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La present tesi es centra en el desenvolupament i optimització d’una estratègia basada en la biocatàlisi per a la síntesi d’amines quirals, les quals són compostos òpticament actius de gran valor que poden ésser utilitzats per a la síntesi de nombrosos productes, especialment en les indústries farmacèutica i agroquímica. Més concretament, es pretén sintetitzar 3-amino-1-fenilbutà (3-APB) i 1-feniletilamina (1-PEA) a través de la reacció en cascada de la transaminasa (TA) i la piruvat decarboxilasa (PDC). Aquesta cascada es basa en una síntesi asimètrica que parteix de les seves corresponents cetones proquirals i l’alanina, i és catalitzada per omega-transaminases, les quals presenten un equilibri desfavorable. Per tal de solucionar aquest problema, la PDC actua com un sistema d’eliminació de producte secundari, a través de la transformació del piruvat a acetaldehid i CO2, la qual cosa provoca un desplaçament de l’equilibri. Amb l’objectiu de superar les limitacions comercials de la PDC, la qual només es pot obtenir en petites quantitats a un cost alt, es va desenvolupar un procés sencer de producció d’aquest enzim. Es va clonar i sobreexpressar el gen de la PDC de Zymobacter palmae (ZpPDC) en Escherichia coli. Posteriorment, es va obtenir l’enzim recombinant en grans quantitats a través del desenvolupament d’un procés de cultiu d’alta densitat cel·lular en bioreactor. Pel que fa a les TAs, es disposava de quatre enzims diferents, procedents de Chromobacterium violaceum (Cvi-TA), Vibrio fluvialis (Vfl-TA) i Aspergillus terreus (Ate-TA i Ate-TA_T247S). Es va caracteritzar tant la PDC com les quatre transaminases per tal de trobar les condicions de compromís adequades per a la construcció de la cascada enzimàtica. Tenint en compte les condicions trobades, es va dur a terme, de forma preliminar, reaccions de cribratge de les quals en van sortir seleccionades la Cvi-TA i la Vfl-TA per a la síntesi de 3-APB; i Vfl-TA per a la síntesi de 1-PEA. Després de demostrar la viabilitat de la reacció en cascada de la TA i la PDC, es van aplicar diferents estratègies d’optimització per tal de maximitzar els rendiments de reacció i millorar la baixa estabilitat operacional de les transaminases. Per una banda, es van explorar algunes estratègies d’optimització de les condicions de reacció. Per l’altra, es va aplicar enginyeria del medi de reacció. Posteriorment, es va dur a terme d’immobilització dels enzims. Es van obtenir derivats immobilitzats tant de la Cvi-TA com de la Vfl-TA en suports de MANA-agarosa i epoxy-agarosa. En el cas de la PDC, es va desenvolupar un sistema innovador de purificació i immobilització simultània en MANA-agarosa. Finalment, els enzims immobilitzats obtinguts van ser aplicats en reacció i es va desenvolupar una estratègia de reacció en cicles. La presente tesis se centra en el desarrollo y optimización de una estrategia basada en la biocatálisis para la síntesis de aminas quirales, las cuales son compuestos ópticamente activos de gran valor que pueden ser utilizados para la síntesis de numerosos productos, especialmente en las industrias farmacéutica y agroquímica. Más concretamente, se pretende sintetizar 3-amino-1-fenilbutano (3-APB) y 1-feniletilamina (1-PEA) a través de la reacción en cascada de la transaminasa (TA) y la piruvato decarboxilasa (PDC). Esta cascada se basa en una síntesis asimétrica que parte de sus correspondientes cetonas proquirales y la alanina, y es catalizada por omega-transaminasas, las que presentan un equilibrio desfavorable. Para solucionar este problema, la PDC actúa como un sistema de eliminación de producto secundario, a través de la transformación del piruvato en acetaldehído y CO2, lo que provoca un desplazamiento del equilibrio. Con el objetivo de superar las limitaciones comerciales de la PDC, la cual sólo se puede obtener en pequeñas cantidades a un coste alto, se desarrolló un proceso entero de producción de esta enzima. Se clonó y sobreexpresó el gen de la PDC de Zymobacter Palmae (ZpPDC) en Escherichia coli. Posteriormente, se obtuvo la enzima recombinante en grandes cantidades a través del desarrollo de un proceso de cultivo de alta densidad celular en bioreactor. En cuanto a las TAs, se disponía de cuatro enzimas diferentes, procedentes de Chromobacterium violaceum (Cvi-TA), Vibrio fluvial (Vfl-TA) y Aspergillus Terreus (Ate-TA y Ate-TA_T247S). Se caracterizó tanto la PDC como las cuatro transaminasas con el fin de encontrar las condiciones de compromiso adecuadas para la construcción de la cascada enzimática. Teniendo en cuenta las condiciones encontradas, se llevó a cabo, de forma preliminar, reacciones de cribado de las que salieron seleccionadas la Cvi-TA y la Vfl-TA para la síntesis de 3-APB; y Vfl-TA para la síntesis de 1-PEA. Tras demostrar la viabilidad de la reacción en cascada de la TA y la PDC, se aplicaron diferentes estrategias de optimización para maximizar los rendimientos de reacción y mejorar la baja estabilidad operacional de las transaminasas. Por un lado, se exploraron algunas estrategias de optimización de las condiciones de reacción. Por el otro, se aplicó ingeniería del medio de reacción. Posteriormente, se llevó a cabo de inmovilización de las enzimas. Se obtuvieron derivados inmovilizados tanto de la Cvi-TA como de la Vfl-TA en soportes de MANA-agarosa y epoxy-agarosa. En el caso de la PDC, se desarrolló un sistema innovador de purificación e inmovilización simultánea en MANA-agarosa. Finalmente, las enzimas inmovilizadas obtenidas fueron aplicadas en reacción y se desarrolló una estrategia de reacción en ciclos. The present thesis is focused on the development and optimization of a biocatalytical approach for the synthesis of chiral amines, which are highly valuable optically active compounds that can be used for the synthesis of numerous targets, especially in pharmaceutical and agrochemical industry. More specifically, 3-amino-1-phenylbutane (3-APB) and 1-phenylethylamine (1-PEA) synthesis is pretended by the cascade reaction of transaminase (TA) and pyruvate decarboxylase (PDC). The mentioned cascade consists in an asymmetric synthesis from their corresponding prochiral ketones and alanine catalyzed by omega-transaminase, which presents an unfavorable equilibrium. To overcome this problem, PDC acts as a by product removing system by transforming the resulting pyruvate to acetaldehyde and CO2, which leads to an equilibrium shift. Aiming to overcome the low PDC commercial availability, which can only be acquired at low amounts and a high cost, a whole production process was developed. Zymobacter palmae PDC (ZpPDC) gene was cloned and overexpressed in Escherichia coli. After that, high amounts of the recombinant enzyme were obtained by the development of a high-cell density culture process in bench-top bioreactor. Regarding TA, four different enzymes were available from Chromobacterium violaceum (Cvi-TA), Vibrio fluvialis (Vfl-TA) and Aspergillus terreus (Ate-TA and Ate-TA_T247S). Both PDC and the different transaminases were characterized to find out the appropriate compromise conditions to construct the enzymatic cascade. Taking into account the found conditions, preliminary screening reactions were carried out, from which Cvi-TA and Vfl-TA were selected for the synthesis of 3-APB; and Vfl-TA for the synthesis of 1-PEA. After proving the feasibility of TA and PDC cascade reaction, different optimization approaches were applied in order to maximize reaction yields and to improve the low transaminase operational stability. On the one hand, reaction conditions optimization approaches were explored. On the other, reaction medium engineering was applied. After that, enzyme immobilization was carried out. Immobilized derivatives of both Cvi-TA and Vfl-TA were obtained in MANA-agarose and epoxy-agarose supports. In the case of PDC, an innovative simultaneous purification and immobilization process was developed using MANA-agarose. Finally, the obtained immobilized enzymes were applied in reactions and a reaction cycle strategy was developed. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biotecnologia

El síndrome de Cushing es un trastorno endocrino que causa infertilidad anovulatoria secundaria a hipercortisolismo; por lo tanto, el embarazo rara vez ocurre durante su curso. Presentamos el caso de una mujer de 24 años, gestante de 16 semanas, con aumento de peso no intencionado de 10 meses de evolución, giba dorsal, comedones no pruriginosos, hirsutismo y caída del cabello. Las investigaciones bioquímicas, hormonales y ecográficas iniciales revelaron hipopotasemia, aumento de la cortisolemia nocturna y una masa suprarrenal derecha. El paciente presentaba hipertensión arterial persistente, hiperglucemia e hipercortisolemia. Inicialmente fue tratada con medicamentos antihipertensivos y terapia con insulina. El síndrome de Cushing endógeno se confirmó mediante una resonancia magnética abdominal que demostró un adenoma suprarrenal derecho. El paciente fue sometido a suprarrenalectomía laparoscópica derecha y el examen anatomopatológico reveló un adenoma suprarrenal con áreas de cambios oncocíticos. Finalmente, se redujo progresivamente la medicación antihipertensiva y se logró el control glucémico y la reversión de la hipopotasemia. La terapia a largo plazo consistió en prednisona diaria en dosis bajas. Durante el seguimiento, a pesar de los resultados favorables con respecto al síndrome de Cushing de la paciente, se confirmó la muerte fetal a las 28 semanas de embarazo. Discutimos la importancia del diagnóstico y tratamiento temprano del síndrome de Cushing para prevenir complicaciones maternas y fetales graves. La terapia a largo plazo consistió en prednisona diaria en dosis bajas. Durante el seguimiento, a pesar de los resultados favorables con respecto al síndrome de Cushing de la paciente, se confirmó la muerte fetal a las 28 semanas de embarazo. Discutimos la importancia del diagnóstico y tratamiento temprano del síndrome de Cushing para prevenir complicaciones maternas y fetales graves. La terapia a largo plazo consistió en prednisona diaria en dosis bajas. Durante el seguimiento, a pesar de los resultados favorables con respecto al síndrome de Cushing de la paciente, se confirmó la muerte fetal a las 28 semanas de embarazo. Discutimos la importancia del diagnóstico y tratamiento temprano del síndrome de Cushing para prevenir complicaciones maternas y fetales graves. Cushing’s syndrome is an endocrine disorder that causes anovulatory infertility secondary to hypercortisolism; therefore, pregnancy rarely occurs during its course. We present the case of a 24-year-old, 16-week pregnant female with a 10-month history of unintentional weight gain, dorsal gibbus, nonpruritic comedones, hirsutism and hair loss. Initial biochemical, hormonal and ultrasound investigations revealed hypokalemia, increased nocturnal cortisolemia and a right adrenal mass. The patient had persistent high blood pressure, hyperglycemia and hypercortisolemia. She was initially treated with antihypertensive medications and insulin therapy. Endogenous Cushing’s syndrome was confirmed by an abdominal MRI that demonstrated a right adrenal adenoma. The patient underwent right laparoscopic adrenalectomy and anatomopathological examination revealed an adrenal adenoma with areas of oncocytic changes. Finally, antihypertensive medication was progressively reduced and glycemic control and hypokalemia reversal were achieved. Long-term therapy consisted of low-dose daily prednisone. During follow-up, despite favorable outcomes regarding the patient’s Cushing’s syndrome, stillbirth was confirmed at 28 weeks of pregnancy. We discuss the importance of early diagnosis and treatment of Cushing’s syndrome to prevent severe maternal and fetal complications.

La academia ha reconocido la necesidad de tener en cuenta tanto las métricas ambientales como las económicas a la hora de desarrollar procesos que, en última instancia, encontrarán aplicación en la fabricación de productos químicos. Las aminas quirales son porciones de moléculas que constituyen un grupo de "estructuras preferidas" (privileged scaffolds) que son frecuentes en los productos naturales, fármacos, agroquímicos y otros productos químicos, y que se incluyen habitualmente en el diseño de bibliotecas para el descubrimiento de nuevas drogas. También se conoce que el 80 % de los 20 fármacos más recetados en medicinas son aminas quirales, lo que hace que estos compuestos sean valiosos componentes básicos en la industria farmacéutica. Esta tesis tiene como objetivo principal investigar nuevos biocatalizadores en síntesis para la producción de aminas quirales, utilizando tanto enzimas reportadas como nuevas enzimas aún no identificadas. Mediante análisis de motivos aminoacídicos conservados detectados en secuencias disponibles y análisis de motivos de iminoreductasas reportados en paralelo a nuestro trabajo, se realizó una búsqueda de nuevas IRED. Como resultado, se han encontrado varias secuencias que cumplen con las características para ser potenciales enzimas reductoras de iminas. Además, se aplicó un enfoque de genome mining and motif análisis, para la selección de potenciales secuencias R--TA. A partir de 423 candidatos, la secuencia R--TA de Capronia semiimmersa fue seleccionada, clonada y expresada en Escherichia coli . La enzima expresada demostró aceptar D-alanina así como también isopropilamina como grupo aminodonor y tener actividad sobre una variedad importante de cetonas. Ademas, ha sido demostrada la aplicación de una cascada quimioenzimática novedosa para la síntesis regio y estereoselectiva de un panel de pirrolidinas 2,5-disustituidas a partir de las correspondientes 1,4-dicetonas. Al mismo tiempo, se logró establecer un sistema de desracemización de aminas en una misma reacción, con cinco biocatalizadores actuando paralelamente de manera simple y práctica. De esta forma se logran obtener las aminas enantioméricamente puras a partir de una mezcla racémica o a partir de la amina con estereoquímica opuesta. Por otra parte, se logró ampliar los sistemas enzimáticos aplicados a la síntesis de aminas quirales, para ello se utilizó un nuevo tipo de transaminasa bifuncional denominada ,- DTAs, perteneciente a la metabolización de la putrescina. Este nuevo sistema, requiere solamente 3-5 equivalentes de aminodonor en el medio de reacción en contraste a los 50-500 equivalentes de grupo aminodonor utilizados normalmente.

Se evaluó en el plasma sanguíneo del hámster dorado (Mesocrisetus auratus L.) el contenido total de proteína (PT), albúmina (Alb), globulinas (Glb), urea (U), ácido úrico (AU), creatinina (Ct) y los niveles de transaminasas (glutámico oxal-acética (TGO) y glutámico-pirúvica (TGP)) a partir del consumo de dietas (proteína bruta; PB= 13,5-19,6%) con harina de lombriz roja (HL) (Eisenia spp.) y dos alimentos convencionales (Coneja-rina®; PB= 11,4% y Ratarina®; PB= 21,1%). La concentración de PT, Alb, Glb y Ct osciló entre 5-6; 2-3; 2-3 g/dL y 0,3-0,4 mg/dL, respectivamente, sin observarse diferencias significativas entre las dietas (p>0,05). En todo el experimento los niveles de U y AU fluctuaron entre 23-101 y 3-9 mg/dL, respectivamente, en función del nivel de PB, la inclusión de HL y el momento de muestreo. Los niveles de transaminasas fueron elevados y variables, acorde al valor proteico de las dietas (TGO: 101-699 y TGP: 54-890 UI/L). Se comprobó que los contenidos séricos de PT, Glb, Alb y Ct fueron independientes de la inclusión de HL y los niveles de PB de cada alimento; mientras que la concentración de U (R2= 0,509*), TGO (R2= 0,661**) y TGP (R2= 0,524*) se encontraron relacionados con los valores proteicos de las raciones, y el contenido de U (R2= 0,502*) y AU (R2= 0,531*) con la inclusión de HL. La adición de HL en proporciones de 24, 27 y 30% a dietas formuladas para M. auratus aumenta significativamente los valores normales de U, AU y transaminasas.

Tesis (Doctorado en Ciencias en Biología Molecular) "Las transaminasas de aminoácidos de cadena ramificada (BCAAT), de L-valina, Lisoleucina y L-leucina (VIL) participan en la biosíntesis y degradación de VIL. Los genes y mecanismos del metabolismo de VIL en la levadura Lachancea kluyveri no se han identificado funcionalmente. Para elucidar los elementos involucrados en ese metabolismo en L. kluyveri analizamos su genoma e identificamos el gen (LkBAT1) ortólogo al gen ScBAT1 de Saccharomyces cerevisiae. Adicionalmente, encontramos otro gen (LkBAT1bis) que es muy similar en secuencia a LkBAT1 y ScBAT1, y si codificara una proteína, ésta estaría trunca en el carboxilo teminal. Para caracterizar funcionalmente estos genes, se generaron las mutantes sencillas y la doble mutante en los genes LkBAT1 y LkBAT1bis, y se hicieron ensayos para probar el papel funcional de los genes en el metabolismo de VIL. Encontramos que el gen LkBAT1 es necesario para el metabolismo de VIL, y actividad de BCAAT en la cepa que expresa LkBAT1 pero no en la cepa mutante Lkbat1. La complementación heteróloga de genes entre S. cerevisiae y L. kluyveri confirmó que LkBAT1 y ScBAT1 son ortólogos funcionales. Se determinó que LkBat1 se localiza principalmente en mitocondria, y la regulación transcripcional de LkBAT1 no depende de la calidad de la fuente de nitrógeno. LkBAT1bis no parece participar en el metabolismo de VIL, pero ambos genes (LkBAT1 y LkBAT1bis) son necesarios para asimilar etanol, una fuente de carbono no fermentable. Estos resultados sugieren que el gen LkBAT1 codifica para una transaminasa de aminoácidos de cadena ramificada y LkBAT1 y LkBAT1bis participan en el metabolismo respiratorio." "Branched chain aminoacid transaminases (BCAAT) have a functional role on the biosynthesis and catabolism of L-valine, L-isoleucine and L-leucine (VIL). In Lachancea kluyveri, the genes and mechanisms for VIL metabolism have not been identified. To elucidate the elements involved in the biosynthesis and catabolism of VIL in L. kluyveri, we survey the genome of this yeast and we found the orthologous gene (LkBAT1) to the S. cerevisiae ScBAT1 gene. In addition, we found another ORF (LkBAT1bis) which is highly similar to LkBAT1 and this gene encodes for a hypothetical protein which is truncated at its C-terminus. To assess the function of these genes, we constructed the single mutants and the double mutant in the Lkbat1 and Lkbat1bis genes. We found that LkBAT1 is needed in the VIL metabolism and that Lkbat1 null mutant did not show transaminase activity. Heterologous complementation assays between S. cerevisiae and L. kluyveri confirmed that LkBAT1 and ScBAT1 are functional orthologous genes. Furthermore, LkBat1 is localized in the mitochondria, and the transcriptional regulation of LkBAT1 does not depend on the nitrogen source quality. LkBAT1bis has no role in VIL metabolism, however, both genes (LkBAT1 and LkBAT1bis) are needed for the assimilation of ethanol, a non-fermentable carbon source. These results suggest that LkBAT1 encodes for a BCAAT and that both genes (LkBAT1 and LkBAT1bis) have a role in the respiratory metabolism."

Se evaluó en el plasma sanguíneo del hámster dorado (Mesocrisetus auratus L.) el contenido total de proteína (PT), albúmina (Alb), globulinas (Glb), urea (U), ácido úrico (AU), creatinina (Ct) y los niveles de transaminasas (glutámico oxalacética (TGO) y glutámico-pirúvica (TGP)) a partir del consumo de dietas (proteína bruta; PB= 13,5-19,6%) con harina de lombriz roja (HL) (Eisenia spp.) y dos alimentos convencionales (Conejarina®; PB= 11,4% y Ratarina®; PB= 21,1%). La concentración de PT, Alb, Glb y Ct osciló entre 5-6; 2-3; 2-3 g/dL y 0,3-0,4 mg/dL, respectivamente, sin observarse diferencias significativas entre las dietas (p>0,05). En todo el experimento los niveles de U y AU fluctuaron entre 23-101 y 3-9 mg/dL, respectivamente, en función del nivel de PB, la inclusión de HL y el momento de muestreo. Los niveles de transaminasas fueron elevados y variables, acorde al valor proteico de las dietas (TGO: 101-699 y TGP: 54-890 UI/L). Se comprobó que los contenidos séricos de PT, Glb, Alb y Ct fueron independientes de la inclusión de HL y los niveles de PB de cada alimento; mientras que la concentración de U (R²= 0,509*), TGO (R²= 0,661**) y TGP (R²= 0,524*) se encontraron relacionados con los valores proteicos de las raciones, y el contenido de U (R²= 0,502*) y AU (R²= 0,531*) con la inclusión de HL. La adición de HL en proporciones de 24, 27 y 30% a dietas formuladas para M. auratus aumenta significativamente los valores normales de U, AU y transaminasas. Content of total protein (PT), albumin (Alb), globulins (Glb), urea (U), uric acid (AU), creatinine (Ct) and transaminase levels (oxalacetic-glutamic (TGO) and piruvic-glutamic (TGP)) was evaluated in the blood plasm of golden hamster (Mesocrisetus auratus L.), fed diets (crude protein; PB= 13.5-19.6%) with red worm (HL) (Eisenia spp.) meal and two conventional feeds (Conejarina®; PB= 11.4% and Ratarina®; PB= 21.1%). The PT, Alb, Glb and Ct concentration oscillated among 5-6, 2-3, 2-3 g/dL y 0,3-0,4 mg/dL, respectively, no significant differences among the treatments in the assay were observed (p>0.05). In the assay the U and AU content fluctuated between 23-101 y 3-9 mg/dL, respectively; according to the PB level, HL inclusion and measurement time. The transaminase levels were high and variables during the second week of assay, according to the proteic level diets (TGO: 101-699 y TGP: 54-890 UI/ L). The seric PT, Glb, Alb and Ct content were independent of PB diets and HL proportion, while the U (R²= 0.509*), TGO (R²= 0.661**) and TGP (R²= 0.524*) level were related with proteic level of diets, and the U (R²= 0.502*) and AU (R²= 0.531*) contents with the HL inclusion. The HL addition in 24, 27 and 30% for making formulated proteic diets to M. auratus cause significant variation in the normal values of U, AU and transaminases.