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Background: Loss of cardiac myocytes due to apoptosis is a relevant feature of ischemic heart disease. It has been described in infarct and peri-infarct regions of the myocardium in coronary syndromes and in ischemia-linked heart remodeling. Previous studies have provided protection against ischemia-induced cardiomyocyte apoptosis by the anti-inflammatory cytokine interleukin-1 receptor-antagonist (IL-1Ra). Mitochondria triggering of caspases plays a central role in ischemia-induced apoptosis. We examined the production of IL-1Ra in the ischemic heart and, based on dual intra/extracellular function of some other interleukins, we hypothesized that IL-1Ra may also directly inhibit mitochondria-activated caspases and cardiomyocyte apoptosis.\ud \ud Methodology/Principal Findings: Synthesis of IL-1Ra was evidenced in the hearts explanted from patients with ischemic heart disease. In the mouse ischemic heart and in a mouse cardiomyocyte cell line exposed to long-lasting hypoxia, IL-1Ra bound and inhibited mitochondria-activated caspases, whereas inhibition of caspase activation was not observed in the heart of mice lacking IL-1Ra (Il-1ra−/−) or in siRNA to IL-1Ra-interfered cells. An impressive 6-fold increase of hypoxia-induced apoptosis was observed in cells lacking IL-1Ra. IL-1Ra down-regulated cells were not protected against caspase activation and apoptosis by knocking down of the IL-1 receptor, confirming the intracellular, receptor-independent, anti-apoptotic function of IL-1Ra. Notably, the inhibitory effect of IL-1Ra was not influenced by enduring ischemic conditions in which previously described physiologic inhibitors of apoptosis are neutralized.\ud \ud Conclusions/Significance: These observations point to intracellular IL-1Ra as a critical mechanism of the cell self-protection against ischemia-induced apoptosis and suggest that this cytokine plays an important role in the remodeling of heart by promoting survival of cardiomyocytes in the ischemic regions.

2008/2009 Effetto Anti-Apoptotico Dell’ IL-1Ra Nel Miocardio Ischemico La morte cellulare dei cardiomiociti dovuta ad apoptosi rappresenta una caratteristica rilevante delle patologie del miocardio ischemico. Studi recenti hanno dimostrato che la citochina anti-infiammatoria IL-1Ra (Antagonista Recettoriale dell’Interleuchina -1) protegga i cardiomiciti dall’apoptosi indotta da ischemia. Per il gene dell’antagonista recettoriale fisiologico dell’IL-1 sono state descritte in letteratura quattro isoforme, generate da splicing alternativi: delle quali una secreta e tre con localizzazione citoplasmatica. In questo lavoro è stato analizzata la sintesi di sIL-1Ra e icIL-1Ra nei miocardiociti ischemici e investigato se l’ IL-1Ra potesse influenzare l’apoptosi indotta da ischemia mediante un meccanismo addizionale rispetto alla sua funzione anti-IL-1 a livello recettoriale. E’stato visto che i cardiomiociti producono attivamente sIL-1Ra and icIL-1Ra sia in espianti cardiaci di pazienti con patologie cardiache ischemiche che in una linea cellulare di miocardiociti murini sottoposta a condizioni di ipossia. E stato trovato che la icIL-1Ra lega ed inibisce la caspasi-9 attivata, mentre non è stata osservata questa inibizione nei cuori di topi KO per IL-1Ra (IL-1Ra-/-) o in cellule silenziate per IL-1Ra. E’ stato inoltre osservato un aumento di apoptosi in cellule silenziate per IL-1Ra. Infatti queste cellule non erano protette dall’attivazione delle caspasi e dall’apoptosi mentre lo knocking down del Recettore dell’IL-1 ha confermato la funzione anti-apoptotica, intracellulare e recettore-indipendente dell’IL-1Ra. Queste osservazioni pongono la icIL-1Ra come un importante meccanismo di protezione cellulare contro l’apoptosi indotta da ischemia e suggeriscono che questa citochina intracellulare giochi un importante ruolo nel remodeling cardiaco promuovendo la sopravvivenza dei cardiomiociti nelle regioni ischemiche. Ruolo Dell’Endotelio Linfatico Nella Ricircolazione Leucocitaria La presente ricerca ha come obiettivo quello di mettere in evidenza il ruolo dell'endotelio dei vasi linfatici nella cosiddetta ricircolazione dei leucociti e nell’entrata nel circolo linfatico di cellule tumorali maligne in fase di metastatizzazione. Più precisamente il nostro obiettivo è quello di identificare quali chemochine prodotte dalle cellule endoteliali linfatiche siano implicate nella migrazione cellulare. Dopo aver confermato l’espressione di alcune chemochine da parte dell’endotelio linfatico, in particolare della C10, si è individuata la possibilità di costruire grazie ad una tecnica di silenziamento genico, l’RNAi, modelli sperimentali in cui le cellule con attività chemiotattica nei confronti delle cellule endoteliali linfatiche siano deficitarie dei recettori per la chemochina C10. Si è osservato che nelle cellule trattate diminuisce l’espressione dei recettori, confermando l’efficacia della tecnica di silenziamento genico utilizzata. Si è anche valutata la capacità delle cellule trattate di migrare verso un gradiente chemiotattico prodotto dalle cellule endoteliali linfatiche, constatando che le cellule trattate, dunque deficitarie del recettore, mostrano una minore capacità migratoria nei confronti del terreno condizionato dalle cellule endoteliali linfatiche. Si è anche constatato che, in vivo, le cellule deficitarie per i recettori della C10 hanno minore capacità di infiltrare il tessuto linfatico. Questi risultati convalidano la tesi che la chemochina C10 sia implicata nel processo di migrazione. Gli esperimenti precedentemente descritti sono sempre stati condotti su cellule murine; fino ad ora infatti esiste solo la possibilità di ottenere colture endoteliali linfatiche murine. Per poter studiare tali fenomeni nell’uomo si sta cercando di isolare cellule endoteliali linfatiche umane. A tale scopo si è prodotto in cavia un anticorpo che fosse specifico per la podoplanina umana. La podoplanina è una mucoproteina di membrana espressa dall’endotelio linfatico e non da quello vascolare, quindi costituisce un valido marcatore per distinguere questi due tipi di endotelio. XXII Ciclo

2006/2007 EFFETTO ANTIAPOPTOTICO DELL’IL-1ra NEI MIOCARDIOCITI ISCHEMICI La morte di cellule cardiache per apoptosi è una fenomeno rilevante nelle cardiomiopatie ischemiche. Questo fenomeno è stato descritto nelle regioni peri-infartuali del miocardio nelle patologie coronariche e nel rimodellamento cardiaco dovuto a patologie ischemiche. L’attivazione, per via mitocondriale, della caspasi-9 gioca un ruolo fondamentale nell’apoptosi indotta da ischemia. Con questo lavoro si vuole dimostrare che: - l’antagonista recettoriale dell’interleuchina-1 (IL-1ra), che è catalogata come una citochina infiammatoria, è presente nei sieri di pazienti con una sindrome coronarica acuta a concentrazioni elevate. - l’IL-1ra è attivamente prodotta dalle cellule cardiache ischemiche. - l’IL-1ra inibisce, in vitro, l’attività della caspasi-9. - l’IL-1ra è una molecola che, in vivo, fa preservare i miocardiociti ischemici dalla morte per apoptosi. La scoperta di questa nuova funzione endogena dell’IL-1ra evidenzia l’importanza di questa proteina nel rimodellamento cardiaco, promuovendo la sopravvivenza dei miocardiociti nelle regioni ischemiche. Queste osservazioni pongono le basi razionali per iniziare a studiare possibili interventi terapeutici in specifiche patologie dove, con il controllo dell’apoptosi attivata per via mitocondriale, si potrebbero ottenere dei vantaggi sul piano clinico. L’ENDOTELIO LINFATICO NELLA RICIRCOLAZIONE LEUCOCITARIA La presente ricerca ha come obiettivo quello di mettere in evidenza il ruolo dell'endotelio dei vasi linfatici nella cosiddetta ricircolazione dei leucociti e nell’entrata nel circolo linfatico di cellule tumorali maligne in fase di metastatizzazione. Più precisamente il nostro obiettivo è quello di identificare quali chemochine prodotte dalle cellule endoteliali linfatiche siano implicate nella migrazione cellulare. Dopo aver confermato l’espressione di alcune chemochine da parte dell’endotelio linfatico, in particolare della C10, si è individuata la possibilità di costruire grazie ad una tecnica di silenziamento genico, l’RNAi, modelli sperimentali in cui le cellule con attività chemiotattica nei confronti delle cellule endoteliali linfatiche siano deficitarie dei recettori per la chemochina C10. Si è osservato che nelle cellule trattate diminuisce l’espressione dei recettori, confermando l’efficacia della tecnica di silenziamento genico utilizzata. Si è anche valutata la capacità delle cellule trattate di migrare verso un gradiente chemiotattico prodotto dalle cellule endoteliali linfatiche, constatando che le cellule trattate, dunque deficitarie del recettore, mostrano una minore capacità migratoria nei confronti del terreno condizionato dalle cellule endoteliali linfatiche. Si è anche constatato che, in vivo, le cellule deficitarie per i recettori della C10 hanno minore capacità di infiltrare il tessuto linfatico. Questi risultati convalidano la tesi che la chemochina C10 sia implicata nel processo di migrazione. Gli esperimenti precedentemente descritti sono sempre stati condotti su cellule murine; fino ad ora infatti esiste solo la possibilità di ottenere colture endoteliali linfatiche murine. Per poter studiare tali fenomeni nell’uomo si sta cercando di isolare cellule endoteliali linfatiche umane. A tale scopo si è prodotto in cavia un anticorpo che fosse specifico per la podoplanina umana. La podoplanina è una mucoproteina di membrana espressa dall’endotelio linfatico e non da quello vascolare, quindi costituisce un valido marcatore per distinguere questi due tipi di endotelio. XX Ciclo