Search

Mortality of patients with end-stage renal disease tremendously exceeds that of the general population due to excess cardiovascular morbidity. Large middle-sized molecules (LMM) including pro-inflammatory cytokines are major drivers of uremic cardiovascular toxicity and cannot be removed sufficiently by conventional high-flux (HFL) hemodialysis. We tested the ability of plasma from 19 hemodialysis patients participating in a trial comparing HFL with high cut-off (HCO) membranes facilitating removal of LMM to induce calcification in mesenchymal stromal cells (MSC) functioning as vascular progenitors. HCO dialysis favorably changed plasma composition resulting in reduced pro-calcific activity. LMM were removed more effectively by HCO dialysis including FGF23, a typical LMM we found to promote osteoblastic differentiation of MSC. Protein-bound uremic retention solutes with known cardiovascular toxicity but not LMM inhibited proliferation of MSC without direct toxicity in screening experiments. We could not attribute the effect of HCO dialysis on MSC calcification to distinct mediators. However, we found evidence of sustained reduced inflammation that might parallel other anti-calcifying mechanisms such as altered generation of extracellular vesicles. Our findings imply protection of MSC from dysfunctional differentiation by novel dialysis techniques targeted at removal of LMM. HCO dialysis might preserve their physiologic role in vascular regeneration and improve outcomes in dialysis patients.

Obwohl Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) die häufigste Todesursache weltweit darstellen, fehlen trotz intensiven Bemühungen durchgreifende Behandlungskonzepte und überzeugende Präventionsstrategien. Ziel dieser Arbeit war es, die zugrunde liegenden Mechanismen der vaskulären Kalzifizierung, eine der wichtigsten Ursachen für CVD, zu analysieren und eine therapeutische Option auszuarbeiten. Um den fehlgeleiteten Prozess der extraossären Kalzifizierung in der Gefäßwand zu ergründen, wurde in einem in vitro Modell untersucht, wie Programme kontrolliert werden, welche die Differenzierung und Entwicklung von humanen Vorläuferzellen des vaskulären Systems steuern. Als potente und zentrale Regulationseinheit der Zelle um auf Stress,Wachstumsfaktoren und Nährstoffe zu reagieren wurde das mTOR-Netzwerk mit seinen beiden strukturell und funktionell verschiedenen Multiproteinkomplexen für die steuernden Befehle in Betracht gezogen und zur Beeinflussung der Prozesse anvisiert. Rapamycin diente der gezielten pharmakologischen Modulation des Netzwerks während der osteoblastären Differenzierung, die ebenso wie die Menge der Kalziumablagerung, die Aktivität der mTOR-Komplexe und die der Zellschicksalsprogramme während des 21-tägigen Prozesses der Kalzifizierung kontinuierlich analysiert wurden. Die Blockade von mTORC1 offenbarte eine zentrale Rolle von mTORC2 für die Induktion protektiver Zellprogramme, die durch den Einsatz eines pharmakologischen Inhibitors und durch genetischen Knockout bestätigt wurde. Der benefizielle Einfluss der mTORC2-Aktivität auf die zellulären Prozesse der Gefäßwand konnte in-vivo durch die Behandlung von Mäusen mit Rapamycin über 37 Tage mit anschließender immunohistologischer Untersuchung der Aorten bestätigt werden. In einem Medium-Transfer-Modell wurde außerdem der durch Rapamycin ausgelöste günstige parakrine Effekt von MSCs auf glatte Muskelzellen bei osteoblastärer Differenzierung untersucht. Die Modulation des mTOR-Netzwerks führte über die Induktion von Autophagie und Verminderung von Seneszenz und Apoptoseprozessen zu einer Reduktion der Kalzifizierung, die durch gezielte Inaktivierung des mTOR-Komplexes 2 verhindert werden konnte. Die Kontrolle der mTORC1-Aktivität zusammen mit einer Verstärkung der mTORC2-Funktionen bietet die Möglichkeit, schützende Zellprogramme und endogene parakrine Effekte für die Behandlung fortschreitender Arteriosklerose einzusetzen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Modulation des mTOR-Netzwerks das zelleigene regenerative Potential schützt, was, ebenso wie die gezielte Aktivierung von mTORC1, bedeutsam für die spezifische Induktion von Knochenbildung im Rahmen einer lokalen Therapie zur Knochenregeneration bei Osteoporosefrakturen sein könnte., Cardiovascular disease (CVD) is the most prominent contributor to global mortality and concepts for treatment as well as compelling prevention strategies are missing. In our study, we provide new insights in the underlying processes for vascular calcification, one basic pillar of CVD, by analysing cell fate programs and their regulation in human cells involved in vascular biology. Accelerated calcifying arteriosclerosis features osteoblastic transformation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and their progenitors, mesenchymal stromal cells (MSCs). Targeting signaling pathways controlling cell differentiation could shift maladaptive cell fate programs towards protective and prevent from vascular calcification. mTOR kinase contained in two functionally and structurally distinct multiprotein complexes mTORC1 and mTORC2 integrates extracellular stimuli into cell differentiation and growth responses. We hypothesize distinct roles for mTORC1 and mTORC2 in regulation of cell fate programs in a temporally controlled sequence. Rapamycin served for pharmacologic mTOR targeting during osteoblastic differentiation of MSCs. Matrix calcium deposition, mTORC1 and mTORC2 targets, and cell fate programs were followed for 21 days. Central role of mTORC2 in induction of protective cell fate programs was determined by AKT blockade, genetic disruption of mTORC2 function and autophagy inhibition. Beneficial Effects of mTORC2 acitivation on vascular cells induced by mTORC1 blockade were confirmed in vivo by low dose-rapamycin injection into mice and immunohistochemical analysis of aortas after 37 days treatment. Paracrine effects of rapamycin conditioned MSCs on VSMCs undergoing osteoblastic transformation were assessed by medium transfer. Attenuation of mTORC1 and activation of mTORC2 downstream signaling effectors inhibited calcification via induction of autophagy and down-regulation of proteins mediating apoptosis and cell senescence. Negative interference with mTORC2 function or autophagy disrupted protective programs via induction of apoptosis and cell senescence. Secretome of rapamycin conditioned MSCs mitigated osteoblastic transformation of VSMCs. Control of mTORC1 activation together with enhancement of mTORC2 function leads to induction of autophagy and maintenance of protective cell fate programs during osteoblastic transformation. Regenerative approaches aiming to translate our findings hold promise for treatment of accelerated arteriosclerosis. Furthermore, modulation of the mTOR signalling protects the endogenous regeneration capacity of osteoblast precursor cells and provides new options for specific induction of bone formation in osteoporosis.

Severe vascular calcification develops almost invariably in chronic kidney patients posing a substantial risk to quality of life and survival. This unmet medical need demands identification of novel therapeutic modalities. We aimed to pinpoint components of the uremic microenvironment triggering differentiation of vascular progenitors to calcifying osteoblast-like cells. In an unbiased approach, assessing the individual potency of 63 uremic retention solutes to enhance calcific phenotype conversion of vascular progenitor cells, the pro-inflammatory cytokines IL-1 beta and TNF-alpha were identified as the strongest inducers followed by FGF-2, and PTH. Pharmacologic targeting of these molecules alone or in combination additively antagonized pro-calcifying properties of sera from uremic patients. Our findings stress the importance of pro-inflammatory cytokines above other characteristic components of the uremic microenvironment as key mediators of calcifying osteoblastic differentiation in vascular progenitors. Belonging to the group of "middle-sized molecules", they are neither effectively removed by conventional dialysis nor influenced by established supportive therapies. Specific pharmacologic interventions or novel extracorporeal approaches may help preserve regenerative capacity and control vascular calcification due to uremic environment.