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La Facultat de Farmàcia i Ciències de l’Alimentació té com a objectiu contribuir a la salut i al benestar, en tots els àmbits de les ciències farmacèutiques i alimentàries mitjançant la formació de professionals competents, la promoció de la recerca, innovació i desenvolupament, i la creació, transferència i difusió del coneixement. Per tal d’incidir en la promoció de la recerca, la Comissió de Recerca ha organitzat la XII Jornada de Recerca, amb la col·laboració de Fedefarma. Els principals objectius de la jornada són, d’una banda donar a conèixer el col·lectiu d’estudiants directament implicats en recerca i afavorir la comunicació entre ells per fer més enriquidora la seva formació i promoure la seva interrelació tant a nivell de coneixements com metodològic, i en segon lloc transmetre la necessitat de potenciar la recerca, mostrant la recerca de qualitat que es desenvolupa en els diferents departaments.

Memòria que recull l'activitat principal realitzada a la Facultat de Farmàcia de la Universitat de Barcelona durant el curs acadèmic 2020-2021.

Memòria que recull l'activitat principal realitzada a la Facultat de Farmàcia de la Universitat de Barcelona durant el curs acadèmic 2019-2020.

Memòria que recull l'activitat principal realitzada a la Facultat de Farmàcia de la Universitat de Barcelona durant el curs acadèmic 2018-2019.

XIV Jornades d'Història de la Farmàcia. Barcelona, 15 i 16 de novembre de 2019. Col·legi de Farmacèutics de Barcelona. Organitzadors: Societat Catalana d’Història de la Farmàcia (en conveni amb la Facultat de Farmàcia i Ciències de l’Alimentació de la Universitat de Barcelona) i Col·legi de Farmacèutics de Barcelona., Les Jornades d'Història de la Farmàcia se celebren cada dos anys, des de 1993, amb dos objectius fonamentals: fomentar la relació personal entre els historiadors de la Farmàcia i oferir un marc per a ponències, comunicacions històriques i taules rodones sobre temes històrico-farmacèutics. Enguany, el Col·legi de Farmacèutics de Barcelona acull la seu de les Jornades en la XIVena edició, que dedica el tema central a "Les Col.leccions: objectes, documents i llibres que expliquen la Història de la Farmàcia" . Tant els historiadors, com els professionals, com els professors i investigadors de les diverses ciències farmacèutiques, com els estudiants de Farmàcia tenen una ocasió única d’aportar noves dades, debats i reflexions sobre les col·leccions que conserven i documenten la història de les diverses generacions d’apotecaris al llarg del temps; igualment, però, s’acceptaran, com sempre, comunicacions de tema lliure dins l’àmbit genèric de la història de la farmàcia.

La Facultat de Farmàcia i Ciències de l’Alimentació té com a objectiu contribuir a la salut i al benestar, en tots els àmbits de les ciències farmacèutiques i alimentàries mitjançant la formació de professionals competents, la promoció de la recerca, innovació i desenvolupament, i la creació, transferència i difusió del coneixement. Per tal d’incidir en la promoció de la recerca, la Comissió de Recerca ha organitzat la XII Jornada de Recerca, amb la col·laboració de Fedefarma. Els principals objectius de la jornada són, d’una banda donar a conèixer el col·lectiu d’estudiants directament implicats en recerca i afavorir la comunicació entre ells per fer més enriquidora la seva formació i promoure la seva interrelació tant a nivell de coneixements com metodològic, i en segon lloc transmetre la necessitat de potenciar la recerca, mostrant la recerca de qualitat que es desenvolupa en els diferents departaments.

La Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació té com a objectiu contribuir a la salut i al benestar, en tots els àmbits de les ciències farmacèutiques i alimentàries mitjançant la formació de professionals competents, la promoció de la recerca, innovació i desenvolupament, i la creació, transferència i difusió del coneixement. Per tal d’incidir en la promoció de la recerca, la Comissió de Recerca ha organitzat la XI Jornada de Recerca, amb la col·laboració de Federació Farmacèutica. Els principals objectius de la jornada són, d’una banda donar a conèixer el col·lectiu d’estudiants directament implicats en recerca i afavorir la comunicació entre ells per fer més enriquidora la seva formació i promoure la seva interrelació tant a nivell de coneixements com metodològic, i en segon lloc transmetre la necessitat de potenciar la recerca, mostrant la recerca de qualitat que es desenvolupa en els diferents departaments., Amb la col·laboració de Fedefarma

Memòria que recull l'activitat principal realitzada a la Facultat de Farmàcia de la Universitat de Barcelona durant el curs acadèmic 2016-2017.

[eng] Crohn’s disease and ulcerative colitis are chronic inflammatory bowel diseases that show perplexing heterogeneity which is poorly understood at a cellular level. We applied single-cell RNA sequencing and CosMxTM Spatial Molecular Imaging to human colon and observed profound changes in the epithelium of IBD patients with the presence of cell loss and the increase of markers linked to inflammation. Additionally, we found the highest diversity among patients in the myeloid and stromal compartment. We characterized for the first time the transcriptional signatures of intestinal neutrophils finding three different neutrophil states, including a CXCR4+ population not found in blood. We detected, in both healthy and inflamed colon, a novel resident macrophage population (M0), that differs from the previously described M2. In addition, we found uniquely in patients a variety of classical inflammatory M1 macrophages and a previously undescribed population that we called Inflammation-Dependent Alternative (IDA) macrophages. Single-cell transcriptomic, spatial data and immunostaining uncovered two distinct populations of IDA macrophages: subepithelial IDA macrophages highly expressing NRG1 that can act on the epithelium; and NRG1low IDA macrophages, which were expanded within the submucosa and in Crohn’s disease granulomas. NRG1 was found to be highly upregulated in IBD, especially UC. Remarkably, we also detected expression of NRG1 in peri-cryptal S2b fibroblasts in healthy tissue and in other fibroblast populations in IBD. Additionally, S2b fibroblasts express the neuromodulator NPY in healthy samples and was profoundly downregulated in IBD patients. Lamina propria S1 fibroblasts decrease in IBD but remaining cells show an increase in the expression of pro- inflammatory genes. Thus, the peri-cryptal and S1 fibroblasts suffer a rewiring in IBD. We also identified a population of inflammatory fibroblasts in IBD which had a unique transcriptomic profile. Remarkably, we observed high co-localization of inflammatory fibroblasts and novel IDA macrophages through CosMx SMI, suggesting cellular crosstalk. The combination of single-cell sequencing and spatial analysis allowed us to unravel the complexity of cell populations in inflammatory bowel disease and find potential cross- talks between cell types that could help in understanding the disease and identifying new therapeutic targets., [spa] La enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) son enfermedades crónicas inflamatorias del intestino (EEI) que muestran una heterogeneidad desconcertante que no está bien descrita a nivel celular. En este estudio hemos aplicado secuenciación de ARN de célula única y CosMxTM Spatial Molecular Imaging al colon humano y hemos observado cambios profundos en el epitelio de pacientes con EII con la presencia de pérdida celular y el aumento de marcadores vinculados a la inflamación. Además, encontramos la mayor diversidad entre pacientes en el compartimento mieloide y estromal. Caracterizamos por primera vez las firmas transcripcionales de los neutrófilos intestinales, encontrando tres estados diferentes de neutrófilos, incluida una población CXCR4+ no encontrada en sangre. Detectamos, tanto en el colon sano como inflamado, una nueva población de macrófagos residentes (M0), que difiere de la M2 descrita previamente. Además, encontramos de manera única en pacientes una variedad de macrófagos inflamatorios clásicos M1 y una población previamente no descrita que llamamos macrófagos alternativos dependientes de la inflamación (IDA). Los datos transcriptómicos de células únicas, espaciales y de inmunotinción nos permitieron descubrir dos poblaciones distintas de macrófagos IDA: macrófagos IDA subepiteliales altamente expresando NRG1 que pueden actuar sobre el epitelio; y macrófagos IDA con expresión baja de NRG1, que se expanden dentro de la submucosa y en los granulomas de un paciente de EC. Observamos que NRG1 estaba altamente regulado en la EII, especialmente en la CU. Sorprendentemente, también detectamos la expresión de NRG1 en fibroblastos S2b peri- criptales en tejido sano y en otras poblaciones de fibroblastos en EII. Además, los fibroblastos S2b expresan el neuromodulador NPY en muestras sanas y se redujeron profundamente en pacientes con EII. Los fibroblastos S1 de la lámina propia disminuyen en la EII pero las células restantes muestran un aumento en la expresión de genes proinflamatorios. Así, los fibroblastos peri-criptales y S1 sufren un recableado en la EII. También identificamos una población de fibroblastos inflamatorios en la EII que tenía un perfil transcriptómico único. Sorprendentemente, observamos una alta co-localización de fibroblastos inflamatorios y nuevos macrófagos IDA a través de CosMx SMI, lo que sugiere una diafonía celular. La combinación de secuenciación unicelular y análisis espacial nos permitió desentrañar la complejidad de las poblaciones celulares en la enfermedad inflamatoria intestinal y encontrar posibles interacciones cruzadas entre tipos celulares que podrían ayudar a comprender la enfermedad e identificar nuevos objetivos terapéuticos.

[spa] Las emulsiones W/W son dispersiones de dos fases acuosas inmiscibles, que presentan la compartimentalización multifásica de las emulsiones convencionales sin requerir la presencia de solvente orgánico ni tensioactivo y, debido a su contenido mayoritariamente acuoso, presentan una mayor biocompatibilidad. Cuando se mezclan dos soluciones acuosas poliméricas, se puede producir una separación de fases por dos mecanismos. El primero se denomina separación asociativa o coacervación compleja y ocurre cuando los dos polímeros se atraen mutuamente y dan lugar a una fase rica en la mezcla de los dos polímeros (coacervato), y la otra fase tiene una baja concentración polimérica. El segundo mecanismo se denomina separación segregativa y tiene lugar cuando se mezclan dos polímeros completamente incompatibles en solución, porque predominan las fuerzas de repulsión entre ellos, dando lugar a una fase rica en uno de los polímeros y una fase rica en el otro polímero; cuando se mezclan estas dos fases se pueden obtener emulsiones W/W. Se ha estudiado la formación y caracterización de emulsiones W/W formadas por mezclas de proteínas y polisacáridos. Para ello se han seleccionado polímeros biocompatibles y adecuadas para uso farmacéutico que presenten incompatibilidad en solución acuosa para dar lugar a la formación de emulsiones, como lo son el caseinato, alginato y pectina. Se realizaron estudios preliminares para seleccionar las mezclas de polímeros y las condiciones de pH a temperatura ambiente. Se han elaborado diagramas binarios donde se identificaron las zonas en las que podía formarse emulsiones. Se seleccionaron las formulaciones en las que se incorporaron posteriormente los principios activos. Actualmente, no se encuentran en la bibliografía estudios relacionados con el uso de este tipo de emulsiones en aplicaciones farmacéuticas; por ello, el objetivo de esta tesis doctoral es estudiar la incorporación de principios activos modelo, de carácter hidrofílico como hidrocloruro de clindamicina e hidrocloruro de metformina, y de carácter lipofílico como melatonina. Los principios activos estudiados en este trabajo y su incorporación en emulsiones W/W, han mostrado perfiles de cesión retardados en comparación con las soluciones poliméricas. Además, se ha logrado incorporar melatonina, una molécula lipofílica en una solución acuosa donde se añadió un porcentaje de etanol para facilitar su disolución. La estabilización de emulsiones W/W es un reto. En este trabajo se han estabilizado emulsiones W/W mediante métodos físicos y químicos. Entre los métodos físicos se ha estudiado la estabilización mediante partículas, ya que la presencia de partículas en la interfase disminuye la coalescencia de las gotas proporcionando una mayor estabilidad al sistema. Se ha utilizado para este fin, partículas de mucina y nanopartículas de PLGA. Entre los métodos químicos, se ha seleccionado la utilización un agente gelificante, glucono-delta- lactona. Se ha estudiado la estabilidad de las emulsiones macroscópicamente y microscópicamente. Se han obtenido emulsiones cinéticamente estables en periodos de 4 a 6 meses, logrando una mayor estabilidad cuando las formulaciones contenían mucina, en comparación con las emulsiones que no lo contenían. Mediante estudios reológicos se ha comprobado que las emulsiones estudiadas presentan un comportamiento pseudoplástico y que su viscosidad depende de la composición. Se ha estudiado la toxicidad de las emulsiones con los principios activos y los distintos agentes estabilizadores que se han utilizado, mediante cultivos celulares y a diferentes concentraciones. La biocompatibilidad de los excipientes utilizados y las propiedades de las emulsiones W/W desarrolladas permite considerarlas vehículos adecuados para aplicaciones farmacéuticas y alimentarias., [eng] W/W emulsions are dispersions of two immiscible aqueous phases, which exhibit the multiphase compartmentalization of conventional emulsions without requiring the presence of organic solvent or surfactant and, due to their mostly aqueous content, have a higher biocompatibility. When two aqueous polymer solutions are mixed, phase separation can occur by two mechanisms. The first is called associative separation or complex coacervation. It occurs when the two polymers attract each other and gives rise to a phase rich in the mixture of the two polymers (coacervate), and the different phase has a low polymer concentration. The second mechanism is called segregative separation and occurs when two completely incompatible polymers are mixed in solution because repulsive forces predominate between them, resulting in a phase rich in one of the polymers and a phase rich in the other polymer; when these two phases are mixed, W/W emulsions can be obtained. The formation and characterization of W/W emulsions formed by mixtures of proteins and polysaccharides have been studied. For this purpose, biocompatible polymers suitable for pharmaceutical use that are incompatible with aqueous solutions for the formation of emulsions, such as caseinate, alginate, and pectin, have been selected. Preliminary studies were conducted to select polymer blends and pH conditions at room temperature. Formulations were selected into which the active ingredients were subsequently incorporated. Binary diagrams have been developed where areas where emulsions could form, were identified. Currently, there are no studies in the literature related to the use of this type of emulsion in pharmaceutical applications; therefore, this doctoral thesis aims to study the incorporation of model active ingredients of a hydrophilic nature, such as clindamycin hydrochloride and metformin hydrochloride, and a lipophilic nature such as melatonin. The active ingredients studied in this work and their incorporation into W/W emulsions have shown delayed release profiles compared to polymeric solutions. In addition, melatonin, a lipophilic molecule, has been incorporated into an aqueous solution in which a percentage of ethanol was added to facilitate its dissolution. Stabilization of W/W emulsions is a challenge. In this work, W/W emulsions have been stabilized by physical and chemical methods. Among the physical methods, stabilization using particles has been studied since the presence of particles at the interface reduces the coalescence of the droplets, providing greater stability to the system. For this purpose, mucin particles and PLGA nanoparticles have been used. Among the chemical methods, a gelling agent, glucono-delta-lactone, has been selected. The stability of the emulsions has been studied macroscopically and microscopically. Kinetically stable emulsions were obtained over 4 to 6 months, achieving greater stability when the formulations contained mucin than emulsions that did not contain mucin. Rheological studies have shown that the emulsions exhibited pseudoplastic behavior and that their viscosity depends on the composition. The toxicity of the emulsions has been studied with the active ingredients and the different stabilizing agents used, using cell cultures and at different concentrations. The biocompatibility of the excipients used and the properties of the W/W emulsions developed allow them to be considered suitable vehicles for pharmaceutical and food applications.

[spa] Apremilast (APR) es un inhibidor selectivo de la fosfodiesterasa 4 que se administra por vía oral para el tratamiento de la psoriasis en placas de moderada a grave y la artritis psoriásica activa. La baja solubilidad y permeabilidad de este fármaco dificultan su administración dérmica. Uno de los propósitos de este estudio fue diseñar y caracterizar una microemulsión cargada con apremilast como terapia tópica para la inflamación local de la piel. Su composición se determinó mediante diagramas pseudoternarios. Se realizaron caracterizaciones físicas, químicas y biofarmacéuticas. Se estudió la estabilidad de esta formulación durante 90 días. Se evaluó la tolerabilidad de APR-ME en voluntarios sanos y se estudió su potencial antiinflamatorio mediante modelos in vitro e in vivo. Se obtuvo una formulación homogénea con comportamiento newtoniano y gotas de tamaño nanométrico y forma esférica. APR-ME liberó el fármaco incorporado siguiendo una cinética de primer orden y facilitó la retención del fármaco en la piel, asegurando un efecto local. Se observó potencial antiinflamatorio por su capacidad para disminuir la producción de IL-6 e IL-8 en el modelo in vitro. Este efecto se confirmó en el modelo in vivo histológicamente por la reducción de la infiltración de células inflamatorias e inmunológicamente por la disminución de las citocinas inflamatorias IL-8, IL-17A y TNFα. En consecuencia, estos resultados sugieren que esta formulación podría utilizarse como un atractivo tratamiento tópico para la inflamación cutánea. Por otro lado, la escasa solubilidad en agua de APR es el principal impedimento para la penetración del fármaco a través de la barrera cutánea. Otro de los objetivos del estudio era evaluar la permeabilidad de APR en diferentes soluciones enriquecidas con promotores de la penetración en muestras ex vivo de piel humana, y evaluar además su tolerancia in vivo. Para ello, se desarrollaron soluciones de APR con un 5% de promotor y se evaluó la capacidad del fármaco para penetrar en muestras de piel abdominal humana; los coeficientes de permeabilidad, las cantidades acumuladas permeadas y el flujo fueron algunos de los parámetros evaluados. Asimismo, se evaluó la tolerancia in vitro e in vivo de las soluciones. Los resultados obtenidos mostraron que las soluciones que contenían escualeno como promotor mejoraban la penetración de la APR en comparación con los otros promotores evaluados; del mismo modo, a escala in vitro en células HaCaT los promotores no resultaron tóxicos, encontrándose una viabilidad celular superior al 80% en las diferentes diluciones evaluadas. En las pruebas in vivo realizadas con APR-Escualeno presentó los mejores resultados. El escualeno se convierte en un excelente candidato para mejorar la permeabilidad del fármaco en el caso del desarrollo de una formulación tópica; además, se confirmó que este potenciador de la penetración no es ni tóxico ni irritante en contacto con la piel en ensayos in vivo., [eng] Apremilast (APR) is a selective phosphodiesterase-4 inhibitor that is administered orally for the treatment of moderate to severe plaque psoriasis and active psoriatic arthritis. The low solubility and permeability of this drug make dermal administration difficult. One of the purposes of this study was to design and characterize an apremilast-loaded microemulsion as a topical therapy for local skin inflammation. Its composition was determined using pseudoternary diagrams. Physical, chemical and biopharmaceutical characterizations were performed. The stability of this formulation was studied for 90 days. The tolerability of APR-ME was evaluated in healthy volunteers and its anti- inflammatory potential was studied by in vitro and in vivo models. A homogeneous formulation with Newtonian behavior and droplets of nanometer size and spherical shape was obtained. APR-ME released the incorporated drug following first-order kinetics and facilitated drug retention in the skin, ensuring a local effect. Anti-inflammatory potential was observed due to its ability to decrease IL-6 and IL-8 production in the in vitro model. This effect was confirmed in the in vivo model histologically by the reduction of inflammatory cell infiltration and immunologically by the decrease of inflammatory cytokines IL- 8, IL-17A and TNFα. Consequently, these results suggest that this formulation could be used as an attractive topical treatment for cutaneous inflammation. On the other hand, the poor water solubility of APR is the main impediment to the penetration of the drug through the skin barrier. Another objective of the study was to evaluate the permeability of APR in different solutions enriched with penetration promoters in ex vivo samples of human skin, and also to evaluate its in vivo tolerance. For this purpose, APR solutions with 5% promoter were developed and the ability of the drug to penetrate human abdominal skin samples was evaluated; permeability coefficients, permeated cumulative amounts and flux were some of the parameters evaluated. The in vitro and in vivo tolerance of the solutions was also evaluated. The results obtained showed that the solutions containing squalene as promoter improved the penetration of APR compared to the other promoters evaluated; likewise, at in vitro scale in HaCaT cells the promoters were not toxic, finding a cell viability higher than 80% in the different dilutions evaluated. In the in vivo tests carried out with APR-Squalene, it presented the best results. Squalene becomes an excellent candidate to improve drug permeability in the case of the development of a topical formulation; in addition, it was confirmed that this penetration enhancer is neither toxic nor irritating in contact with the skin in vivo tests.

[eng] Advances in structural and molecular biology have favoured the rational development of novel drugs thru structure-based drug design (SBDD). Particularly, computational tools have proven to be rapid and efficient tools for hit discovery and optimization. The main motivation of this thesis is to improve and develop new methods in the area of computer-based drug discovery in order to study challenging targets. Specifically, this thesis is focused on docking and Virtual Screening (VS) methodologies to be able to exploit non-standard sites, like protein-protein interfaces or allosteric sites, and discover bioactive molecules with novel mechanisms of action. First, I developed an automatic pipeline for binding mode prediction that applies knowledge- based restraints and validated the approach by participating in the CELPP Challenge, a blind pose prediction challenge. The aim of the first VS in this thesis is to find small molecules able to not only disrupt the RANK-RANKL interaction but also inhibit the constitutive activation of the receptor. With a combination of computational, biophysical, and cell-based assays we were able to identify the first small molecule binders for RANK that could be used as a treatment for Triple Negative Breast Cancer. When working with challenging targets, or with non-standard mechanisms of action, the relationship between binding and the biological response is unpredictable, because the biological response (if any) will depend on the biological function of the particular allosteric site, which is generally unknown. For this reason, we then tested the applicability of the combination of ultrahigh-throughput VS with low-throughput high content assay. This allowed us to characterize a novel allosteric pocket in PTEN and also describe the first allosteric modulators for this protein. Finally, as the accessible Chemical Space grows at a rapid pace, we developed an algorithm to efficiently explore ultra-large Chemical Collections using a Bottom-up approach. We prospectively validated the approach in BRD4 and identified novel BRD4 inhibitors with an affinity comparable to advanced drug candidates for this target., [cat] Els avenços en biologia estructural i molecular han afavorit el desenvolupament racional de nous fàrmacs a través del disseny de fàrmacs basat en l'estructura (SBDD). En particular, les eines computacionals han demostrat ser ràpides i eficients per al descobriment i l'optimització de fàrmacs. La principal motivació d'aquesta tesi és millorar i desenvolupar nous mètodes en l'àrea del descobriment de fàrmacs per ordinador per tal d'estudiar proteïnes complexes. Concretament, aquesta tesi se centra en les metodologies d'acoblament i de cribratge virtual (CV) per poder explotar llocs no estàndard, com interfícies proteïna-proteïna o llocs al·lostèrics, i descobrir molècules bioactives amb nous mecanismes d'acció. En primer lloc, vaig desenvolupar un protocol automàtic per a la predicció del mode d’unió aplicant restriccions basades en el coneixement i vaig validar l'enfocament participant en el repte CELPP, un repte de predicció del mode d’unió a cegues. L'objectiu del primer CV d'aquesta tesi és trobar petites molècules capaces no només d'interrompre la interacció RANK-RANKL sinó també d'inhibir l'activació constitutiva del receptor. Amb una combinació d'assajos computacionals, biofísics i basats en cèl·lules, vam poder identificar les primeres molècules petites per a RANK que es podrien utilitzar com a tractament per al càncer de mama triple negatiu. Quan es treballa amb proteïnes complexes, o amb mecanismes d'acció no estàndard, la relació entre la unió i la resposta biològica és impredictible, perquè la resposta biològica (si n'hi ha) dependrà de la funció biològica del lloc al·lostèric particular, que generalment és desconeguda. Per aquest motiu, després vam provar l'aplicabilitat de la combinació de CV d'alt rendiment amb assaig de contingut alt de baix rendiment. Això ens va permetre caracteritzar un nou lloc d’unió al·lostèric en PTEN i també descriure els primers moduladors al·lostèrics d'aquesta proteïna. Finalment, a mesura que l'espai químic accessible creix a un ritme ràpid, hem desenvolupat un algorisme per explorar de manera eficient col·leccions de productes químics molt grans mitjançant un enfocament de baix a dalt. Vam validar aquest enfocament amb BRD4 i vam identificar nous inhibidors de BRD4 amb una afinitat comparable als candidats a fàrmacs més avançats per a aquesta proteïna.

[eng] This research aims to study the effect of supplementation with docosahexaenoic acid (DHA) and antioxidants in older adults diagnosed with age-related macular degeneration or cataracts to contribute to preventive nutritional care and healthy ageing. This study involves a randomised and observed-blinded trial that included 106 patients >50 years of age with a previous diagnosis of Age-Related-Macular Degeneration (AMD) and was conducted in nine sites in Spain and Portugal between November 2014 and April 2018. We study the effect of a 2-year intervention with a nutritional supplement. Plasma samples were analysed at baseline and after 12 and 24 months to determine the fatty acid (FA) status. The omega-3 index (O3I) was additionally calculated to assess the coronary heart disease (CHD) mortality risk. Additionally, a review of another visual impairment and the effects on antioxidants was made to support the nutrition strategies as an essential factor for healthy ageing. The FA levels at baseline showed no differences between groups. However, at month 12 and 24-month follow-up, the mean changes in the polyunsaturated fatty acids (PUFAs) were statistically significantly different between the intervention and control groups except for the total omega-6 (n-6) long-chain (LC) PUFAs; thus, DHA, total omega-3 (n-3) PUFAs and total n-3 LCPUFAs showed a greater increase with the intervention than with the control treatment, with an effect size that was moderate to large. In contrast, the total n-6 PUFAs, total n-6 LCPUFAs and the ratios of n-6/n-3 PUFAs and LCPUFAs showed a greater decrease in the intervention group than in the control group. On the primary visual acuity assessment after a year, ETDRS letters had decreased with the intervention (N = 45; mean change −1.73, 95% CI −3.28 to −0.19) and in the control group (N = 48; mean change −0.10, 95% CI −2.03 to 1.83), for an estimated treatment difference between the intervention and control groups of –1.63 (95% CI –0.83 to 4.09; p = 0.192). The O3I at baseline exhibited both study groups at the second highest cardiovascular risk category (O3I >2.9 - 4.0). Nonetheless, by the 2-year intervention, the supplemented patients presented an O3I of 4.16%, reaching the second-best category of low risk for cardiovascular diseases (O3I >4.0 – 5.2), while the control group remained the same. Additionally, a review was conducted on the role of the antioxidant vitamin C in cataracts, another common eye disease to back up nutritional strategies as an essential factor in healthy ageing. While dietary intake of vitamin C might have a positive effect in cataracts, its supplementation does not show the same effect. The protective effects of vitamin C in cataracts still need to be clarified; further assessments are encouraged. The collection of analyses performed in this research allows us to confirm: 1)The link between FAs and health; 2) that DHA supplementation is promising to slow the progression of visual acuity loss in the older adult population with a previous AMD diagnosis; 3) the need to balance n-6, and n-3 proportions; 4) that DHA supplementation optimizes two markers of health, n6-n3 ratio and the O3I; 5) the antioxidant effect of vitamin C in cataracts remains unclear. Altogether, these results endorse the role of nutrition in healthy ageing decreasing the risk for NCDs, which are responsible for poor health and quality of life.

[spa] Alrededor del 10% de los pacientes con cáncer colorrectal metastático (mCRC) presentan la mutación BRAF(V600E), mutación que está asociada a una peor respuesta al tratamiento estándar con agentes quimioterapéuticos y a una menor supervivencia. Recientemente se ha aprobado el uso de la combinación encorafenib + cetuximab para el tratamiento del mCRC BRAF(V600E). Desafortunadamente, sólo un pequeño porcentaje de los pacientes responden a este tratamiento y una importante fracción de éstos recaen al poco tiempo, lo que hace que sea muy importante identificar los mecanismos asociados a la adquisición de resistencia a los inhibidores de BRAF (BRAFi) y la identificación de nuevas vulnerabilidades. En este proyecto, hemos descrito que en respuesta a terapias combinadas con BRAFi en CRC se da una inducción del programa hipóxico y angiogénico, la activación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs) y una transición a un fenotipo extremadamente mucinoso. Donde, la calidad de la ramificación de la estructura de las mucinas es necesaria para la adquisición de resistencia a las terapias BRAFi. Además, hemos observado un aumento de la expresión de MMP7, el cual promueve y mejora la liberación y accesibilidad de VEGFA bioactivo, lo que induce la angiogénesis tras el tratamiento en modelos preclínicos PDX y líneas celulares tratados con encorafenib + cetuximab + binimetinib. Estos acontecimientos generan una vulnerabilidad que nos dio la oportunidad de diseñar nuevas combinaciones racionales y efectivas añadiendo un inhibidor de VEGFA (VEGFAi) al tratamiento. Esta nueva combinación con el anticuerpo anti-angiogénico bevacizumab retrasó el tiempo de progresión de las terapias BRAFi y nos ha permitido establecer un ensayo clínico nuevo para validar este nuevo régimen terapéutico en pacientes de CRC con tumores BRAF(V600E). Paralelamente, hemos descrito que en pacientes de CRC la hipermetilación del promotor del gen BRCA1 puede reprimir su expresión, liderando así una deficiencia en la reparación por recombinación homóloga (HRD) y una sensibilidad a los inhibidores de PARP (PARPi). Además, hemos descrito de forma detallada un caso de CRC en el que el tratamiento y la progresión a los BRAFi da lugar a la selección de clones con una reparación homóloga funcional (HRP), los cuales provenían de una enfermedad que inicialmente presentaba HRD. De este caso, hemos extraído una firma de metilación que nos permitiría identificar casos con HRD de diferentes tipos tumorales. Esto es especialmente evidente en tumores donde la HRD es una alteración frecuente, como es el caso del adenocarcinoma de pulmón o el cáncer de ovario. Los datos obtenidos de este paciente apoyan el concepto de tratar a pacientes de CRC con PARPi mientras presenten una HRD. Son necesarios más estudios para refinar y validar el potencial de nuestra firma epigenética como marcador de selección de pacientes HRD sensibles a PARPi., [eng] Around 10% of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) present a BRAF(V600E) mutation, which is associated with a poor response to standard chemotherapy and shorter overall survival. The combination encorafenib + cetuximab has been recently approved for the treatment of mCRC BRAF(V600E). Unfortunately, only a small percentage of them respond to this treatment and a large fraction of patients relapse shortly, so it has become very important to identify the mechanisms associated to the acquired resistance to BRAF inhibitors (BRAFi) and the identification of new vulnerabilities. In this project, we described a hypoxic and angiogenic program induction, the activation of tumour associated fibroblasts (CAFs) and the transition to an extreme mucinous differentiation phenotype as a response to BRAFi- combined therapies in CRC. This drastic tumour tissue remodelling leads to a non-genetic drug resistance. In particular the quality of the branched structure in mucins is required for the acquisition of resistance to BRAFi therapies. Furthermore, we observed an increase in MMP7 expression that promoted an enhanced release of bioactive VEGFA accessible to induce angiogenesis upon treatment of preclinical PDX and cell line models with encorafenib + cetuximab + binimetinib. These events became a vulnerability that gave us the opportunity to design new rational and effective combinations adding a VEGFA inhibitor (VEGFAi) to the treatment. This new combination with the anti- angiogenic antibody bevacizumab delayed the time to progression to BRAFi therapy and led us to set a new clinical trial to validate such therapeutic regime in CRC patients with BRAF(V600E) tumours. In parallel, we describe that in CRC patients the hypermethylation of BRCA1 gene promoter can repress its expression leading to Homologous Repair Deficiency (HRD) and sensitivity to PARP inhibitors (PARPi). Here we also report in detail a CRC case in which treatment and progression to BRAF(V600E) inhibitory therapy selected Homologous Repair Proficient (HRP) clones from an initial disease presenting HRD. From this case, we extracted a methylation signature that could identify HRD cases suffering of different tumour types. This is particularly evident in tumours where HRD has been described as a frequent alteration, such as lung adenocarcinomas or ovarian cancer. Our real patient data supports the concept of treating CRC patients with PARP inhibitors as far as they present HRD. Future studies will be required to refine and validate the potential of our epigenetic signature as biomarker for selecting HRD patients sensitive to PARP inhibitors

[spa] Las enfermedades cardiovasculares (ECV), representan la principal causa de morbimortalidad en los países desarrollados y su aumento continúa a nivel mundial. Su denominación hace referencia a varias enfermedades de diferentes etiologías, cuya causa más común es la aterosclerosis. Sabemos que la adherencia a un estilo de vida poco saludable junto a unos malos hábitos alimentarios se traduce en un aumento del riesgo cardiovascular (RCV). Sin embargo, diversos estudios como el estudio PREDIMED han mostrado que seguir una dieta saludable como la Dieta Mediterránea (DietMed) y la práctica de actividad física (AF) de manera regular, podrían limitar o reducir la aparición de ECV y posiblemente con un menor uso de medicamentos para las ECV. La DietMed se caracteriza por una ingesta notable de aceite de oliva virgen extra, frutos secos, verduras, legumbres y cereales integrales, un consumo moderado de pescado, marisco y carne blanca, un bajo consumo de productos lácteos, carnes rojas y procesadas y la ingesta ocasional de alcohol en forma de vino en las principales comidas. Por otra parte, la AF regular se asocia con menores tasas de mortalidad cardiovascular y la mortalidad total. Varios factores de riesgo (FR) pueden ser modificados de forma efectiva mediante la práctica regular de ejercicio. Además, de medidas preventivas resulta fundamental la implantación de un tratamiento farmacológico. El objetivo de esta tesis doctoral es determinar si seguir una DietMed (en relación a una dieta control baja en grasas), incrementar la calidad de un patrón dietético o promover el consumo de alguno de sus alimentos principales (aceite de oliva, frutos secos, verduras, frutas, legumbres, cereales integrales, pescado, carnes blancas, lácteos fermentados) se asocia con un menor debut de individuos que deban iniciar un tratamiento nuevo de fármacos para el tratamiento de la diabetes, dislipemia, hipertensión, así como para evitar la aparición de trombos en una población de adultos mayores con alto riesgo cardiovascular en el marco del estudio PREDIMED. Adicionalmente, se pretende evaluar si la alta adherencia a la DietMed y la actividad física en tiempo libre (LTPA, por sus siglas en inglés) de forma individual y combinada, están asociadas con un menor riesgo de iniciar el uso de fármacos cardiometabólicos. Los resultados mostraron que una DietMed enriquecida con aceite de oliva virgen extra (AOVE) es capaz de disminuir el riesgo de iniciar el uso de inhibidores de la epóxido reductasa de vitamina K (ERK) respecto a la dieta control. El uso de ERK parece asociarse con un mayor riesgo de ECV en los participantes del grupo control. Por otra parte, se observó que una DietMed+AOVE es capaz de reducir el riesgo de iniciar el uso de medicamentos antihipertensivos en comparación con los participantes del grupo control un 14%. Además, se observó que en este mismo grupo hubo una disminución de intensificar la terapia antihipertensiva en los participantes que usaban dos fármacos al inicio del estudio. Finalmente, una alta adherencia a una DietMed junto con altos niveles de AF tuvieron un efecto sinérgico para reducir las concentraciones de glucosa y el uso de fármacos cardiovasculares. En conclusión, nuestro trabajo confirma los hallazgos previos y contribuye a la evidencia que seguir una DietMed mejora los FRCV y sugieren que este patrón dietético va asociado a una reducción en el riesgo de empezar a ser usuario de medicación para las ECV, reforzando la idea de que la DietMed es un patrón útil en la prevención de la enfermedad cardiometabólica en personas mayores con alto RCV. Además, en las personas con alto RCV, la adherencia a la DietMed en combinación con LTPA se asocia a una disminución del riesgo de iniciar medicamentos relacionados con ECV., [eng] INTRODUCTION: Cardiovascular diseases (CVD) represent the main cause of morbidity and mortality in developed countries and their cause is atherosclerosis. An unhealthy lifestyle together with poor eating habits increases cardiovascular risk (CVR). The PREDIMED study has shown that following a Mediterranean Diet (MedDiet) and practicing physical activity (PA) on a regular basis could reduce the appearance of CVD by 30%. The MedDiet is characterized by an intake of olive oil, nuts, vegetables, fruits, legumes, whole grains, fish, white meat, fermented dairy products. Also, regular PA is associated with lower rates of cardiovascular, as well as improvement of some risk factors. In addition to these preventive measures, the implementation of pharmacological treatment is essential. OBJECTIVES: The objective of this doctoral thesis is to determine wheter to follow a MedDiet (in relation to a low-fat control diet), increase the quality of a dietary pattern or promote the consumption of key foods in the MedDiet is associated with a lower debut of starting a new cardiometabolic treatment. In addition, it is intended to assess whether high adherence to the MedDiet and leisure-time physical activity (LTPA) individually or in combination, are associated with a lower risk of starting the use of these drugs. The results showed that a MedDiet enriched with extra virgin olive oil (EVOO) reduces the risk of starting the use of antithrombotic and antihypertensive compared to the control diet, reduces the risk of starting the use of antihypertensive drugs. RESULTS: The results showed that a MedDiet enriched with extra virgin olive oil (EVOO) reduces the risk of starting the use of antithrombotic and antihypertensive drugs. In addition, it was observed a decreased intensifying antihypertensive therapy in participants that used two drugs at baseline. Finally, high adherence to the MedDiet and regular PA had a synergistic effect on the reduction of glucose concentrations and the use of cardiovascular drugs. CONCLUSION: In conclusion, our work contributes to the evidence that following a MedDiet improves CVRF and suggests that this dietary pattern is associated with a reduced risk of starting to use CVD medication. Furthermore, in people with high CVR, adherence to the MedDiet in combination with LTPA is associated with a lower risk of starting a new CVD treatment.

[eng] L-type amino acid transporters play key roles in human physiology and are involved in several human pathologies such as primary inherited aminoacidurias (Feliubadaló et al., 1999; Torrents et al., 1999), autism spectrum disease (Tărlungeanu et al., 2016) and age-related hearing loss (Espino Guarch et al., 2018) among others. However, their complete and detailed transport mechanism is still unknown as the structures solved until now are most of them in the same conformational state, open-to-in, with an exception of LAT1 bound to inhibitors that showed for the first time an inward occluded conformation (Yan et al., 2021). To decipher LATs transport mechanism we have studied the bacterial LAT alanine- serine-cysteine exchanger BasC as a LAT model. With the objective to use BasC to translate from the already well described transport mechanism of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, which shares the same APC fold from the APC superfamily, to the current LAT transport mechanism in study here. BasC has been already characterized (Bartoccioni et al., 2019) and 3D structurally solved in complex with the specific nanobody 74 (Errasti-Murugarren et al., 2019). Here, the 29 nanobodies have been characterised for the following parameters. Firstly, nanobodies have been characterised by their binding to sort them by affinity through Surface Plasmon Resonance. Then, by their inhibition profile to unveil their side of interaction through inhibition screenings of BasC transport activity. Also, by their recognised conformation compatibilities between them through the feasibility of tertiary complex between BasC and nanobody pairs. Finally, for their possible conformational effect on BasC through single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (smFRET) measurements on TM1a on the cytoplasmic gate. In this regard, selected nanobodies could eventually force BasC to adopt these new conformations currently unavailable and solve them in complex through structural techniques such as X-ray crystallography and cryo-EM. Here we present two low-resolution structures of BasC-Nb71 and BasC-Nb53-58 complexes. Furthermore, the dynamics of this cytoplasmic gate were also studied under the effect of substrates (L- alanine and L-serine) and inhibitors (L-glutamine). It was detected an inward closing of the TM1a due to L-alanine and L-Serine but not due to the addition of L-glutamine, that did not provoke any closing effect by the cytosolic side. Even more, nanobodies became here a powerful tool to study the blocking effect of these substrate-induced effects. It was identified nanobody 71 as a strong blocker of it while nanobody 53 was not impeding this TM1a bend. These substrate-induced dynamic effects being blocked or not by nanobodies in combination with the two structures solved, sustains the designed smFRET approach, as the structure interactions between the nanobodies 71 and 53 towards BasC structurally explain the blocking effects of the TM1a dynamic results obtained by smFRET. Regarding the mechanism of transport of LATs, the seen substrate-induced closing effect of the cytoplasmic gate for the BasC WT variant has been studied on lysinuric protein intolerance (LPI) related variant (K154A). This Lys residue is highly conserved among all hLATs, located in the TM5 in a homologue region of the key Na2 site for the NSS family of the APC superfamily. It has been speculated the role of this conserved Lys to be one of the key factors for the sidedness of LATs and mainly responsible for the occlusion and opening of the thick gate in the cytosol. Here we obtained the first experimental evidence of the molecular mechanism deficiency when there lacks this Lys as the LPI related variant was unable to close the cytosolic gate. Overall, we present a useful approach that can be used to study the transport mechanism of membrane proteins and the miss functions of disease related variants., [cat] Els transportadors d’L-aminoàcids (LATs) tenen un paper capital en la fisiologia humana i estan involucrats en diverses patologies com les aminoacidúries primàries heretades (Feliubadaló et al., 1999; Torrents et al., 1999), l’espectre autista (Tărlungeanu et al., 2016) o la pèrdua d’oïda relacionada amb l’edat (Espino Guarch et al., 2018). Així i tot, el seu mecanisme de transport complet i en detall encara resta desconegut, atès que la gran majoria d’estructures resoltes fins a l’actualitat es troben en el mateix estat obert al citosol, amb la única excepció de LAT1 unit a inhibidors resolt tancat pel citosol (Yan et al., 2021). Amb la finalitat de revelar el mecanisme de transport dels LATs ens proposem emprar com a model l’intercanviador obligat bacterià d’alanina-serina-cisteïna (BasC). Aquest intercanviador ja ha estat prèviament caracteritzat funcionalment (Bartoccioni et al., 2019) i la seva estructura es va resoldre en complex amb el nanocòs específic 74 (Errasti-Murugarren et al., 2019). Els 29 nanocossos han sigut caracteritzats pels seus paràmetres d’unió, el seu costat d’interacció amb BasC i l’efecte conformacional que efectuen sobre BasC per assajos de transferència d’energia de ressonància fluorescent per molècules individuals (smFRET) sobre el TM1a de la porta citosòlica de BasC. Els estudis de smFRET ens han permès estudiar la dinàmica de tancament de la porta citosòlica induïda per l’adició de substrats, L-Ala i L-Ser. A més, s’ha comprovat que els nanocossos poden esdevenir una eina molt útil a l’hora de bloquejar certs moviments de la proteïna i, eventualment, bloquejar el transportador en un estat conformacional diferent del ja resolt, seleccionant els nanocossos prometedors per resoldre l’estructura de BasC en complex amb ells per tècniques estructurals com la cristal·lografia de raigs X o la crio-microscopia electrònica. Finalment, aquests efectes de tancament de la porta citosòlica induïts pels substrats van ser assajats sobre la variant relacionada amb la malaltia d’intolerància lisinúrica proteica de BasC (K154A). Aquesta variant ha resultat ser incapaç de tancar la porta citosòlica, esdevenint la primera evidència experimental sobre el rol clau d’aquest residu, K154, en el mecanisme de transport dels LATs, més concretament el tancament de la porta citosòlica. Al cap i a la fi, aquest projecte pretén presentar i posar a punt una tècnica que pot ser d’alta utilitat per estudiar el mecanisme de transport de proteïnes de membranes, així com els funcionament aberrants de les variants relacionades amb les malalties.

[eng] Obesity and its associated metabolic diseases are currently a priority research topic. The increase in global prevalence at different ages is having a huge economic and health impact. Genetic and environmental factors play a crucial role in the development of obesity, and diet is one of the main factors that directly contributes to the genic obese phenotype. Scientific evidence has shown that increased fat intake is associated with increased body weight that triggers obesity. Rodent animal models have been extremely useful in the study of obesity, as weight gain can be easily induced by a high-fat diet. On the other hand, thermogenesis is a process that our body uses to produce heat. Studies show that the body uses a variety of mechanisms to produce this effect, demonstrating that brown adipose tissue (BAT) is one of the main effector organs. In general, adipose tissue is the organ where energy is stored in the form of fat (triacylglycerols), while BAT, in particular, owes its name to the color that characterizes the presence of a large number of mitochondria, which have a high concentration of uncoupling proteins (UCP}, in addition to a good number of a and beta-adrenergic receptors and high vascularization. BAT is located in specific areas of the body such as the cervical area of the neck, armpits, associated with the ribs, around the heart and kidneys, showing a greater distribution in fetuses and newborns compared to adults. Understanding the activity of adipose tissue is important because of the involvement of this organ in the pathophysiology of obesity. Mitochondria burn fuels such as fatty acids and glucose into useful energy, consuming oxygen in the process. In addition, BAT has a high concentration of the protein UCP1 (uncoupling protein 1). This protein bypasses the respiratory chain, so instead of generating useful energy, it dissipates energy as heat. This function, known as non-shivering thermogenesis, is crucial in infants to maintain body temperature. BAT has emerged as an important regulator of energy expenditure in obesity by controlling thermogenesis. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A), a key enzyme in fatty acid oxidation (FAO), has been implicated in the control of energy homeostasis. However, the specific role of CPT1A in modulating BAT metabolism to control food intake and obesity is still highly unknown. The aim of this research work was to find new approaches to reduce obesity by activating CPT1A, and thus FAO, in BAT. For peripheral activation of FAO in BAT, the mutated and permanently active form (CPT1AM) was expressed. This was done in mice in vivo using adeno-associated (AAV) vectors. As a result, activation of CPT1A in BAT activated thermogenesis and reduced weight gain, identifying new strategy for potential therapy against obesity and its associated metabolic diseases, such as diabetes. In addition, our results showed that expression of CPT1AM in BAT increased lipolysis FAO and thermogenesis in BAT. The increase FAO in BAT prevented the increase in the content of triglycerides, cholesterol and insulin in the blood, and the expression of markers of obesity and inflammation in the tissues, caused by HFD. Our results show that FAO is critical in supplying fuel for BAT-generated thermogenesis, which may be a good strategy to increase energy expenditure through thermogenesis and thus avoid obesity and its associated diseases resulting from HFD., [spa] La obesidad y sus enfermedades metabólicas asociadas son actualmente un tema prioritario de investigación. Los factores genéticos y ambientales juegan un papel crucial en el desarrollo de la obesidad, y la dieta es uno de los principales factores que contribuye directamente al fenotipo obeso génico. Por otra parte, el tejido adiposo marrón (TAM) se ha convertido en un importante regulador del gasto de energía en la obesidad al controlar la termogénesis. La carnitina palmitoiltransferasa 1A (CPT1A), una enzima clave en la oxidación de ácidos grasos (OAG), se ha implicado en el control de la homeostasis energética. Sin embargo, el papel específico de CPT1A en la modulación del metabolismo de TAM para controlar la ingesta de alimentos y la obesidad aún es muy desconocido. El objetivo de este trabajo de investigación fue encontrar nuevos enfoques para reducir la obesidad activando CPT1A, y por lo tanto OAG, en TAM. Para la activación periférica de OAG en TAM, se expresó la forma mutada y permanentemente activa (CPT1AM). Esto se hizo en ratones in vivo utilizando vectores virales adenoasociados (AAVs). Como resultado, la activación de CPT1A en TAM activó la termogénesis y redujo el aumento de peso, identificando una nueva estrategia para la terapia potencial contra la obesidad y sus enfermedades metabólicas asociadas, como la diabetes. Además, nuestros resultados mostraron que la expresión de CPT1AM en TAM aumentó la lipólisis OAG y la termogénesis en TAM. El aumento de la OAG en TAM evitó el aumento del contenido de triglicéridos, colesterol e insulina en sangre, y la expresión de marcadores de obesidad e inflamación en los tejidos, provocados por la dieta alta en grasa. Nuestros resultados muestran que la OAG es fundamental en el suministro de combustible para la termogénesis generada por TAM, lo que puede ser una buena estrategia para aumentar el gasto energético a través de la termogénesis y así evitar la obesidad y sus enfermedades asociadas resultantes de la dieta alta en grasa.

[eng] Myotonic dystrophy type 1 (DM1), one of the more complex diseases already known, is the most common and multisystemic rare neuromuscular disease among adults, without cure and limited pharmacological treatments. In the light of the ´Leave No-one Behind´ commitment behind Sustainable Development Goals, the nutritional management of DM1 may provide a valuable strategy to improve the very limited quality of life of people living and suffering this minority disease. Our previous background research suggested that caffeine could elicit some positive effects on DM1. Therefore, the present research aimed to evaluate the potential of methylxanthines, to scientifically substantiate properly formulated food products based on methylxanthines, as a novel nutritional management approach in Myotonic Dystrophy type 1. Accordingly, the research disclosed herein comprises: technology surveillance on nutritional studies in DM1; natural sources of methylxanthines; food content and consumption of methylxanthines from natural sources; the regulatory framework for food products, particularly, food supplements and food for special medical purposes; as well as the European requirements for launching said food products into the market. In order to do so, the project required the complete food product research and development, from the definition of composition through in vitro and in vivo studies on DM1 models, to dose definition and development of galenic form, while carefully considering intellectual property constraints, such as patent protection status and freedom to operate studies. Then, an observational clinical study evaluating the background nutritional habits in a DM1 adults’ cohort precede the interventional clinical trial (study code NCT04634682) to measure the effect of the investigational food product on quality of life, fatigue and hypersomnia in DM1 adult patients. The data shown herein suggest that the controlled and dosed administration of the investigational food product could provide statistically significant improvements in diminishing excessive daytime sleepiness and increasing the 6-minute walking distance, at least in adult DM1 male. Excessive daytime sleepiness has been scored as one of the main aspects limiting the quality of life in DM1. Although the present pilot study encompassed a limited dataset, the obtained results encourage further clinical trials in larger cohorts, ideally to be performed beyond the era of COVID-19 pandemic., [cat] La Distròfia Miotònica de tipus 1 (DM1), una de les malalties més complexes que es coneixen, és una malaltia rara neuromuscular i multisistèmica, la més freqüent en adults, sense cura i amb tractaments farmacològics limitats. En el marc de ‘No deixar ningú enrere’ associat als Objectius de Desenvolupament Sostenible, el maneig nutricional de la DM1 pot proporcionar una estratègia valuosa per millorar la tant limitada qualitat de vida de les persones que conviuen i pateixen aquesta malaltia minoritària. La nostra recerca prèvia suggeria que la cafeïna podia induir alguns efectes positius en DM1. Per tant, la recerca actual tenia com a objectiu avaluar el potencial de la família de metilxantines per fonamentar científicament productes alimentaris basats en metilxantines, adientment formulats, com a una nova aproximació al maneig nutricional de la DM1. En aquest sentit, la recerca que s’ha dut a terme inclou: vigilància tecnològica d’estudis nutricionals en DM1; fonts naturals de metilxantines; contingut i consum de metilxantines presents en fonts naturals alimentàries; el marc regulatori dels productes alimentaris, particularment, complements alimentosos i aliments per a usos mèdics especials; així com els requeriments europeus necessaris per poder comercialitzar aquests productes. Per tal d’aconseguir els objectius, el projecte requeria de la recerca i desenvolupament complerts del producte en investigació, des de la definició de la seva composició a partir de resultats d’estudis en models in vitro i in vivodeDM1, a la definició de dosi i desenvolupament de la forma galènica, i a la vegada considerant especialment possibles limitacions en matèria de propietat intel·lectual i industrial, com ara l’estat de protecció en patents i estudis de llibertat operacional. A continuació, l’estudi clínic observacional per avaluar els hàbits nutricionals de base en una cohort d’adults afectats per DM1 va precedir l’estudi clínic intervencionista (codi estudi a clinicaltrials.govNCT04634682) per mesurar l’efecte del producte en investigació en la qualitat de vida, fatiga i somnolència excessiva en malalts adults amb DM1. Els resultats assolits descrits en aquesta memòria suggereixen que l’administració controlada i dosificada del producte en investigació pot proporcionar millores estadísticament significatives en la disminució de la somnolència diürna excessiva i un increment en la distància recorreguda durant sis minuts, almenys en homes adults afectats per DM1. La somnolència diürna excessiva s’ha considerat un dels principals factors que limiten la qualitat de vida en DM1. Malgrat que aquest estudi pilot es va realitzar en un grup limitat de participants, els resultats obtinguts encoratgen dur a terme nous estudis clínics en cohorts més grans, idealment per dur a terme un cop superada la Pandèmia de COVID-19.

[spa] La inflamación ocular es uno de los trastornos oftalmológicos más comunes y está asociada a un amplio abanico de patologías que afectan tanto al segmento anterior como posterior del ojo. El síndrome del ojo seco (SOS) o queratoconjuntivitis sicca es una patología de la superficie ocular, crónica y multifactorial, caracterizada por la pérdida de la homeostasis de la película lagrimal. Es la primera causa de consulta oftalmológica y está asociada a diferentes síntomas oculares como inestabilidad e hiperosmolaridad de la película lagrimal, inflamación en la superficie ocular, daño y anomalías neurosensoriales. Existe una amplia variedad de alternativas terapéuticas para el tratamiento del Síndrome del ojo seco y las enfermedades inflamatorias oculares. Las lágrimas artificiales administradas por vía tópica, se utilizan para lubricar la superficie ocular, con el fin de mantener la humedad y evitar la desecación, produciendo un alivio instantáneo de los síntomas. Sin embargo, al no tener propiedades antinflamatorias, no actúan sobre la patogenia fundamental de la enfermedad, la inflamación. Por otro lado, los tratamientos habituales para combatir la inflamación ocular incluyen corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), desaconsejados para su uso prolongado debido al amplio número de efectos adversos que conlleva. La Lactoferrina (LF) es una glicoproteína con numerosas propiedades terapéuticas, entre las que se incluye la capacidad antinflamatoria, antioxidante e inmunomoduladora. Está presente en las lágrimas basales y reflejas constituyendo un 20- 30 % del proteoma, en pacientes sanos, disminuyendo significativamente en pacientes con la enfermedad de ojo seco. Sin embargo, uno de los retos más importantes en el tratamiento ocular por vía tópica es la rápida eliminación vía conjuntiva y conducto nasolacrimal del activo administrado, dando como resultado una vida media precorneal limitada. Considerando lo anterior, el objetivo principal de esta investigación es el desarrollo y caracterización de dos sistemas nanoestructurados conteniendo Lactoferrina, un vehículo polimérico basado en NPs de PLGA (bLF-NPs) y uno lipídico, basado en liposomas (bLF-LIP). Ambas formulaciones presentaron características fisicoquímicas adecuadas para la administración por vía ocular, así como un perfil biofarmacéutico de liberación prolongada de la LF. Los dos sistemas desarrollados mostraron una óptima tolerancia ocular, respaldada por los resultados in vitro (MTT y HET-CAM) e in vivo (test de Draize). Los ensayos de eficacia terapéutica in vitro e in vivo (en modelos de inflamación y sequedad ocular), demostraron su elevada eficacia tanto en la prevención y el tratamiento de la inflamación ocular del segmento anterior del ojo como en el tratamiento del Síndrome de ojo seco. En conclusión y considerando los resultados obtenidos, ambos sistemas nanoestructurados de LF constituirían una alternativa prometedora, eficaz y segura para el tratamiento por vía tópica de patologías inflamatorias oculares., [eng] Ocular inflammation is one of the most common ophthalmological disorders and is associated with a wide range of pathologies affecting both the anterior and posterior segments of the eye. Dry eye syndrome (DES) or keratoconjunctivitis siccais a chronic, multifactorial ocular surface pathology characterised by loss of tear film homeostasis. It is the leading causeof ophthalmological consultation and is associated with different ocular symptoms such as tear film instability and hyperosmolarity, ocular surface inflammation, damage,and neurosensory abnormalities. A wide variety of therapeutic alternatives exist for the treatment of DESand inflammatory oculardiseases. Topically administered artificial tears are used to lubricate the ocular surface to maintain moisture and prevent drying, producing instant relief of symptoms. However,itdoesnot presentanti-inflammatory properties, so it does not act on the fundamental pathogen of the disease, inflammation. On the other hand, the usual treatments to combat ocular inflammation include corticosteroids and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), which are not recommended for prolonged use due to the large number of sideeffects associated with them. Lactoferrin (LF) is a glycoprotein with numerous therapeutic properties, including anti-inflammatory, antioxidant and immunomodulatory capacity. It is present in basal and reflex tears and constitutes 20-30% of the proteome in healthy patients, decreasing significantly in patients with dry eye disease. However, one of the most important challenges in topical ocular treatment is the rapid elimination of the administered active viaconjunctiva and nasolacrimal duct, resulting in a limited precorneal half-life. Considering the above, the main objective of this research is the development and characterisation of two nanostructured systems containing LF, a polymeric vehicle based on PLGA NPs (bLF-NPs) and a lipidic one, based on liposomes (bLF-LIP). Both formulations presented physicochemical characteristics suitable for ocular administration, as well as a biopharmaceutical profile based onprolonged release of LF. Bothsystems developed showed optimal ocular tolerability, supported by in vitro(MTT and HET-CAM) and in vivo (Draize test) results. In vitro and in vivotherapeutic efficacy tests (in models of ocular inflammation and dry eye), demonstrated their high efficacy bothin the prevention and treatment of ocular inflammation of the anterior segment of the eye and in the treatment of dry eye syndrome. In conclusion, and considering the results obtained, both nanostructured LF systems would constitute a promising, effective,and safe alternative for the topical treatment of ocular inflammatory pathologies

[eng] Pain and inflammation are the most common and recurrent side effects after surgery and, understandably, the patient's most feared, affecting treatment adherence. The present work aims to characterize in vitro, ex vivo, and in vivo different ketorolac tromethamine mucoadhesive topical formulations to be applied to the skin and mucous membranes for the pain and inflammation management associated with surgical, chemical, and/or ablative processes, such as it may be that of the eradication of condyloma acuminata. For this, different gelling polymers with mucoadhesive properties that were biocompatible, and biodegradable, were chosen. Sodium alginate and chitosan were the polymers we worked with in addition to other ingredients such as hyaluronic acid. Additionally, PLGA (polylactic glycolic acid) nanoparticles were made where ketorolac tromethamine was encapsulated with the possibility that it could be applied as a spray. The in vitro characterization was carried out by studying the organoleptic characteristics, pH, rheological behavior, morphology, and release study of each formulation. The ex vivo studies consisted of Franz-type cell permeation tests of the formulations on different tissues (human skin and mucous membranes). The in vivo studies included applying some of the formulations in live pigs and their subsequent histological analysis, anti-inflammatory efficacy studies in the ear of mice, and tolerability studies in human skin and pigs oral mucosa. The results show how all ketorolac tromethamine formulations meet the requirements for application on skin and mucous membranes, showing easy applicability, excellent tolerability, and good topical anti-inflammatory efficacy., [spa] Dolor e inflamación son los efectos secundarios más comunes y recurrentes tras una cirugía y comprensiblemente, los más temidos por el paciente, lo cual repercute en la adherencia al tratamiento. El presente trabajo pretende caracterizar in vitro, ex vivo e in vivo diferentes formulaciones tópicas mucoadhesivas de ketorolaco trometamina con el fin de ser aplicados sobre piel y mucosas para el manejo del dolor y la inflamación asociado a procesos quirúrgicos, químicos y/o ablativos, como puede ser el de la erradicación del condiloma acuminado. Para ello se escogieron diferentes polímeros gelificantes con propiedades mucoadhesivas que fueran biocompatibles y biodegradables. El alginato de sodio y el chitosan fueron los polímeros con los que trabajamos a de más de otros ingredientes como el ácido hialurónico. Adicionalmente, se elaboraron nanopartículas de PLGA (ácido polilácticoglicólico) donde se encapsulo el ketorolaco trometamina con la posibilidad de que pudiera aplicarse en forma de spray. La caracterización in vitro se llevó a cabo mediante el estudio de las características organolépticas, pH, comportamiento reológico, morfología, y estudio de liberación de cada formulación. Los estudios ex vivo consistieron en ensayos de permeación en celdas tipo Franz de las formulaciones sobre diferentes tejidos (piel humana y mucosas). Los estudios in vivo incluyeron la aplicación de algunas de las formulaciones en cerdos vivos y el posterior análisis histológico, estudios de eficacia antinflamatoria en oreja de ratones y estudios de tolerabilidad en piel humana y en mucosa oral de cerdo. Los resultados muestran cómo todas las formulaciones de ketorolaco trometamina cumplen con los requisitos necesarios para su aplicación sobre piel y mucosas, mostrando una fácil aplicabilidad, excelente tolerabilidad, así como una buena eficacia antinflamatoria tópica.

[eng] Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most prevalent soft tissue sarcoma (STS) in children and adolescents. The Alveolar subtype (ARMS) is driven by PAX3-FOXO1, a fusion protein originated from a chromosomal translocation. PAX3-FOXO1 is considered a key player in ARMS initiation and progression, due to its enhanced transcriptional activity, that leads to the upregulation of downstream targets genes involved in ARMS tumorigenesis and metastasis. Several studies have focused on the epigenetic and transcriptional profiling of PAX3-FOXO1 expressing cells, but very little is known about the metabolic landscape of these tumors. Although during the last decades, considerable advancements have been done in understanding ARMS pathogenesis, the outcome for children with metastatic or recurrent disease remains poor. Metabolic reprogramming is considered one of the main hallmarks of cancer. To sustain enhanced cell proliferation and build new biomass in a frequently nutrient-poor microenvironment, many metabolic requirements must be satisfied by tumor cells. This is achieved through the activation of gene expression and protein regulation programs, that involve, among others, deregulation of glucose and amino acids uptake and utilization. The main objective of our research project is to analyze the effects of PAX3-FOXO1 expression on RMS metabolic rewiring. Starting from transcriptomic analysis of publicly available data, we identified the Argininosuccinate Synthase 1 (ASS1), an enzyme of the urea cycle involved in the de novo synthesis of arginine, as a putative transcriptional target of PAX3-FOXO1. It has been described that ASS1 plays a role in enhancing tumor progression and invasion in different cancer types. Despite all the evidence that describe other STS as ASS1-deficient, we found that RMS cells overexpress ASS1. Using our cellular models of fusion protein silencing in ARMS cell lines, we confirmed that PAX3-FOXO1 downregulation results in ASS1 mRNA levels decrease, suggesting that the fusion protein could regulate ASS1 transcription. Moreover, through metabolomics experiments, we demonstrated that PAX3-FOXO1 ectopic introduction in fusion-negative RMS cells induced a modulation of the urea cycle intermediates relative levels, that reflected ASS1 upregulation upon the fusion protein expression. To better address its role in ARMS pathogenesis, we silenced ASS1 expression in fusion-positive RMS cells and characterized their phenotype. CRISPR-Cas9-mediated ASS1 knockdown impaired ARMS migratory capability in vitro without affecting cell proliferation, even under arginine starvation, suggesting that this amino acid metabolic rewiring could be promoting the metastatic phenotype of ARMS. Furthermore, in vivo tumorigenesis resulted to be notably delayed in mice injected with ASS1-silenced ARMS cells, confirming the oncogenic role of the enzyme in these cancers. Finally, to describe the molecular mechanism underlying ASS1- mediated ARMS progression and spreading we performed a microarray to study the transcriptional signature induced by ASS1 knockdown. We were able to identify a possible molecular mediator of the phenotype observed in ASS1-deficient cells: the elongation factor EEF1A2, extensively described in literature to display oncogenic activity in cancer, resulted to be transcriptionally downregulated upon ASS1 silencing. In accordance with the evidence that describe its activation as downstream EEF1A2 oncogenic signaling, AKT phosphorylation was also found to decrease, together with the activation of S6K1 and S6 downstream effectors. Further experiments are needed to better describe the upstream signaling involved and the precise mechanism that links ASS1 to EEF1A2 downregulation. In conclusion, our work suggests that urea cycle enzyme ASS1 is highly expressed in ARMS and its upregulation, driven by PAX3-FOXO1 fusion protein, could be involved in sustaining these cancers tumorigenesis and metastatic process, through the induction of EEF1A2-mediated AKT activation. Thus, the inhibition of this pathway could represent a promising tool to target RMS metabolism, hopefully leading to the potential development of more effective targeted therapies for the treatment of these aggressive pediatric cancers.

[spa] En esta tesis doctoral se realizan el desarrollo, estudio y optimización de parches transdérmicos de base acrílica de tipo "drug in adhesive" de ropinirol para su aplicación tópica en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. El uso de la vía transdérmica confiere ciertas ventajas biofarmacéuticas como la eliminación del efecto de primer paso hepático y la mejora de la adherencia al tratamiento farmacológico prescrito. Los principios activos deben cumplir ciertos requisitos fisicoquímicos en el estudio de las posibles formulaciones. Ropinirol los cumple, en especial con el de tamaño de partícula. La parte experimental de este estudio fue concebida en dos fases o etapas, en las que la segunda dependía directamente de los resultados obtenidos en la primera. Previamente a estas dos etapas, se desarrolló un dispositivo para la elaboración de parches transdérmicos ante la necesidad de producción de lotes pequeños para la elaboración de esta tesis doctoral, utilizando un método conocido como laminación por vertido sobre molde (“mold-casting” en inglés). Se obtuvo un prototipo funcional haciendo posible la repetitividad y reproducibilidad del procedimiento de fabricación. En la Fase I, cada polímero utilizado fue formulado en tres niveles de concentración de fármaco para poder examinar si existían diferencias significativas a la hora de utilizar diferentes polímeros, detectar las posibles interacciones polímero-fármaco y determinar cuál de los tres polímeros presentaba mejores parámetros de liberación. En la Fase II, se formularon un conjunto de preparaciones con fármaco y con el polímero que proporcionó los mejores resultados de liberación in vitro en la Fase I con una serie de potenciadores y excipientes para detectar las posibles interacciones fármaco-excipiente/potenciador y determinar cuál de estos presentaban mejoras en la liberación., [eng] In this doctoral thesis, the development, study and optimization of acrylic-based transdermal drug-in-adhesive patches of ropinirole for topical application in the treatment of Parkinson's disease are carried out. The use of the transdermal route confers certain biopharmaceutical advantages such as elimination of the hepatic first-pass effect and improved adherence to the prescribed drug treatment. The active ingredients must meet certain physicochemical requirements in the study of possible formulations. Ropinirole meets them, especially about particle size. The experimental part of this study was conceived in two phases or stages, in which the second one depended directly on the results obtained in the first one. Prior to these two stages, a device to produce transdermal patches was developed in response to the need to produce small batches for the preparation of this doctoral thesis, using a method known as mold-casting. A functional prototype was obtained, making possible the repeatability and reproducibility of the manufacturing process. In Phase I, each polymer used was formulated at three drug concentration levels to examine whether there were significant differences when using different polymers, to detect possible polymer-drug interactions and to determine which of the three polymers had the best release parameters. In Phase II, a set of preparations were formulated with drug and the polymer that gave the best in vitro release results in Phase I with a series of enhancers and excipients to detect possible drug-excipient/potentiator interactions and to determine which of these had improved release.

[eng] I have used the brain tumours that originate in Drosophila larvae upon depletion of the brain tumor (brat) gene as a model to study neoplastic malignant growth. I have used genetic analysis to interrogate the Drosophila genome for genes that can be targeted to inhibit the development or arrest the growth of brat tumours. The targetable genome identified through this functional genomics approach includes 80 suppressors of brat tumour growth (brat-SPRs). I have also carried out transcriptomic analysis of brat tumours through which I have been able to define a brat tumour signature that includes 625 and 903 genes that are significantly up- and down-regulated in brat larval brain tumours compared to normal larval brains. From the combined analysis of my functional genomics and transcriptomics data I have concluded that correlation between the extent of gene expression dysregulation and function with regards to tumour development is so low that the former is not a good predictor of the latter. From the combined analysis of my own data on brat tumours and published functional genomics and transcriptomics data on the brain tumours that originate upon depletion of lethal(3)malignant brain tumor (l(3)mbt), henceforth referred to as mbt tumours, I have found that nearly 60% (47/80) of the brat-SPRs are tumour-type specific in the sense that they do not suppress mbt tumours. One of the non-tumour specific suppressors (i.e. mbt&brat-SPRs) identified in my study is Vacuolar protein sorting 26 (Vps26). Vps26 had been reported to be a type II neuroblast lineage-specific tumour suppressor. My results show that in addition, Vps26 function contributes to brat tumour growth and is essential for long-term survival of mbt tumours. My results also suggest that unlike its published tumour suppressor function, Vps26 mbt&brat-SPR activity might be independent of its role in the retromer complex., [spa] En este trabajo he utilizado los tumores cerebrales que se originan en larvas de Drosophila mutantes para el gen brain tumor (brat) como modelo para el estudio del crecimiento de neoplasias malignas. Mediante análisis genético he cribado el genoma de Drosophila en la búsqueda de genes cuya inactivación de lugar a la inhibición de la formación o del crecimiento sostenido de tumores brat. El conjunto de genes diana identificado a través de este enfoque de genómica funcional incluye 80 supresores de tumores brat (brat-SPRs). Así mismo he obtenido el transcriptoma de tumores brat de cuyo análisis he podido definir una “tumour signature” que incluye 625 and 903 genes cuya expresión está significativamente aumentada o disminuida en tumores brat con respecto a cerebros normales. Mediante el análisis combinado de mis resultados de genómica funcional y transcriptómica he podido concluir que la correlación entre el grado de desregulación de la expresión génica y la función del gen en relación con el desarrollo del tumor es tan reducida que el primer factor no puede ser utilizado para predecir el segundo. Del análisis combinado de mis datos sobre los tumores brat y de datos publicados de genómica funcional y transcriptómica de tumores cerebrales causados por la falta de función del gen lethal(3)malignant brain tumor (l(3)mbt) (“tumores mbt”) he observado que cerca del 60% (47/80) de los brat-SPRs son específicos de este tipo de tumor en el sentido de que su falta de función no suprime los tumores mbt. Uno de los supresores comunes para ambos tumores (mbt& brat-SPRs) identificados en mi trabajo es Vacuolar protein sorting 26 (Vps26). Datos publicados previamente demuestran que Vps26 funciona como supresor tumoral específicamente en el linaje de neuroblastos tipo II. Mis resultados revelan que, además, Vps26 contribuye al crecimiento de los tumores brat y es esencial para la supervivencia a largo plazo de los tumores mbt. Mis resultados también sugieren que a diferencia de su actividad como supresor tumoral, la función de Vps26 como mbt&brat-SPR parece ser independiente de su papel en el complejo del retrómero.

[spa] Mycoplasma pneumoniaees una bacteria patógena humana sin pared celular que causa neumonías atípicas y otras infecciones respiratorias. Es una de las pocas especies de procariotas que necesitan lípidos en la integridad de su membrana citoplasmática, los cuales debe captar del medio o de la célula hospedadora debido a que en su genoma no tiene los mecanismos para sintetizarlos. En este proyecto hemos caracterizado la proteína P116 de membrana y altamente inmunogénica, que además es esencial para la supervivencia de las células de M.pneumoniae. A partir de criomicroscopía electrónica(Crio-EM)de partícula única (single particle) se reveló una organización homodimérica para los ectodominios de esta proteína. Cada subunidad consta de un dominio distal N-terminal y un dominio central de dimerización presentando un nuevo plegamiento y estructura bastante novedosa. Una de las características más notables del dominio central de la estructura es una gran cavidad con una superficie interna accesible al solvente, pero completamente hidrófoba. Los aminoácidos que recubren la cavidad están altamente conservados entre las proteínas ortólogas en el clúster taxonómico de M.pneumoniae, lo que indica la importancia de la conservación de esta estructura en especies muy emparentadas. En el interior de esta cavidad hidrofóbica se encontró una densidad adicional intensa en el mapa de la Crio-EM,indicandoque esta cavidad está llena de moléculas en forma de cadena, lo que explica el exceso de masa (alrededor de 13kDa) determinado para P116 en estas muestras. Mediante técnicas de análisis molecular cualitativo se determinaron las sustancias que aparecían en la densidad extra del mapa: la espectrometría de masas demostró la presencia de los lípidos esenciales de M.pneumoniae, fosfatidilcolina y esfingomielina, unidos a la P116. Las subunidades de P116 vacías se obtuvieron mediante desnaturalización y reconstitución después de un riguroso tratamiento con detergente. Además, se comprobó mediante marcación de colesterol con tritio radiactivo, como tanto colesterol libre como colesterol esterificado incorporado en lipoproteínas de alta densidad (HDL) humanas,se transfiere a P116 cuando se incuban juntas. La microscopía de fluorescencia con anticuerpos policlonales y monoclonales generados contra el ectodominio de P116, muestra una distribución ubicua de la proteína sobre toda la superficie del micoplasma.Además, en ensayos de inhibición de adherencia se comprobó que la P116 no tiene un papel relevante en la misma, lo que contrasta con la bibliografía. Los constructos de P116 que carecen del dominio N-terminal, al expresarse también resultan en dímeros que, en esta ocasión, muestran una reducción del 50% en el reconocimiento antigénico por el suero de pacientes infectados por M.pneumoniae. Lo que indica que el dominio N-terminal es altamente inmunogénico y, a pesar de su pequeño tamaño comparado con el dominio central, concentra la mitad de epítopos. Los resultados reflejados en esta tesis muestranque P116 tiene un papel esencial en la captura y almacenamiento de moléculas lipídicas del ambiente del hospedador para la organización estructural de la membrana y propósitosmetabólicos de M.pneumoniae., [eng] P116 is an essential protein for Mycoplasma pneumoniae, a human pathogen responsible for approximately 30% of community-acquired human pneumonia. M pneumoniae needs to uptake lipids from the environment, a characteristic shared by many important human pathogens. How this uptake is accomplished on a molecular level is largely unknown, and there are no comprehensive characterizations of proteins directly involved in this process. Here, we report a comprehensive analysis of P116 by several techniques. Fluorescence microscopy, using antibodies raised against the ectodomain of P116, shows a ubiquitous distribution of P116 on the cell surface. Single-particle cryo-electron microscopy at 3.3 Å resolution reveals two homodimers connected by a dimerization interface, and a core domain presenting a previously unseen fold. This fold creates a large cavity of ~38 Å by 62 Å with a fully hydrophobic internal surface that is accessible to solvent. The hydrophobic residues lining the cavity are conserved in P116 orthologues of other mycoplasma species. Elongated densities of ~8 Å by 30 Å within the cavity, which are not accounted for by the structure, are identified by mass spectrometry as the essential lipids phosphatidylcholine and sphingomyelin. When the cavity is emptied by stringent treatment with detergents, it undergoes an extensive conformational change to adopt a closed conformation that does not allow for the accommodation of lipids. A radioactivity transfer experiment demonstrates a net transfer of cholesterol from high- density lipoproteins (HDLs) to P116, and cryo-electron microscopy shows a direct attachment of P116 to HDLs. The results show the mechanism by which P116 captures essential lipids from the host environment that are required for metabolic purposes and delivers them by a wringing movement into the membrane by passive transport.

[spa] La obesidad es una enfermedad crónica y un problema de salud pública, producido por un desequilibrio entre la ingesta y el gasto de energía. La prevalencia de la obesidad en todo el mundo se ha duplicado desde 1980, llegando a 650 millones de personas obesas en 2016, y las estimaciones futuras siguen una tendencia similar. Las principales causas de esta epidemia son las conductas alimentarias poco saludables, el aumento de los hábitos sedentarios y, lo más importante, la combinación de ambos. Aunque la obesidad está clasificada por la OMS como un factor de riesgo de enfermedades no transmisibles, su patrón de transmisión comparte rasgos comunes con las enfermedades contagiosas. Además, la obesidad sigue un patrón de agregación, que podría atribuirse en parte a la agrupación natural entre personas previamente obesas al compartir afinidades y moverse en un entorno obesogénico La Dieta Mediterránea no es solamente un tipo de dieta, es un patrón alimentario incluido en un estilo de vida donde se recogen costumbres, alimentos y formas de cocinar característicos en la zona del Mediterráneo. Todo este conjunto representa una serie de beneficios para la salud y concretamente para prevenir y combatir la obesidad. Estudios de intervención intensiva con pérdida de peso, apoyados con educación nutricional, actividad física y terapia conductual pueden ayudar a remitir la obesidad que presentan los individuos, y asimismo provocar un efecto “Halo” en su entorno más cercano y en su red social También es necesaria la validación de herramientas que nos ayuden a cuantificar la adherencia a la Dieta Mediterránea con restricción de energía y poder asociar esta adherencia con una mejoría en los parámetros de salud., [eng] Obesity is a chronic disease and a growing public health problem, caused by an imbalance between energy intake and expenditure. The prevalence of obesity worldwide has doubled since 1980, reaching 650 million obese people in 2016, and future estimates follow a similar trend. The main causes of this epidemic are unhealthy eating behaviors, the increase in sedentary habits and, most importantly, the combination of both. Although obesity is classified by the WHO as a risk factor for non-communicable diseases, its transmission pattern shares common features with contagious diseases. Obesity follows an aggregation pattern, which means that if a person suffers from obesity, their immediate environment is more likely to be obesogenic. Such aggregation could be attributed in part to natural grouping among previously obese people who share affinities. The Mediterranean Diet is not just a type of diet, it is an eating pattern included in a lifestyle where customs, foods and ways of cooking characteristic of the Mediterranean area are collected. All this set represents a series of health benefits and specifically serve to prevent and combat obesity. Intensive intervention studies with weight loss, supported by nutritional education, physical activity and behavioral therapy can help reduce the obesity that individuals present, but can also cause a “Halo” effect in their closest environment and ultimately in their social network. It is also necessary to validate tools that help us to quantify adherence to the energy- restricted Mediterranean Diet and to be able to associate this adherence with an improvement in health parameters.

[eng] Tumours grow in a self-imposed hypoglycaemic microenvironment due to their exacerbated metabolic needs. To thrive in these harsh conditions, malignant cells must adapt their own metabolic routes and hijack the host nutrient supply infrastructure through extracellular signalling. This study aimed at characterising the secretory response of tumoral cells in response to glucose deprivation, both the molecular signalling leading to this response and the consequences of this response for the tumour. In particular, this study focused on a cytokine never before linked to glucose deprivation: LIF. Through use of in silico, in vitro, and in vivo approaches we made two novel findings: firstly, we determined that LIF induction happens through non-canonical N-glycosylation dependent signalling, in the context of glucose deprivation. Furthermore, we have determined that the signalling mechanism leading to LIF production encompasses a complex combination of transcriptional and post-transcriptional signals that involve PERK but none of its canonical transcription factors. Secondly, we discovered a novel pro-tumorigenic role for this cytokine as an angiogenic. Our findings addressed the gap in literature regarding the mechanism for LIF production in tumours, providing insight relevant to future development of therapeutic approaches. And most importantly, we provide an integrative view of not only how glucose deprivation leads to production of LIF, but also how this cytokine could lead to the resolution of the local hypoglycaemia via angiogenesis., [spa] Los tumores imponen un microambiente de constante hipoglicemia debido a su rápida proliferación y al exacerbado consumo de metabolitos que esto conlleva. Para prosperar en estas circunstancias, las células cancerosas alteran su metabolismo y sus rutas de señalización de forma que puedan abusar de la infraestructura de aporte de nutrientes del organismo. El objetivo de este estudio es caracterizar la respuesta secretora del tumor en respuesta a la falta de glucosa, tanto al nivel de la señalización molecular que integra esta respuesta como al nivel de las consecuencias externas que estas señales tienen para el tumor. En particular, este estudio se centra en una citoquina que nunca antes se había relacionado con la falta de glucosa: LIF (por sus siglas en inglés: Factor Inhibidor de la Leucemia). A través del uso de técnicas in silico, in vitro e in vivo hemos alcanzado dos descubrimientos. En primer lugar, hemos determinado que la producción de LIF está inducida a través de una ruta no-canónica de detección de la falta de glucosa basada en la falta de N-glicosilación. Además, hemos determinado que el mecanismo que sigue a este fallo en la glicosilación incluye una compleja combinación de señales transcripcionales y postranscripcionales dependientes de PERK, pero no de los factores de transcripción tradicionalmente asociados a esta quinasa. En segundo lugar, hemos descubierto un nuevo rol pro-tumorigénico de esta citoquina como factor pro-angiogénico. Nuestros hallazgos cubren un vacío en la literatura en lo relativo al mecanismo que causa la producción de LIF por parte del tumor, lo cual podría servir de base para nuevas aproximaciones terapéuticas. Además, hemos desarrollado una visión unificada que explica cómo la falta de glucosa resulta en la producción de esta citoquina, y cómo LIF a su vez puede actuar para resolver la hipoglicemia local restaurando el riego sanguíneo mediante la angiogénesis.

[eng] INTRODUCTION: Inflammatory bowel disease is a complex intestinal disease with several genetic and environmental factors that can influence its course. The ethiology and pathophysiology of the disease is not fully understood. There is some evidence that microbiome can play a role. Finding relationships between microbiome and host’s mucosa could help advance prevention, diagnosis or treatment. METHODS: We based our analysis on intestinal bacterial 16S rRNA and human transcriptome data from biopsies from multiple timepoints and intestine segments. We extended regularized generalized canonical correlation analysis to find models that are coherent with previous knowledge on the disease taking into account the samples’ information. Multiple inflammatory bowel disease datasets on different treatments and conditions were analysed and the models defining those dataset were compared. The results were compared with multiple co-inertia analysis. RESULTS: Splitting sample variables into different blocks results in models of these relationships that show differences on the genes and microorganisms selected. The models generated using our new method inteRmodel outperformed multiple coinertia analysis to classify the samples according to their location. Despite being used on datasets of different sources the resulting models show similar relationships between variables. DISCUSSION: Comparing multiple models helps find out the relationships within datasets. Our method finds how strong are the relationships between the microbiome, transcriptome and environmental variables. On different datasets genes selected were common. This approach is robust and flexible to different datasets and settings. CONCLUSION: With inteRmodel we found that the microbiome relates more closely to the sample location than to disease, but the transcriptome is highly related to the location of the sample on the intestine. There is a common transcriptome between datasets while microorganisms depend of the dataset. We can improve sample classification by taking into account both bacterial 16S rRNA and host transcriptome., [cat] INTRODUCCIÓ: La malaltia inflamatòria intestinal és una malaltia intestinal complexa amb diversos factors genètics i ambientals que poden influir en el seu curs. L'etiologia i fisiopatologia de la malaltia no es con eix del tot. Hi ha evidències que el microbioma pot tenir un paper rellevant. Trobar relacions entre el microbioma i la mucosa de l'hoste podria ajudar a avançar en la prevenció, el diagnòstic o el tractament. MÈTODES: Vam basar la nostra anàlisi en dades d'ARNr 16S bacteriana intestinal i de transcriptoma humà de biòpsies de múltiples punts de temps i segments intestinals. Hem ampliat l'anàlisi de correlació canònica generalitzada regularitzada per trobar models coherents amb el coneixement previ sobre la malaltia tenint en compte la informació de les mostres. Es van analitzar diversos conjunts de dades de malaltia inflamatòria intestinal sobre diferents tractaments i condicions i es van comparar els models que defineixen aquest conjunt de dades. Els resultats es van comparar amb l'anàlisi de coinèrcia múltiple. RESULTATS: Dividir les variables de la mostra en diferents blocs dona com a resultat models d'aquestes relacions que mostren diferències en els gens i els microorganismes seleccionats. Els models generats mitjançant el nostre nou mètode intermodel van superar l'anàlisi de coinèrcia múltiple per classificar les mostres segons la seva ubicació. Tot i utilitzar-se en conjunts de dades de diferents fonts, els models resultants mostren relacions similars entre variables. DISCUSSIÓ: La comparació de diversos models ajuda a esbrinar les relacions dins dels conjunts de dades. El nostre mètode troba com de fortes són les relacions entre el microbioma, el transcriptoma i les variables ambientals. En diferents conjunts de dades, els gens seleccionats eren comuns. Aquest enfocament és robust i flexible per a diferents conjunts de dades i configuracions. CONCLUSIÓ: Amb inteRmodel vam trobar que el microbioma es relaciona més estretament amb la ubicació de la mostra que amb la malaltia, però el transcriptoma està molt relacionat amb la ubicació de la mostra a l'intestí. Hi ha un transcriptoma comú entre conjunts de dades, mentre que els microorganismes depenen del conjunt de dades. Podem millorar la classificació de les mostres tenint en compte tant l'ARNr 16S bacterià com el transcriptoma hoste., [spa] INTRODUCCIÓN: La enfermedad inflamatoria intestinal es una enfermedad intestinal compleja con factores genéticos y ambientales que pueden influir en su curso. La etiología y la fisiopatología de la enfermedad no se conocen por completo. Existen evidencias que el microbioma puede desempeijar un papel relevante. Encontrar relaciones entre el microbioma y la mucosa del huésped podría ayudar a avanzar en la prevención, el diagnóstico o el tratamiento. MÉTODOS: Basamos nuestro análisis en el ARNr 16S bacteriano intestinal y en datos de transcriptomas humanos de biopsias de múltiples puntos temporales y segmentos intestinales. Extendimos el análisis de correlación canónica generalizada regularizado para encontrar modelos coherentes con el conocimiento previo sobre la enfermedad teniendo en cuenta la información de las muestras. Se analizaron múltiples conjuntos de datos de enfermedad inflamatoria intestinal en diferentes tratamientos y condiciones y se compararon los modelos que definen esos conjuntos de datos. Los resultados se compararon con análisis de coinercia múltiple. RESULTADOS: Dividir las variables de la muestra en diferentes bloques resulta en modelos de estas relaciones que muestran diferencias en los genes y microorganismos seleccionados. Los modelos generados con nuestro nuevo método, inter-Rmodel, superaron el análisis de múltiples coinercias para clasificar las muestras según su ubicación. A pesar de ser utilizados en conjuntos de datos de diferentes fuentes, los modelos resultantes muestran unas relaciones similares entre las variables. DISCUSIÓN: La comparación de varios modelos ayuda a descubrir las relaciones dentro de los conjuntos de datos. Nuestro método encuentra cuán fuertes son las relaciones entre el microbioma, el transcriptoma y las variables ambientales. En diferentes conjuntos de datos, los genes seleccionados eran comunes. Este enfoque es robusto y flexible para diferentes conjuntos de datos y configuraciones. CONCLUSIÓN: Con inteRmodel descubrimos que el microbioma se relaciona más estrechamente con la ubicación de la muestra que con la enfermedad, pero el transcriptoma está muy relacionado con la ubicación de la muestra en el intestino. Hay un transcriptoma común entre los conjuntos de datos, mientras que los microorganismos dependen del conjunto de datos. Podemos mejorar la clasificación de las muestras teniendo en cuenta tanto el ARNr 16S bacteriano como el transcriptoma del huésped.

[eng] Tribbles (TRIB) homologues proteins are a family of three pseudokinases withan important role in controlling immunity, metabolism, and cancer throughprotein-protein interactions (PPIs). TRIB pseudokinases have the same overalltertiary structure as the eukaryotic protein kinase domain but lack some of themain motifs needed for its catalytic function, such as the DFG motif and amodified glycine-rich loop. This is why this family of proteins lacks catalyticfunction and has been shown to function as scaffolds. TRIB can interact withkinases (e.g., AKT), E3 ligases (e.g., COP1, SIAH1), and even transcriptionfactors (e.g., C/EBPα). Nevertheless, little is known about how TRIB caninteract and modulate other protein functions. For example, TRIB have beenseen to act as tumor-suppressors or oncogenes in colorectal cancer in a context-dependent manner. This highlights the need of studying TRIB function in away that provides temporal and spatial control, such as a chemical probe. Asmall molecule targeting TRIB will potentially modulate TRIB activity andtherefore could help to better understand their role. Moreover, the compoundcould serve as a potential starting point for drug discovery. Therefore, this PhD thesis aims to find small molecules that could regulateTRIB function and help to better understand this specific family of pseudoki-nases. To date, only TRIB2 has been targeted with a covalent compound prob-ing an effect of destabilization and subsequent degradation. In contrast, TRIB1is unable to interact with ATP but could potentially bind small molecules. Inthis thesis we have applied a combination of computational and biophysicaltechniques to study TRIB1 ability to bind small molecules. Thanks to thesefindings, we demonstrate that TRIB1 can bind small molecules in a similarway to canonical kinases. At the same time, we wanted to look in more detail some of the PPIsreported for TRIB. As described before, TRIB can interact with kinases, suchas AKT/PKB which is a critical regulator of cell survival and proliferation.TRIB3 was described to regulate AKT phosphorylation in the liver, althoughthe mechanism is still poorly understood. Another case under study has beenTRIB3 and SIAH1, an E3 ligase linked to ubiquitylation and degradation ofTRIB3. The interaction of SIAH1 with TRIB3 has been already described,however, the specific mechanism of how these two proteins interact remainsunknown. In this thesis, we have been interested on elucidate these PPIs sincethey are very relevant for understanding how TRIB functions., [spa] Las proteínas homólogas de Tribbles (TRIB) son una familia de tres pseudoquinasas con un papel importante en el control de la inmunidad, el metabolismo y el cáncer a través de interacciones proteína-proteína (PPI). Las pseudoquinasas TRIB tienen la misma estructura terciaria general que el dominio de proteína quinasa eucariota, pero carecen de algunos de los motivos principales necesarios para su función catalítica, como el motivo DFG y un bucle rico en glicina modificado. Es por esto que esta familia de proteínas carece de función catalítica y se ha demostrado que funcionan como andamios. TRIB puede interactuar con quinasas (p. ej., AKT), ligasas E3 (p. ej., COP1, SIAH1) e incluso factores de transcripción (p. ej., C/EBPα). Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo TRIB puede interactuar y modular otras funciones de proteínas. Por ejemplo, se ha visto que TRIB actúa como supresor de tumores u oncogenes en el cáncer colorrectal de una manera dependiente del contexto. Esto destaca la necesidad de estudiar la función TRIB de manera que proporcione control temporal y espacial, como una sonda química. Una pequeña molécula dirigida a TRIB modulará potencialmente la actividad de TRIB y, por lo tanto, podría ayudar a comprender mejor su función. Además, el compuesto podría servir como un posible punto de partida para el descubrimiento de fármacos. Por lo tanto, esta tesis doctoral tiene como objetivo encontrar pequeñas moléculas que puedan regular la función TRIB y ayudar a comprender mejor esta familia específica de pseudoquinasas. Hasta la fecha, solo TRIB2 ha sido objeto de un compuesto covalente que prueba un efecto de desestabilización y posterior degradación. Por el contrario, TRIB1 no puede interactuar con ATP, pero podría unirse potencialmente a moléculas pequeñas. En esta tesis hemos aplicado una combinación de técnicas computacionales y biofísicas para estudiar la capacidad de TRIB1 para unirse a moléculas pequeñas. Gracias a estos hallazgos, demostramos que TRIB1 puede unirse a moléculas pequeñas de manera similar a las quinasas canónicas. Al mismo tiempo, queríamos ver con más detalle algunos de los PPI informados para TRIB. Como se describió anteriormente, TRIB puede interactuar con quinasas, como AKT/PKB, que es un regulador crítico de la supervivencia y proliferación celular. Se describió que TRIB3 regula la fosforilación de AKT en el hígado, aunque el mecanismo aún no se conoce bien. Otro caso en estudio ha sido TRIB3 y SIAH1, una ligasa E3 ligada a la ubiquitilación y degradación de TRIB3. La interacción de SIAH1 con TRIB3 ya ha sido descrita, sin embargo, se desconoce el mecanismo específico de interacción de estas dos proteínas. En esta tesis nos ha interesado dilucidar estos IPP ya que son muy relevantes para entender cómo funciona el TRIB.

[spa] INTRODUCCIÓN. La retinopatía de la prematuridad (Retinopathy of prematurity, ROP) es una vitreorretinopatía proliferativa que afecta a los recién nacidos prematuros y es una de las principales causas de ceguera infantil. El ácido docosahexanoico (DHA) es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga de la serie omega 3 necesario para el desarrollo de la retina. El aporte de DHA a través de los lípidos de la nutrición parenteral puede modificar el curso de la ROP y reducir su morbilidad. Los lípidos basados en aceite de pescado contienen DHA. OBJETIVOS. El objetivo principal fue comparar el efecto de dos emulsiones de lípidos de la nutrición parenteral, una basada en aceite de oliva (Clinoleic®) y la otra basada en aceite de pescado (SMOFlipid®), sobre la incidencia de ROP y la ROP con necesidad de tratamiento. Los objetivos secundarios fueron comparar el efecto de estas dos emulsiones sobre la ganancia de peso postnatal en las primeras 6 semanas de vida y sobre las siguientes comorbilidades neonatales: duración de la nutrición parenteral, necesidad de oxigenoterapia, necesidad de tranfusiones de sangre, alteraciones de la glucemia, sepsis, enterocolitits necrotizante, colestasis, displasia broncopulmonar, hemorragia intraventricular de grado ≥2, enfermedad de la membrana hialina y necesidad de surfactante, ductus arterioso persistente (DAP), necesidad de tratamiento del DAP, duración de la estancia hospitalaria y exitus. MATERIAL Y MÉTODOS. Estudio analítico, retrospectivo, observacional y unicéntrico realizado en el Hospital Universitario Vall d’Hebron de Barcelona entre los meses de abril del 2.015 y diciembre del 2.018. Los criterios de inclusión fueron: neonatos prematuros de menos de 31 semanas de edad gestacional (EG), peso al nacimiento inferior a 1.251 g, nacidos en el Hospital Universitario Vall d’Hebron e ingresados en el Servicio de Neonatología y con nutrición parenteral con un mismo tipo de lípidos durante su estancia hospitalaria. Los datos biodemográficos, obstétricos, analíticos, terapéuticos y clínicos fueron recopilados de la historia clínica de los pacientes. Los datos referentes a la nutrición parenteral se extrajeron de la base de datos de prescripción y preparación de las nutriciones parenterales del Servicio de Farmacia. RESULTADOS. Ciento ochenta pacientes cumplían todos los criterios de inclusión, 90 recibieron la nutrición parenteral con Clinoleic® (abril 2.015 - marzo 2.017) y otros 90 recibieron la nutrición parenteral con SMOFlipid® (junio 2.017 - diciembre 2.018). La incidencia de ROP (40% en grupo Clinoleic®, 41% en SMOFlipid®, p=0,88) y necesidad de tratamiento de la ROP (4% en Clinoleic® y 10% en SMOFlipid®, p=0,152) no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de tratamiento. En las subpoblaciones de EG 29 semanas, tampoco hubo diferencias entre los dos grupos de tratamiento. Respecto a la ganancia de peso en las primeras 6 semanas de vida y resto de parámetros de morbilidad del prematuro, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de tratamiento. CONCLUSIONES. Los lípidos de la nutrición parenteral basados en aceite de pescado, SMOFlipid®, no protegen del desarrollo de ROP ni a la necesidad de tratamiento frente a los lípidos basados en aceite de oliva, Clinoleic®, en prematuros de EG, [eng] INTRODUCTION. Retinopathy of prematurity (ROP) is a proliferative vitreoretinopathy that affects preterm infants and is one of the leading causes of childhood blindness. Docosahexaenoic acid (DHA) is a long-chain polyunsaturated fatty acid of the omega 3 series, necessary for the development of the retina. The supply of DHA through the lipids of parenteral nutrition can modify the course of ROP and reduce its morbidity. Fish oil-based lipids contain DHA. OBJECTIVES. The main objective was to compare the effect of two parenteral nutrition lipid emulsions—one based on olive oil (Clinoleic®) and the other based on fish oil (SMOFlipid®)—on the incidence of ROP and ROP with need of treatment. The secondary objectives were to compare the effect of these two emulsions on postnatal weight gain in the first 6 weeks of life and on the following neonatal comorbidities: duration of parenteral nutrition; need for oxygen therapy; need for blood transfusions; changes in blood glucose; sepsis; necrotizing enterocolitis; cholestasis; bronchopulmonary dysplasia; intraventricular hemorrhage grade ≥2; hyaline membrane disease and need for surfactant, patent ductus arteriosus (PDA); need for PDA treatment; length of hospital stay; and death. MATERIALS AND METHODS. An analytical, retrospective, observational and single-center study was carried out at the Vall d'Hebron University Hospital in Barcelona between April 2015 and December 2018. The inclusion criteria were: premature infants less than 31 weeks of gestational age (GA), birth weight less than 1,251 g, born at the Vall d'Hebron University Hospital and admitted to the Neonatology Service and with parenteral nutrition with a same type of lipids during their hospital stay. Biodemographic, obstetric, analytical, therapeutic and clinical data were collected from the clinical history of the patients. The data referring to parenteral nutrition were extracted from the Pharmacy Service parenteral nutrition prescription and preparation database. RESULTS. One hundred and eighty patients met all the inclusion criteria, 90 received parenteral nutrition with Clinoleic® (April 2015 - March 2017) and another 90 received parenteral nutrition with SMOFlipid® (June 2017 - December 2018). The incidence of ROP (40% in the Clinoleic® group, 41% in the SMOFlipid® group, p=0.88) and the ROP with need of treatment (4% in the Clinoleic® group and 10% in the SMOFlipid® group, p=0.152) did not show statistically significant differences between the two treatment groups. In the GA 29 weeks subpopulations, there were also no differences between the two treatment groups. Regarding weight gain in the first 6 weeks of life and other morbidity parameters for premature infants, no statistically significant differences were observed between the two treatment groups. CONCLUSIONS. Parenteral nutrition lipids based on fish oil, SMOFlipid®, do not protect from the development of ROP or the need for treatment compared to lipids based on olive oil, Clinoleic®, in premature infants with GA

[eng] The herpesvirus diseases are increasing in importance as a public health problem throughout the world. Members of the human herpesvirus family are global in distribution and infect 60-95% of the world's population, both in developed and in developing countries. The terminase complex plays a key role in genome packaging and is a promising drug target for developing new antiviral compounds. The tripartite terminase 3 subunit C-terminal domain (TRM3-C) of five human herpesviruses (HSV-2, VZV, EBV, HCMV and KSHV) has been biochemically characterized, showing the need of Mn2+ cations in order to enhance the nuclease activity. The three-dimensional structure of TRM3-C HSV-2 has been determined by X-ray crystallography and showed a new position of the two Mn+2 ions in the active centre. Diverse inhibitors have been tested against the TRM3-C terminal domain of the five herpesviruses. Some of them were developed in our laboratory (BS14 and BS17) and the others are specific inhibitors of the HIV integrase. Docking models of TRM3-C have been obtained with the inhibitors that were able to inhibit the nuclease activity in a low micromolar range (BS14, BS17 and Bictegravir). Cell assays with BS14 showed that is moderately active against HCMV. Considering all the biochemical and structural data, new compounds have been designed to obtain better inhibitors against the TRM3-C target. Coronaviruses are a large family of viruses that are known to cause human illness ranging from the common cold to more severe diseases such as MERS and SARS. The emergence of SARS-CoV-2 in 2019 has triggered an ongoing global pandemic of the severe pneumonia-like disease coronavirus disease 2019 (COVID-19). The main protease (Mpro) is one of the best characterized drug targets among coronaviruses. Compound 1 inhibits the protease of the rhinovirus, which is homolog to the SARS-CoV-1 Mpro. Thus, could be a promising drug against coronaviruses. The three-dimensional structure of SARS-CoV-1 Mpro in complex with the inhibitor Compound 1 has been determined., [spa] Las enfermedades provocadas por herpesvirus están cobrando cada vez más importancia como problema de salud pública en todo el mundo. Los miembros de la familia del herpesvirus humano están distribuidos mundialmente e infectan al 60-95% de la población, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo. El complejo de la terminasa juega un papel clave en el empaquetamiento del genoma y es una diana farmacológica prometedora para el desarrollo de nuevos compuestos antivirales. Se ha caracterizado bioquímicamente el dominio C- terminal de la subunidad 3 de la terminasa tripartita (TRM3-C) de cinco herpesvirus humanos (HSV-2, VZV, EBV, HCMV y KSHV), mostrando la necesidad de cationes Mn2+ para potenciar la actividad nucleasa. La estructura tridimensional de TRM3-C HSV-2 ha sido determinada por cristalografía de rayos X, mostrando una nueva posición de los dos iones Mn+2 en el centro activo. Se han probado diversos inhibidores contra el dominio terminal TRM3-C de los cinco herpesvirus. Algunos de ellos fueron desarrollados en nuestro laboratorio (BS14 y BS17) y los demás son inhibidores específicos de la integrasa del VIH. Se han obtenido modelos de acoplamiento de TRM3-C con los inhibidores que fueron capaces de inhibir la actividad nucleasa en un rango micromolar bajo (BS14, BS17 y Bictegravir). Los ensayos celulares con BS14 mostraron que es moderadamente activo contra HCMV. Teniendo en cuenta todos los datos bioquímicos y estructurales, se han diseñado nuevos compuestos para obtener mejores inhibidores contra la diana TRM3-C. Los coronavirus son una gran familia de virus que causan enfermedades humanas que van desde el resfriado común hasta enfermedades más graves como MERS y SARS. La aparición del SARS-CoV-2 en 2019 ha desencadenado una pandemia mundial en curso de la enfermedad grave por coronavirus 2019 (COVID-19), una enfermedad similar a la neumonía. La proteasa principal (Mpro) es una de las dianas farmacológicas mejor caracterizadas entre los coronavirus. El compuesto 1 inhibe la proteasa del rinovirus, que es homóloga al SARS-CoV-1 Mpro. Por lo tanto, podría ser un fármaco prometedor contra los coronavirus. Se ha determinado la estructura tridimensional de SARS-CoV-1 Mpro en complejo con el inhibidor Compuesto 1.

[spa] La familia TAM consta de tres receptores de membrana de tipo tirosina-quinasa: TYRO3, AXL, MERTK. Sus ligandos son Growth Arrest-Specific 6 (GAS6) y la Proteína S (PROS1). Éstas últimas son proteínas dependientes de vitamina K, que al unirse activan los receptores y desencadenan cascadas de señalización involucradas en procesos inflamatorios, fibróticos, anti-apoptóticos y autoinmunes. Su diversidad funcional hace que su investigación tenga interés en diversas patologías caracterizadas por estos eventos. Múltiples estudios han observado que los niveles, tanto de los receptores como de los ligandos, están alterados en diversas patologías: cáncer colorrectal, cáncer de mama, infecciones víricas, lupus, esteatohepatitis, artritis, entre muchas otras. Nuestros estudios, de cáncer de páncreas y la enfermedad por coronavirus (Coronavirus disease 2019, COVID-19), son solamente un ejemplo del posible uso de estas proteínas como biomarcadores en suero de pacientes. Representa un avance en clínica, ya que detectaría la patología en sus fases iniciales y daría una orientación del pronóstico del paciente, mediante una técnica rápida, no invasiva y de bajo coste. En primer lugar, el estudio de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), el tipo de cáncer de páncreas más común, refleja una sobreexpresión inmunohistológica de AXL en muestras de tumores. Asimismo, mediante el estudio con líneas celulares y ratones transgénicos, detectamos que las modificaciones de estas proteínas a nivel de ARN y proteína, se deben a las células tumorales y a partir de un tipo concreto de lesiones preneoplásicas. Además, los niveles de sAXL y GAS6 se encuentran aumentados en suero de pacientes, por lo que serían indicativos de la presencia de esta patología en sus fases tempranas. Estos análisis, comparados con CA19-9, el biomarcador por excelencia de PDAC, muestran a AXL con una mayor especificidad y sensibilidad, ya que es capaz de discernir entre PDAC y pancreatitis crónica. Esto es importante ya que el cáncer de páncreas es uno de los cánceres más mortíferos dado a su detección tardía, lo que supone la imposibilidad de iniciar un tratamiento a tiempo. No obstante, dado a la heterogeneidad de la expresión de AXL, proponemos el uso de esta proteína junto a otros biomarcadores para un diagnóstico definitivo. La COVID-19 es una patología causada por la infección de (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS-CoV-2). En nuestro estudio observamos que los niveles de GAS6 en suero de pacientes positivos en SARS-CoV-2 en el momento que acuden a urgencias, están significativamente más elevados respecto a pacientes negativos en la infección vírica. Concretamente, GAS6 está más aumentado en pacientes que hospitalizan respecto a aquellos que no lo requieren, siendo aún más significativo el aumento en pacientes que fallecen. Estos resultados, junto a otros estudios que proponen que AXL podría ser un co-receptor del virus junto a (Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2), muestran que el sistema GAS6/AXL está activo en las fases iniciales de la infección y puede dar un pronóstico del paciente. Nuestros resultados van en sintonía con aquellos reportados posteriormente por otros grupos de investigación. El hecho que el sistema GAS6/TAM sea partícipe en los eventos moleculares iniciales en la patología, refuerza la idea de que el uso de moduladores de este sistema, como el del inhibidor de AXL bemcentinib, podría ayudar a la prevención y/o tratamiento de estas patologías. Aun así, se necesitarían más estudios ampliando el número de muestras y empleando reactivos que en su momento no estaban a disposición del laboratorio., [eng] TYRO3, AXL and MERTK are membrane receptors that belong to the TAM family. Their ligands are GAS6 and PROS1, vitamin K-dependent proteins. Their interaction leads to an activation of multiple signaling cascades involved in inflammatory, fibrotic, antiapoptotic and autoimmune processes. Their behavior in these mechanisms leads to a special interest in their role in different pathologies that are characterized by these processes, such as cancer, virus infections and autoimmune diseases. Thus, we performed two studies, one of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and another one of the coronavirus diseases 2019 (COVID-19). They can serve as examples of the use of these proteins’ measurement in order to demonstrate their usage as an early detection method of these pathologies. First, in our study of PDAC, we analyzed AXL expression by immunohistochemistry in human pancreatic tissue samples and its concentration in patients’ plasma. We found out that patients with PDAC had higher AXL expression compared to the chronic pancreatitis and control cohorts. Thanks to a ROC analysis, we demonstrated that AXL has a better sensibility and specificity than CA19-9, the most-used biomarker in PDAC, as it can differentiate PDAC from chronic pancreatitis. These results are validated with the experiments we performed with transgenic mice, as the animals that developed PDAC showed higher AXL levels than the ones who didn’t. Also, human cell lines showed that the cancerous cells are the responsible ones of this increase. In addition, our study in COVID-19, we observed that patients who were positive in SARS-CoV-2 had higher GAS6 plasma concentration. Indeed, those patients who needed hospitalization had higher GAS6 levels compared to patients who did not required it, being the ones who died who had the highest levels. These findings demonstrate that GAS6/AXL system is involved in the first stages of the virus infection, so the measurement of their plasma concentration could help to a better prognosis of the patient and a more accurate treatment. In conclusion, the measurement of TAM proteins and their ligands can be helpful if they are used with other biomarkers, for a better diagnosis and treatment decision. Moreover, as their role in these pathologies has been demonstrated, the usage of modulators of this system, like the AXL inhibitor bemcentinib, can be useful for prevention or treatment of these pathologies.

[spa] INTRODUCCIÓN. La retinopatía de la prematuridad (Retinopathy of prematurity, ROP) es una vitreorretinopatía proliferativa que afecta a los recién nacidos prematuros y es una de las principales causas de ceguera infantil. El ácido docosahexanoico (DHA) es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga de la serie omega 3 necesario para el desarrollo de la retina. El aporte de DHA a través de los lípidos de la nutrición parenteral puede modificar el curso de la ROP y reducir su morbilidad. Los lípidos basados en aceite de pescado contienen DHA. OBJETIVOS. El objetivo principal fue comparar el efecto de dos emulsiones de lípidos de la nutrición parenteral, una basada en aceite de oliva (Clinoleic®) y la otra basada en aceite de pescado (SMOFlipid®), sobre la incidencia de ROP y la ROP con necesidad de tratamiento. Los objetivos secundarios fueron comparar el efecto de estas dos emulsiones sobre la ganancia de peso postnatal en las primeras 6 semanas de vida y sobre las siguientes comorbilidades neonatales: duración de la nutrición parenteral, necesidad de oxigenoterapia, necesidad de tranfusiones de sangre, alteraciones de la glucemia, sepsis, enterocolitits necrotizante, colestasis, displasia broncopulmonar, hemorragia intraventricular de grado ≥2, enfermedad de la membrana hialina y necesidad de surfactante, ductus arterioso persistente (DAP), necesidad de tratamiento del DAP, duración de la estancia hospitalaria y exitus. MATERIAL Y MÉTODOS. Estudio analítico, retrospectivo, observacional y unicéntrico realizado en el Hospital Universitario Vall d’Hebron de Barcelona entre los meses de abril del 2.015 y diciembre del 2.018. Los criterios de inclusión fueron: neonatos prematuros de menos de 31 semanas de edad gestacional (EG), peso al nacimiento inferior a 1.251 g, nacidos en el Hospital Universitario Vall d’Hebron e ingresados en el Servicio de Neonatología y con nutrición parenteral con un mismo tipo de lípidos durante su estancia hospitalaria. Los datos biodemográficos, obstétricos, analíticos, terapéuticos y clínicos fueron recopilados de la historia clínica de los pacientes. Los datos referentes a la nutrición parenteral se extrajeron de la base de datos de prescripción y preparación de las nutriciones parenterales del Servicio de Farmacia. RESULTADOS. Ciento ochenta pacientes cumplían todos los criterios de inclusión, 90 recibieron la nutrición parenteral con Clinoleic® (abril 2.015 - marzo 2.017) y otros 90 recibieron la nutrición parenteral con SMOFlipid® (junio 2.017 - diciembre 2.018). La incidencia de ROP (40% en grupo Clinoleic®, 41% en SMOFlipid®, p=0,88) y necesidad de tratamiento de la ROP (4% en Clinoleic® y 10% en SMOFlipid®, p=0,152) no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de tratamiento. En las subpoblaciones de EG 29 semanas, tampoco hubo diferencias entre los dos grupos de tratamiento. Respecto a la ganancia de peso en las primeras 6 semanas de vida y resto de parámetros de morbilidad del prematuro, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de tratamiento. CONCLUSIONES. Los lípidos de la nutrición parenteral basados en aceite de pescado, SMOFlipid®, no protegen del desarrollo de ROP ni a la necesidad de tratamiento frente a los lípidos basados en aceite de oliva, Clinoleic®, en prematuros de EG 29 weeks subpopulations, there were also no differences between the two treatment groups. Regarding weight gain in the first 6 weeks of life and other morbidity parameters for premature infants, no statistically significant differences were observed between the two treatment groups. CONCLUSIONS. Parenteral nutrition lipids based on fish oil, SMOFlipid®, do not protect from the development of ROP or the need for treatment compared to lipids based on olive oil, Clinoleic®, in premature infants with GA

[eng] OBJECTIVE: Identifying predictive biomarkers at early stages of undifferentiated arthritis (UA) is crucial for starting appropriate therapies to avoid poor outcomes. Monocytes and macrophages, largely associated with arthritis, are contributors and sensors of inflammation through epigenetic modifications. We investigated associations between clinical features and DNA methylation patterns in monocytes from UA patients, seeking potential prognostic biomarkers. METHODS: We characterized the DNA methylation profiles of blood and synovial fluid (SF) monocytes from UA patients at baseline and during subsequent visits and compared them to those from healthy donors (HD) and in vitro-differentiated macrophages. These data were used to interrogate their relationship with prognosis and changes over time, and identify predictive biomarkers of poor prognosis. RESULTS: UA blood monocyte profiles exhibited significant alterations in comparison with those from HD. After comparing UA patients grouped by their future outcomes —good versus poor—, additional differences were identified both in blood and SF monocytes. Patient profiles in subsequent visits revealed a reversion towards a healthy level in both groups, those requiring DMARD treatment and those that remitted spontaneously. Changes in disease activity between visits revealed an impact on DNA methylation, partially concomitant in the SF of UA and in blood monocytes of rheumatoid arthritis patients. CONCLUSION: We propose a list of DNA methylation-based biomarkers of poor prognosis in early untreated UA patients. We demonstrate the value of DNA methylation as a tool for estimating disease activity in UA. Finally, we highlight epigenetic similarities between arthritis types that allow a common prediction of disease activity., [spa] OBJETIVO: La identificación de biomarcadores predictivos en fases tempranas de la artritis indiferenciada (AI) es crucial para iniciar las terapias apropiadas para evitar malos resultados. Los monocitos y macrófagos, asociados en gran medida a la artritis, son contribuyentes y sensores de la inflamación a través de modificaciones epigenéticas. Investigamos las asociaciones entre las características clínicas y los patrones de metilación del ADN en monocitos de pacientes con AI, buscando potenciales biomarcadores de pronóstico. MÉTODOS: Caracterizamos los perfiles de metilación del ADN de los monocitos de sangre y líquido sinovial (LS) de pacientes con AI al inicio y durante las visitas posteriores y los comparamos con los de donantes sanos (DS) y macrófagos diferenciados in vitro. Estos datos se utilizaron para interrogar su relación con el pronóstico y los cambios a lo largo del tiempo, e identificar biomarcadores predictivos de mal pronóstico. RESULTADOS: Los perfiles de monocitos en sangre de la AI mostraron alteraciones significativas en comparación con los de la EH. Tras comparar a los pacientes de AU agrupados por sus resultados futuros -buenos frente a malos-, se identificaron diferencias adicionales tanto en los monocitos sanguíneos como en los de SF. Los perfiles de los pacientes en las visitas posteriores revelaron una reversión hacia un nivel saludable en ambos grupos, los que requirieron tratamiento con DMARD y los que remitieron espontáneamente. Los cambios en la actividad de la enfermedad entre las visitas revelaron un impacto en la metilación del ADN, parcialmente concomitante en el SF de la UA y en los monocitos sanguíneos de los pacientes con artritis reumatoide. CONCLUSIONES: Proponemos una lista de biomarcadores basados en la metilación del ADN de mal pronóstico en pacientes con AI no tratados en fase inicial. Demostramos el valor de la metilación del ADN como herramienta para estimar la actividad de la enfermedad en la AI. Por último, destacamos las similitudes epigenéticas entre los tipos de artritis que permiten una predicción común de la actividad de la enfermedad.

[spa] El papel que juega el metabolismo lipídico en la progresión del cáncer está siendo revisado. Estudios recientes de nuestro laboratorio demuestran que el tratamiento con ácido palmítico (AP) de células en cultivo o una dieta rica en AP en ratones incrementan la capacidad metastática de las células cancerosas. Sin embargo, los mismos experimentos realizados con ácido oleico (AO) disminuyen la capacidad metastática, lo cual sugiere que cada ácido graso (AG) de nuestra dieta tiene un efecto diferente en las células tumorales. El efecto pro-metastático del AP es mediado por una memoria epigenética, pero su mecanismo no se ha comprendido completamente todavía. Para caracterizar el mecanismo por el cual el AP induce un estado pro-metastático en las células, decidimos estudiar mediante análisis proteicos los cambios en la señalización celular provocados por el AP y el AO. Observamos que el proteoma de las líneas celulares de carcinoma oral de células escamosas (COCE) cambia en direcciones opuestas en respuesta a los tratamientos con AP o AO en cultivo. Por el contrario, el análisis del proteoma de células tumorales creciendo ortotópicamente en animales alimentados con dietas enriquecidas con aceite de palma (rico en AP) o aceite de oliva (rico en AO) mostró que ambas dietas inducen cambios similares, aunque la magnitud de dichas alteraciones es mayor en la dieta rica en AP. Esta diferencia podría ser causada por el hecho de que los aceites de la dieta (palmítico y oleico) están compuestos por diversos AG, no son AG puros. A pesar de ello, observamos ciertas diferencias en los cambios inducidos por cada dieta. Una de las principales categorías específicamente incrementadas con la dieta rica en AP fue la S-palmitoilación: las acil-proteina transferasas DHHC son aumentadas por esta dieta y su expresión génica incrementa con el tratamiento con AP en cultivo y en las metástasis en nódulos linfáticos en comparación con los tumores primarios. El estudio del palmitoiloma de células COCE pro-metastáticas, indicó que está enriquecido en proteínas involucradas en funciones de la membrana celular como movilidad o adhesión celular. Pudimos observar que las células tratadas con AP muestran un aumento en el nivel de palmitoilación de su proteoma comparadas con las tratadas con AO o las células control. Validamos y caracterizamos la palmitoilación de una proteína con especial relevancia en la biología celular y posible implicación en el incremento de la capacidad metastática inducido por el tratamiento con AP.

[eng] The present Thesis is divided in three chapters: 1. Design and synthesis of new soluble epoxide hydrolase inhibitors (sEHI) The synthesis of new soluble epoxide hydrolase inhibitors based on ureas as the main pharmacophore, a benzohomoadamantane unit and different arylpiperidine groups. The aim was to broaden the spectrum of inhibitors previously developed by the group, taking as starting point the Astellas pharmaceutical product AS2586114. Twelve new urea-based sEHIs were synthesized and evaluated. Two of them were selected for further in vitro studies. The synthesis of new sEHI derived from the substitution of the urea group by and amide group, in order to extend the Markush formula of a patent that the group filled in two years ago and, on the other hand, to improve the solubility of the urea-containing sEHI. Twelve novel amide-based sEHI were synthesized and evaluated. One of them was selected for further in vitro studies demonstrating potent anti-inflammatory properties. 2. Design and synthesis of new anti-influenza virus molecules. The development of new antiviral molecules against the influenza A virus H1/N1 subtype targeting the hemagglutinin of the virus, continuing previous research by our group. This part of the Thesis greatly improved and completed previous SAR studies on this kind of hemagglutinin inhibitors. 3. Design and synthesis of new anti-coronavirus molecules. The development of new antiviral molecules against coronavirus 229E, continuing group’s research in the field carrying out a more complete SAR study. Guanidine-bearing molecules were endowed with a great potency against 229E subtype. The most active compound was selected for further mechanistic studies in order to identify the targeted protein. Unfortunately, the compounds were not active against the SARS-2 coronavirus.

[eng] Infectious diseases are still one of the main leading causes of death worldwide mainly due the overuse and the lack of development of new antibiotics. This fact has increased the appearance of multidrug resistance (MDR) bacteria strains resulting in a growing number of infections difficult to treat with conventional drugs. In this context, Pseudomonas aeruginosa gram negative bacterium presents great interest since it is a MDR bacterium causing a high number of infections, especially nosocomial infections. Moreover, it is one of the most predominant pathogen in patients with cystic fibrosis. Usually, P. aeruginosa infections can be categorized as acute and chronic, but this classification is not always obvious. Acute infections are frequent during early stages of infection and associated with a planktonic lifestyle and with high levels of virulence factors (VFs) production. In contrast, chronic infections are characterized by a lower VF production and the formation of biofilms and persiter cells, which confer high resistance to antibiotics. The development of pathogenesis and the transition between acute and chronic infections are regulated by a bacterial communication system called Quorum Sensing (QS), which controls the expression of a myriad of genes in response to the presence of small signal molecules called autoinducers. In consequence, QS has attracted attention as a promising target to develop diagnostic and therapeutic approaches. Although being a time-consuming technique, which delays treatment administration with the consequences that this entails, the gold standard technique used for P. aeruginosa detection is still based on plate culture. Thus, there is a clear need to obtain rapid and sensitive diagnostic techniques. Within this framework, a highly sensitive, specific and rapid immunochemical assay has been developed to detect one of the main VF of P. aeruginosa, pyocyanin (PYO), in less than 2 h using a high affinity monoclonal antibody (mAb) against it. The low limit of detection of the assay has allowed PYO detection in bacterial isolates from patients infected with P. aeruginosa and its validation as potential biomarker of these infections. In the light of the obtained results, further investigations have been assessed on analysing directly clinical samples, such as sputa and swab samples from patients infected with this pathogen. Furthermore, based on QS system and on the use of specific mAbs against key molecules of this system, a new therapeutical approach to treat P. aeruginosa infections has been studied. In this context, the quenching activity of PYOmAb has been assessed using a developed cell based in vitro system. First, the cytotoxic effect caused by PYO has been evaluated on murine macrophages studying different hallmarks of viability since this VF is known to exert a large number of toxic effects in host cells. Subsequently, the protective effect of PYOmAb on the same cell line has been analysed obtaining a high increase of viability percentages (50 - 80 %). Apart from studying an effector molecule, the quenching of a signalling molecule, such as Pseudomonas Quinolone Signal (PQS), has been also adressed using the same in vitro system. In this case, the protection levels obtained have been even better reaching 80 - 100 % viability levels. Thus, the obtaines results has demonstrated the potential of these mAbs as therapeutic agents., [spa] Las enfermedades infecciosas siguen siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo debido principalmente al uso excesivo y la falta de desarrollo de nuevos antibióticos. Este hecho ha incrementado la aparición de cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos (multiresistentes), lo que ha dado lugar a un número creciente de infecciones difíciles de tratar con fármacos convencionales. En este contexto, la bacteria gram negativa Pseudomonas aeruginosa presenta gran interés al tratarse de un patógeno multiresitente causante de un elevado número de infecciones, especialmente infecciones nosocomiales. Además, es una de las bacterias más predominantes en pacientes con fibrosis quística. Por lo general, las infecciones por P. aeruginosa pueden clasificarse en agudas y crónicas, pero esta clasificación no siempre es obvia. Las infecciones agudas son frecuentes durante las primeras etapas de la infección y se asocian con un estilo de vida planctónico y con altos niveles de producción de factores de virulencia (FV). Por el contrario, las infecciones crónicas se caracterizan por una menor producción de FV y por la formación de biopelículas y células persitentes que confieren una alta resistencia a los antibióticos. El desarrollo de la infección y la transición entre infecciones agudas y crónicas están regulados por un sistema de comunicación bacteriano llamado sistema Quorum Sensing (QS), el cual controla la expresión genética en respuesta a la presencia de pequeñas moléculas señalizadoras llamadas autoinductores. Por ello, el sistema QS suscita gran interés en el desarrollo de herramientas tanto de diagnostico como de terapia. A pesar de tratarse de una técnica larga que retrasa la administración del tratamiento con las consecuencias que esto conlleva, el cultivo en placa sigue siendo la técnica por excelencia utilizada para la detección de P. aeruginosa. Por esta razón, existe una clara necesidad de obtener técnicas de diagnóstico rápidas y sensibles. En este contexto, se ha desarrollado un ensayo inmunoquímico de alta sensibilidad, especificidad y rapidez para detectar uno de los principales FV de P. aeruginosa, la piocianina (PYO), en menos de 2 h utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb). El bajo límite de detección del ensayo ha permitido la detección de PYO en aislados bacterianos de pacientes infectados con P. aeruginosa y su validación como potencial biomarcador de este tipo de infecciones. A la luz de los resultados obtenidos, se llevaron a cabo experimentos analizando directamente muestras clínicas como esputos e hisopos de pacientes infectados con este patógeno. Además, basándonos en el sistema QS y en el uso de mAbs específicos contra moléculas clave de este sistema, se ha estudiado un nuevo enfoque terapéutico para tratar las infecciones causadas por P. aeruginosa. Así pues, la capacidad protectora del mAbPYO se evaluó utilizando un sistema in vitro basado en cultivo celular. Primero, se estudio el efecto citotóxico de la PYO en macrófagos murinos estudiando diferentes características de viabilidad debido a la gran cantidad de efectos tóxicos que ejerce este FV en las células huésped. Posteriormente, se ha analizado el efecto protector del mAbPYO sobre la misma línea celular obteniendo elevados porcentajes de viabilidad (50 - 80 %). Además de estudiar una molécula efectora, también se ha abordado el bloqueo de una molécula de señalización como la Pseudomonas Quinolone Signal (PQS) utilizando el mismo sistema in vitro. En este caso, los niveles de protección obtenidos han sido aún mejores alcanzando niveles de viabilidad del 80 - 100 %. Por lo tanto, los resultados obtenidos han demostrado el potencial de estos mAbs como agentes terapéuticos.

[eng] The use of imaging techniques routinely used for diagnosis and the assessment for treatment response in oncology allow us to analyze the changes in body composition that occur during treatment and how these changes impact on oncologic outcomes such as survival or toxicity. In addition, we can observe the efficacy of nutritional support through these images. My main objective for this thesis was to evaluate the nutritional and body composition changes affecting patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) during cancer treatment. Initially we designed a prospective study to analyze the body composition and nutritional changes that occur during conservative treatment in patients with locally advanced HNSCC at different time points. All patients were closely monitored throughout the treatment implementing nutritional support according to clinical practice guidelines. We observed that 30% of patients were malnourished at diagnosis. However, after the induction chemotherapy, there was an increase in weight and muscle mass with a significant improvement in nutrition impact symptoms such as dysphagia and odynophagia. Nevertheless, a significant nutritional deterioration occurred by the end of concomitant treatment with bio-radiotherapy or chemo- radiotherapy with 95% of patients becoming severely/moderately malnourished. Our findings suggest that induction chemotherapy may help improve nutritional status by ameliorating nutrition impact symptoms. This improvement could contribute to minimize the significant deterioration that occurs despite an intensive nutritional support along the oncological treatment. An additional aimed was to describe the changes in muscle and fat mass during the chemo- radiation in locally advanced HNSCC patients and evaluate the clinical predictors implicated in this loss. A longitudinal retrospective study was carried out focusing in the analysis of CT images pre-treatment and at the evaluation of tumor response at 3 months after finishing radiotherapy, to quantify muscle and adipose tissue. Nutritional support was provided according to ESPEN guidelines and adjusted body weight (ABW) was used in overweight/obese patients to define their nutritional targets. Patients lost a significant amount of weight, muscle and fat mass during the concomitant treatment. Patients with higher body mass index tended to lose more fat mass but also more muscle. In multivariate regression, only ABW independently predicted muscle and fat loss suggesting that the use of ABW to set nutrition targets in overweight/obese patients may be insufficient. It should be highlighted the urgent need for the development of nutritional guidelines to treat obese cancer patients in order to improve oncological outcomes. We used the repeated images at baseline and after treatment in same cohort of patients to describe the changes in skeletal muscle and fat over time at different anatomical levels to determine whether those changes are systemic or localized. Precision testing was performed calculating the % coefficient of variation, the root-mean-square standard deviation and the corresponding 95% least significant change values for four anatomical levels: upper arm, thigh, chest and abdomen. The median time between scans was 224 (SD 31 days). The least significant change values for muscle varied from 0.7 to 2.4% depending on anatomic level; with the lowest precision error to detect change in the thigh. Muscle wasting appears to be systemic and while present in limbs and trunk is significant higher in the thigh that in the chest abdomen and upper arm. As reduced muscle mass has been associated with increased treatment complications worsening survival in several tumor types, we evaluated the impact of reduced skeletal muscle on prognosis and immune-related adverse events (IrAEs) in patients of recurrent/metastatic HNSCC treated with immune checkpoints inhibitors (ICI). Skeletal muscle was quantified using a CT scan at diagnosis. We observed that low skeletal muscle mass was an independent factor for overall survival in the univariate and multivariate analysis. There was no association between low skeletal muscle and IrAEs of any grade., [spa] El uso de técnicas de imagen utilizadas habitualmente para el diagnóstico y la valoración de respuesta al tratamiento oncológico permite analizar los cambios en la composición corporal (CoC) que se producen durante el tratamiento y cómo estos cambios repercuten en los resultados oncológicos, como la supervivencia o la toxicidad. Además, podemos observar la eficacia del soporte nutricional a través de estas imágenes. El principal objetivo de esta tesis ha sido evaluar los cambios nutricionales y de CoC que afectan a los pacientes con carcinoma escamoso de cabeza y cuello (CECC) durante el tratamiento oncológico. Inicialmente diseñamos un estudio prospectivo para analizar la CoC y los cambios nutricionales que se producen durante el tratamiento conservador en pacientes con CECC localmente avanzado. Todos los pacientes tuvieron seguimiento nutricional implementando el soporte nutricional de acuerdo con las guías de práctica clínica. Hemos observado que el 30% de los pacientes estaban desnutridos en el momento del diagnóstico. Sin embargo, tras la quimioterapia de inducción, aumentó el peso y la masa muscular con una mejora significativa de los síntomas de que limitaban la ingesta (disfagia y odinofagia). No obstante, se produjo un deterioro nutricional significativo al final del tratamiento concomitante (bio-radioterapia o quimio- radioterapia), con un 95% de desnutrición grave/moderada. Nuestros hallazgos sugieren que la quimioterapia de inducción puede ayudar a mejorar el estado nutricional mejorando aquellos síntomas que limitan la ingesta. Esta mejora podría contribuir a minimizar el importante deterioro que se produce a pesar del soporte nutricional intensivo a lo largo del tratamiento oncológico. Un objetivo adicional ha sido describir los cambios en la masa muscular y la grasa durante la quimio-radioterapia concomitante en pacientes con CECC localmente avanzado y evaluar los predictores clínicos implicados en esta pérdida. Se realizó un estudio longitudinal retrospectivo centrado en el análisis de las imágenes de TC previas al tratamiento y en la valoración de respuesta a los 3 meses tras finalizar el tratamiento, para cuantificar músculo y grasa. Se proporcionó soporte nutricional según las guías ESPEN utilizando el peso ajustado (PA) en los pacientes con sobrepeso/obesidad para definir sus objetivos nutricionales. Los pacientes perdieron una cantidad significativa de peso, masa muscular y grasa durante el tratamiento concomitante. Aquellos pacientes con un mayor índice de masa corporal (IMC) tendían a perder más grasa, pero también más músculo. En el análisis multivariado, sólo el IMC predijo de forma independiente la pérdida muscular y grasa, lo que sugiere que el uso del PA para establecer objetivos nutricionales en pacientes con sobrepeso/obesidad puede ser insuficiente. Cabe destacar la necesidad urgente de desarrollar guías nutricionales para el tratamiento nutricional de pacientes obesos con cáncer con el fin de mejorar los resultados oncológicos. Además, hemos utilizado las imágenes del diagnóstico y tras el tratamiento concomitante de esta misma cohorte de pacientes para describir los cambios de CoC a lo largo del tiempo en diferentes niveles anatómicos para determinar si estos cambios son sistémicos o localizados. Se realizaron pruebas de precisión calculando el % de coeficiente de variación y los correspondientes valores del mínimo cambio significativo al 95% para cuatro niveles anatómicos: brazo, muslo, tórax y abdomen. La mediana del tiempo transcurrido entre las exploraciones fue de 224 (DE 31 días). Los valores del mínimo cambio significativo para el músculo variaron entre el 0,7 y el 2,4% según el nivel anatómico; el error de precisión más bajo para detectar el cambio se produjo en el muslo. El deterioro muscular parece ser sistémico y, aunque está presente en las extremidades y el tronco, es significativamente mayor en el muslo que en el tórax, el abdomen y el brazo. Por otro lado, se ha evaluado el impacto de la reducción del músculo esquelético en el pronóstico y los efectos adversos inmuno-relacionados (EAI) en pacientes con CECC recurrente/metastásico tratados con inmunoterapia. El músculo esquelético se cuantificó mediante TC al diagnóstico. Hemos observado que la baja masa muscular era un factor independiente de supervivencia global en el análisis univariante y multivariante. No hubo asociación entre la baja masa muscular y los EAI.

[eng] El receptor de glucocorticoides (GR) es un factor de transcripción que se expresa de forma ubicua y controla procesos esenciales para la vida como el metabolismo, la inflamación y la homeostasis. Aunque se han publicado numerosas estructuras cristalinas del dominio de unión al ligando de este receptor (GR-LBD), el estado oligomérico funcional del receptor en su totalidad, el cual es esencial para su actividad transcripcional, sigue siendo cuestionado. En esta disertación doctoral presentamos seis nuevas estructuras cristalinas del dominio GR-LBD unido a un agonista, junto con un extensivo análisis del trabajo estructural previamente publicado. Como resultado de esta investigación, se ha identificado un catálogo de 20 conformaciones diméricas distintas a partir de los estudios estructurales (usando cristalografía de rayos X y complementándolo con cálculos in silico), así como homodímeros biológicamente importantes corroborados con una batería de mutaciones puntuales de GR en áreas cruciales para el autoensamblaje de este receptor. Además, GR y sus mutantes han sido analizados usando ensayos de crosslinking y resonancia de plasmones superficiales en solución, así como con microscopia cuantitativa de fluorescencia en células. Nuestros resultados destacan la relevancia de los modelos no canónicos de dimerización para GR, especialmente los contactos mediante residuos localizados en el loop L1-3 como la Tyr545. No solo esto, sino que también describimos un pocket secundario ubicado en la superficie del dominio LBD del receptor, al cual hemos denominado sensor site, capaz de modular la actividad transcripcional de GR al unir derivados del colesterol, tanto endógenos como sintéticos, convirtiéndose así en un potencial candidato como diana para nuevos tratamientos. Nuestro trabajo revela los ensamblajes cuaternarios (pato) fisiológicamente relevantes de este receptor nuclear que tienen importantes implicaciones para la acción de los glucocorticoides y que serán cruciales para el futuro diseño de fármacos., [spa] The glucocorticoid receptor (GR) is a ubiquitously expressed transcription factor that controls metabolic and homeostatic processes essential for life. Although numerous crystal structures of the GR ligand-binding domain (GR-LBD) have been reported, the functional oligomeric state of the full-length receptor (FL-GR), which is essential for its transcriptional activity, remains disputed. In this thesis dissertation we present six new crystal structures of agonist-bound GR-LBD, along with an extensive analysis of previous structural work. A catalog of 20 different dimeric arrangements have been identified from the structural studies (using X-ray crystallography and complementary in silico calculations) and biologically meaningful homodimers were corroborated by studying a battery of GR point mutants in selected areas crucial for GR-LBD self-assembly. In addition, GR mutants were analyzed using crosslinking and surface plasmon resonance assays in solution and quantitative fluorescence microscopy in living cells. Our results highlight the relevance of non-canonical dimerization modes for GR, especially of contacts made by loop L1-3 residues such as Tyr545. Additionally, we describe a second surface pocket placed in the LBD that can modulate GR activity by binding several endogenous and synthetic cholesterol derivatives. We have coined the term GR sensor site for this newly identified druggable pocket on the receptor. Our work unveils likely (patho)physiologically relevant quaternary assemblies of this nuclear receptor with important implications for glucocorticoid action and drug design.

[spa] La industria vitivinícola genera una gran cantidad de subproductos. Entre ellos el subproducto más abundante son los sarmientos de vid originados durante la temporada de poda. Los sarmientos de vid poseen una mezcla compleja de compuestos fenólicos los que incluyen ácidos fenólicos, flavonoides, y estilbenos, que a su vez están asociados con una amplia gama de beneficios para la salud. El perfil fenólico de los sarmientos es altamente dependiente del tipo de cultivar, la zona geográfica de cultivo, y de las condiciones de almacenamiento posteriores a la poda. Los procesos y sistemas de extracción también influyen fuertemente en el perfil de los compuestos fenólicos. Aunque existen numerosos estudios de recuperación e identificación de compuestos fenólicos obtenidos desde sarmientos de vid, muy pocos de ellos se han centrado en el estudio del escalamiento de los procesos de extracción y en el efecto sobre el perfil fenólico. Por otro lado, los compuestos fenólicos son reconocidos por ser inestables y sensibles a altas temperaturas, la luz, el pH y las enzimas oxidativas y degradantes. Estas variables afectan al perfil fenólico tanto en los procesos de producción como en la estabilidad de los productos finales. Una opción viable a escala industrial que permite solucionar estos problemas es la encapsulación de estos compuestos en ciclodextrinas, que les proporcionan una matriz protectora y les ayuda a preservar sus actividades biológicas. Por todas estas razones, esta tesis tiene por objetivo estudiar los cambios en el perfil fenólico de un extracto de sarmientos durante su producción y encapsulación, mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. La espectrometría de masas de alta resolución basada en LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS ha demostrado ser una poderosa herramienta de identificación y caracterización de compuestos fenólicos. El uso de este equipo nos permitió identificar nuevos compuestos en los extractos de sarmientos de vid producidos a escala de laboratorio. También fue útil para estudiar los cambios en el perfil fenólico durante la extracción a escala piloto y posterior encapsulación de estos compuestos en ciclodextrinas. Los resultados de esta tesis doctoral permitieron ampliar el conocimiento del perfil fenólico de los extractos de sarmientos de vid, analizar las diferencias de los extractos desde la extracción de laboratorio, a la extracción piloto hasta su posterior encapsulación en ciclodextrinas, permitiendo el desarrollo de un producto de alto valor agregado y con futuras aplicaciones en las industrias alimentaria y farmacéutica., [eng] The wine industry produces many by-products. The most common by-product is the grape canes (or vine shoots) that are produced during the pruning season. Grape canes contain a complex mixture of phenolic compounds, including phenolic acids, flavonoids, and stilbenes, which in turn have been linked to several health benefits. The phenolic profile of grape canes is highly dependent on the variety, the geographical area of cultivation, and the storage conditions after pruning. Extraction methods and systems also strongly influence the profile of phenolic compounds. Although there are numerous studies on the extraction and identification of phenolic compounds from grape canes, very few of them have focused on the study of the scaling-up of the extraction process and the effects on the phenolic profile. On the other hand, phenolic compounds are known to be unstable and sensitive to high temperature, light, pH, and oxidative and degradative enzymes. These variables affect the phenolic profile both in the production processes and in the stability of the final products. A viable way to address these issues on an industrial scale is to encapsulate these compounds in cyclodextrins, which allows them to obtain a protective matrix and retain their biological activities. For all these reasons, this PhD aims to study the changes in the phenolic profile of a grape cane extract during its production and encapsulation using liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometry. High-resolution mass spectrometry-based on LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS has proven to be a powerful tool for the identification and characterization of phenolic compounds. The use of this equipment allowed us to identify new compounds in extracts of grape canes. It was also useful to study the changes in phenolic profile during pilot-scale extraction and subsequent encapsulation of these compounds in cyclodextrins. The results of this PhD allowed to increase the knowledge of the phenolic profile of extracts from grape canes, to analyze the differences of the extracts from laboratory extraction to pilot extraction and their encapsulation in cyclodextrins, leading to the development of a product with high added value and with future applications in the food and pharmaceutical industries.

[eng] Proteins are composed of domains, a well-defined region within a protein that constitutes a stable, independently folding, compact structural unit, and that usually performs a specific function. During protein evolution, domains have been used as a ‘modules’, and the vast majority of the current proteins show a modular organization in which two or more domains are combined. While the creation of multi-domain proteins through shuffling different domains has been studied extensively, the evolution of proteins made of tandem repeats of a same domain has been less investigated. It is known, for instance, that the fraction of proteins with domain repeats is higher in multicellular organisms than in unicellular organisms, or that proteins with domain repeats seem to be related with stress response functions or with the acquisition of high yielding capacity, but the origin, the genetic mechanisms and the evolutionary forces controlling the expansion of domains repeats in modular proteins are still poorly understood. To investigate the functional and structural evolution of modular proteins with domain repeats, we have chosen the Metallothioneins (MTs) as a case study. MTs are present across all the tree of life and due to their metal-binding ability have been involved in metal homeostasis and detoxification of many organisms. They are modular cysteine-rich proteins that bind metal ions through functionally and structurally independent domains that form metal-thiolate clusters. Many MTs are bi-modular proteins made of a tandem repetition of two similar (although not identical) metal-binding domains. There also are large multi-modular MTs that have expanded the number of their domain repeats, and therefore, their metal-binding capacity. Studying the evolution of metallothionein domains in several phyla can help us to understand, at some level, the evolvability of organisms to adapt to new environmental conditions. In our studies we have identified, analysed, characterized and compared many MTs from different groups of selected organisms (chordates and molluscs) in order to study their domain composition and arrangement, and to untangle the evolution of their modular organization., [spa] Las proteínas están compuestas por dominios, una región bien definida dentro de una proteína que constituye una unidad estructural compacta, estable y que se pliega independientemente, y que normalmente realiza una función específica. Durante la evolución de las proteínas, los dominios se han utilizado como "módulos", y la gran mayoría de las proteínas actuales muestran una organización modular en la que se combinan dos o más dominios. Si bien la creación de proteínas de múltiples dominios mediante la combinación aleatoria de diferentes dominios se ha estudiado ampliamente, la evolución de proteínas compuestas de repeticiones en tándem de un mismo dominio se ha investigado menos. Se sabe, por ejemplo, que la fracción de proteínas con dominios repetidos es mayor en organismos multicelulares que en organismos unicelulares, o que las proteínas con dominios repetidos parecen estar relacionadas con funciones de respuesta al estrés o con la adquisición de una alta capacidad productiva, pero el origen, los mecanismos genéticos y las fuerzas evolutivas que controlan la expansión de las repeticiones de dominios en las proteínas modulares aún son poco conocidos. Para investigar la evolución funcional y estructural de las proteínas modulares con dominio repetido, hemos elegido las metalotioneínas (MT) como caso de estudio. Los MT están presentes en todo el árbol de la vida y, debido a su capacidad de unión a metales, han estado involucrados en la homeostasis de metales y la desintoxicación de muchos organismos. Son proteínas modulares ricas en cisteína que se unen a iones metálicos a través de dominios funcional y estructuralmente independientes que forman grupos de tiolatos metálicos. Muchos MT son proteínas bimodulares hechas de una repetición en tándem de dos dominios de unión a metales similares (aunque no idénticos). También hay grandes MT multimodulares que han ampliado el número de repeticiones de su dominio y, por lo tanto, su capacidad de unión a metales. El estudio de la evolución de los dominios de las metalotioneínas en varios filos puede ayudarnos a comprender, hasta cierto punto, la capacidad de evolución de los organismos para adaptarse a nuevas condiciones ambientales. En nuestros estudios hemos identificado, analizado, caracterizado y comparado muchos MT de diferentes grupos de organismos seleccionados (cordados y moluscos) para estudiar la composición y disposición de sus dominios y desentrañar la evolución de su organización modular.

Tesis doctoral.-- Universidad de Barcelona, Determining and understanding protein structure in atomic detail is a fundamental process to the advancement of biotechnology and biomedicine, shedding light the role of macromolecules and their complexes, their biological functions and pathways. The work presented in this thesis contributes to this aim by exploring new ways of identifying, analysing and classifying small, disconnected fragments and their association into local folds to provide specialised input models for X-ray crystallography phasing methods and as a general structural bioinformatics tool to enrich our insight of the results

[eng] Dermatitis is a chronic inflammatory skin disease, described by intensive pruritus and eczematous lesions of skin. In most of the patients with Dermatitis, a long-lasting cycle of itch-scratch roots produces substantial morbidities and discomforts. For instance, sleeping problems, compromised quality of life, and psychosocial problems, as well as appearance-related complications including skin infections resulting to a loss of self-confidence. The purpose of treatment in dermatitis is to decrease symptoms, cure superinfection, avoid exacerbations, lessen the risk of treatment, and bring back the integrity of the skin. In most patients with mild Dermatitis, treatment goals can be accomplished with topical therapies, however, in patients with moderate to severe Dermatitis, treatment is still a challenge. At present, a guideline-based method for treating Dermatitis is lacking and the pathogenesis of Dermatitis remains unknown. However, there is evidence that neuropeptides such as Calcitonin gene- related peptide (CGRP) influence the development and course of Dermatitis. Likewise, there are studies investigating spinal neurotransmitters in accordance with itching in dermatitis and it is reported that a species of neuropeptides is released from chloroquine-sensitive pruriceptors within the spine to arbitrate histamine-independent itch in Dermatitis. Moreover, a correlation between spine biomechanical alteration and Dermatitis is reported in numerous studies. Therefore, the main objective of this work is to carry out a prospective study to determine the relationship between alterations in the spine and Dermatitis by focusing on the level of CGRP in patients’ plasma. Furthermore, in this study we set out to investigate whether chiropractic can be an effective treatment for dermatitis. 73 patients suffering from dermatitis participated in this study. 51 of these patients were randomly assigned to the treatment group and 22 patients were also randomly assigned to the control group. All patients in both, treatment and control groups, were prescribed a topical compound cream, containing emollient corticosteroid-indomethacin, and antioxidants. However, only patients in the treatment group underwent chiropractic treatment while patients in the control group only received the above- mentioned topical treatment. In order to accomplish our objectives, the following data was analyzed in patients of the treatment group: (1) Dermatological examination quantified using the Eczema Area and Severity Index (EASI) score method, (2) Radiographic description and quantification of the severity level of spinal biomechanical alterations (SBA), hereinafter referred to as (spinal) severity score. (3) Biological data including blood tests and measurement of plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) level in all the patients and (4) chiropractic spinal examination and treatment (SMT) and on a 3-month weekly plan. All data was compared and analyzed before and after the treatment in the 73 study patients. The results presented in this study would be indicative of a correlation between the altered biomechanics of different spinal segments and the altered state of the skin. In this study we found that the EASI levels in the patients suffering from Dermatitis were significantly correlated with SBA in the Atlas- Axis (AT- AX) (p< 0.001; r=0.82), in the cervical spine (r=0.91), in the sagittal balance of the spine (SBS) (p< 0.001; r=0.88), in Spondylolisthesis (p< 0.001; r=0.85), in Thoracic 10 (p< 0.001; r=0.87), in Lumbar 1 (p< 0.001; r=0.81), and Lumbar 2 (p< 0.001; r=0.70). Overall, the results of this study indicated that improvement in the plasma CGRP level correlates with the improvement in the EASI level and the improvement in the SBA severity score. It suggests that spinal biomechanical alterations may contribute to the release of neuropeptides, including CGRP, from sensory nerves endings. Increase of plasma CGRP results in neurogenic inflammation of the skin and contributes to dermatological disorders such as dermatitis. In addition, our results indicated a significant reduction in the CGRP level in patients of the treatment group (who underwent chiropractic spinal treatment) and following that a significant reduction in EASI scores (improvement of skin´s situation). On the other hand, although the EASI level of the patients in control group decreased after 2 weeks of using compound cream, the CGRP level remained altered and consequently, the dermatitis symptoms showed up in those patients after 3 months. As a conclusion, the result of our study suggesting that there may be a strong correlation between the spine biomechanical alteration, CGRP level, and neurogenic inflammation of skin (in the form of Dermatitis of the skin). We also strongly suggest further investigations with bigger sample population., [spa] La dermatitis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel, descrita por prurito intensivo y lesiones cutáneas eccematosas. En la mayoría de los pacientes con dermatitis, un ciclo prolongado de raíces con picazón y rascado produce morbilidades y malestares sustanciales. Por ejemplo, problemas para dormir, calidad de vida comprometida y problemas psicosociales, así como complicaciones relacionadas con la apariencia, incluidas infecciones de la piel que provocan una pérdida de la confianza en uno mismo. El propósito del tratamiento de la dermatitis es disminuir los síntomas, curar la superinfección, evitar las exacerbaciones, disminuir el riesgo del tratamiento y devolver la integridad de la piel. En la mayoría de los pacientes con dermatitis leve, los objetivos del tratamiento se pueden lograr con terapias tópicas, sin embargo, en pacientes con dermatitis moderada a grave, el tratamiento sigue siendo un desafío. En la actualidad, se carece de un método basado en directrices para el tratamiento de la dermatitis y se desconoce la patogenia de la dermatitis. Sin embargo, existe evidencia de que los neuropéptidos como el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) influyen en el desarrollo y el curso de la dermatitis. Asimismo, hay estudios que investigan los neurotransmisores espinales de acuerdo con la picazón en la dermatitis y se informa que una especie de neuropéptidos se libera de los pruriceptores sensibles a la cloroquina dentro de la columna vertebral para arbitrar la picazón independiente de histamina en la dermatitis. Además, en numerosos estudios se informa de una correlación entre la alteración biomecánica de la columna y la dermatitis. Por tanto, el principal objetivo de este trabajo es realizar un estudio prospectivo para determinar la relación entre las alteraciones de la columna y la dermatitis centrándose en el nivel de CGRP en el plasma de los pacientes. Además, en este estudio nos propusimos investigar si la quiropráctica puede ser un tratamiento eficaz para la dermatitis. En este estudio participaron 73 pacientes que padecían dermatitis. 51 de estos pacientes fueron asignados al azar al grupo de tratamiento y 22 pacientes también fueron asignados al azar al grupo de control. A todos los pacientes de los grupos de tratamiento y control se les prescribió una crema compuesta tópica que contenía corticosteroide-indometacina emoliente y antioxidantes. Sin embargo, solo los pacientes del grupo de tratamiento se sometieron a un tratamiento quiropráctico, mientras que los pacientes del grupo de control solo recibieron el tratamiento tópico mencionado anteriormente. Para lograr nuestros objetivos, se analizaron los siguientes datos en pacientes del grupo de tratamiento: (1) Examen dermatológico cuantificado mediante el Índice de Severidad y Área de Eczema (EASI) método de puntuación, (2) Descripción radiográfica y cuantificación del nivel de gravedad de las alteraciones biomecánicas espinales (SBA), en lo sucesivo denominado puntuación de gravedad (espinal). (3) Datos biológicos que incluyen análisis de sangre y medición del nivel de péptido relacionado con el gen de calcitonina en plasma (CGRP) en todos los pacientes y (4) examen y tratamiento espinal quiropráctico (SMT) y en un plan semanal de 3 meses. Todos los datos se compararon y analizaron antes y después del tratamiento en los 73 pacientes del estudio. Los resultados presentados en este estudio serían indicativos de una correlación entre la biomecánica alterada de diferentes segmentos espinales y el estado alterado de la piel. En este estudio encontramos que los niveles de EASI en los pacientes que padecían Dermatitis se correlacionaron significativamente con SBA en el Atlas-Eje (AT-AX) (p

[eng] Metacaspases are a family of cysteine proteases found in lower eukaryotes and plants. They are considered to be distant relatives of caspases, present only in animals. The role of metacaspases is quite diverse, from developmental processes involved in tissue formation, to responses against pathogens and other environmental stresses. For some members of the family there is ongoing research regarding their function and possible substrates and for some others they have not been characterized. In this study we attempted to functionally analyse Arabidopsis thaliana metacaspase 3 (MC3), an uncharacterized metacaspase which was found to be expressed in the vascular tissue. We considered that the best way to address this challenge was to use a reverse genetics approach in combination with proteomic analysis. In Chapter 2, we specifically identified the exact localization of the transcript and the protein in planta, we generated mutant plants using the CRISPR/Cas9 technology and we analysed their growth in basal conditions. Moreover, we performed a whole proteome analysis for different tissues and we attempted to identify candidate substrates by N-termini analysis. In Chapter 3, we delved into multiple stresses testing how plants with over-accumulation or lack of MC3 responded to stress conditions, since multiple proteins related to stress responses came up from the proteomic study. In Chapter 2 we generated reporter lines to specify the exact localization of the gene expression. MC3 was found specifically expressed in the phloem vascular tissue. Furthermore, translational fusion to fluorescent proteins verified the same pattern for protein localization. Using multiple mutant lines, we performed an analysis of the phenotypes caused from the absence, malfunction or overexpression of the putative protease in the development of the plant. Overall growth and formation of the vascular tissue in particular, were not affected when plants were grown upon standard growth conditions. From previous studies, MC1 reporter lines exhibited expression in the stele in almost every developmental stage and MC4 has a high and ubiquitous expression in most of the tissues. Double mutants were generated in order to exclude the possibility of functional redundancy and we showed that under normal conditions the overall growth of these plant remained similar to wild-type plants. Finally, we checked the total proteome of the plants to compare the differentially abundant proteins in different expression backgrounds. Overall, the analysis demonstrated that root tissue of MC3 overexpressor lines showed differential accumulation of stress related proteins, specifically osmotic and hypoxic related. Metacaspases have been shown to participate amongst others, in the plant responses to biotic and abiotic stresses. In Chapter 3 we analyzed whether MC3 had a role in responses to different environmental stresses. We found that MC3 function is associated with drought stress, since plants overaccumulating MC3 were able to survive more and performed better under low water availability conditions. Moreover, compared to wild-type plants, mc3 mutant appeared less sensitive to ABA, which is one of the hormones orchestrating drought responses. Considering that the vasculature plays a very important role in facilitating ABA signalling, we investigated vascular formation upon osmotic stress in plants with altered MC3 levels. Overexpressor lines showed a faster formation of the vascular tissue under osmotic stress conditions than wild type plants. Finally, we observed that in conditions of low oxygen concentrations, the excessive amount of MC3 can also be beneficial for plant survival. Additional stresses were tested in order to detect if MC3 function was specific of osmotic unbalances. Plants were not affected of the presence or absence of MC3 upon light and temperature altered conditions, neither upon infection with a vascular pathogen. In conclusion, we reported that metacaspase 3 is a phloem-specific metacaspase which contributes to drought tolerance possibly due to enhanced metaphloem vascular differentiation upon osmotic stress conditions., [spa] Las metacaspasas son una familia de cisteína proteasas que se encuentran en eucariotas inferiores y plantas. Se consideran parientes lejanos de las caspasas, presentes solo en animales. El rol de las metacaspasas es bastante diverso, desde los procesos de desarrollo involucrados en la formación de tejidos, hasta las respuestas contra patógenos y otras tensiones ambientales. Para algunos miembros de la familia se está investigando su función y posibles sustratos y para otros no se han caracterizado. En este estudio intentamos analizar funcionalmente Arabidopsis thaliana metacaspase 3 (MC3), una metacaspasa no caracterizada presente en el tejido vascular. Consideramos que la mejor manera de abordar este desafío era utilizar un enfoque de genética inversa en combinación con el análisis proteómico. En el Capítulo 2, identificamos específicamente la localización exacta de la transcripción y la proteína en planta, generamos plantas mutantes utilizando la tecnología CRISPR / Cas9 y analizamos su crecimiento en condiciones basales. Además, realizamos un análisis de proteoma completo para diferentes tejidos e intentamos identificar sustratos candidatos mediante análisis de péptidos N- terminales. En el Capítulo 3, profundizamos en múltiples estreses mostrando cómo las plantas con sobreacumulación o falta de MC3 respondieron a las condiciones de estrés, ya que del estudio proteómico surgieron múltiples proteínas relacionadas con las respuestas al estrés. En el Capítulo 2 generamos líneas reporteras para especificar la localización exacta de la expresión génica. Se encontró que MC3 se expresaba específicamente en el tejido vascular del floema. Además, la fusión traslacional a proteínas fluorescentes verificó el mismo patrón para la localización de proteínas. Utilizando múltiples líneas mutantes, realizamos un análisis de los fenotipos causados por la ausencia, mal funcionamiento o sobreexpresión de la supuesta proteasa en el desarrollo de la planta. El crecimiento general y la formación del tejido vascular en particular no se vieron afectados cuando las plantas se cultivaron en condiciones de crecimiento estándar. A partir de estudios anteriores, las líneas reporteras de MC1 mostraron expresión en la estela en casi todas las etapas del desarrollo y MC4 tiene una expresión alta y ubicua en la mayoría de los tejidos. Se generaron mutantes dobles con el fin de excluir la posibilidad de redundancia funcional y mostramos que en condiciones normales el crecimiento general de estas plantas se mantuvo similar al de las plantas de tipo salvaje. Finalmente, comprobamos el proteoma total de las plantas para comparar las proteínas diferencialmente abundantes en diferentes fondos genéticos. En general, el análisis demostró que el tejido de la raíz de las líneas sobreexpresoras de MC3 muestran una acumulación diferencial de proteínas relacionadas con el estrés, específicamente relacionadas con el osmótico y la hipoxia. Se ha demostrado que las metacaspasas participan, entre otras cosas, en las respuestas de las plantas al estrés biótico y abiótico. En el Capítulo 3 analizamos si MC3 tuvo un papel en las respuestas a diferentes tensiones ambientales. Encontramos que la función de MC3 está asociada con el estrés por sequía, ya que las plantas que sobreacumulan MC3 pudieron sobrevivir más y funcionar mejor en condiciones de baja disponibilidad de agua. Además, en comparación con las plantas de tipo salvaje, el mutante mc3 parecía menos sensible a ABA, que es una de las hormonas que orquestan las respuestas a la sequía. Teniendo en cuenta que la vasculatura juega un papel muy importante en la facilitación de la señalización de ABA, investigamos la formación vascular tras el estrés osmótico en plantas con niveles alterados de MC3. Las líneas sobreexpresoras mostraron una formación más rápida del tejido vascular en condiciones de estrés osmótico que las plantas de tipo salvaje. Finalmente, observamos que en condiciones de bajas concentraciones de oxígeno, la cantidad excesiva de MC3 también puede ser beneficiosa para la supervivencia de las plantas. Se probaron tensiones adicionales para detectar si la función de MC3 era específica de los desequilibrios osmóticos. Las plantas no se vieron afectadas por la presencia o ausencia de MC3 por condiciones de luz y temperatura alteradas, ni por infección con un patógeno vascular. En conclusión, reportamos que la metacaspasa 3 es una metacaspasa específica del floema que contribuye a la tolerancia a la sequía posiblemente debido a la diferenciación vascular mejorada del metafloema en condiciones de estrés osmótico.

[eng] Biocatalysis gained importance in the latter half of the 20th century and its application in the pharmaceutical, food and chemical industries continues to expand nowadays. Enzymes catalyze chemical reactions in a highly selective manner, achieving high molecular complexity without the need of protection and deprotection steps and usually under mild reaction conditions. Particularly important classes of enzymes are aldolases, which catalyze stereoselectively carbon-carbon bond formation between a nucleophilic donor and an electrophilic acceptor. The aldol adducts are usually typified as β- hydroxycarbonyl compounds, a structural element that is frequently found in the framework of complex molecules. For this reason, advances in this field are focused on finding new aldolases with unprecedented activities and engineering those available for improved substrate tolerance and stereoselectivity. In this thesis, we exploited the potential capacities of two Class II aldolases that utilize 2-oxoacids and aldehydes as substrates, to furnish different chiral molecules that are used as building blocks in organic chemistry. These are YfaU (2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase, EC 4.1.2.53), which was used as a robust biocatalyst in previous investigations in our group, and KPHMT (ketopantoate hydroxymethyltransferase, EC 2.1.2.11), which was employed with synthetic applications for the first time in this present work. In chapter 3.1 MBP-YfaU and KPHMT were applied to the synthesis of 2- substituted 3-hydroxycarboxylate esters (i.e., Roche ester, 3-hydroxy-2- methylpropanoate), which are an important class of chiral building blocks widely used in organic synthesis. To do this, KPHMT from E. coli was cloned, expressed, and characterized (e.g., metal cofactor, nucleophile substrates, tolerance to formaldehyde). Then, a panel of different 2-oxoacids was synthetized, and based on molecular models, four variants of KPHMT were constructed to increase the substrate scope of this catalyst. Finally, the aldol addition of different 2-oxoacids to formaldehyde catalyzed by KPHMT and MBP-YfaU wild-type and variants was deeply studied and it was determined that they generated stereocomplementary aldol adducts. Oxidative decarboxylation and esterification of the aldol adducts led to the formation of Roche ester derivatives with high isolated yields and excellent enantiomeric excesses. In chapter 3.2 KPHMT was used in the synthesis of compounds bearing quaternary carbon centers. To this end, 3,3-disubstituted 2-oxoacid nucleophiles and a panel of selected aldehydes were used as substrates. Based on molecular models, residue V214 was targeted for site directed mutagenesis and five new variants that were useful for the synthesis of these congested compounds were produced. Different methodologies on the aldol adducts rendered 2-oxolactones (including a bicyclic lactone), 3-hydroxyacid derivatives and ulosonic acid type products, all of them bearing gem-dialkyl, gem-cycloalkyl and spirocyciclic quaternary centers. In chapter 3.3 preliminary studies for the application of KPHMT and MBP- YfaU to the synthesis of nucleoside analogues were performed. As substrates we selected 2-oxoacids and D-glyceraldehyde derivatives, including O- protected D-glyceraldehde and α,α-disubstituted-α-hydroxy aldehydes. The subsequent oxidative decarboxylation of the aldol adducts rendered diverse lactones and carboxylic acids. These products with different substituents at C2 and at C4 can be used as precursors for the synthesis of nucleoside analogues., [cat] La biocatàlisi va guanyar importància durant la segona part del segle XX i la seva aplicació en les indústries farmacèutica, química i alimentària es continua expandint avui dia. Els enzims catalitzen reaccions químiques de manera selectiva, produint molècules d’alta complexitat, usualment en condicions suaus de reacció. Les aldolases són un tipus d’enzims que catalitzen de manera estereoselectiva la formació d’enllaços carboni-carboni entre un donador (nucleòfil) i un acceptor (electròfil). Els adductes aldòlics són classificats com a compostos β-hidroxicarbonílics, elements estructurals que formen part de molècules complexes. Els progressos en aquest camp es focalitzen en trobar noves aldolases amb activitats no descrites, o en modificar les ja conegudes per tal d’incrementar la tolerància per diferents substrats o per millorar l’estereoquímica dels productes obtinguts. En aquesta tesi, ens vam centrar en investigar les capacitats de dues aldolases de Classe II, que usen 2-oxoacids i aldehids com a substrats, per sintetitzar diferents molècules quirals que són usades com a elements fonamentals en química orgànica. Aquestes són la YfaU (2-keto-3-deoxy- L-rhamnonate aldolase, EC 4.1.2.53), que va ser usada com a biocatalitzador en investigacions prèvies en el nostre grup d’investigació, i la KPHTM (ketopantoate hydroxymethyltransferase, EC 2.1.2.11), que ha estat usada amb aplicacions sintètiques per primer cop en aquest treball. En el capítol 3.1, la MBP-YfaU i la KPHMT van ser aplicades per la síntesi d’esters carboxílics substituits al C2 i amb un grup hidroxil al C3 (un exemple és l’ester de Roche, 3-hidroxi-2- metilpropanoat). Per fer-ho, la KPHMT d’E. coli va ser clonada, expressada i caracteritzada. També es van sintetitzar diferents 2-oxoacids i es van dissenyar quatre variants de la KPHMT per tal d’incrementar la varietat de substrats acceptats per aquest catalitzador. Finalment, es va estudiar la addició aldòlica dels diferents 2-oxoacids al formaldehid catalitzada per la KPHMT o per la MBP-YfaU i es va determinar que les dues aldolases son estereocomplementaries. La descarboxilació i l’esterificació dels adductes aldòlics van permetre generar derivats d’esters de Roche amb bons rendiments i bons excessos enantiomèrics. En el capítol 3.2 la KPHMT va ser usada en la síntesi de compostos que contenen un carboni quaternari. Per fer-ho, es van sintetitzar diferents 2-oxoacids disubstituits en el C3 i un panell d’aldehids que van ser usats com a substrats. A més, oel residu V214 de l’enzim va ser seleccionat per ser mutat i es van construir cinc noves variants que van ser útils per la síntesi d’aquests compostos. Les diferents metodologies aplicades sobre els adductes aldòlics van generar 2- oxolactones, derivats de 3-hidroxiacids, i productes semblants a l’àcid ulosonic, tots ells amb centres quaternaris del tipus gem-dialquil, gem-cycloalquil i espirocíclics. En el capítol 3.3 es van fer estudis preliminars per l’aplicació de la KPHMT i la MBP-YfaU per la síntesi d’anàlegs de nucleòsids. Com a substrats es van usar els 2-oxoacids disponibles de capítols anteriors i es van sintetitzar derivats del D-gliceraldehid (incloent D-gliceraldehid O- protegit i aldehids α-hidroxi-α,α-disubstituïts). La descarboxilació dels adductes aldòlics van generar diferents lactones i àcids carboxílics amb diferents substituents als carbonis 2 i 4, que poden ser usats com a precursors per la síntesi d’anàlegs de nucleòsids.

[eng] The health promoting attributes associated with following a traditional Mediterranean diet have been reviewed extensively. The principal source of dietary fat in the Mediterranean diet is Extra virgin olive oil (EVOO) that contribute significantly to the superior health profile observed in Mediterranean populations. Between its minors compounds, EVOO contains at least 30 phenolic compounds (PCs) and has been classified according to their chemical structure into the following main classes: phenolic acids, lignans, flavonoids, phenolic alcohols, secoiridoids (SEC). Regarding this last group, these compounds are responsible for the sensory features of EVOO, mainly the bitter and pungent mouthfeel. Oleocanthal (OLC) and oleacein (OLEA) appear the main compounds responsible for the mouthfeel perceptions, respectively. Moreover, they are the most studied and best-known components in terms of health protecting activities. In this sense, the potential protective role exerted by SECs from EVOO in cancer, cardiovascular, neurodegenerative, aging‐related, and immunoinflammatory diseases has been studied. The data obtained so far has clearly shown that SECs has proven biological activity, including antioxidant and antimicrobial properties, anti-inflammatory effects, anticancer properties and neuro- protective effects, among others. The phenolic concentration and composition of EVOO together with the degree to which these components are absorbed and metabolized are essential in determining the health effects associated with such compounds. Several factors have been shown to affect the concentration of PCs in EVOO and these include olive fruit cultivar and variety, region of growth, agricultural cultivation techniques, maturity at harvest, processing, and storage. In this thesis the study of the main factors affecting the PCs concentration is covered. Regarding its bioavailability after EVOO dietary intake has been a topic of increasing research in recent years. Bioavailability is a complex process involving several different stages that include liberation, absorption, distribution, metabolism and elimination phases. For polyphenols, this principally involves the following digestive processes: i) release of polyphenols from the food matrix; ii) changes in PCs during gastric/small-intestinal digestion; iii) cellular uptake of aglycons and some conjugated polyphenols by enterocytes; iv) microbiological fermentation of nonabsorbed polyphenols or those re-excreted via bile or the pancreas to yield additional metabolites, v) phase I/II enzyme modifications that occur upon uptake in the small intestine and/or colon; vi) transport in the bloodstream and subsequent tissue redistribution; and vii) excretion via the kidney or re-excretion into the gut via bile and pancreatic juices. Since many in vitro, in situ, in vivo and clinical studies, have demonstrated the protective effect of SECs, in this thesis we set out to evaluate the intestinal absorption and metabolism of OLC and OLEA for a better understanding of the biological effects attributed to these compounds. In addition, a tissue distribution of OLC and OLEA and its metabolites also was study after the oral administration of enriched refined olive oil. Target tissues likes as brain, hearth, lungs, among other were evaluated to determine the biological concentrations usually achieved when following a Mediterranean diet.

[eng] Non-canonical activation of p38α MAPK has been associated to cardiomyocyte death in several cardiovascular pathologies, such as myocardial ischaemia-reper- fusion injury. Unfortunately, current p38α inhibitors are mainly ATP-competitors, which have not progressed in clinical trials. Efforts to discover novel allosteric p38α inhibitors are crucial to overcome potential side effects that undermine their therapeutic efficacy. By running an in silico small molecule drug discovery program to target the non-canonical site on p38α, we have identified several compounds, named NC-p38i, which inhibit both TAB1-induced and spontaneous p38α autophosphorylation in vitro. Additionally, NC-p38i do not inhibit canonical MAP2K-dependent p38α activation but slightly impair its ability to phosphorylate substrates. A combination of biophysical and structural studies has allowed us to characterize their mechanism of action. NC-p38i do not interfere with the binding of TAB1 to p38α in vitro but modulate the ATP-binding site and the prone-to-au- tophosphorylate conformation of the kinase. Nuclear magnetic resonance and X-ray crystallography data suggest that NC-p38i probably bind to several sites on p38α, including the active site and the N-terminal domain, which may induce structural rearrangements that reduce its autoactivation capacity. Cell based assays show that NC-p38i decrease ischaemia-reperfusion-induced cardio- myocyte death both under prophylactic and therapeutic conditions. Moreover, these compounds ameliorate doxorubicin-induced cardiac toxicity in human iPSC-derived cardiomyocytes and zebrafish models. Importantly, NC-p38i are quite specific at inhibiting p38α but not a number of other protein kinases, and possess good drug-like properties, including weak cardiac hERG K+ channel inhibition and low cytotoxic effects. Together, our data identify NC-p38i as novel allosteric p38α inhibitors with promising cardioprotective effects, which may serve as a good starting point to develop clinical candidates for treating non-canonical p38α signalling associated diseases., [spa] La activación no canónica de p38α MAPK se ha asociado con la muerte de los cardiomiocitos en varias patologías cardiovasculares, como el daño miocárdico producido por isquemia-reperfusión. Desafortunadamente, los inhibidores de p38α actuales son principalmente competidores de ATP, y no han progresado en los ensayos clínicos. Por tanto, resulta crucial descubrir nuevos inhibidores alostéricos de p38α para evitar los potenciales efectos secundarios que reducen su eficacia terapéutica. En este trabajo, hemos desarrollado un programa in silico de descubrimiento de fármacos para diseñar compuestos que se puedan unir al sitio no canónico en p38α. Hemos identificado varias moléculas, denominadas NC-p38i, que inhiben la autofosforilación de p38α tanto inducida por TAB1 como espontánea in vitro. Además, los NC-p38i no inhiben la activación canónica de p38α dependiente de MAP2K, aunque afectan ligeramente la capacidad de p38α para fosforilar sustratos. La combinación de estudios biofísicos y estruc- turales nos ha permitido caracterizar su mecanismo de acción. Los NC-p38i no interfieren con la unión de TAB1 a p38α in vitro, pero alteran el sitio de unión del ATP y la conformación propensa a la autofosforilación de la quinasa. Los datos de resonancia magnética nuclear y de cristalografía de rayos X sugieren que los NC-p38i podrían unirse a varios sitios en p38α, incluido el sitio activo y el dominio N-terminal, lo que puede inducir alteraciones estructurales que reducen su capacidad de autoactivación. Ensayos celulares muestran que los NC-p38i reducen la muerte de los cardiomiocitos inducida por isquemia-reperfusión tanto en condiciones preventivas como terapéuticas. Además, estas moléculas mejoran la toxicidad cardiaca inducida por doxorrubicina tanto en cardio- miocitos humanos derivados de iPSCs como en pez cebra. Cabe destacar que los NC-p38i inhiben principalmente a p38α pero no a otras proteína-quinasas, y que poseen buenas propiedades farmacológicas, incluyendo una inhibición débil del canal hERG K+ cardiaco y una citotoxicidad reducida. En conjunto, nuestros datos caracterizan a los NC-p38i como nuevos inhibidores alostéricos de p38α con efectos cardioprotectores prometedores, y que pueden servir como punto de partida para desarrollar candidatos clínicos utilizables en el tratamiento de enfermedades asociadas a la señalización no canónica de p38α.

[spa] Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) se encuentran compuestos por una subunidad pesada que dirige el tráfico del transportador a la membrana plasmática y la subunidad ligera que posee la actividad catalítica. Cada uno de sus miembros ha evolucionado para reconocer y transportar una serie de aminoácidos específicos, lo cual les confiere un papel fisiológico cuya alteración se ha visto relacionada con diferentes patologías humanas; cáncer, aminoacidurias, sordera asociada a la edad o autismo. De la aplicación de inhibidores que reconozcan estos transportadores de manera específica y de la comprensión de cómo una mutación afecta a su actividad radica la importancia de caracterizar estructural y funcionalmente estos transportadores. Hasta hace muy pocos años la información estructural publicada de los HATs se reducía a modelos atómicos construidos a partir de homólogos bacterianos lejanos y una estructura de h4F2hc/LAT2 resuelta a 21 Å. No obstante, en los 2 últimos años, se han resuelto varias estructuras de un LAT bacteriano y de hasta tres HATs diferentes, incluyendo uno en varias conformaciones, en presencia y ausencia de sustrato. Durante esta tesis se ha realizado un cribado de varios HATs, con el objetivo de encontrar aquel que mejor balance presentara entre un alto nivel de expresión y purificación, y una homogeneidad y estabilidad suficientes para realizar un estudio estructural en crio-microscopía electrónica. Tal estudio resultó en la resolución de la estructura de 4F2hc/LAT2 humano a una resolución de 3,7 Å con el núcleo transmembranal de LAT2 resuelto en un rango entre 2,5 y 3 Å. El análisis de la estructura de 4F2hc/LAT2, junto con una aproximación multidisciplinar, ha permitido establecer las bases del diferente perfil de selectividad mostrado por los transportadores HAT de aminoácidos neutros (LAT2, LAT1 y Asc1). De este modo, la información estructural existente (LAT1 y LAT2 humanos) junto con los estudios funcionales llevados a cabo para LAT2 y Asc1 humanos y los análisis de simulación con sustratos realizados en LAT2 humano permitieron identificar los residuos clave para la diferente selectividad de sustrato dentro de los transportadores HAT de aminoácidos neutros. Por otro lado, el análisis estructural de las mutaciones identificadas en LAT2 asociadas a sordera temprana y cataratas en pacientes determinaron que la región entre el dominio transmembrana 2 (TM2) y el bucle intercelular 1 (IL1) resultaría clave en la configuración del sitio de unión al sustrato. De esta manera, proponemos que las conexiones de regiones cercanas al sitio de unión con el TM2 y el IL1 resultarían clave en la conformación espacial de los residuos clave para el reconocimiento de sustrato y que han sido identificados en el transcurso de esta tesis. Así, pequeños cambios en las interacciones entre estas regiones que se observan en el análisis de secuencia de los diferentes HATs podrían explicar, al menos en parte, el perfil de selectividad de sustrato observados para los diferentes subgrupos de transportadores HAT. Nuestros resultados abren la puerta para identificar los mecanismos moleculares de selectividad de sustratos de los transportadores HAT tanto en el lugar de unión al sustrato como en una región que determina la conformación de este lugar de unión.

[eng] Lipids are essential components in most living organisms whose functionality varies with their chemical structure. In an aqueous environment, diluted dispersions of phospholipids tend to form vesicles and other bilayered structures widely employed in the pharmaceutical field. These nanostructures present excellent biocompatibility and work as drug delivery systems for poorly soluble drugs. Despite the remarkable properties of phospholipid nanostructures, those are mainly used in the liquid state; soft materials (with solid- like properties) tend to be made of other molecules, like polymers, able to form gels. The formation of phospholipid systems with a gel- like behaviour typically requires stabilising agents and increasing the phospholipids concentration above 40%. In these conditions, lipids can form cream-like dispersions of vesicles by mechanical procedures, or lyotropic phases by self-assembly. It has been reported that polymeric or clay colloidal systems can form diluted gels by using strategies to control particle aggregation into structured networks. Although diluted suspensions of lipid vesicles behave like a colloidal system, structured networks of vesicles leading to a gel have barely been described. This thesis aimed to develop an aqueous colloidal gel using a low concentration of lipids (mainly phospholipids) without requiring gelling agents. We started studying aqueous lipid systems composed of phospholipids (hydrogenated soy phosphatidylcholines) and oleic acid at different pH and molar ratios. These mixtures, ranging from 0.2% to 6% lipid concentration, resulted in suspensions of vesicles with a fluid behaviour. Results showed how particle size and membrane phase transition temperature decreased at high pH due to the ionisation of oleic acid. Further assays revealed that dispersions of phospholipids and fatty acids with a specific pH (5.5 – 7.5) could form structured gels. Gelation was achieved employing a temperature-induced procedure: After the hydration of the lipids, the resulting dispersion of vesicles was frozen at -20 ºC, heated above the main phase transition temperature, and cooled back to room temperature, where gelation was completed. These results were the first report of a colloidal gel formed exclusively by lipid membranes and vesicles in a high-water content (95%). The unique properties of such colloidal phospholipid/fatty acid gels granted this new type of system with the requirements of novelty and inventive step to be patented. Confocal microscopy illustrated that the microstructure of the gel was made of big vesicle aggregates connecting across the aqueous phase in a sponge-like matrix. The gel formation was attributed to the effect of charge in the lipid membranes. Rheological assays revealed that a lack of repulsion facilitated the rupture of the microstructure under deformation. In contrast, a high interparticle repulsion resulted in small, interconnected aggregates that deformed easier without yielding. This data led to a second patent, providing the details to form a broader range of gels stable in diverse conditions. Besides, we included preliminary experiments that tested the applicability of the gels for gastric application and as a topical system for permeation and wound healing. Finally, we assessed the distinct phases of the gelation mechanism through transmission electron microscopy, differential scanning calorimetry, and synchrotron X-ray scattering. These studies revealed a synergetic effect between freezing and heating that allows vesicles to fuse into tubular structures. The eventual cooling of the sample results in branched vesicle aggregates, finishing the formation of the gel. With this thesis, we have contributed to the development and study of a novel colloidal gel formed exclusively by lipids. The high water content and the phospholipid composition provide the gel with excellent biocompatibility. The ability to be formed with different lipids makes these gels a platform to design products with diverse pharmaceutical and biomedical applications. Future works should address a significant focus on their practical application., [cat] Els lípids són components essencials en la majoria d’organismes, i la funcionalitat varia segons la seva estructura química. Les dispersions aquoses de fosfolípids tendeixen a formar vesícules i altres estructures de bicapa que han estat àmpliament emprades en el camp farmacèutic. Aquestes nanoestructures presenten una excel·lent biocompatibilitat i funcionen com a sistemes d’administració de fàrmacs per a molècules poc solubles. Malgrat les excel·lents propietats d’aquestes nanoestructures lipídiques, el seu ús està principalment limitat en l’estat líquid. En canvi, els materials de tipus gel solen estar formats per altres molècules, com els polímers. La formació de sistemes lipídics amb un comportament tipus gel acostuma a requerir l’ús d’agents estabilitzants i incrementar la concentració per sobre el 40%. En aquestes condicions, els lípids poden formar dispersions viscoses de vesícules mitjançant processos mecànics o organitzar-se en fases cristall líquid. Aquesta tesi ha tingut com a objectiu desenvolupar un gel col·loidal emprant una baixa concentració de lípids (principalment fosfolípids) sense requerir agents gelificants. Duran els inicis d’aquesta tesi vam estudiar sistemes lipídics aquosos compostos de fosfolípids (fosfatidilcolines de soja hidrogenades) i àcid oleic a diferents relacions molars i de pH. Aquestes mescles, que van ser del 0,2% al 6% de concentració de lípids, van donar lloc a suspensions de vesícules amb un comportament fluid. Els resultats van mostrar com la mida de les partícules i la temperatura de transició de fase de membrana disminuïen a pH elevat a causa de la ionització de l'àcid oleic. Assajos posteriors van revelar que les dispersions de fosfolípids i àcids grassos amb un pH específic (entre 5,5 i 7,5) poden formar gels estructurats. La gelificació es va aconseguir mitjançant un procediment basat en canvis de temperatura: un cop hidratats els lípids, la dispersió resultant de vesícules es va congelar a -20 ºC, després es va escalfar per sobre de la temperatura de transició de fase i es va refredar fins a temperatura ambient, on es va completar la gelificació. Aquests, van ser els primers resultats d’un gel col·loidal format exclusivament per membranes lipídiques i vesícules amb un contingut elevat d’aigua (95%). Les propietats úniques d’aquests gels de fosfolípids i àcids grassos van atorgar a aquest nou tipus de sistema els requisits de novetat i activitat inventiva per poder ser patentats. Els resultats de microscòpia confocal van il·lustrar que la microestructura del gel estava formada per grans agregats de vesícules que connectaven entre ells a través de la fase aquosa. La formació del gel es va atribuir a l’efecte de la càrrega a les membranes lipídiques. Els assaigs reològics van revelar que la manca de repulsió facilitava la ruptura de la microestructura. En canvi, una alta repulsió entre partícules resultava en agregats petits i interconnectats que es deformaven més fàcilment sense ruptura. Aquestes dades van permetre una segona patent, que proporciona informació sobre una gamma més àmplia de gels estables en diverses condicions. A més, inclou experiments preliminars que van demostrar l’aplicabilitat dels gels a la pell com a agents per facilitar la permeabilitat o la cicatrització de ferides, i també per l’aplicació gàstrica. Finalment, vam avaluar les diferents fases del mecanisme de gelificació mitjançant microscòpia electrònica, calorimetria i dispersió de raigs X. Aquests estudis van revelar un efecte sinèrgic entre la congelació i el refredament que permeten la fusió de vesícules en estructures tubulars. L’eventual refredament de la mostra resulta en agregats de vesícules ramificades i la formació del gel. Aquesta tesi ha contribuït al desenvolupament i estudi d’un nou gel col·loidal format exclusivament per lípids. L’alt contingut d’aigua i la composició de fosfolípids proporcionen al gel una excel·lent biocompatibilitat. La capacitat de formar-se amb diferents lípids fan d’aquests gels una plataforma per dissenyar productes amb diverses aplicacions farmacèutiques i biomèdiques. Futurs projectes centrats en el seu ús pràctic podrien ser rellevants per trobar noves aplicacions.

Els materials porosos polimèrics, també denominats escumes sòlides, són materials sòlids de baixa densitat i elevat volum de porus. Són ben coneguts per la seva varietat d’aplicacions i constitueixen una part integral de diverses formes de dosificació. La xarxa porosa és important per determinar fenòmens relacionats amb l’administració de medicaments, tals com la dissolució, adsorció i difusió de fàrmacs. S’ha descrit l’ús de materials mesoporosos per incorporar i posteriorment alliberar diverses molècules d’interès farmacèutic i s’ha demostrat que molècules de diferents mides poden quedar atrapades als porus mitjançant un procés d’impregnació i alliberades a través d’un mecanisme controlat per difusió. En aquest context, els materials porosos tenen característiques molt interessants com són superfícies elevades, mida de porus ajustable amb una baixa polidispersitat i propietats superficials ben definides, permetent així l’adsorció i alliberament de certs tipus de fàrmacs d’una manera més reproduïble i predictible. La majoria de mètodes per fabricar materials porosos donen lloc a estructures poroses jeràrquiques, però són processos laboriosos amb diverses etapes i, per aplicacions industrials es requereixen mètodes més simples. Com a alternativa als mètodes convencionals es poden obtenir materials porosos mitjançant sistemes col·loidals, generant un sistema bifàsic i polimeritzant posteriorment la fase externa. Les entitats col·loidals serveixen per a formar la porositat en el material final i després són eliminades del sistema. Depenent de la naturalesa del sistema col·loidal (emulsions, microemulsions, etc.), la grandària dels porus generats pot ser des de nanòmetres fins a centenars de micres. En aquesta tesi doctoral s’han seleccionat quatre polímers biocompatibles per desenvolupar materials nanoestructurats a partir d’emulsions altament concentrades: poliestirè-divinilbenzè (PS-DVB), poliacrilamida (PAM), quitosan (QS) i àcid hialurònic (HA). Els materials de poliestirè-divinilbenzè i els de poliacrilamida s’han obtingut mitjançant una reacció de polimerització de l’estirè amb divinilbenzè en el primer cas i d’acrilamida i bisacrilamida en el segon cas, fent servir com a plantilla (template) l’estructura de les emulsions altament concentrades. Per a l’obtenció de materials de poliestirè-divinilbenzè s’han emprat emulsions altament concentrades W/O i pels materials de poliacrilamida, emulsions O/W, degut a les diferents solubilitats de l’estirè i l’acrilamida en els components de les emulsions i per afavorir les reaccions de polimerització a la fase externa. Els altres polímers s’han incorporat directament preformats a les emulsions O/W i s’han utilitzat agents reticulants (cross-linkers) per mantenir l’estructura. El reticulant emprat pel quitosan ha estat la genipina i per a l’àcid hialurònic, el butandiol diglicidil éter (BDDE). La caracterització d’aquests nous materials i l’estudi de la incorporació de fàrmacs i la cinètica d’alliberament és fonamental pel desenvolupament de formes farmacèutiques segures i eficaces. És per això que s’ha desenvolupat un sistema de control senzill basat en l’equip de dissolució que ens ha permès comparar les característiques del diferents materials sense haver de recórrer a tècniques complexes que suposarien un cost excessiu per a la fabricació industrial d’aquests nous materials per a ús farmacèutic. S’han preparat materials porosos de poliestirè-divinilbenzè (PS-DVB), partint d’emulsions altament concentrades W/O preparades pel mètode PIT o pel mètode de les addicions successives. Les diferents característiques de les emulsions i dels materials obtinguts han permès comprovar que les emulsions efectivament han servit de plantilla per a l’estructura porosa dels materials, obtenint-se porus més petits i homogenis quan les emulsions es preparen pel mètode PIT. És possible augmentar la hidrofília de la superfície d’aquests materials hidrofòbics amb un tractament amb plasma atmosfèric a baixa temperatura. Les escumes sòlides que s’han format per polimerització de monòmers a la fase continua de l’emulsió altament concentrada, materials de PS-DVB i PAM, tenen una estructura més compacta i els porus són més ordenats i interconnectats. Quan es produeix la polimerització en un sistema col·loidal compartimentat, la reacció té lloc d’una manera més ordenada i les estructures que es formen tenen un grau d’ordenació més elevat. Els materials obtinguts conserven l’estructura de l’emulsió, són majoritàriament macroporosos, amb més d’un 90% de porositat, i tenen una baixa densitat. Els resultats de porosimetria han evidenciat la possibilitat de modificar les característiques dels materials porosos, mida de por i superfície específica, mitjançant canvis en la mida de gota de l’emulsió de partida, per canvis en la composició o en el mètode de preparació. Els resultats obtinguts en l’estudi dels mètodes d’incorporació de principis actius als monòlits han permès comprovar que es pot realitzar una impregnació eficient, uniforme i en profunditat dels monòlits hidròfobs de PS-DVB i QS pel mètode d’immersió en una solució hidroalcohòlica d’aigua/etanol (1:1, p/p). El mètode de degoteig es va reservar pels materials d’HA degut a la seva fragilitat. També s’ha comprovat que les solucions més concentrades en principi actiu permetien la incorporació de quantitats més elevades de fàrmac. La posada a punt d’una metodologia per a la presa de mostres de manera automàtica amb l’equip de dissolució ha permès establir les condicions per a un mostreig fiable i reproduïble, per realitzar els assaigs d’alliberament de fàrmacs des dels materials polimèrics. L’automatització de l’equip ha permès assajar vàries mostres simultàniament i obtenir resultats més fiables. Els dispositius basats amb bossa de diàlisi, cel·la d’immersió i cistell perforat (mètode 1 de la Real Farmacopea Española) són adequats per avaluar la cessió de principis actius des de materials porosos polimèrics fins una solució receptora; no obstant, aquest darrer mètode te l’avantatge de que l’alliberament es realitza directament a la solució receptora sense interferència de cap membrana i és el més adient per comparar diferents materials o diferents principis actius. Les escumes sòlides hidròfobes de PS-DVB produeixen un alliberament retardat de fàrmacs lipòfils com el ketoprofèn (KP) i afecten en menor grau a la cessió de fàrmacs hidròfils com el clorhidrat de clindamicina i el sulfat de salbutamol, que queden menys retinguts pel material porós. El retard en l’alliberament de KP des dels materials hidròfobs és molt significatiu en comparació amb formes sòlides orals comercialitzades d’aquest mateix principi actiu. La retenció dels fàrmacs pels materials porosos estudiats està influenciada per l’estructura de l’emulsió que ha fet de plantilla perquè condiciona la morfologia de l’estructura porosa, per la composició dels materials porosos i la seva afinitat pels principis actius incorporats i per la rigidesa o fragilitat dels materials, que condiciona els mètodes per a la seva impregnació. Considerar aquestes característiques permetrà modular les propietats de les escumes sòlides per adaptar-les als perfils de cessió més adequats per cada principi actiu.

Tesis doctoral.--Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació., Pathologies that result in highly modulated intensities in macromolecular crystal structures pose a challenge for structure solution. To address this issue two studies have been performed: a theoretical study of one of these pathologies, translational non- crystallographic symmetry (tNCS), and a practical study of paradigms of highly modulated macromolecular structures, coiled-coils. tNCS is a structural situation in which multiple, independent copies of a molecular assembly are found in similar orientations in the crystallographic asymmetric unit. Structure solution is problematic because the intensity modulations caused by tNCS cause the intensity distribution to differ from a Wilson distribution. If the tNCS is properly detected and characterized, expected intensity factors for each reflection that model the modulations observed in the data can be refined against a likelihood function to account for the statistical effects of tNCS. In this study, a curated database of 80482 protein structures from the PDB was analysed to investigate how tNCS manifests in the Patterson function. These studies informed the algorithm for detection of tNCS, which includes a method for detecting the tNCS order in any commensurate modulation. In the context of automated structure solution pipelines, the algorithm generates a ranked list of possible tNCS associations in the asymmetric unit, which can be explored to efficiently maximize the probability of structure solution. Coiled-coils are ubiquitous protein folding motifs present in a wide range of proteins that consist of two or more α-helices wrapped around each other to form a supercoil. Despite the apparent simplicity of their architecture, solution by molecular replacement is challenging due to the helical irregularities found in these domains, tendency to form fibers, large dimensions in their typically anisometric asymmetric units, low-resolution and anisotropic diffraction. In addition, the internal symmetry of the helices and their alignment in preferential directions gives rise to systematic overlap of Patterson vectors, a Patterson map that indicates tNCS is present, and intensity modulations similar to those in true tNCS. In this study, we have explored fragment phasing on a pool of 150 coiled-coils with ARCIMBOLDO_LITE, an ab initio phasing approach that combines fragment location with Phaser and density modification and autotracing with SHELXE. The results have been used to identify limits and bottlenecks in coiled-coil phasing that have been addressed in a specific mode for solving coiled-coils, allowing the solution of 95% of the test set and four previously unknown structures, and extending the resolution limit from 2.5 Å to 3.0 Å., This work was supported by grants BIO2015-64216-P and BES-2016-076329 from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness