Search

Bu çalışmada, 2011 ve 2012 yıllarında Tokat ilinde domates üretiminin yoğun olarak yapıldığı Merkez, Pazar, Turhal, Niksar ve Erbaa ilçelerinde domates üretim alanlarında sürvey yapılarak domates bakteriyel solgunluk hastalığının bölgedeki ve tarladaki bulunma oranlarının belirlenmesi, hasta bitki örneklerinden elde edilen izolatların morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal testleri, serolojik (ELISA), moleküler (PCR) ve yağ asit metil ester (Fatty Acid Methyl Ester: FAME) analizleri ile tanısının yapılması amaçlanmıştır. Ayrıca hastalığın bölgemiz koşullarında epidemiyolojisi incelenerek hastalığı başlatma yeteneği olan ilk inokulum kaynaklarının tespit edilmesi ve hastalık belirtisi göstermeyen, üreticiler tarafından Tokat yöresinde kullanılan domates fidelerinde Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'in varlığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Yapılan sürvey çalışmalarında 2011 yılında hastalığın tarlada bulunma oranı ortalama %9,64, 2012 yılında ise %4,98 olarak belirlenmiştir. Bölgede hastalığın bulunma oranı ise 2011 yılında Merkez'de %88,88, Niksar'da %54,54, Erbaa'da %52,38, Turhal'da %46,15 ve Pazar'da %18,18 olarak, 2012 yılında ise Erbaa'da %61,90, Merkez'de %52,85, Turhal'da %47,72, Pazar'da %44,44 ve Niksar'da ise %0 olarak belirlenmiştir. Sürveylerde toplanan hasta bitki örneklerinden yapılan izolasyonlar sonucu 2011 yılında toplam 99 adet, 2012 yılında ise toplam 163 adet bakteri izolatı elde edilmiştir. Patojenite ve virülenslik testine tabi tutulan izolatlar, yapılan morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal testler ile tanıyı destekleyici ELISA, PCR ve yağ asit metil ester analizleri ile Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis olarak tanılanmıştır. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'in tohum, toprak ve bitki artıklarındaki latent/epifitik yaşam süresinin saptanması amacıyla yapılan çalışmada, kullandığımız yöntemlere göre, etmenin domates tohumlarında birincil inokulum kaynağı oluşturduğu ve tohumlardaki inokulumun hastalığı başlatacak yeteneğe sahip olduğu belirlenmiştir. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ile bulaştırılmış tohumlarda etmen 370. güne kadar canlılığını sürdürmüştür. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'in topraktaki yaşam süresinin saptanması amacıyla yürütülen denemede ise, etmenin yaz aylarında yaklaşık 15 gün, kış aylarında ise yaklaşık 30 gün canlı kalabildiği saptanmıştır. Toprakta bulunan bulaşık bitki artıklarında patojenin yaşam süresini belirlemek amacıyla yürütülen çalışmada ise, bulaşık bitki artıklarında etmen bir ay canlı kalabilmiştir. Bölgemizde yapılan gözlemlerde Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'in görüldüğü üretim sezonundan sonraki sezonlarda da hastalığın yeniden ortaya çıktığı saptanmıştır. Domates fidelerinde Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'in epifitik popülasyonunun belirlenmesi amacıyla yürütülen çalışmada ise, yarı seçici besi yerine ekim ve gelişen bakterilerin toplanarak total genomik DNA izolasyonunu takiben, etmene spesifik PCR testleri şeklinde uygulanan yöntemle, bakteriyel solgunluk hastalığı belirtisinin henüz domates fidelerinde görülmediği dönemlerde, etmenin varlığı başarılı bir şekilde belirlenmiştir. Tokat Merkez ve ilçelerinden toplanan 104 fide örneğinin 19'unda etmene rastlanılmıştır. Bu çalışma ile hastalığın Tokat yöresindeki epidemiyolojisinde kullanılan fidelerdeki epifitik bulaşıklığın rolü de ortaya konulmuştur. This study aimed to determine the intensity of bacterial wilt disease of tomato in Central, Pazar, Turhal, Niksar and Erbaa counties which are main tomato production areas of Tokat. For this purpose surveys were conducted during the 2011 and 2012 growing seasons. For identification of the bacterial isolates, which were isolated from infected plant samples, morphological, physiological and biochemical tests were performed and also serological (ELISA), molecular (PCR) and fatty acid methyl-ester (FAME) analysis were performed. Additional purpose of the study was to evaluate the epidemiology of disease, to determine the initial inoculum sources and determination of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on syptomless tomato seedling used by farmers in Tokat province. Based on the survey results, the average disease intensities were 9,64% and 4,98% in 2011 and 2012 respectively. In 2011, the disease prevalences in Central, Niksar, Erbaa, Turhal and Pazar counties were 88,88%, 54,54%, 52,38%, 46,15% and 18,18% respectively. In 2012 the disease prevalence in Erbaa, Central, Turhal, Pazar and Niksar counties were 61,90%, 52,85%, 47,72%, 44,44% and 0%. In 2011, 99 bacterial isolates were isolated from infected plant samples. Number of bacterial isolates, obtained from infected plants, were 163 in 2012 survey. These bacterial isolates were identified as Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis by morphological, physiological and biochemical tests and confirmed by ELISA, PCR and FAME analysis. In the studies conducted to determine latent/epiphytic survival time of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in soil, seed and plant debris, it was determined that tomato seeds were primary inoculum source and infected seeds were capable of establishing the disease according to the methods used in the present study. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis could persist for 370 days in infested tomato seeds. In the conducted to survival period survival of the pathogen in infested soil, it was determined that Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis could survive in soil for 15 days during summer and 30 days during winter time. On the other hand, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis could persist on infected plant debris only for a month. It was observed that Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis can be re-emerge in sub-sequent season when it was observed previous season in Tokat province. In the studies conducted to determine epiphytic population of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on symptomless tomato seedling, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis was detected successfully on symptomless tomato seedling by specific polymerase chain reaction (PCR) assay after streaking on semiselective medium and extracting DNA of the bacteria growing on the medium. In the symptomless seedling tests, 19 out of 104 tomato seedlings, collected from Tokat province, were contaminated with Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. This study demonstrated the role of epiphyticaly contaminated tomato seedlings in the epidemiology of the disease in Tokat province. 158

Bu çalışmada, domateste bakteriyel benek hastalığı etmeni Pseudomonas syringae pv. tomato (PST)'ya karşı dayanıklılık reaksiyonlarının belirlenmesi amacıyla 50 farklı domates çeşidi incelenmiştir. İki farklı Pst izolatı( YA-1 ve YA-2)'nın 108 hücre/ml yoğunluktaki süspansiyonu ile inokule edilen ve steril saf su ile muamele edilen kontrol bitkiler, 250C ve %60-70 nispi nemde tutulmuşlardır. Oluşan tipik yaprak lekeleri inokkulasyondan sonraki 21. günde sayılmışlar, bitkilerin dayanıklılık düzeyleri Chambers ve Merriman skalasına göre sınıflandırılmıştır. Sağlıklı domates bitkilerinde, patojene karşı dayanıklılık geninin (pto) 963 bp'lik fragmentinin varlığı SSP17 ve JCP32 spesifik primerleri kullanılarak PCR yöntemiyle tespit edilmiştir. Veriler varyans analizi (Anova ver. 10) ve MSTAT programında Duncan çoklu karşılaştırma testiyle değerlendirilmiş ve istatistiki olarak önemli bulunmuşlardır (p?0,01). İncelenen 50 farklı domates çeşidinden 15'inde pto geninin varlığı belirlenirken, çeşitlerin farklı bakteriyel izolatlara karşı verdikleri reaksiyonlar farklılıklar göstermiştir., Pseudomonas syringae pv. tomato is the causative agent of the bacterial speck disease of tomato (Lycopersicon lycopersicum), a disease that occurs worldwide and causes severe reduction in fruit yield and quality. Disease resistance conferred by the pto gene, encodes a serine?threonine protein kinase, is one of the first R-genes to be cloned and sequenced. In this research, the resistance reactions of 50 popular tomato cultivars which are grown commonly in Turkey against P. s. pv. tomato causal agent of bacterial speck disease were determined. Six-week-old plants were inoculated by spraying of P. s. pv. tomato YA-1 and YA-2 strains (108 cfu ml-1) with an airbrush until leaf surfaces were uniformly wet. After inoculation, the plants were incubated at 25±1 °C in 60-70?% relative humidity with a 12 h photoperiod and the disease progress occurred on the seedling leaves by P. s. pv. tomato was followed by counting the dark brown-black leaf necroses in 21st days after inoculation of the seedlings. Each experiment was performed at least three times and control plants were sprayed with sterile distilled water. The results of resistance reactions on plants were evaluated according to Chambers and Merriman scale. The resistance levels of the cultivars were statistically determined by using ANOVA variance analyze and Duncan multiple, range tests. Presence of pto gene (963 bp) in the tomato cultivars was verified by using the primers SSP17 and JCP32 by PCR and the gene was determined in 15 different tomato cultivars.

Projede gerçekleştirilen embriyo kurtarma çalışmalarıyla, L. esculentum ile Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'e dayanıklı L. peruvianum'un LA 2157 aksesyonunun arasında bir adet melez bitki elde edilmesi başarılmıştır. Elde edilen türler arası melezin doğrulaması SCAR markırlarıyla yapılmıştır. Çalışmada katı modifiye MS bazal besi ortamının, sıvı modifiye MS bazal besi ortamına kıyasla embriyoların büyümesi için daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca, bahar aylarında yapılan melezleme ve embriyo kurtarma çalışmaları, kış aylarına göre, L. esculentum × L. peruvianum melezi elde etme şansını önemli ölçüde arttırmıştır. Çalışmada embriyonun, tohum kabuğundan çıkarılmadan chalazal bölgesine kesik atılıp besi eriyiğine ekilmesinin çok da başarılı bir yöntem olmadığı anlaşılmıştır. Melez bitkinin anne ebeveyni olan L. esculentum'a ait 15 hat içerisinden en çok 1B hattının bitkicik oluşturduğu dikkat çekmiştir. Bu da onun L. peruvianum ile daha iyi uyuştuğunun bir göstergesidir. Bu çalışma sonuçlarına göre, L. peruvianum ile daha başarılı melez oluşturabilen bir L. esculentum ebeveyn hattının tespit edilmiş olması, gelecekte yapılacak L. esculentum × L. peruvianum melezlerindeki başarıyı büyük ölçüde arttıracak nitelikte bir bilgidir. Embryo rescue techniques were applied in this project, and one hybrid was successfully obtained between Lycopersicon esculentum and the LA 2157 accession of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis resistant Solanum peruvianum. The verification of the inerspecific hybrid was done using SCAR markers. It was concluded that the solid modified MS basal medium was much more successful for embryo growth as compared to liquid modified MS basal medium. Hence, hybridizations and subsequent embryo rescues done in spring time have proven to be much more successful in obtaining L. esculentum × L. peruvianum hybrids as compared to winter time. A small cut in the chalazal region of the seed without extracting the embryo from the seed coat was not proven to be a successful procedure. Studies showed that the line 1B, the mother plant of the hybrid produced most of the embryos and plantlets out of 15 L. esculentum lines, which is outlining its compatibility with L. peruvianum. Having found a better L. esculentum parent line for L. peruvianum, is an important information for success in coming L. esculentum × L. peruvianum hybridizations. 61

Birim alandan daha fazla verim almak, bitkilerde görülen hastalık ve zararlılara karşı dayanıklı bitkiler geliştirmek, bitkilerde kullanılan pestisitleri en aza indirmek için günümüzde üstün özellikte bitkilerin kullanılması gerekmektedir. Bakteriyel kanser ve solgunluk hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subp. michiganensis' i kontrol altına alabilmek için hassas bir domates hattı olan NCEBR3 domates tohumları üzerinde kimyasal mutasyon oluşturularak ümitvar dayanıklı mutant domates bitkileri elde edilmiştir. Bu çalışma hassas ve ümit var dayanıklı olan domates bitkilerinde bakteriyel kanser ve solgunluk hastalığına karşı oluşan fenolik bileşiklerin belirlenmesi ve bu bileşiklerin dayanıklılık mekanizması ile olan ilişkisini ortaya koymayı amaçlamıştır. Hassas NCEBR3 ve ümit var dayanıklı olan domates mutant bitkileri bakteriyel kanser hastalık etmeniyle inokule edildi ve inokulasyondan sonraki ilk hafta hergün,14, 21 ve 28 gün sonra bitkilerden alınan yaprak örnekleri 1,5 ml metanol ile havanda ezilerek ekstraksiyon işlemi yapıldı. Ekstrakte domates yaprağı numunelerindeki fenolik bileşikler p-kumarik asit, ferulik asit, kafeik asit, rutin, kuersetin, naringenin, kaemferol ve klorjenik asit miktarları Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC) sisteminde belirlendi. Bugüne kadar hep meyvede analiz edilen bu bileşiklerin tamamının bitki yapraklarında üretildiği bulunmuştur. Ayrıca UV spektrofotometre ile yapılan C vitamini analizlerinde NCEBR3 ve ümitvar domates mutant bitkileri arasında C vitamini bakımından bir farklılık olmadığı ortaya çıkmıştır. Ümit var dayanıklı domates bitkilerinde bazı fenolik bileşiklerin miktarlarının hassas NCEBR3 domates ve kontrollere göre çok fazla miktarda oluşturulduğu saptanmış olup bunun bitkilerin dayanıklılığından ileri geldiği sanılmaktadır.Anahtar Kelimeler: Domates, Clavibacter michiganensis subp. michiganensis, Fenolik Bileşikler, HPLC The superior plants have to be produced to obtain higher yield from unit area, to develop resistant plants against pests and diseases, to minimize pesticides usage on plants. To control bacterial canker and wilt disease caused by Clavibacter michiganensis subp. michiganensis, a susceptible NCEBR3 tomato line seeds were mutagenized with a chemical mutagen and promising resistant tomato mutant plants were obtained. This study aims to determine phenolic substances and to investigate their roles in resistance mechanims between inoculated susceptible NCEBR3 and promising resistant M3 tomato plants. The plants samples were collected every day in the first week, 14, 21 and 28 days after inoculation. Each collected plant samples was crushed in a mortar with 1.5 ml of methanol for sample extraction. The extracted leaf samples were assessed in High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) system to measure phenolic compounds p-coumaric acid, ferulic acid, caffeic acid, rutin hydrate, quercetin, naringenin, and chlorgenic acid and kaemferol quantities. To date, all of the phenolics compounds were analyzed in fruits; however, all the phenolics substances were investigated in the plant leaves at this study. Additionaly, the vitamin C measurements with UV spectrophotometer revealed that there is no significant difference between susceptible NCEBR3 and promising resistant mutant tomato vitamin C concentrations. Phenolic substance concentrations were significantly increased in the inoculated promising resistant M3 tomato plants than inoculated susceptible NCEBR3 and control tomato plants. Higher phenolic substances accumulations can be associated with plant resistance mechanisms in the promising resistant tomato plants.Keywords: Tomatoes, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Phenolics compounds, HPLC 47

Domates yetiştiriciliğinde toprak kaynaklı patojenler Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl) ve Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Seralarda her iki patojeni de kontrol edebilecek etkili ve pratik bir savaşım yöntemi bulunmamaktadır. Bu çalışmada, solarizasyon tek başına, metam sodyum ve hidrojen peroksitin solarizasyon ile ayrı ayrı kombinasyonunun Forl ve Cmm'ye karşı etkileri sera koşullarında Muğla Ortaca'da Temmuz-Ağustos 2009 tarihlerinde araştırılmıştır. Her iki patojende solarizasyondan önce her parseldeki toprağa suni inokulasyonla bulaştırılmıştır. Metam sodyum solarizasyon ile birlikte bir kez uygulanırken, hidrojen peroksit 3 haftalık solarizasyon süresi boyunca iki farklı dozda ikişer kez damla sulama sistemi ile uygulamıştır. Bu çalışmanın sonucunda solarizasyon tek başına her iki patojeni de kontrol edememiştir. Bununla birlikte, 125 L metam sodyum 0.1 ha dozu ve 10 L hidrojen peroksit 0.1 ha dozu bu patojenlere karşı etkisiz bulunmuştur. Diğer yandan, 15 L hidrojen peroksit 0.1 ha dozu hem Forl hem de Cmm'ye karşı solarizasyon süresi boyunca en yüksek etkiyi göstermiştir. Sonuç olarak hidrojen peroksit solarizasyonda toprak kaynaklı hastalıklara karşı savaşımda çevre dostu kimyasal ve yeni bir yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır. Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl) and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) could cause serious economic loses as soilborne pathogens of tomato. There is no practical and effective way to control both pathogens in greenhouse. In this study, effects of solarization alone and combined with metam sodium and hydrogen peroxide, individually against Forl and Cmm were evaluated in greenhouse conditions in July and August, 2009 in Ortaca, Turkey. The both pathogens were artificially incorporated into soil of each plot before solarization. Metam sodium was applied once with solarization while hydrogen peroxide was practiced twice via drip irrigation system with two different doses during three-week solarization period. In the result of the study, solarization alone did not suppress the both pathogens. Moreover, metam sodium with 125 L at 0.1 ha dose and hydrogen peroxide with 10 L at 0.1 ha dose were found ineffective to control them, as well. On the other hand, hydrogen peroxide with 15 L at 0.1 ha dose had the highest efficacy for both Forl and Cmm along with solarization. In conclusion, hydrogen peroxide as an environmentally friendly chemical could be new approach to combat the soilborne diseases in solarization. 79

ÖZET Doktora Tezi DOMATES BAKTERİYEL KANSERİ ETMENİNİN (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) TANISINDA MOLEKÜLER VE SEROLOJİK METOTLARIN KULLANIMI Mohamed Abdalla ÖMER Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Salih MADEN Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm)*in 9 straini, Türkiye' deki çeşitli araştırıcılardan temin edilmiştir. Strainler, biyokimyasal, fizyolojik ve patojenite testlerine tabi tutulmuştur. Bu testler, tüm strainlerin michiganensis subsp.' i olduğunu ve domates bitkilerinde patojenik olduğunu doğrulamıştır. PCR, iki subsp.' e spesifik primer, CM 3 ve CM 4 kullanılarak protokolüne uygun olarak ve CMM 5 ve CMM 6 primerleri protokolde modifikasyonlar yapılarak uygulanmıştır. Amplifikasyon ürünleri, her iki metotta da 0.6 Kb lık DNA fragmenti olarak elde edilmiştir. Strainler, ayrıca serolojik olarak Agdia' dan elde edilen polikonal antibodi ve alkalin fosfatazla etiketli konjugat kullanılarak DAS-ELISA yöntemi ile test edilmiştir. Her iki tekniğin de patojeni tamlamadaki hassasiyeti, seçiciliği ve hızı test edilmiştir. PCR, patojeni tamlamada DAS-ELISA yöntemine göre daha hassas, spesifik ve hızlı bulunmuştur. PCR, patojeni 102 cfu/ml' de tespit edebilirken, DAS-ELISA tespit sının 107 cfu/ml' olmuştur. Bitki dokusundan patojeni tespit etmek için PCR, BIO-PCR, DAS-ELISA ve gövde baskı yöntemlerinin etkinliği ölçülmüştür. DNA extraksiyonu yapılmadan klasik PCR ile patojenin bitki homojenatından doğrudan tespiti yapılamamıştır. Diğer taraftan, BIO-PCR ile hastalık simptomu görülmeden bile patojen tespit edilebilmiştir. Bitki gövde ve yapraklarından elde edilen BIO-PCR ürünleri inokülasyondan 3 ve 6 günsonra test edilmiştir. Bitkinin erken gelişme devrelerinde özellikle bitki simptom göstermediğinde ve ürün tohum üretimine yönelik olduğunda patojenin tespit edilmesi için BIO-PCR uygun bulunmuştur. Gövde baskı tekniği yan seçici ortamda BIO-PCR'a benzer sonuçlar vermiştir. Bitki dokusundaki bakteri titresi teşhis edilebilir sınırlar içindeyse dokuz strain de DAS-ELISA ile tamlanabilmektedir. Patojen bu titreye gövde ve yaprakta sırasıyle 3 ve 6 günde ulaşabilmektedir. DYCA, KBT, CMS, mSCM ve CNS yan seçici ortamlarının Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis' in 9 straininin her birinin geri elde etme etkinlikleri değerlendirilmiştir. Strainler her ortamda farklı derecede geri elde edilmiştir. KBT ve CNS ortamlarında strainler bir birlerine çok benzemektedir. Ortamların geri eldeleri CMS, mSCM, KBT, DYCA ve CNS için sırasıyle % 96,84, % 84,6, % 74,5, % 69,2 ve % 63,68' tır. CMS ve KBT' in patojenin bitki dokusundan geri elde edilmesine olan etkileri araştırılmıştır. Saf kültüre göre daha düşük geri elde edilme oranlan görülmüştür (CMS % 43,1, KBT % 34,66). 2002, 69 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, PCR, BIO-PCR, DAS-ELISA ve Seçici ortamlar ABSTRACT Ph. D. Thesis USE OF MOLECULAR AND SEROLOGICAL METHODS IN IDENTIFICATION OF TOMATO BACTERIAL CANKER PATHOGEN (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) Mohamad Abdalla Omer Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Prof. Dr. Salih MADEN Nine strains of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis were obtained from different research workers in Turkey. The strains were subjected to some biochemical, physiological and pathogenicity tests. These tests confirmed that all strains tested belong to the subsp. michiganensis and were pathogenic on tomato plants. The classical polymerase chain reaction (PCR) was carried out using two subspecies- specific primer pairs, CM3 and CM4 in one method with its own protocol and CMM5 and CMM6 in the second method with a different protocol. Amplification products were produced with both methods for each of the nine strains where amplification of 0.6 Kb fragment of DNA was obtained. The strains were also identified serologically by double antibody sandwich (DAS) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using a polyclonal antibody and antibody conjugate alkaline phosphatase from Agdia. Both techniques were found successful in the identification of the C. m. michiganensis strains of Turkish origin. The sensitivity, specificity and rapidity of both techniques to detect and identify the pathogen were tested. The polymerase chain reaction (PCR) was foundmore sensitive, rapid and specific for the detection and identification of the pathogen than DAS-ELISA with polyclonal antibody. The polymerase chain reaction was able to detect the pathogen down to concentration less than 102 cfu/ml whereas the DAS- ELISA detection limit was found 107 cfu/ml. The abilities of PCR, BIO-PCR, DAS-ELISA, and stem printing to detect the pathogen in plant tissue were investigated. The classical PCR was unable to detect the pathogen in the plant homogenate without prior DNA extraction where no amplification products were obtained. On the other hand the BIO-PCR proved to be successful for detection of the pathogen even when the plant showed no disease symptoms. Amplification products were obtained with BIO-PCR from plant stems and leaves assayed three and six days after inoculation respectively. The BIO-PCR could be useful for the detection of the pathogen at early stages of the plant growth especially when the plants showing no symptoms and the crop was directed towards the production of seeds. The stem printing technique on the semi selective media produced results similar to the BIO-PCR. The nine strains were detected in plant tissue by DAS-ELISA when the bacterial titer in the plant tissue within the detectable limits. The pathogen could reach this titer in three and six days in the stem and the leaf respectively. The effectiveness of five semi-selective media DYCA, KBT, CMS, mSCM and CNS for the recovery of each of the nine strains of C. m. michiganensis was evaluated. The strains were varied in the degree with which were recovered on each medium. In case of KBT and CNS the strains were more or less similar to each other. Average recovery percentages were 96.84%, 84.6%, 74.5%, 69.2% and 63.68% for CMS, mSCM, KBT, DYCA, and CNS respectively. The effectiveness of CMS and KBT to recover the pathogen from plant tissue was investigated. Lower recovery percentages (CMS, 43.1% and KBT, 34.66%) compared to those obtained in case of pure culture were obtained. 2002, 69 pages Key Words: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, PCR, BIO-PCR, DAS- ELISA and selective media 69