Suoliston bakteerit: kuoleman jälkeiset muutokset, kulkeutuminen ja yhteys alkoholimaksakirroosiin Suoliston mikrobioston, jonka on arvioitu koostuvan noin 10 14 bakteerista, tiedetään vaikuttavan isäntänsä hyvinvointiin ja se on myös liitetty erilaisiin sairauksiin kuten alkoholimaksakirroosiin. On oletettu, että alkoholi muuttaa suoliston bakteeriston koostumusta ja lisää bakteerien kulkeutumista suolistosta maksaan. Nämä bakteerit ja niiden jäännökset voisivat sitten aiheuttaa maksassa kroonisen tulehdustilan, joka voi lopulta johtaa kirroosiin. Kuoleman jälkeen bakteerit alkavat siirtyä elimiin osana luonnollista hajoamisprosessia. Bakteerien siirtymistä suolen ontelosta vereen ja sisäelimiin tapahtuu normaalisti myös elämän aikana, joskin immuunijärjestelmä hankkiutuu näistä bakteereista eroon. Kuoleman jälkeisiä suoliston bakteeriryhmien muutoksia ja näiden bakteerien kulkeutumista elimiin on tutkittu vain vähän. Tämän vuoksi ei tiedetä, voidaanko kuoleman jälkeen otetuilla näytteillä tutkia elämän aikaisia tapahtumia. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena on selvittää miten suoliston bakteeristo kuoleman jälkeen muuttuu ajan mukaan sekä miten nämä bakteerit kulkeutuvat kudoksiin. Sovelsimme näitä saatuja tuloksia suolistobakteerien roolin määrittämisessä alkoholimaksakirroosissa. Tuloksemme osoittavat ruumiinavausten peräsuolinäytteiden verrattavuuden elävien ihmisten ulostenäytteisiin. Tiettyjen bakteeriryhmien määrät eivät muuttuneet, joten kuoleman jälkeen otettuja ulostenäytteitä voidaan käyttää näiden bakteeriryhmien tutkimuksessa. Parhaat ja luotettavimmat kudosten näytteenottopaikat mikrobiologisiin tarkoituksiin olivat sydänpussineste ja maksa aina 5 päivään saakka kuoleman jälkeen. Maksaa ja sydänpussinestettä voidaan käyttää erilaisten elämänaikaisten tautimekanismien tutkimuksessa ja sydänpussinestettä jopa mikrobiologisena kontrollina kuoleman jälkeiselle kontaminaatiolle ja bakteerien kulkeutumiselle. Jos näistä näytteistä löytyy yksittäisiä bakteereita, niiden voidaan ajatella edustavan oikeaa elämänaikaista infektiota. Tutkimustuloksemme ehdottavat myös suoliston bakteereilla olevan rooli alkoholimaksakirroosin synnyssä. Löysimme lisääntyneen määrän Enterobactericeae-heimon bakteereja kirrootikkojen ulosteista, maksoista ja askitesnestenäytteistä. Kirrootikoilla oli myös lisääntynyt ilmentymisprosentti CD14 bakteerien tunnistus reseptorille; yhteys CD14 ja kokonaisbakteerimäärän välillä nähtiin kirrootikkojen maksanäytteissä. Tuloksemme viittaavatkin, että suoliston haitallisten Enterobactericeae-heimon bakteerien määrän kasvu voi johtaa niiden kulkeutumiseen maksaan ja lisääntyneeseen tunnistamiseen siellä Kupfferin solujen toimesta CD14 reseptorien kautta. Kupfferin solujen sytokiinien liikatuotanto voi johtaa maksan sidekudoistumiseen ja mahdollisesti jopa kirroosiin. The intestinal microbiota, that has been estimated to consist of around 10 14 bacteria, is known to affect the well-being of the host, and has been linked to various diseases such as alcoholic liver cirrhosis. Alcohol has been hypothesised to alter intestinal bacterial populations and enhance bacterial migration from the intestine into the liver. These bacteria and their residuals could then promote chronic inflammation that could eventually lead to fibrosis and cirrhosis. After death, bacteria start to migrate into the organs as a part of normal putrefaction. Bacterial migration, i.e., translocation from the intestinal lumen into the blood and visceral organs, occurs also normally during life. The time sequence of post-mortem changes in intestinal bacterial populations and their migration into organs has not been extensively studied. Therefore, it is not known whether results obtained from post-mortem samples reflect conditions during life. The aim of this doctoral thesis was to examine time-dependent changes in the intestinal microbiota after death and the translocation of these bacteria into tissues. Finally, we used these results to evaluate the role of intestinal bacteria in alcoholic liver cirrhosis. Post-mortem changes in major intestinal bacterial groups (Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Clostridium coccoides, Clostridium leptum group, Enterobactericeae, Lactobacillus spp.) and Streptococcus spp. were evaluated in 61 rectal and ceacal samples obtained at autopsy and in 7 healthy volunteers using quantitative real-time PCR (RT-qPCR, Study I). Bacterial migration after death into the liver, mesenteric lymph nodes, pericardium, portal vein and peripheral blood was examined in a time-dependent manner with RT-qPCR and conventional bacterial culturing in 33 post-mortem samples. RT-qPCR was used to study the following bacterial groups: Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Clostridium leptum group, Clostridium coccoides group, Enterobacter spp., Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. (Study II). The composition of selected intestinal bacteria (Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Clostridium leptum group, Enterobactericeae and Lactobacillus spp.) was investigated in 42 rectal samples obtained at autopsy (13 cirrhotics, 15 alcoholics, and 14 controls) and in faecal samples from 7 healthy volunteers (Study III). Intestinal bacterial translocation into the liver (n=42) and its association with cirrhosis and ascites (n=12) was also studied with RT-qPCR and CD14 immunohistochemistry. Our results show that the relative amounts of Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Clostridium spp., Streptococcus spp., Enterobactericeae and Lactobacillus spp. remained stable in the rectum for up to 5 days after death (Study I). The proportions of the major intestinal bacteria populations in rectal autopsy samples were comparable to faecal samples from living persons. In contrast, post-mortem caecal samples proved to be microbiologically unreliable, as significant time-dependent post-mortem differences were observed in bacterial populations of Bacteroides spp. (p=0.014) and Lactobacillus spp. (p=0.024, Study I). Bacterial culturing and RT-qPCR analyses revealed the presence of bacteria in peripheral blood soon after death as a result of post-mortem bacterial migration. Outside the intestinal tract, the most reliable post-mortem microbiological sampling sites at up to 5 days after death were the pericardial fluid and the liver (Study II). Based on the results of Studies I and II, cases over 5 days post-mortem were excluded from Study III, and RT-qPCR measurements of Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Clostridium leptum group, Enterobactericeae and Lactobacillus spp. were selected for the samples. Alcoholic liver cirrhotics harboured 27 times more DNA of Enterobactericeae in their faeces than living controls (p=0.011). Genomes of this bacterial species were also found in the liver and ascites samples from cirrhotics (Study III). The total amount of bacterial DNA was associated with the level of CD14 expression (p=0.045). Furthermore, the CD14 expression percentage was statistically significantly higher in cirrhotic livers than in autopsy controls (p=0.004, Study III). In conclusion, post-mortem samples from the rectum and liver can be used in basic research if taken within 5 days after death. Alcoholic cirrhotics harboured more gram-negative Enterobactericeae in their faeces and had higher amounts of Enterobactericeae in the liver. This suggests the possible involvement of intestinal bacteria in the development of alcoholic liver cirrhosis.