Search

A linfadenite caseosa (LC) é uma doença causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, que acomete principalmente caprinos e ovinos. Esta enfermidade é responsável por perdas econômicas significativas relacionadas à produtividade dos animais infectados. E, apesar de sua importância, atualmente não existem vacinas, diagnóstico e tratamentos satisfatórios para LC. No presente trabalho, foi utilizada a ferramenta Phage Display a qual seleciona peptídeos através de bacteriófagos geneticamente modificados para expressar aleatoriamente sequências de peptídeos na sua superfície. Estas bibliotecas têm demonstrado sucesso em numerosas aplicações, como mapeamento e mimetismo de antígenos reconhecidos por anticorpos, desenvolvimento de vacinas, e em testes de imunogenicidade. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos selecionar e identificar pela técnica de Phage Display peptídeos ligantes específicos para proteínas secretadas e/ou excretadas e totais de C. pseudotuberculosis linhagem 1002. Para isso foi utilizada uma biblioteca comercial de 12 peptídeos lineares (Ph.D.-12 mer - New England Biolabs - NEB) e após três ciclos de seleção foram obtidos 366 peptídeos, sendo que 116 são seqüências distintas. Foram realizadas análises in silico desses peptídeos com o proteoma predito de C. pseudotuberculosis, onde apresentaram similaridade com proteínas envolvidas na sinalização, nutrição, metabolismo, patogênese bacteriana e fatores de transcrição entre outras. A reatividade e especificidade dos clones isolados foram testadas por ELISA e Spot síntese. Através de imunoensaios para ambas as metodologias foi possível selecionar 12 peptídeos (dos 116 identificados por Phage Display), entre os quais três foram sintetizados, agregados a duas formulações distintas de lipossomas, uma com fosfatidilcolina hidrogenada (HPC) e a outra com fosfatidilcolina de soja (SPC), e utilizados em ensaios de imunização de camundongos BALB/c. A imunização com os peptídeos sintetizados foi capaz de induzir uma elevada resposta imune do tipo Th1 antes da infecção. Após o desafio, foi observada uma produção elevada de IFN- nos animais imunizados tanto com peptídeo/SPC quanto com peptídeo/HPC, e os níveis de IL-10 foram mais elevados nos animais imunizados com peptídeo/SPC. Em contraste, camundongos dos grupos controle exibiram baixos níveis de IFN e de IL-10. A identificação de novos antígenos ou genes específicos de C. pseudotuberculosis pode prover novos biomarcadores específicos potencialmente antigênicos para a obtenção de antígenos candidatos à vacina e diagnósticos subclínicos mais acurados para o controle e erradicação da LC. The Caseous Lymphadenitis (CL) is a disease caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, which affects mainly sheep and goats. This illness is responsible for significant economic losses related to productivity of animals. Currently, there is no satisfactory diagnosis for CL. In this work the tool Phage Display was used that selects peptides using bacteriophages to express random sequences of peptides on their surface. Phage Display has been used successfully in many applications such as mapping and mimicry antigens, vaccine development and immunogenicity tests. The main goal of the study was to perform the selection and identification of mimotopes peptides of secreted and /or excreted and total C. pseudotuberculosis 1002 proteins through Phage Display technique. A commercial librarary of 12 linear peptides (Ph.D.-12 mer - New England Biolabs - NEB) was used. After three cycles of selection, 366 peptides were obtained, including 116 distinct sequences. In silico analysis of the peptides obtained in Phage Display were tested against the predicted proteome of C. pseudotuberculosis 1002. The indentified proteins showed similarity to protein involved in signaling, nutrition, metabolism, bacterial pathogenesis and transcription factors. The reactivity and specificity of isolated clones were tested by ELISA and Spot synthesis. Through immunoassays for both methods, was possible to select 12 peptides among them three were synthesized, bound to two different formulations of liposomes, with a hydrogenated phosphatidylcholine (HPC) and soy phosphatidylcholine (SPC), the three peptide were used for testing and immunization of BALB/c. Immunization with the peptides 1 and 2 was able to induce a high Th1 immune response before infection. After the challenge, we observed a high production of IFN- in animals immunized with either peptide/SPC or peptide/HPC, and the levels of IL-10 were higher in animals immunized with peptide/SPC only. In contrast, control groups of mice exhibited low levels of IFN- and IL-10. The identification of new antigens or C. pseudotuberculosis specific genes can potentially provide new specific biomarkers with antigens for obtaining vaccine candidate antigens and sub-clinical diagnosis tests for more accurate control and eradication of the CL.

Tecnologias de sequenciamento de nova geração têm o potencial para decifrar a diversidade genômica a um custo moderado. Corynebacterium pseudotuberculosis, é um parasita intracelular facultativo, responsável por causar enfermidades infecto-contagiosas de caráter crônico. A doença se apresenta de diferentes formas, de acordo com o hospedeiro acometido. Linhagens de C. pseudotuberculosis mostram alta adaptabilidade para diversos nichos ecológicos e são capazes de crescer em algumas fontes de carbono, bem como existem linhagens capazes de realizar a redução de nitrato. O objetivo deste trabalho é analisar e propor a via de redução de nitrato de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar Equi e identificar as enzimas que constituem a cadeia de transporte de elétrons através de análises in silico. Foram analisados 15 genomas completos de C. pseudotuberculosis, para identificação in silico da cadeia respiratória e da via de redução de nitrato. Genes constituintes destas vias foram identificados. Validação experimental foi realizada por fenotipagem e PCR. Com este trabalho inédito para a espécie pretende-se utilizar a genômica comparativa e validação experimental para tentar entender e caracterizar via metabólicas associadas a respiração ainda não conhecidas em C. pseudotuberculosis. Para se adaptar a uma ampla variedade de condições de crescimento e estresse ambiental, as bactérias possuem sistemas respiratórios modulares que as permitem aperfeiçoar a produção de energia em ambientes variáveis e que podem ser hostis. A composição do sistema respiratório é ajustada de acordo com condições específicas em que se encontram, por meio de uma complexa rede de regulação que as permitem sobreviver e prosperar em um determinado ambiente, tais como compartimentos intracelulares fagossomais de macrófagos humanos. Uma maior compreensão do metabolismo respiratório de C. pseudotuberculosis será de grande importância para o discernimento das interações patógeno-hospedeiro e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas futuras. Technologies for sequencing new generation have the potential to decode the genomic diversity at a moderate cost. Corynebacterium pseudotuberculosis is a facultative intracellular parasite, responsible for causing chronic infect-contagious illnesses. The disease presents itself in different ways, in accordance with the affected host. Lineages of C. pseudotuberculosis show high adaptability to different ecological niches and are able to grow in some carbon sources, besides the fact that some specific lineages are capable of achieving the nitrate reduction. The objective of this study is to analyze and propose the route of nitrite reduction of Corynebacterium pseudotuberculosis biovar Equi and to identify the enzymes that constitute the electron transport chain, through analysis in silico. A total of 15 complete genomes of C. pseudotuberculosis were analyzed, in order to identify the respiratory chain and the route of nitrate reduction in silico. Constituent genes of these routes have been identified. Experimental validation was performed through phenotyping and PCR. With this yet unpublished work for the species, comparative genomics and experimental validation are intended to be used, in order to try to understand and characterize metabolic routes associated with breathing still not known in C. pseudotuberculosis. To adapt to a wide range of growing conditions and environmental stress, bacteria have modular respiratory systems that allow them to improve energy production in variable environments, which can be hostile. The respiratory system composition is adjusted according to specific conditions in which they find themselves, by means of a complex network of regulation that allow them to survive and thrive in a particular environment, such as fagossomics intracellular compartments of human macrophages. A greater understanding of the respiratory metabolism of C. pseudotuberculosis will be of great importance to perceive the interactions between pathogen and host and for the development of therapeutic strategies in the future.