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Milk cream must be pasteurized in order to be sold in Brazil. However, there are no specific legal requirements for this product, and producers set their own pasteurization parameters using the ones approved for milk as a reference. Considering that fat protects bacteria from heat, that no thermal inactivation studies have been performed on Mycobacterium bovis present in cream, and that bovine tuberculosis is endemic in Brazil, the aim of this study was to evaluate the inactivation of M. bovis in milk cream subjected to commercial parameters of pasteurization. Milk cream samples were contaminated and pasteurized in a water bath at 75, 80, 85, and 90°C for 5 and 15 s. M. bovis cells were plated onto Stonebrink-Leslie medium, incubated at 36°C for 45 days, and quantified; the result was expressed in log CFU mL-1. The fat content of the samples ranged from 34% to 37% and the average initial load of M. bovis was 8.0 Log CFU mL-1. The average decay of the M. bovis populations was 4.0, 4.3, 4.9 and 6.7 log CFU mL-1 when the cream was incubated for 15 sec at 75, 80, 85 and 90°C, respectively, showing that the efficiency of the heat treatment was improved by increasing the temperature of the process. Given the lipophilic nature of M. bovis, the cream should be subjected to more intense parameters of pasteurization than those applied to milk., A pasteurização do creme de leite é obrigatória no Brasil, mas não há parâmetros legais específicos para esse produto, de forma que as empresas estabelecem seus próprios parâmetros tendo como referência mínima os aprovados para a pasteurização do leite. Assim, considerando que a gordura tem efeito termo protetor para as bactérias, que não há estudos de inativação térmica do Mycobacterium bovis em creme de leite e que a tuberculose bovina é endêmica no Brasil, o objetivo deste estudo foi avaliar a inativação de M. bovis em creme de leite, submetido aos parâmetros comerciais de pasteurização. Amostras de creme de leite foram contaminadas e pasteurizadas em Banho-Maria a 75°C, 80°C, 85°C e 90°C, por até 15 s. O M. bovis foi quantificado por semeadura em meio Stonebrink-Leslie, incubado a 36ºC por 45 dias, e o resultado expresso em Log UFC mL-1. O teor de gordura das amostras variou de 34 a 37% e a carga inicial média de M. bovis foi de 8,0 Log UFC mL-1. O decaimento médio da população de M. bovis foi de 4,0, 4,3, 4,9 e 6,7 Log UFC mL-1, quando expostos respectivamente às temperaturas estudadas por 15 s, demonstrando que a eficácia do tratamento térmico melhorou com o aumento da temperatura do processo. Devido ao caráter lipofílico do M. bovis, o creme de leite deveria ser submetido a parâmetros de pasteurização mais intensos do que aqueles aplicados ao leite.

The current scenario of international beef trading has increased the pressure for better and faster diagnosis of bovine tuberculosis. Although traditional culture remains the gold standard method to confirm Mycobacterium bovis infection, it is exceedingly time consuming, and demands viable mycobacteria. Molecular methods overcome the flaws of the bacteriological methods with faster detection and identification. However, mycobacterial features like a complex cell wall and pathogen–host interaction make the molecular detection a challenge. Three protocols for DNA extraction (A, B and C) from bovine tissues were tested to verify the most suitable technique for routine diagnostic assessment of their specificity and sensitivity. Thirty culture-positive and thirty culture-negative granulomatous lesions were included in the trial. From each sample, three tissue suspensions at different dilutions (10-1, 10-2 and 10-3) were prepared and submitted to DNA extraction. PCR procedures targeting IS6110 were performed, employing two volumes of DNA: 5 µL of all three dilutions, and 2.5 µL of the 10-1 dilution. Protocol A was able to detect members of the M. tuberculosis complex in most samples. The sensitivity of the test decreased with increase in tissue-suspension dilution. Although Protocol A presented the highest sensitivity followed by C and B, it showed the lowest specificity, which can be due to a failure in primary isolation caused by the lack of viable organisms or incubation time. Regardless classical bacteriological methods are still recommended by OIE, after evaluating the sensitivity of DNA extraction protocols and PCR procedures, we conclude that the best strategy for M. bovis detection is to follow Protocol A on concentrated tissue suspensions., O atual comércio internacional de carne tem aumentado a pressão para haver um melhor e mais rápido diagnóstico de tuberculose bovina. O tradicional cultivo continua a ser o método padrão ouro para confirmar a infecção por Mycobacterium bovis, apesar de ser excessivamente demorado e necessitar de micobactérias viáveis. Métodos moleculares representam a superação de todos os defeitos dos métodos bacteriológicos com detecção e identificação mais rápidas. Entretanto, características das micobactérias, como uma complexa parede celular e a interação patógeno-hospedeiro, torna-os um desafio. Três protocolos de extração de DNA (A, B e C) foram testados em tecidos bovinos para verificar qual técnica é mais adequada para diagnóstico de rotina, avaliando sua especificidade e sensibilidade. Trinta lesões granulomatosas positivas no cultivo e 30 lesões granulomatosas negativas no cultivo foram utilizadas no experimento. A partir de cada amostra, três homogeneizados com diferentes diluições (10-1, 10-2 e 10-3) foram preparadas e submetidas à extração de DNA. A PCR para o gene alvo IS6110 foi realizada empregando-se dois volumes de DNA: um com 5 µL para todas as três diluições e outro com 2,5 µL da diluição 10-1. O Protocolo A foi capaz de detectar membros do complexo M. tuberculosis na maior parte das amostras. À medida que a diluição dos homogeneizados aumentou, a sensibilidade diminuiu. Embora o Protocolo A tenha apresentado a maior sensibilidade, seguido por C e B, este revelou a menor especificidade, que pode ser devido à insuficiência de organismos viáveis ou tempo de incubação no primo isolamento. Apesar de os métodos bacteriológicos clássicos ainda serem recomendados pela OIE, através da avaliação da sensibilidade dos protocolos de extração de DNA e dos procedimentos de PCR, concluímos que a melhor estratégia para a detecção de M. bovis é usar o Protocolo A em homogeneizados mais concentrados.

The isolation of Mycobacterium bovis is critical to a surveillance system for bovine tuberculosis based on detection of lesions in abattoirs. Thus, four solid culture media and three incubation conditions were investigated to elucidate which combination overcomes the others by assessing growth, time to the first appearance of colonies and their number. Ninety-seven samples of granulomatous lesions were submitted to the decontamination procedure by 1-hexadecylpyridinium chloride at 0.75% w/v, and inoculated on two egg-based media, Stonebrink’s (ST) and Löwenstein-Jensen’s with sodium pyruvate (LJp), and two agar-based media, tuberculosis blood agar (B83) and Middlebrook 7H11 medium (7H11). Each medium was incubated at 37°C for 90 days in three incubation conditions: in air, in air containing 10% carbon dioxide (CO2), and in air in slopes closed with burned hydrophobic cotton and subsequently plugged with a cork to create a microaerophilic atmosphere. The colonies appeared faster and in higher number when incubated in air containing 10% CO2 (p < 0.01), independent of media. B83 showed a faster growth and detected more isolates at 30 days of incubation, when compared to ST (0.0178), LJp (p < 0.0001) and 7H11 (p < 0.0001), though there was no difference between B83, ST and LJp at 60 and 90 days of incubation. 7H11 presented the lowest number of isolates (p < 0.0001) and a longer period for the appearance of the first colony (p < 0.001). According to our findings, the concomitant use of ST and B83 media incubated in air containing 10% CO2 increases the isolation of M. bovis in a shorter period of time, which improves bovine tuberculosis diagnosis., O isolamento do Mycobacterium bovis é fundamental para um sistema de vigilância para tuberculose bovina baseado na detecção de lesões em abatedouro. Assim, quatro meios de cultura sólidos e três condições de incubação foram investigados para elucidar qual combinação supera as outras através da avaliação de crescimento, tempo para o aparecimento da primeira colônia e número de colônias. Noventa e sete amostras de lesões granulomatosas foram submetidas ao processo de descontaminação por cloreto de 1-hexadecilpiridínio a 0,75%, e inoculadas em dois meios a base de ovo, Stonebrink (ST) e Löwenstein-Jensen com piruvato de sódio (LJp), e dois meios a base de ágar, ágar sangue tuberculose (B83) e Middlebrook 7H11 (7H11). Cada meio foi incubado a 37°C por 90 dias, em três condições de incubação: em atmosfera normal, em atmosfera com acréscimo de 10% de dióxido de carbono (CO2), e em atmosfera normal em tubos fechados com algodão hidrófobo queimado e subsequentemente fechado com rolha para criar uma atmosfera microaerófila. As colônias apareceram mais rapidamente e em maior número quando incubadas em atmosfera com 10% de CO2 (p < 0,01), independente dos meios. As micobactérias cresceram em maior abundância e mais rapidamente no meio B83 aos 30 dias de incubação, comparado a ST (0,0178), LJp (p < 0,0001) e 7H11 (p < 0,0001), apesar de não ter havido diferença entre B83, ST e LJp aos 60 e 90 dias de incubação. 7H11 exibiu o número mais baixo de isolados (p < 0,0001) e um período mais longo para o aparecimento da primeira colônia (p < 0,001). De acordo com nossos resultados, o uso concomitante dos meios ST e B83, incubados em atmosfera com acréscimo de 10% de CO2, aumenta a proporção de isolados e o número de UFC de M. bovis, além de abreviar o tempo para aparecimento das primeiras colônias, melhorando o diagnóstico direto de tuberculose.

Parameters for milk pasteurization were established a long time ago, considering the thermal resistance of Mycobacterium bovis, and the systematic adoption of this process has drastically reduced the incidence of human tuberculosis caused by this pathogen. However, more recently, molecular methods have allowed the identification of genetic variations in this bacterium that may lead to greater thermal resistance. The aim of this study was to investigate whether genetic variation leads to variation in the death pattern of this bacterium during the milk pasteurization process. Samples of UHT (ultra-high temperature)-treated whole milk were artificially contaminated with four different Mycobacterium bovis spoligotypes and were subjected to pasteurization by low-temperature long-time (LTLT) and high-temperature short-time (HTST) treatments. The M. bovis spoligotypes were quantified (Colony Forming Unit per milliliter of milk) before and during the thermal process. The decay of the pathogen was quantified by calculating the difference between the measurements at the beginning and at the end of the thermal treatment. The data demonstrated that the LTLT and HTST pasteurization processes considerably reduced the M. bovis load in the milk; however, the bacterium was not eliminated. There was no difference in the thermal resistance of the spoligotypes tested or in the efficiency of pasteurization processes (LTLT versus HTST). However, heating phase was more effective in reducing the M. bovis load than the target temperature maintenance phase., Os parâmetros para a pasteurização do leite foram estabelecidos há muito tempo, considerando a resistência térmica de Mycobacterium bovis e a adoção sistemática deste processo reduziu drasticamente a incidência de tuberculose humana causada por este patógeno. Entretanto, mais recentemente, métodos moleculares permitiram a identificação de variações genéticas nesta bactéria que podem levar a uma maior resistência térmica. O objetivo deste estudo foi investigar se a variação genética apresenta modificação no padrão de morte da bactéria durante o processo de pasteurização do leite. Amostras de leite tratadas por UHT (ultra-alta temperatura) integral foram contaminadas com quatro diferentes espoligotipos de Mycobacterium bovis e foram submetidos ao tratamento por temperatura baixa e tempo longo (LTLT) e temperatura alta e tempo curto (HTST). Os espoligotipos M. bovis foram quantificados (Unidades Formadoras de colônias por mililitro de leite) antes e durante o processo térmico. A diminuição do patógeno foi quantificada através do cálculo da diferença entre as medições no início e no fim do tratamento térmico. Os dados demonstraram que os processos de pasteurização HTST e LTLT reduziram consideravelmente a carga de M. bovis no leite; no entanto, a bactéria não foi eliminada. Não houve diferença na resistência térmica dos espoligotipos testados nem na eficiência dos processos de pasteurização (HTST versus LTLT). Entretanto, a fase de aquecimento foi mais eficaz na redução da carga de M. bovis que a fase de manutenção da temperatura-alvo.