RAxML program. The presence of resistance and virulence genes was evaluated with the CARD and VFDB databases. The isolates showed a high genetic diversity. Seventeen different resistance genes were found in all N. elongata isolates, with a higher predominance of genes related to efflux systems. Duplicated pili genes were found only in isolate M001, which may predict a higher virulence capacity. The results achieved by the N. gonorrhoeae induced resistance study point to the acquisition of resistance to ESC by different mechanisms and reinforce the importance of N. gonorrhoea antimicrobial surveillance program in Brazil, due to the recent change of treatment and prevalence of STs that can acquire resistance to these antimicrobials. The genomic study of N. elongata associated with this case report highlights the need for rapid microbiological identification and medical intervention in order to avoid unfavorable outcomes and provides evidence that may contribute to further biological investigations of commensal Neisseria species.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. A resistência bacteriana aos antimicrobianos por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC), principalmente em K. pneumoniae, representa um grave problema para o manuseio de infecções adquiridas no ambiente hospitalar. Carbapenêmicos, considerados a ?última linha de defesa? para diversos tipos de infecção por bactérias Gram-negativas, tornam-se ineficientes contra bactérias produtoras de carbapenemases, e poucos antibióticos estão disponíveis atualmente para o tratamento. O presente estudo caso-controle pareado, teve por objetivo identificar aspectos clínicos, fatores de risco e mortalidade associados a infecções causadas por K. pneumoniae produtora de carbapenemase do tipo KPC (Kp-KPC) em pacientes internados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (HU/UFSC) no período de Janeiro de 2012 a Dezembro de 2014. A identificação dos isolados e o antibiograma foram realizados por metodologia automatizada (Vitek 2®/Biomerieux). Foram utilizados dois testes fenotípicos, em diferentes momentos do estudo, para triagem dos isolados com resistência aos carbapenêmicos. Todos os isolados foram confirmados por metodologia molecular (Reação em Cadeia da Polimerase - PCR). Foram selecionados para o grupo caso 40 pacientes com Kp-KPC e para o grupo controle 40 pacientes com K. pneumoniae não produtora de carbapenemase do tipo KPC (Kp-não-KPC) isoladas de amostras de urina e hemocultura. Dados obtidos incluíram a origem do paciente no momento da internação, fatores de risco, como tempo de hospitalização antes da infecção, admissão em Unidade de Terapia Intensiva (UTI) antes do isolamento de K. pneumoniae, cirurgia, presença de dispositivos invasivos, uso prévio de antibióticos, tratamento empírico e definitivo, bem como comorbidades e desfecho clínico dos pacientes. Os dados foram coletados dos prontuários. A maioria dos pacientes transferidos para o HU/UFSC de outros hospitais pertencia ao grupo caso (P=0,010). Isso destaca a necessidade de realização de culturas de vigilância para pacientes transferidos para o HU/UFSC. Neste estudo, a admissão na UTI (Razão de Chance [RC], 3,115; Intervalo de Confiança [IC] 95%, 1,247-7,781; P=0,014), presença de cateter venoso (RC, 5,516; IC 95%, 1,109-27,429; P=0,023), presença de cateter urinário (RC, 3,484; IC 95%, 1,246-9,747; P=0,015) e uso prévio de antibióticos (RC, 3,444; IC 95%, 1,310-9,058; P=0,011) foram associados a infecções por Kp-KPC por análise univariada. Quando analisados os antibióticos ou as classes mais comumente utilizadas, foi encontrada diferença significativa para o grupo caso no uso de cefalosporinas deamplo espectro (P=0,039). A análise da terapia empírica mostrou que 71,4% dos pacientes que não a utilizaram foram a óbito. Dentre os pacientes que fizeram uso de terapia empírica, a mortalidade foi maior para os pacientes que receberam terapia apropriada (58,3% vs 37,5%). Após o resultado do antibiograma, a mortalidade foi maior para os pacientes que receberam terapia apropriada (55% vs 50%). Além disso, verificou-se que a mortalidade de quem fez uso de terapia definitiva combinada (70%) foi maior do que pacientes que utilizaram monoterapia (40%). A frequência da mortalidade total foi significantemente maior para o grupo caso (47,5% vs 25%, P=0,036). O número crescente de isolados, tanto em amostras clínicas quanto em culturas de vigilância, alerta para a necessidade de aprimoramento das medidas já adotadas a fim de controlar a disseminação do microrganismo no HU/UFSC. Cateteres venoso e urinário foram associados com infecções por Kp-KPC, por isso em internações mais longas, esses dispositivos devem ser revistos regularmente para verificar se ainda são necessários. Kp-KPC é um patógeno emergente associado à mortalidade no HU/UFSC. A frequência da mortalidade associada às limitadas opções terapêuticas ressalta a necessidade de detecção precoce, de medidas de prevenção de contato e o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento dessas infecções. Abstract : The bacterial resistance to antimicrobials by Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC), especially in Klebsiella pneumoniae, is a serious problem to handling healthcare associated infections. Carbapenems, considered the ?last-line agents" to treat several infections by Gram-negative bacteria become ineffective against carbapenem-producing bacteria, and few effective antibiotics are currently available to treatment. To identify clinical aspects, risk factors and mortality associated to infections caused by KPC-producing K. pneumoniae (Kp-KPC), this matched case-control study was performed at the University Hospital of the Federal University of Santa Catarina (HU/UFSC) from January 2012 through December 2014. The bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing were performed by automatized methodology (Vitek 2®/Biomerieux). Two phenotypic tests were performed in different moment to screening the isolates with carbapenems resistance. All isolates were confirmed by molecular methodology (Polimerase Chain Reaction - PCR). Were selected isolates from urine and blood culture of forty patients with Kp-KPC (case) and forty patients with non-KPC-producing K. pneumoniae (Kp-non-KPC). Data obtained included origin of patient at the time of hospital admission, risk factors such as length of stay before infection, Intensive Care Unit (ICU) stay prior to K. pneumoniae isolation, surgery, use of invasive devices, prior antibiotic therapy, empiric therapy and definitive treatment, as well as comorbidities and outcomes. Data were collected from medical charts. Most of transferred patients to HU/UFSC from others hospitals belonged to case group (P=0.010). This highlight the need of surveillance cultures to patients transferred to HU/UFSC. In this study, stayed in ICU, (Odds Ratio [OR], 3.115; Confidence Intervals [CI] 95%, 1.247-7.781; P=0.014), use of venous catheter (OR, 5.516; CI 95%, 1.109-27.429; P=0.023), use of urinary catheter (OR, 3.484; CI 95%, 1.246-9.747; P=0.015) and prior antimicrobial use (OR, 3.444; CI 95%, 1.310-9.058; P=0.011) were associated with Kp-KPC infections by univariable analysis. The analysis of the antibiotics or class of antibiotics most commonly used, showed significant difference to case group for the use of extended-spectrum cephalosporins (P=0.039). The analysis of empirical therapy showed that 71.4% of patients who did not use empiric antibiotic died. Amongpatients who used empirical therapy, mortality was higher for patients who received appropriate therapy (58.3% vs 37.5%). After antimicrobial susceptibility testing, mortality was higher for patients who received appropriate therapy (55% vs 50%). Furthermore, it was found that mortality of patients who received definitive associated therapy (70%) was higher than patients who used monotherapy (40%) (P=0.370). The mortality frequency was significant higher for case group (47.5% vs 25%, P=0.036). The increase number of isolates, both in clinical samples and surveillance cultures, alert to the need to improve the measures already adopted in order to control the spread of the microorganisms in HU/UFSC. Venous and urinary catheters were associated with Kp-KPC infections, so in long-stay hospitalizations, these devices should be reviewed regularly to check whether they are still needed. Kp-KPC is an emerging pathogen associated with significant mortality in HU/UFSC. The mortality frequency associated with limited therapeutic options, highlight the need of early detection, contact prevention measures and development of new drugs for the treatment of these infections.