Muitas espécies de felinos silvestres estão ameaçadas de extinção, entre eles, a onça-pintada, um símbolo nacional da biodiversidade, que vem sendo dizimada devido, principalmente, a perda do seu habitat e à caça. Para que as biotecnologias reprodutivas sejam uma ferramenta importante na conservação, faz-se necessário o estabelecimento de protocolos da reprodução assistida, específicos para a espécie em questão. O objetivo deste estudo foi comparar três diferentes crioprotetores de sêmen - dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol (GLY) e metanol (MET) - na criopreservação de sêmen de onça-pintada, assim como o impacto da temperatura de descongelação na qualidade da dose. Para tanto, utilizamos sêmen obtido de cinco machos de onça-pintada (Panthera onca) com idades entre dois e 11 anos, mantidos sob cuidados humanos na Instituição NEX Corumbá de Goiás/GO. Os animais foram contidos quimicamente e foi realizada a colheita farmacológica de sêmen. Após a colheita do sêmen, as amostras foram avaliadas, fracionadas e a estas frações foram adicionados diluente e os crioprotetores. O sêmen foi congelado, sendo posteriormente descongelado e novamente avaliado, com o intuito de comparar qual crioprotetor é mais efetivo em manter a qualidade do sêmen após descongelação. Os resultados encontrados pela análise do CASA mostraram que as motilidades total e progressiva após a descongelação não apresentaram diferença entre os crioprotetores DMSO e o glicerol, porém se mostraram superiores quando comparadas ao Metanol. Al ém disto, os três crioprotetores avaliados não mostraram diferenças nas análises espermáticas quando avaliadas duas temperaturas distintas (37ºC e 50ºC) para o mesmo diluente. A qualidade espermática mostrou - se ruim visto as elevadas taxas de alterações mo rfológicas dos espermatozoides encontradas em todos os animais estudados. As alterações morfológicas encontradas com maior incidência foram as pseudogotas, seguida de cauda dobrada e gota citoplasmática proximal. Acreditamos que mais estudos precisam ser realizados com a espécie no que tange os protocolos de reprodução assistida, porém a baixa qualidade espermática pode ser um dos gargalos importantes nos programas de conservação para a espécie. Many wild feline species are threatened with extinction, including the jaguar, a Brazilian national symbol of biodiversity, decimated mainly due to the loss of its habitat and hunting. For reproductive biotechnologies to be an essential tool in conservation, it is necessary to establish specific protocols for assisted reproduction to the species. This study aimed to compare three different semen cryoprotectants - dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol (GLY), and methanol (MET) - in the cryopreservation of jaguar semen, as well as the impact of thawing temperature on dose quality. Semen was obtained from 5 male jaguars (Panthera onca) aged between two and 11 years, kept under human care at the NEX Institution Corumbá de Goiás/GO. The animals were chemically restrained, and pharmacological semen collection was performed. After collection, the semen samples were evaluated and fractionated, and to these fractions, diluent and cryoprotectants were added. The semen was frozen, then thawed, and evaluated again to compare which cryoprotectant is more effective in maintaining semen quality after thawing. The results found by the CASA analysis showed that the total and progressive motility after thawing showed no difference between the cryoprotectants DMSO and glycerol. However, they were superior when compared to methanol. In addition, the three cryoprotectants evaluated did not show differences in sperm analysis when evaluated at two different temperatures (37ºC and 50ºC) for the same extender. Sperm quality was poor given the high rates of morphological alterations of sperm found in all animals studied. The morphological alterations found with the highest incidence were pseudodrops, followed by bent tails and proximal cytoplasmic droplets. We believe that more studies need to be carried out with the species regarding assisted reproduction protocols. However, the low sperm quality may be one of the critical bottlenecks barriers in conservation programs for the species.