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Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2017-06-07T14:44:10Z No. of bitstreams: 1 2_v.11_1.pdf: 237989 bytes, checksum: 6b55a08f07ed815719ff27691d10ef8a (MD5) Made available in DSpace on 2017-06-07T14:44:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2_v.11_1.pdf: 237989 bytes, checksum: 6b55a08f07ed815719ff27691d10ef8a (MD5) Previous issue date: 2012-01 Staphylococcus aureus resistentes a múltiplos antibióticos representam um grande problema no controle de infecção hospitalar. O perfil de resistência aos antimicrobianos de S. aureus, presente em cateteres vasculares centrais de pacientes internados em uma Unidade de Terapia Intensiva de um Hospital Universitário do Triângulo Mineiro, foi avaliada por testes antimicrobianos, através do qual foi possível detectar uma elevada resistência a penicilina ( 94,7%) e à ampicilina (86,8%), além de uma cepa resistente à vancomicina. A avaliação da resistência a oxacilina foi confirmada através de PCR pela presença do gene mecA. A associação dos resultados obtidos no ensaio fenotípico com a presença do gene mecA, foi confirmada através da tabela de contingência e o do teste ×2 com correcção de Yates. Em 49 amostras avaliadas, 23 apresentaram resistência a oxacilina, e foi possível detectar a presença do gene de resistência mecA em 21 amostras. O teste por RAPD permitiu a separação dos grupos fenotípicas em dois padrões de grupos diferentes, as que apresentam resistência e as sensíveis à substâncias antimicrobianas, com uma divergência de 73,3%. Os marcadores moleculares para a detecção de resistência a oxacilina, como o gene mecA, foram encontrados por ser mais sensível do que os marcadores fenotípicos. Salvador

Considerando a restrita diversidade de espécies disponíveis para nutrir a carência de vitaminas no Brasil, Kerr e colaboradores, desde 1981, vêm desenvolvendo pesquisas para melhoramento genético de hortaliças ricas em vitamina A. Dentre elas, obtiveram uma cultivar de alface, denominada Uberlândia 10.000 com 10.200 UI de vitamina A em 100 gramas de folha fresca. Este trabalho objetivou comparar o grau de divergência genética entre a cultivar Uberlândia 10.000 e seus parentais para avaliar a eficiência da seleção utilizada, por meio da técnica AFLP. Foram utilizados os seguintes genótipos de alface: Maioba, Salad Bowl-Mimosa, Moreninha-de-Uberlândia, Vitória de Santo Antão, Uberlândia 10.000 lisa 8.ª e 9.ª geração e Uberlândia 10.000 crespa 8.ª e 9.ª geração. A técnica AFLP foi eficiente para identificar genótipos muito próximos e para estudos de progênies em alface. O primer PR15 permitiu a separação da forma lisa e crespa com 1,8% de divergência genética e a oitava da nona geração com apenas 0,71%. Com o estudo da filogenia da cultivar pode-se observar que o programa de melhoramento foi desenvolvido com sucesso, pois a cultivar obtida Uberlândia 10.000 possui alto teor de vitamina A e 92% de similaridade com o parental Vitória de Santo Antão. O primer PR11 conseguiu identificar polimorfismo entre cultivares de alta e baixa resistência à septoriose, sugerindo a possibilidade destas bandas estarem relacionadas à resistência. Considering the restricted diversity of species available to counteract vitamin deficiencies in Brazil, Kerr and coworkers have been engaged since 1981, in developing genetic improved garden vegetables rich in vitamin A. One of these vegetables is the lettuce cultivar Uberlândia 10,000, which contains 10,200 UI of vitamin A per 100 grams of fresh leaves. This study compares the genetic diversity between Uberlândia 10,000 and its parental, evaluating selection efficiency through the AFLP technique. The following lettuce genotypes were used for this comparison: Maioba, Salad Bowl-Mimosa, Moreninha-de-Uberlândia, Vitória de Santo Antão, smooth 8th and 9th generation Uberlândia 10,000, and crinkly 8th and 9th generation Uberlândia 10,000 cultivars. The AFLP technique was effective for identifying very close genotypes and for studying lettuce progenies. The primer PR15 enabled the separation of smooth and crinkly types down to 1.8% of genetic diversity and the 8th and 9th generations down to only 0.71% of diversity. Phylogenetic study of the cultivar confirmed the success of the breeding program, with the Uberlândia 10,000 cultivar revealing high vitamin A content and 92% of similarity with the parental Vitória de Santo Antão. The primer PR11 allowed the identification of polymorphism between cultivars with high and low resistance to septoriosis, suggesting that these bands may be resistance-related.

Esse trabalho analisou a região 16S do DNA mitocondrial em populações de Melipona rufiventris do Espírito Santo, comparando a eficiência das técnicas moleculares SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism-Polimerase Chain Reaction) e DS-PCR (Double-Stringency-Polimerase Chain Reaction). A técnica PCR-RFLP foi sensível para detectar alterações resultantes de mutações, entre as espécies Melipona rufiventris e Melipona compressipes mas não entre as amostras de Melipona rufiventris. A técnica DS-PCR não mostrou resultado satisfatório. A técnica SSCP foi a mais eficiente e a única capaz de identificar polimorfismo em uma amostra de M. rufiventris proveniente do município de Alto Castelinho- ES. UNITERMOS: Mutação, Abelha, Técnicas moleculares, DNA mitocondrial

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Doutor em Genética e Bioquímica Abelhas do gênero Melipona têm importante papel na polinização de plantas no Brasil, e por apresentar mecanismo peculiar de determinação de casta genético alimentar pode ser considerada um laboratório vivo para pesquisas de natureza molecular. O Hormônio Juvenil (HJ) é o principal hormônio que regula a diferenciação de casta e o polietismo etário em abelhas, eventos que depende de genes que estão relacionados com o controle da biossíntese e degradação do HJ. Para o entendimento do mecanismo molecular envolvido no desenvolvimento e diferenciação em abelhas foi realizado estudo sobre a expressão de enzimas que participam das vias de biossíntese e de degradação do HJ e isolamento de peptídeos ligantes ao cérebro de Melipona scutellaris. Foi isolado, clonado e seqüenciado um fragmento do gene o-metiltransferase do ácido farnesóico de M. scutellaris (MsFAMeT) que participa da via de biossíntese do HJ, que apresenta splicing alternativo de um micro-éxon de 27 nucleotídeos. O transcrito maior apresenta expressão diferencial nas castas, porém, aparentemente, não funciona como conversor do ácido farnesóico a metilfarnesoato. A diminuição nos níveis de expressão do transcrito menor nos estágios iniciais de pupas de rainhas que comparado aos mesmos estágios em operárias e sua inibição em larvas tratadas com HJ III indicam que esse mRNA está associado à via de biossíntese de HJ e confirma sua relação com a cascata regulatória de diferenciação das castas em M. scutellaris. O perfil de expressão dos genes que codificam para as enzimas Esterase do HJ (EHJ) e Epóxide Hidrolase do HJ (EHHJ) mostrou que essas enzimas estão expressas durante todo o desenvolvimento ontogenético pósembrionário de M. scutellaris. Em Apis mellifera, essas enzimas não são expressas nos estágios de pupa e sua expressão em M. scutellaris pode indicar presença de HJ circulante nessas fases, o qual seria utilizado em processos fisiológicos diferentes daqueles que ocorrem em Apis. Foi verificado o aumento da expressão dos genes das enzimas EHJ e EHHJ após aplicação tópica de HJ III, indicando que esses genes são regulados por esse hormônio, enquanto que, a injeção de ecdisona não mostrou influência na expressão deles. Quando comparamos os títulos de HJ em larva pré-defecante (LPD) com a expressão do gene das enzimas da via de degradação do HJ, foi possível observar 2 agrupamento de indivíduos com baixos títulos de HJ devido a ação dela, confirmando o papel na via de degradação do HJ. Na fase de L3-3 ficaram agrupados dois indivíduos com altos títulos de HJ, que podem ser rainhas. Esse estágio mostrou ser o melhor para identificação de rainhas no estágio larval. O cérebro é o principal órgão que controla a biossíntese do HJ pelos corpora allata (CA) por meio de neuropeptídeos e aminas biogênicas, além de controlar a aprendizagem e memória. Por isso, utilizamos a técnica de Phage Display para isolar, in vivo, peptídeos ligantes ao cérebro de M. scutellaris. Após quatro ciclos de seleção, clones foram escolhidos para sequenciamento e a análise de bioinformática revelou que são similares a seqüências expressas em cérebro de outros insetos. Foram utilizados dois tipos de bibliotecas apresentadas na superfície de fagos, uma de heptapeptídeos linear e outra de heptapeptídeos constrita, sendo que em nossas análises não encontramos nenhum representante da biblioteca constrita, provavelmente em função da formação de loop no peptídeo que, dificulta a interação com proteínas do cérebro. A análise de expressão das proteínas do cérebro ligantes de peptídeos (fagos) mostrou que alguns clones similares a transportadores de glutamato e lipoforina se expressam somente em cérebro de adultos, enquanto que os ligantes de outros clones expressam-se durante os estágios de pupa e adultos. Pelo mapeamento da região do cérebro de ligação dos peptídeos foi possível mostrar que alguns fagos ligam-se a todo o cérebro, enquanto outros têm ligação sítio-específica. O perfil de expressão de esterases em campeiras que receberam injeção do clone similar a alatostatina, foi alterado, indicando o caráter funcional do peptídeo. A técnica de phage display in vivo foi eficiente para a caracterização de peptídeos ligante no cérebro de Melipona.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Diante da importância das abelhas sem ferrão como principais polinizadores de espécies nativas do Brasil e da escassez de dados sobre a microbiota presente neste grupo, este estudo gerará conhecimento sobre a microbiota associada a esse inseto altamente social. Esta pesquisa terá como foco principal o uso biotecnológico de bactérias isoladas do alimento larval de abelhas sem ferrão. No primeiro Capítulo desta pesquisa tratamos da importância das abelhas sem ferrão, da composição do alimento larval e sua importância para a diferenciação de castas dessas abelhas. Assim como, a importância da microbiota que compõe esse alimento larval. O potencial para uso biotecnológico dos produtos das abelhas sem ferrão e dos microrganismos associados a essas abelhas; O uso de ferramentas de NGS e de isolamento para caracterização de microrganismos; E por fim, a importância da descoberta de antimicrobianos para uso contra bactérias multirresistentes. No Capítulo 2, apresentamos o artigo intitulado: “Microbiota associated with larval food of Brazilian stingless bees: F. varia, M. quadrifasciata, M. scutellaris, and T. angustula”, disponível no formato de envio para publicação. Esta pesquisa traz resultados inéditos sobre a microbiota associada às abelhas sem ferrão Frieseomelitta varia, Melipona quadrifasciata, Melipona scutellaris e Tetragonisca angustula. Contribuindo para melhorar o entendimento sobre o papel desses microrganismos no desenvolvimento das abelhas. No Capítulo 3, apresentamos o artigo “Antimicrobial activity of supernatants produced by bacteria isolated from Brazilian stingless bee’s larval food”; já publicado. Neste trabalho são avaliados os efeitos antimicrobianos de diferentes sobrenadantes de bactérias isoladas do alimento larval de abelhas sem ferrão, das espécies Melipona quadrifasciata, Melipona scutellaris e Tetragonisca angustula. Nossas investigações resultaram na descoberta de bactérias com potencial de produção de moléculas antimicrobianas. Given the importance of stingless bees as the main pollinators of native species in Brazil and the scarcity of data on the microbiota present in this group, this study will generate knowledge about the microbiota associated with this highly social insect. This research will focus on the biotechnological use of bacteria isolated from the larval food of stingless bees. In the first chapter of this research, we deal with the importance of stingless bees, the composition of larval food, and its importance for the differentiation of castes of these bees. As well as the importance of the microbiota that makes up this larval food. The potential for biotechnological use of the products of stingless bees and the microorganisms associated with these bees; The use of NGS and isolation tools for the characterization of microorganisms; And finally, the importance of discovering antimicrobials for use against multidrug-resistant bacteria. In Chapter 2, we present the article entitled: “Microbiota associated with larval food of Brazilian stingless bees: F. varia, M. quadrifasciata, M. scutellaris, and T. angustula”, available in submission format for publication. This research brings unprecedented results on the microbiota associated with stingless bees Frieseomelitta varia, Melipona quadrifasciata, Melipona scutellaris, and Tetragonisca angustula. Contributing to improving the understanding of the role of these microorganisms in the development of bees. In Chapter 3, we present the article “Antimicrobial activity of supernatants produced by bacteria isolated from Brazilian stingless bee’s larval food”; already been published. In this work, the antimicrobial effects of different bacterial supernatants isolated from the larval food of stingless bees of the species Melipona quadrifasciata, Melipona scutellaris, and Tetragonisca angustula are evaluated. Our investigations resulted in the discovery of bacteria with the potential to produce antimicrobial molecules. Tese (Doutorado) 2024-08-12

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais A neurodegeneração é um processo fisiopatológico leva ao comprometimento do Sistema Nervoso, é comumente relacionado com o envelhecimento por se tratar de danos cumulativos ao longo do tempo de vida. Com o aumento da expectativa de vida da população mundial o estudo da neurodegeneração se tornou uma prioridade mundial. A doença de Alzheimer é uma das mais comuns dentre as doenças neurodegenerativas, um dos eventos fisiopatológicos dessa doença é acúmulo do peptídeo β-amiloide, devido ao desequilíbrio entre produção e degradação do mesmo. O acúmulo de β-amiloide se relaciona com outras alterações como a redução da expressão do gene CG15105 (tn), que codifica uma proteína envolvida em processos de degradação proteica por meio da ubiquitinação. Devido a isso, o presente trabalho teve como objetivo explorar os efeitos do gene CG15105 em cérebro de Drosophila melanogaster. Por meio do uso da técnica de knockdown genético com iRNA em cérebro de moscas e análises histopatológicas e comportamentais foi observado que o knockdown do gene CG15105 reduz a atividade locomotora, e o knockdown causa degeneração da morfologia cerebral. E os achados dos estudos in silico do gene CG15105, mostraram que sua atividade está relacionada principalmente com a ubiquinação. E alguns dos genes da rede de interação do CG15105 tem atividade no citoesqueleto e apresentam alteração transcricionais em cérebro de moscas relacionadas aos processos de envelhecimento e presença do peptídeo β-amiloide. Neurodegeneration is a pathophysiological process leading to an impaired nervous system, it is caused by cumulative damage over a lifetime and it is commonly related to aging. With the increase in life expectancy of the world population, the study of neurodegeneration has become a world priority. Alzheimer's disease is one of the most common neurodegenerative diseases. A pathophysiological event of this disease is the accumulation of the β-amyloid peptide, caused by the imbalance between production and degradation. The accumulation of β-amyloid is related to other alterations such as the expression reduction of gene CG15105 (tn), which encode proteins involved in protein degradation processes through ubiquitination. In this way, the present work aimed to explore the effects of the CG15105 gene on the brain of Drosophila melanogaster. Through the use of the technique of genetic knockdown with iRNA in the brain of flies and histopathological and behavioral analyses it was observed that the knockdown of CG15105 gene reduce locomotor activity, and the knockdown of CG15105 causes morphological degeneration of brain. And the findings of the in silico studies of the CG15105 show that its activity is mainly related to ubiquitination. And some of the genes in the CG15105 interaction network that have cytoskeleton functions present transcriptional alterations in the brain of flies related to aging processes and the presence of the β-amyloid peptide. Dissertação (Mestrado)

O câncer de mama (CM) é um importante problema de saúde mundial e é o principal responsável pelas mortes em decorrência do câncer em mulheres. As mortes são, em sua maioria, consequência de metástases à distância e a forma mais efetiva de evitá-las é a detecção do CM em estadiamentos iniciais. O teste padrão ouro para a triagem do câncer de mama é a mamografia e apresenta importantes limitações como restrição ao seu uso em uma faixa etária específica e a constituição física das mamas. Além disso, apresenta altas taxas de resultados falso positivos principalmente por falhar em diferenciar doenças benignas de malignas, ocasionando biópsias teciduais desnecessárias. A biópsia é a única ferramenta capaz de confirmar o diagnóstico de câncer de mama, mas tem a desvantagem de ser altamente invasiva. Diante desse cenário, é de suma importância o desenvolvimento de novas ferramentas ou plataformas que auxiliem na redução de biópsias e outros procedimentos desnecessários. Nesta tese, serão apresentados três capítulos. No capítulo I será abordada uma revisão da literatura sobre o tema da tese. Será descrita a anatomopatologia mamária, os biomarcadores e técnicas mais relevantes que podem solucionar o problema exposto acima. O objetivo é apresentar os conceitos e estudos necessários para a compreensão dos demais capítulos. No capítulo II será abordado um método, painel e kit desenvolvido visando detectar células tumorais circulantes no sangue periférico para diagnóstico do câncer de mama e monitoramento da terapia (Patente 1). Essa patente foi depositada sob o número BR1020200263951 em 22/12/2020 e em 20/12/2021 foi solicitado o PCT da mesma sob o número PCT/BR2021/050561. Encontra-se em fase de validação do protocolo desenvolvido, otimização e estudo prospectivo para confirmação dos parâmetros do monitoramento do tratamento. No capítulo III será apresentado o método desenvolvido de uso de algoritmos de aprendizado de máquina na análise de dados de espectroscopia do infravermelho médio com objetivo de triagem da população feminina pela saliva (Patente 2). Essa patente foi depositada sob o número BR1020210260386 em 22/12/2021 no INPI. Encontra-se em fase de validação do modelo com aumento do número amostral. Logo após o Capítulo III, será apresentada a conclusão da tese e as perspectivas. Breast cancer (BC) is an important global health problem and is the main cause of cancer-related deaths in women. Most deaths are a consequence of distant metastases and the most effective way to avoid them is the detection of BC in the early stages. The gold standard test for breast cancer screening is mammography and it has important limitations such as restriction of its use in a specific age group and the physical constitution of the breasts. In addition, it has high rates of false-positive results, mainly because it fails to differentiate between benign and malignant diseases, causing unnecessary tissue biopsies. A biopsy is the only tool able to confirm the diagnosis of breast cancer, but it has the disadvantage of being highly invasive. Given this scenario, it is extremely important to develop new tools or platforms to help reduce biopsies and other unnecessary procedures. In this thesis, three chapters will be presented. In chapter I, a review of the literature on the theme of the thesis will be addressed. Breast anatomy pathology, the most relevant biomarkers, and techniques that can solve the problem exposed above will be described. The objective is to present the concepts and studies necessary to understand the other chapters. In chapter II, a method, panel, and kit developed to detect circulating tumor cells in peripheral blood for breast cancer diagnosis and therapy monitoring (Patent 1) will be discussed. This patent was filed under the number BR1020200263951 on 12/22/2020 and on 12/20/2021 the PCT of the same was requested under the number PCT/BR2021/050561. It is in the phase of validation of the protocol developed, optimization and prospective study to confirm the parameters of treatment monitoring chapter III, the developed method of using machine learning algorithms in the analysis of mid-infrared spectroscopy data to screen the female population by saliva (Patent 2) will be presented. This patent was deposited under the number BR1020210260386 on 12/22/2021 at the INPI. The model is currently being validated with an increase in the sample size. Soon after Chapter III, the conclusion of the thesis and perspectives will be presented. Tese (Doutorado) 2024-01-31

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma pneumonia intersticial crônica, progressiva e fibrosante, de causa desconhecida, limitada aos pulmões e que afeta em sua maioria idosos. Seu caráter progressivo limita a sobrevida dos pacientes a cerca de três a cinco anos. Os tratamentos atuais, apesar de retardarem a progressão da doença, não são capazes de impedir seu avanço ou reverter seus efeitos. A activina A desempenha um papel fundamental na progressão da FPI, sendo responsável principalmente pela transformação de fibroblastos em miofibroblastos no local da lesão pulmonar. Este estudo buscou inibir a ação da activina A através da utilização de peptídeos sintéticos, capazes de se ligarem e neutralizarem a ação da activina A. Através da seleção por phage display foi possível a seleção de 10 peptídeos únicos, ligantes a activina A. Após a avaliação do potencial de ligação, três peptídeos (A7, B9 e E10) foram escolhidos para terem suas sequencias sintetizadas. Avaliação estrutural in sílico dos peptídeos, bem como de sua interação com a molécula de activina A, demonstrou que os pontos de ligação peptídeo-proteína estão situados na mesma região de ligação da activina A com seu receptor celular (ActRIIB). Além disso, ensaios de migração celular demonstraram a capacidade dos peptídeos em diminuir a proliferação de células pulmonares, mesmo quando estimuladas com pmTGF-β. O peptídeo sintético E10, demonstrou ainda capacidade de inibir a transição epitélio-mesenquimal em células A549 estimuladas com pmTFG-β, bem como inibir a transformação de fibroblastos em miofibroblastos in vitro. Demonstramos assim o potencial inibitório de um peptídeo sintético ligante específico de activina A. Entretanto, estudos in vivo devem ser conduzidos a fim de melhor compreendermos os efeitos da inibição da activina A e seu impacto na progressão da FPI. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic, progressive, and fibrous interstitial pneumonia, of unknown cause, limited to the lungs, that mostly affects the elderly. Its progressive character limits patients' survival to about three to five years. Current treatments, despite slowing its progression, are not able to prevent the disease progress or reverse its effects. Activin A plays a fundamental role in the development of IPF, being mainly responsible for the transformation of fibroblasts into myofibroblasts at the site of the lung injury. This study sought to inhibit the action of activin A through the use of synthetic peptides, capable of binding and neutralizing the action of activin A. Selection of peptides by phage display made it possible to select ten unique peptides that are able of binding to activin A. After evaluation of the binding potential, three peptides (A7, B9, and E10) were chosen to have their sequences synthesized. Structural evaluation in silico of the peptides, as well as their interaction with an activin A molecule, demonstrated that the peptide-protein binding points are located in the same region used for the binding of activin A with its cell receptor (ActRIIB). In addition, cell migration assays demonstrated the ability of peptides to decrease lung cell proliferation, even when stimulated with pmTGF-β. The synthetic peptide E10 was also capable of inhibiting an epithelial-mesenchymal transition in A549 cells stimulated with pmTFG-β, as well as inhibiting the transformation of fibroblasts into myofibroblasts in vitro. We thus demonstrate the inhibitory potential of a specific synthetic peptide binding for activin A. However, in vivo studies must be conducted to understand the effects of inhibition of activin A and its impact on the progression of IPF. Tese (Doutorado) 2023-12-31

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Neospora caninum é um protozoário que pertence ao filo Apicomplexa, possui ampla distribuição mundial e é o causador da neosporose. Essa doença possui grande importância econômica pois causa abortamentos em bovinos. Atualmente não há tratamento e nem vacinas e, por isso, o estudo do parasito e das suas relações com o meio ambiente é de suma importância. Sabe-se que aves são reservatórios de N. caninum, porém o papel da neosporose nestes hospedeiros ainda não está claro. O presente trabalho busca caracterizar o genótipo de uma nova cepa de N. caninum, descrita como Nc-UDI4, isolada do cérebro de uma galinha da região de Uberlândia/MG. Buscou-se ainda compreender o comportamento biológico desta cepa comparando-a com outras duas cepas de N. caninum, Nc-1 e Nc-Liverpool (Nc-Liv). Análises sorológicas mostraram que este novo isolado induz anticorpos específicos anti- N. caninum em camundongos e, através da reação de cadeia em polimerase (PCR), identificou-se que Nc-UDI4 possui o gene Nc5 específico de N. caninum. Além disso, Nc-UDI4 teve uma taxa de alinhamento de 99,8% com o genoma de referência Nc-Liv, conforme as análises de sequenciamento de nova geração (NGS). Foram identificados polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções e deleções (InDels) entre Nc-UDI4 e Nc-Liv. Os principais genes que tiveram mutações foram os responsáveis pela adesão, invasão e sobrevivência do parasito e, conforme mostrado no ensaio de placa, Nc-UDI4 conseguiu invadir e se replicar menos que Nc-Liv. Foram feitas análises de microssatélites que dividiram os isolados de N. caninum em 2 clusters principais, sendo o genótipo de Nc-UDI4 mais próximo de cepas Argentinas e de Nc-1. Nc-UDI4 demonstrou ser menos virulento que Nc-Liv, pois induziu menor mortalidade de camundongos e perfil de citocinas diferente. Portanto, camundongos C57BL/6 infectados com Nc-UDI4 e Nc-1 conseguem ser mais resistentes a infecção por equilibrarem a resposta imune pró e anti-inflamatória, enquanto Nc-Liv modula essa resposta favorecendo a infecção do parasito no hospedeiro. Neospora caninum is a protozoan that belongs to the Apicomplexan phylum, has worldwide distribution and causes neosporosis. This disease induces abortions in cattle and has a significant economic impact. There are no treatment nor vaccines against the parasite so, it is important to study the parasite and its relationship with the environment. It is known that birds are reservoirs for N. caninum, but the actual relevance of neosporosis in birds it is not clear yet. In the present work we aimed to characterize the genotype of a new strain of N. caninum isolated from the brain of a chicken in the city of Uberlandia/MG, Brazil, and compare its biological features with Nc-1 and Nc-Liv. Serological analysis showed that this new strain induces anti-N. caninum antibodies in mice and, using polymerase chain-reaction (PCR), we amplified the Nc5 sequence in its genomic DNA. Furthermore, Nc-UD4 genome aligned 99,8% to the reference genome, Nc-Liv, according to new generation sequencing (NGS) analysis. We identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (InDels) between Nc-UDI4 and Nc-Liv. Genes related to adhesion, invasion and survival of the parasite were altered and, as we showed in plaque assay, Nc-UDI4 had lower invasion/replication rates compared to Nc-Liv. Microsatellite analysis shared N. caninum in two clusters and revealed that the genotype of Nc-UDI4 is closely related to the Argentinian strains and Nc-1. Nc-UDI4 and Nc-1 are less virulent than Nc-Liv, as it induced low mortality of C57BL/6 mice and also a different cytokine profile. In that sense, mice infected with Nc-UDI4 and Nc-1 are more resistant to the infection, allied to a more favourable balance of pro- and anti-inflammatory immune responses against N. caninum, while Nc-Liv modulated this response in its favor, contributing to a worst outcome to its host. Tese (Doutorado) 2023-06-08

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada pela presença de placas amiloides, emaranhados neurofibrilares, inflamação, dano oxidativo, perda de sinapses e morte seletiva de neurônios. A inibição da expressão de BACE1 tem sido considerada um alvo terapêutico para a prevenção e tratamento da doença de Alzheimer. Este estudo avaliou a atividade inibitória do BACE1 do secretoma de bactérias isoladas de alimento larval de abelhas sem ferrão de espécies nativas brasileiras, Melipona quadrifasciata e Tetragonisca angustula. Para tanto, foi realizada a triagem de secretomas nas linhagens transgênicas de Drosophila melanogaster, seguida de análises in silico. Avaliamos a taxa de sobrevivência da mosca transgênica com fenótipo de olho áspero, gerado pela superexpressão de ortólogos humanos APP e BACE1 no sistema nervoso em desenvolvimento do olho. Modificações morfológicas nos olhos de D. melanogaster recém-eclodidos foram examinadas. Verificamos redução das alterações morfológicas no olho, apresentando olhos compostos com superfície lisa, diferença na fusão das omatídeos e presença de grande número de cerdas, nos grupos tratados com os secretomas S9 e S27 quando comparados aos grupos controle. Cortes histológicos mostraram concordância com esta melhora, exibindo olhos compostos com morfologia regular e superfície organizada. O modelo anti-DA de D. melanogaster foi tratado com vários secretomas bacterianos por 15 dias após a eclosão. As moscas tratadas com o secretoma S1 apresentaram melhora na taxa de escalada quando comparadas aos grupos controle negativo e veículo. Além disso, os grupos tratados com os secretomas S1 e S27 mostraram um declínio nos níveis de beta-amiloide após 15 dias de tratamento. A análise histológica do cérebro revelou diminuição da neurodegeneração nas moscas tratadas com S1 visualizada pela redução das lesões vacuolares, quando comparada aos grupos controle negativo e veículo. Realizamos a análise proteômica dos secretomas mais eficientes nos testes com D. melanogaster. As análises in silico selecionou os peptídeos mais potencialmente bioativos para interagir com BACE1 e beta-amiloide, prevendo o docking molecular entre eles. Nossa análise encontrou quatro peptídeos que interagem com BACE1 e Aβ42, com potencial ação na redução do processo neurodegenerativo. Esses peptídeos potencialmente bioativos podem servir de protótipo para novos fármacos para a prevenção ou tratamento da Doença de Alzheimer. O secretoma de bactérias isoladas do alimento larval de abelhas sem ferrão provou ser uma fonte potencial de moléculas terapêuticas direcionadas a distúrbios neurodegenerativos. Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by the presence of amyloid plaques, neurofibrillary tangles, inflammation, oxidative damage, synapse loss, and selective neuron death. Inhibition of BACE1 expression has been considered a therapeutic target for the prevention and treatment of Alzheimer's disease. This study evaluated BACE1 inhibitory activity of secretome of bacteria isolated from stingless bees’ larval food of native Brazilian species, Melipona quadrifasciata and Tetragonisca angustula. For this purpose, the screening of secretomes in the Drosophila melanogaster transgenic strains, followed by in silico analysis. We assessed the survival rate of transgenic fly with rough eye phenotype, generated by overexpression of human APP and BACE1 orthologs in the developing nervous system of the eye. Morphological modifications in the eyes of newly hatched D. melanogaster were examined. We verified reduction of morphological alterations in the eye, presenting compound eyes with smooth surface, difference in the fusion of the omatids and presence of a large number of bristles, in the groups treated with the S9 and S27 secretomes when compared to the control groups. Histological sections showed agreement with this improvement, exhibiting compound eyes with regular morphology and organized surface. The anti-AD model of D. melanogaster was treated with several bacterial secretomes for 15 days after hatching. The flies treated with the S1 secretome showed an improvement in the climbing rate when compared to the negative control and vehicle groups. Additionally, the groups treated with the S1 and S27 secretomes showed a decline in beta-amyloid levels after 15 days of treatment. The histology analysis of the brain revealed a decrease in neurodegeneration in flies treated with S1 visualized through the reduction of vacuolar lesions, when compared to the negative control and vehicle groups. We carried out the proteomic analysis of the most efficient secretomes in the tests with D. melanogaster. The in silico analysis selected the most potentially bioactive peptides to interact with BACE1 and beta-amyloid, predicting the docking between them. Our analysis found four peptides that interact with BACE1 and β-amyloid plaques, with potential action in reducing the neurodegenerative process. Thus, our investigations resulted in the identification of potentially bioactive peptides that can serve as a prototype for new drugs for the prevention or treatment of Alzheimer's Disease. The secretome of bacteria isolated of the larval food of stingless bees proved to be a potential source of therapeutic molecules targeting neurodegenerative disorders. Tese (Doutorado) 2023-06-29

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A proteína óxido nítrico sintase induzível (iNOS) é a mais importante proteína da família das óxido nítrico sintases, a qual é capaz de produzir grandes quantidades de óxido nítrico. A indução permanente de iNOS foi levantada como potencialmente mutagênica, apresentando um papel central na biologia tumoral. O objetivo deste estudo é investigar o papel da iNOS no desenvolvimento de carcinomas de células escamosas bucais (CCEB), usando um modelo experimental de carcinogênese lingual em camundongos knockouts para NOS2 e amostras humanas derivadas da mucosa normal, leucoplasia bucal e CCEB. Camundongos selvagens (iNOS+/+) e knockout (iNOS-/-) para iNOS foram desafiados com 4-nitroquinolina-1-óxido (4NQO) diluída em água potável por 16 semanas e sacrificados após 0, 8 e 16 semanas de acompanhamento. As línguas foram removidas e o número de displasias e carcinomas foram contados. Sangue periférico destes camundongos foram analisados, por citometria de fluxo, em busca de células tumorais circulantes. Amostras humanas derivadas da mucosa normal, leucoplasia e CCEB, foram utilizadas para quantificar o RNA mensageiro (mRNA) de NOS2. As amostras humanas também foram imuno-coradas com anticorpos anti-iNOS e anti-nitrotirosina. Em ambos os grupos, foram observadas uma redução no número de displasias e um aumento de carcinomas da 16 semana até a 32 semanas. Camundongos iNOS-/- demonstraram menor número de lesões displásicas e neoplásicas em todos os períodos de avaliação, sendo menores e menos invasivas, quando comparados aos animais selvagens. Aparentemente, há uma tendência em ascensão nos níveis do mRNA e da proteína iNOS durante a carcinogênese bucal humana. Dados similares foram obtidos com a imuno-detecção de nitrotirosina. Além disso, as imuno-marcações de iNOS e nitrotirosina foram associadas a várias características clínicopatológicas dos CCEB (tamanho, presença de metástase, estadiamento e recidiva). Nossos resultados demonstraram que iNOS afeta o processo de carcinogênese bucal experimental e humana, estando associada com a gênese e progressão dos CCEB. Mais estudos devem ser feitos, para nos fornecer, uma compreensão profunda das funções de iNOS no desenvolvimento de câncer bucal. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is most important protein of nitric oxide synthases family, which is capable to produce huge amounts of nitric oxide. Permanent induction of iNOS has been raised as potentially mutagenic; presenting pivotal roles in tumor biology. The aim of this study is to investigate the role of iNOS in the development of oral squamous cells carcinomas (OSCC), using a mouse model of oral carcinogenesis in NOS2 knockout animals and human samples derived from normal mucosa, leukoplakia and OSCC. Wild-type (iNOS+/+) and NOS2-knockout (iNOS-/-) mices, were challenged with 4- nitroquinoline- 1-oxide (4NQO) in drinking water for 16 weeks and killed after 0, 8 and 16 weeks of after treatment. Tongues were removed and the number of dysplasias and carcinomas was counted. Mice’s peripheral blood were analyzed by flux cytometry in search of circulating tumor cells. Human samples derived from normal mucosa, leukoplakia and OSCC, were utilized to relative quantify the amount of NOS2-mRNA. The human samples were also immune-stained with anti-iNOS and anti- Nitrotyrosine antibodies. In both groups, a reduction of dysplasias and an increase of carcinomas from week 16 to week 32 were observed. iNOS-/- mices had shown a small number of dysplastic and neoplastic lesion in all evaluated periods, moreover these lesions were usually smaller and less invasive when compared to wild type animals. Apparently, there is a rising tendency in the iNOS mRNA and protein levels during human oral carcinogenesis. Similar findings were obtained in the nitrotyrosine staining. Furthermore, iNOS and nitrotyrosine imuno-stained is associated with several clinic-pathological features of OSCC (site, presence of metastasis, staging and recidive). Our results shows that, iNOS affects the process of experimental and human oral carcinogenesis, being associated with OSCC genesis and progression. More studies should be done to provide us a deep understanding of the iNOS functions in oral cancer development. Tese (Doutorado)

Os nematódeos dos gêneros Toxocara e Toxascaris são identificados, tradicionalmente, com base nos aspectos morfológicos, entretanto a diversidade genética entre esses parasitos é reconhecida, sendo a análise precisa dessa variação é necessária para o entendimento da biologia desses organismos. Esse trabalho teve como objetivos estabelecer relações filogenéticas e filogeográficas entre espécimes de Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara malaysiensis e Toxascaris leonina, e comparar os resultados das técnicas morfológica e moleculares. Foram coletados 436 helmintos adultos e quatro “pools” de ovos de canídeos e felídeos, procedentes de oito países. Os parasitos foram analisados por microscopia estereoscópica, pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e “Restriction Fragment Lenght Polymorfism” (PCR-RFLP). Os primers TOXCOIF3 e TOXCOIF2 foram desenhados para amplificar 490 pares de base do gene mitocrondrial Cox1 e a PCR-RFLP foi realizada utilizando-se a enzima MseI. As relações filogenéticas entre os isolados foram observados no filograma e pelo cálculo das taxas de variabilidade genotípicas (distância filogenética). Dos 313 parasitos adultos provenientes de cães, 309 foram identificados, por microscopia, como T.canis e quatro como T. leonina. Dos 123 oriundos de gatos, 118 foram identificados como T. cati, quatro T. malaysiensis e um T. leonina. Dentre os “pools” de ovos, os três de leoas foram identificados como T. leonina e o de cão como T. canis. A PCR em todas as amostras analisadas (n=440) apresentou falha de 3,6%. Das amostras amplificadas (n=424) 72 foram selecionadas para o sequenciamento. Com exceção de três amostras, duas provenientes de gato foram caracterizadas como T. canis, e uma proveniente de cão como T. cati, todas as restantes foram caracterizadas em concordância com os respectivos hospedeiros. Das 424 amostras submetidas a PCR-RFLP, 351 foram identificadas como T. canis/T.leonina, 70 como T. cati e três como T. malaysiensis. Essa técnica apresentou resultados semelhantes ao sequenciamento. Foram observadas homologia e variação genotípica nas espécies, sendo a maior 6,6%. Relações filogeográficas, dentro das espécies, puderam ser observadas pelo filograma. Entre as técnicas, observou-se 9,7% de incongruência de resultados entre microscopia e sequenciamento e 0,9% entre microscopia e PCR-RFLP. Entre as técnicas moleculares, considerou-se somente T. cati e T. malaysiensis, o que significou 100% de concordância entre resultados. A partir dos achados desse trabalho, conclui-se que alguns isolados, da mesma espécie, apresentaram variabilidade intragenotípica; Sequências homólogas foram identificadas em diferentes países, sugerindo a ocorrência de fluxo gênico; A procedência geográfica teve relação direta com a variação genética dos parasitos; T. canis e T. cati apresentaram taxa de variabilidade semelhante às de T. cati e T. leonina; E as três técnicas utilizadas apresentaram resultados que indicam a preferência de T. canis, T. cati e T. malaysiensis por determinados hospedeiros. The nematodes of the genus Toxocara and Toxascaris are identified, traditionally, based on the morphologic aspects, however the genetic diversity among these parasites is recognized, being an accurate analysis of this variation necessary for the understanding of the biology of these organisms. This work aimed to establish the phylogenetic and phylogeographic relationships among specimens of Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara malaysiensis and Toxascaris leonina and to compare the results given by the morphologic and molecular techniques. In total, 436 helminths adults and four pools of eggs were collected from canids and felines from eight countries. The parasites were analyzed by stereoscopic microscopy, by Polymerase Chain Reaction (PCR) and by Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Primers TOXCOIF3 and TOXCOIR2 were designed in order to amplify 90pb of the mitochondrial gene Cox1, and the PCR-RFLP using the enzyme MseI could discriminate between these four species. The phylogenetic relationships among the isolates were observed in the phylogram and by the genetic variability (phylogenetic distance) rates. Of the 313 parasites adults, from dogs, 309 were identified, by microscopy, as T. canis and four as T. leonina. Of 123 originating from cats 118 were identified as T. cati, four as T. malaysiensis and one as T. leonina. Among the pools the three from lions were identified as T. leonina and that of dog as T. canis. PCR in all analyzed samples (n=440) failed in 3,6%. Of the amplified samples (n=424) 72 were selected to sequencing. With the exception of three samples, two from cats, were characterized as T. canis and one from dog as T. cati, all remaining were identified in agreement with their respective hosts. Of the 424 samples submitted to PCR-RFLP 351 were identified as T. canis/T.leonina, 70 as T. cati and three as T. malaysiensis. This technique presented similar results to sequencing. Homology and genotypic variation were observed within species, being the largest one 6.6%. Phylogeographic relationships within species could be observed by the phylogram. Among the techniques it was observed 9,7% of incongruence in the results between microscopy and sequencing, and 0,9% between microscopy and PCR-RFLP. Between the molecular techniques, it was considered only T. cati and T. malaysiensis which meant 100% of agreement. Based on the findings, of this study, it was concluded that some isolates of the same specie presented intragenotipic variability; Homologous sequences were identified in different countries, suggesting the occurrence of gene flow; The geographic origin was directed related to the genetic variation of the parasites; T. canis and T. cati presented variability rates similar to T. cati and T. leonina; And the three techniques used, herein, showed results that indicate a preference of T. canis, T. cati and T. malaysiensis for certain hosts. Tese (Doutorado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Em rainhas e operárias de abelhas do gênero Melipona somente a alimentação diferencial não é suficiente para explicar o polifenismo das fêmeas. Nessas abelhas, além do componente ambiental (alimento), é necessário um componente genético. Esse mecanismo ainda não foi totalmente elucidado e pode ser que envolva eventos epigenéticos e regulação metabólica além dos mecanismos genéticos. Nesse contexto, esse trabalho analisou a expressão dos transcritos dos genes codificadores das enzimas desacetilases HDAC1 e HDAC4 e acetiltransferase KAT2A, o efeito do inibidor de histona desacetilase 10HDA na diferenciação de castas e, o perfil metabólico de larvas e do alimento larval de Melipona scutellaris. Os transcritos de hdac1, hdac4 e kat2a são expressos em todos os estágios, com flutuações nos estágios e castas, e podem estar relacionados à regulação endócrina. O 10HDA foi incapaz de promover a diferenciação em rainhas. Os metabólitos de larvas e alimento estão enriquecidos para metabolismo de galactose. O perfil metabólico de larvas pode ser indicador de casta/sexo e de alterações epigenéticas. Nossos resultados sugerem que regulação epigenética e metabólica atuem sinergicamente com mecanismos hormonais e genéticos para a diferenciação de castas em Melipona. In bees from genus Melipona bees, differential feeding is not sufficient to explain female polyphenism. In these bees, in addition to the environmental component (food), a genetic component is required. This mechanism has not yet been fully elucidated and may involve epigenetic events and metabolic regulation in addition to genetic mechanisms. In this context, this work analyzed the expression of the transcripts of the genes coding for the enzymes deacetylases HDAC1 and HDAC4 and acetyltransferase KAT2A, the effect of histone deacetylase inhibitor 10HDA on caste differentiation and the metabolic profile of larvae and larval food of Melipona scutellaris. The hdac1, hdac4 and kat2a transcripts are expressed at all stages, with fluctuations in stages and casts, and may be related to endocrine regulation. 10HDA was unable to promote differentiation in queens. Larvae and food metabolites are enriched for galactose metabolism. The metabolic profile of larvae may be an indicator of caste/sex and epigenetic modifications. Our results suggest that epigenetic and metabolic regulation act synergistically with hormonal and genetic mechanisms for drive caste differentiation in Melipona. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O câncer de próstata (CaP) é uma das principais causas de morte entre homens no mundo e pouco se conhece sobre seu desenvolvimento e metástase. Assim, novas abordagens têm sido propostas para obtenção de uma melhor qualidade de vida para os pacientes. Dentre essas abordagens a biópsia líquida tem se destacado, por ser uma prática menos invasiva que a biópsia tecidual. Nessa situação, células tumorais, vesículas extracelulares e fragmentos de DNA circulantes são utilizados para triagem do câncer a partir de diferentes fluidos biológicos. Em adição, podem participar de eventos pró tumorais como transformação maligna das células adjacente ao tumor e na metástase. Diante disso, esse trabalho buscou analisar o efeito das vesículas extracelulares e do DNA circulante, derivados de pacientes com câncer de próstata, em linhagens celulares normais da próstata após serem tratadas por 24 h. Para isso, foram realizados previamente ensaios de caracterização destas moléculas e em seguida, ensaios funcionais como: migração e proliferação celular, expressão gênica e metabolômica. Esta última foi realizada também na intenção de verificar a presença de potenciais biomarcadores secretados pelas células normais em resposta a presença de DNA tumoral circulante. Os resultados obtidos mostraram que vesículas extracelulares derivadas de pacientes com CaP podem alterar o perfil de expressão de genes relacionados a progressão do CaP e ao processo de transição epitélio mesenquimal, muito abordado na metástase do câncer, além de aumentar a proliferação e a migração celular. O DNA circulante isolado de pacientes com CaP também mostrou ser capaz de induzir alterações na expressão gênica em células normais, alterando também o perfil de metabólitos secretados por essas células. Baseado na concentração do cfDNA indivíduos saudáveis foram distinguidos de pacientes com CaP com uma sensibilidade de 72% e especificidade de 71%. Esses dados confirmam, portanto, a participação de VE e cfDNA, isolados de pacientes com CaP, em eventos celulares cruciais para o desenvolvimento e progressão da doença, além de demonstrar o potencial de VE e cfDNA para serem empregados no diagnóstico e como alvos terapêuticos em futuros tratamentos do câncer. Prostate cancer (PCa) is one of the major causes of death among men worldwide, and little is known about the disease development and the metastasis process. New clinical approaches have been proposed, aiming to improve the quality of life of prostate cancer patients. Amongst various approaches, liquid biopsies have been distinguished from other techniques, by being less invasive than tissue biopsies. In this technique, tumor cells, extracellular vesicles and circulating DNA fragments can be identified in various biological fluids and used for screening. In addition to their use in the prostate cancer diagnosis, circulating tumor cells, vesicles and DNA, can play a role in pro-tumor events, as the malignant transformation of adjacent cells or in the metastasis process. Based on that information, this work aimed to evaluate the effect of prostate tumor derived extracellular vesicles and circulating DNA in normal prostate cell lines upon 24 h treatment. To this end, we first characterized those molecules, then functional assays were performed, such as cell migration and proliferation, gene expression and metabolomics. Metabolomic analysis was also performed in hope to identify potential biomarkers secreted by normal cells in response to the treatment with circulating tumor DNA. Results demonstrate that extracellular vesicles derived of PCa patients can alter the expression profile of PCa related genes and epithelial mesenchymal transition genes. Increase in cell proliferation and migration was also observed after treatment. Circulating DNA isolated from PCa patients were also capable to alter the gene expression of normal cells, altering as well their metabolic profile. In addition, concentration of cfDNA could separate health individuals and PCa patients with a sensibility of 72% and specificity of 71%. Those data confirm the role of EV and cfDNA derived from PCa patients in malignant cellular events, crucial to the development and progression of the PCa. Furthermore, we demonstrated the potential of EV and cfDNA as diagnostic and therapeutic targets. Tese (Doutorado)

FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais O presente estudo buscou compreender variações quanto a características demográficas, morfológicas e de razão sexual de duas populações do camarão carídeo Macrobrachium amazonicum, localizadas no Triângulo Mineiro, nas bacias do Rio Araguari (UHE Miranda – ambiente lêntico) e do Rio Grande (a jusante da UHE de Igarapava - SP – ambiente lótico) e como essas populações se enquadram nos seguintes clados propostos por Vergamini et al. (2011): 1 –região continental da Bacia Amazônica, 2 – região continental da Bacia Paraná/Paraguai, 3 – regiões costeiras do Norte e Nordeste. Duas coletas foram realizadas em cada um dos rios descritos acima. Para amostragem dos camarões, utilizaram-se armadilhas tipo covo (27h de amostragem/ponto) e peneiras (1h amostragem/ponto). Os espécimes foram identificados, sexados, mensurados quanto ao comprimento de carapaça (CC) com um paquímetro analógico, para posterior distribuição de frequência em classes de 1 mm de CC e classificados em jovens e adultos. Os machos foram divididos em morfotipos conforme coloração de quelípodos e diferenciação de tamanho entre carpo e quelípodo. Os dados morfológicos e a frequência de indivíduos por categoria demográfica das populações foram comparados com uso de Teste t-Student e a razão sexual com uso de Qui-quadrado e Teste Binomial. A partir de levantamento bibliográfico, dados referentes a razão sexual e CCmáximo de populações de diferentes regiões no Brasil foram compilados para compor uma meta-análise. O critério de seleção dos artigos científicos foi possuir dados completos referentes a razão sexual, CCmáximo e local de coleta. Pelo menos uma região de cada clado proposto acima foi amostrada. Os dados foram avaliados através de uma análise de componentes principais (PCA). Foram amostrados 703 indivíduos no Rio Araguari (366 fêmeas, 337 machos), organizados em oito classes de CC (4 - 11 mm), com razão sexual 1Macho:1,1Fêmea e fêmeas maiores que machos. No Rio Grande 808 indivíduos foram amostrados (575 fêmeas, 233 machos), distribuídos em 21 classes de CC (4 - 24 mm). Os machos apresentavam-se divididos nos morfotipos Transparent Claw, Cinnamon Claw e Green Claw, mas o tamanho médio de CC de fêmeas e machos não diferiu. A razão sexual foi 1Macho:2,5Fêmea. Na meta-análise, 22 populações foram consideradas, as quais estavam distribuídas entre ambientes lênticos e lóticos, águas salobras e doces e podiam ser caracterizadas como hololimnéticas e anfídromas. Por meio da PCA, verificou-se que as populações do Rio Araguari parecem estar enquadradas no Clado 2 (Bacia Paraná/Paraguai) e as populações do Rio Grande apresentam-se divididas entre os Clados 1 (Bacia Amazônica Continental) e 2. Os dados obtidos indicam que foram selecionadas nas duas populações estratégias reprodutivas diferentes e que essas podem interferir nas diferenças de categorias demográficas encontradas, bem como na presença ou ausência de morfotipos de machos. Também é possível inferir que o Rio Grande pode ter se configurado como uma área que manteve fluxo gênico entre populações dos clados 1 e 2 e constitui-se como uma área fundamental na manutenção da variabilidade genética dessa espécie. The present study sought to understand variations in demographic, morphological and sexual ratio characteristics of two populations of the caridean shrimp Macrobrachium amazonicum, located in the Triângulo Mineiro region in the Araguari (Miranda Hidroeletric Power Plant – lentic environment) and Rio Grande (downstream of Igarapava HPP - lotic environment) river basins and how these populations fit into the following clades proposed by Vergamini et al. (2011): 1- Amazon Basin continental region; 2 - Paraná / Paraguay Basin continental region; 3 - North and Northeast coastal regions of the. Two samples were carried out at each river. For shrimp sampling, covo traps (27h sample / point) and sieves (1h sample / point) were used. Specimens were identified, sexed, had carapace length (CC) measured with an analog caliper for posterior frequency distribution in classes of 1 mm CL and classified in young and adult. Males were divided into morphotypes according to cheliped staining and size differentiation between carpus and propodus. Morphological data and frequency of individuals by demographic categories of the populations were compared using Student's t-test and the sex ratio using Chi-square and Binomial Test. Based on a bibliographical survey, data on sex ratio and CLmax of populations from different regions in Brazil were compiled to compose a meta-analysis. The criterion for the selection of papers was to have complete data referring to sex ratio, CLmax and sampling location. At least one region of each clade proposed above was sampled. The data were evaluated through a principal component analysis (PCA). A total of 703 individuals were sampled in the Araguari River (366 females, 337 males), organized in eight classes of CL (4 - 11 mm), with sexual ratio 1Macho: 1.1 Females and females larger than males. In Grande River, 808 individuals were sampled (575 females, 233 males), distributed in 21 CL classes (4 - 24 mm). The males were divided in three morphotypes: Transparent Claw, Cinnamon Claw and Green Claw, but the average CL size of females and males did not differ. The sex ratio was 1Male: 2.5 Females. In the meta-analysis, 22 populations were considered, which were distributed between lentic and lotic environments, brackish and freshwaters and could be characterized as hololimnetic and amphidrome. Through the PCA, it was verified that the populations of the Araguari River seem to be framed in clade 2 (Paraná Basin / Paraguay) and the populations of Grande River are divided between clades 1 (Continental Amazon Basin) and 2. The data obtained indicate that both populations adopt different reproductive strategies and these strategies can interfere in the differences of demographic categories found, as well as in the presence or absence of morphotypes of males. It is also possible to infer that Grande River may have been configured as an area that maintained gene flow between populations of clades 1 and 2 and it is a fundamental area in maintaining the genetic variability of this species. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A clonagem via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) é uma biotécnica de reprodução assistida em uso comercial, com várias aplicações. Ainda assim é uma técnica de baixa eficiência, possivelmente em consequência do perfil epigenético do genoma somático da célula doadora de núcleo, o que dificulta a reprogramação correta após a transferência nuclear. A memória epigenética da célula diferenciada resulta em alterações na expressão de genes importantes durante o desenvolvimento embrionário. Nesse estudo, analisamos o perfil de metilação do DNA e de expressão gênica de fibroblastos bovinos cultivados in vitro com drogas desmetilantes de DNA, S-Adenosil-L-Homocisteína e procaína. Com relação ao perfil epigenético, foram quantificados os níveis globais de metilação do DNA, bem como os níveis de metilação em uma região de DNA repetitivo. Além disso, foram produzidos embriões e avaliados os níveis de metilação destes para duas regiões repetitivas satélites. Quanto ao perfil de expressão gênica, determinamos os níveis de mRNA para os genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2, TET3 e OCT4, os quais estão relacionados à reprogramação da metilação do DNA e estado de pluripotência. Células tratadas com as substâncias desmetilantes apresentaram níveis menores de metilação do DNA, tanto a nível global quanto para a região satélite I. Os embriões clones produzidos a partir de células tratadas apresentaram menores níveis de metilação em relação aos embriões controles para a região Satelite I. Quanto ao perfil transcricional, verificamos que células tratadas com SAH+procaína, apresentaram redução geral nos níveis de DNMTs. Por outro lado, para a enzima TET3 foi observado maior nível de transcritos em comparação ao controle. Nossos resultados mostraram que o uso desses agentes desmetilantes em células doadoras de núcleo foi capaz de alterar os níveis de metilação do DNA, além de alterar o perfil transcricional dos genes envolvidos na maquinaria epigenética. Portanto, sugere-se que o uso dessas substâncias possa contribuir para que o ovócito consiga reprogramar o núcleo doador de uma forma mais eficiente após a transferência nuclear. Assim, sugerimos que o uso de agentes moduladores de cromatina nos protocolos de cultivo celular para uso na clonagem por transferência nuclear possa contribuir para melhorar a eficiência da técnica. Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a commercially available technique of assisted reproductive technology with broad applications. It is still a low-efficiency technique, possibly as a consequence of the epigenetic profile of the somatic genome of the donor cell, which carries characteristic marks of differentiated cells, which hampers correct reprogramming after nuclear transfer. This differentiated cell memory leads to changes in DNA methylation patterns as well as changes in the gene expression profile of important genes during embryonic development. In this study, we analyzed the DNA methylation and gene expression profile of bovine fibroblasts cultured in vitro with DNA toxicity drugs of low toxicity, SAH and procaine. Regarding the epigenetic profile, the global levels of DNA methylation were quantified as well as the levels of methylation in a satellite repetitive region of the treated cells. In addition, embryos were produced and their methylation levels were evaluated for two repetitive satellite regions. Regarding the gene expression profile, we determined the mRNA levels for the DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2, TET3 and OCT4 genes, which are related to the reprogramming of DNA methylation and pluripotency state. Cells treated with DNA demethylating substances showed lower levels of DNA methylation, both globally and in the satellite region. The embryonic clones produced from treated cells had lower levels of methylation compared to control embryos for the Satelite I region. Regarding the transcriptional profile, we observed that in cells treated with SAH + procaine, they presented a general reduction in the levels of DNMTs. On the other hand, for the TET3 enzyme, a higher level of transcripts was observed in comparison to the control. Our results showed that the use of demethylating agents in nucleating donor cells is capable of altering their epigenetic profile, in order to modify at the transcriptional level the production of enzymes related to methylation, which can lead the cell to a state of less differentiation. We have discussed, in this research study, the use of chromatin modulating agents as a perspective for use in cloning, medical research in cancer and other diseases. Tese (Doutorado)

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Esta tese está subdividida em três capítulos e anexos: • Capítulo 1: Fundamentação teórica • Capítulo 2: DNA methylation profile at a satellite region is associated with aberrant placentation in cloned calves • Capítulo 3: DNA methylation and transcriptional profiles of endogenous retroviruses in placenta of cloned cattle • Anexos: Descrição dos protocolos; Artigo e resumos publicados No capítulo 1 é demonstrada a relação intrínseca entre a técnica de clonagem por transferência nuclear e a epigenética, fornecendo a base do conhecimento necessário para o entendimento dos assuntos que serão abordados nos demais capítulos. O capítulo 2 está estruturado no formato de artigo científico e escrito em língua inglesa. Neste capítulo é apresentado estudos de metilação em regiões de DNA repetitivo satélites, as quais estão presentes em múltiplas cópias nas regiões centroméricas e pericentroméricas de cada cromossomo do organismo. Além disso foram também realizadas análises de metilação e hidroximetilação globais do DNA. As avaliações foram realizadas em amostras de placenta de bezerros clonados e os níveis de metilação foram comparados entre animais considerados saudáveis e aqueles apresentando algum fenótipo aberrante. Esse artigo foi recentemente publicado na revista Placenta. O capítulo 3 também foi estruturado no formato de artigo científico e escrito em língua inglesa. Neste capítulo é sugerida a participação de retrotransposons na fisiologia do organismo hospedeiro. Foram realizados estudos de metilação de DNA e expressão gênica de genes originados de retrovírus endógenos envolvidos na placentação, um dos processos críticos na gestação de embriões clones. Esse artigo será submetido para publicação na revista Plos One. Em anexos estão descritos os protocolos que foram utilizados nos experimentos realizados nos capítulos 2 e 3. E estão em anexos o artigo e os resumos publicados. This thesis is subdivided into three chapters and annexes: • Chapter 1: Theoretical rationale • Chapter 2: DNA methylation profile at a satellite region is associated with aberrant placentation in cloned calves • Chapter 3: DNA methylation and transcriptional profiles of endogenous retroviruses in placenta of cloned cattle • Attachments: Description of protocols; Article and published abstracts In Chapter 1 the intrinsic relationship between the nuclear transfer cloning technique and the epigenetic technique is demonstrated, providing the knowledge base necessary to understand the subjects that will be addressed in the other chapters. Chapter 2 is structured as a scientific paper and written in English. In this chapter we present methylation studies in regions of repetitive satellite DNA, which are present in multiple copies in the centromeric and pericentromeric regions of each chromosome of the organism. In addition, global methylation and hydroxymethylation analyzes of DNA were also performed. Evaluations were performed on placental samples from cloned calves and methylation levels were compared between animals considered healthy and those showing some aberrant phenotype. This article was recently published in the journal Placenta. Chapter 3 was also structured in a scientific paper format and written in English. In this chapter the participation of retrotransposons in the physiology of the host organism is suggested. DNA methylation studies and gene expression of genes originating from endogenous retroviruses involved in placentation, one of the critical processes in embryo clones, were carried out. This article will be submitted for publication in Plos One magazine. The protocols used in the experiments carried out in chapters 2 and 3 are described in annexes. The articles and published abstracts are attached. Tese (Doutorado)

Fundamentação teórica: A doença cardiovascular é a principal causa de morte nos países desenvolvidos e uma causa importante de morbidade, dependência e elevados custos em saúde. Por outro lado, a hipertensão arterial, que apresenta elevada prevalência nas diversas comunidades, é um fator de risco maior para as doenças cardiovasculares, doença renal e déficit cognitivo. Sabe-se, assim, que o controle dos fatores de risco para as doenças cardiovasculares, dentre eles a hipertensão arterial e a hipercolesterolemia, diminui a morbimortalidade. Objetivos: O estudo avaliou o papel da sinvastatina, em monoterapia ou associada ao enalapril, no nível pressórico, na frequência cardíaca, no peso do coração, na hipertrofia dos cardiomiócitos e no peso corporal em ratos espontaneamente hipertensos. Materiais e métodos: Foram utilizados ratos espontaneamente hipertensos, machos, adultos, submetidos às mesmas condições ambientais, e distribuídos em quatro grupos (controle, sinvastatina, enalapril e associação - sinvastatina mais enalapril). O experimento teve duração de quatro semanas. No início foram mensurados o peso corporal dos animais, a frequência cardíaca e a pressão arterial por pletismografia de cauda. Ao final do experimento foram mensurados o peso corporal, do coração e do ventrículo esquerdo, a frequência cardíaca, a pressão arterial e o diâmetro transversal dos cardiomiócitos. Os resultados foram comparados estatisticamente num delineamento inteiramente casualizado, no esquema fatorial em parcela subdividida, e por ANOVA. Resultados: Houve redução na frequência cardíaca no grupo sinvastatina quando comparado ao grupo controle. A pressão arterial sistólica nos grupos com enalapril também foi reduzida, tanto em monoterapia como na associação deste com a sinvastatina. O peso dos animais do grupo enalapril também foi menor do que os do controle. Nenhuma alteração foi observada no peso do coração e do ventrículo esquerdo em qualquer dos grupos tratados. Houve aumento no diâmetro transversal dos cardiomiócitos nos grupos sinvastatina e enalapril e nenhuma alteração quando se associou os dois medicamentos, em relação ao grupo controle. Conclusões: A sinvastatina em monoterapia promove uma redução da frequência cardíaca. O enalapril isolado não altera a frequência cardíaca. O enalapril e a sinvastatina, quando administrados isoladamente, aumentam o diâmetro transversal dos cardiomiócitos e esse efeito é abolido pela terapia combinada. Em combinação com o enalapril, a sinvastatina potencia a redução da pressão arterial sistólica em SHR. Há interrupção do ganho de peso com o enalapril em monoterapia, que é suprimida quando a sinvastatina está associada ao tratamento. Theoretical Background: Cardiovascular disease is the leading cause of death in developed countries and it is an important cause of morbidity, dependency and high health costs. Furthermore, hypertension has a high prevalence in the various communities and it is a major risk factor for cardiovascular disease, kidney disease and cognitive impairment. Thus, it is clear that the modification of cardiovascular risk factors reduces cardiovascular and renal morbidity and mortality. Objective: This study evaluated the effects of simvastatin associated with enalapril in blood pressure and transversal diameter of cardiomyocytes in spontaneously hypertensive rats. Materials and methods: We used spontaneously hypertensive male rats, adults, subject to the same environmental conditions, divided into four groups (control, simvastatin, enalapril and combination of simvastatin and enalapril). The experiment lasted four weeks. Earlier, the body weight, the heart rate and the sistemic blood pressure by tail plethysmography were registered. At the end of experiment, the body weight, the heart and the left ventricle weight were measured. In addition, the heart rate and the systolic blood pressure were registered by plethysmography and the transversal diameters of cardiomyocytes were measured. The statistical treatment of results was done analyzing the results by a completely randomized design in a factorial and in a split plot and UNIANOVA. Results: There was a reduction in heart rate in the simvastatin group when compared to the control group. Systolic blood pressure in the enalapril groups was also reduced, both in monotherapy and in the association of this with simvastatin. The weight of the animals in the enalapril group was also lower than those of the control group. No change was observed in the weight of the heart and left ventricle in any of the treated groups. There was an increase in the transverse diameter of the cardiomyocytes in the simvastatin and enalapril groups and no change when the two drugs were associated, in relation to the control group. Conclusions: Simvastatin monotherapy promotes a reduction in heart rate. Enalapril alone does not alter heart rate. Enalapril and simvastatin, when given alone, increase the cross-sectional diameter of cardiomyocytes and this effect is abolished by combination therapy. In combination with enalapril, simvastatin potentiates the reduction of systolic blood pressure in SHR. There is interruption of weight gain with enalapril monotherapy, which is suppressed when simvastatin is associated with treatment. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O presente trabalho descreve o desenvolvimento de genossensor eletroquímico com eletrodos de grafite modificados com óxido de grafeno reduzido e politiramina para detecção do RNAg do vírus Zika (ZIKV) e genossensor óptico e colorimétrico baseado em nanopartículas de ouro e prata. A infecção por vírus Zika (ZIKV) tornou-se questão emergencial em termos de saúde global desde a epidemia no Brasil em 2015. Desde então o vírus tem se espalhado para outros países na América Latina e nos Estados Unidos. O controle e monitoramento da infecção por ZIKV são limitados devido a indisponibilidade de drogas, vacinas e diagnóstico rápido. Neste último fator, o teste diagnóstico mais utilizado é a técnica de transcriptase reversa (RT-PCR) que consiste em um método laboroso e pode ocasionar em resultados indeterminados. O presente estudo avaliou a resposta eletroquímica, colorimétrica e óptica de amostras de RNAg do vírus Zika de 10 pacientes infectados e que foram validadas previamente pelo método de RT-PCR tradicional. A plataforma EG/OGr/PoliTir mostrou superioridade no quesito de transferência eletrônica e aumento da área superficial quando comparada ao EG sem modificação. A sonda ZIK1V foi imobilizada na plataforma de EG/OGr/PoliTir e detectado o material genômico do vírus por monitoramento das mudanças eletroquímicas do par redox [Fe(CN)6]4/[Fe(CN)6]3 por técnica de voltametria de pulso diferencial. Os parâmetros analíticos foram analisados e o genossensor eletroquímico apresentou limite de detecção de 10 fg/mL com resposta de corrente decrescendo menos do que 20% no período avaliado de 90 dias. Na plataforma óptica e colorimétrica foi imobilizada sonda tiolada seguida de hibridização com alvo, leitura no espectrofotômetro e mudanças visuais de cor. A plataforma se mostrou sensível às variações de concentração de material genético, descrecendo cerca de 5% em 90 dias. Assim, as plataformas aqui desenvolvidas demonstram- se como soluções eficientes e de baixo custo no controle da infecção e preenche a lacuna de escassez de métodos diagnósticos para o vírus Zika. The present work describes the development of electrochemical genossensor with graphite electrodes modified with reduced graphene oxide and polythiramine to detect the gRNA of Zika virus (ZIKV) and optical and colorimetric genosensor based on gold and silver nanoparticles. Zika virus (ZIKV) infection has become an emerging global health issue since the 2015 outbreak in Brazil. Since then the virus has spread to other countries in Latin America and the in United States. The control and monitoring of ZIKV infection are limited due to the unavailability of drugs, vaccines and rapid diagnosis. The most commonly used diagnostic test is the reverse transcriptase (RT-PCR) technique, which consists of a laborious method and can lead to indeterminate results. The present study evaluated the electrochemical, colorimetric and optical response of Zika virus gRNA samples from 10 infected patients wich were previously validated by the traditional RT-PCR method. The GE/rGO /Polytir platform showed superiority in electronic transfer and increased surface area when compared to GE without modification. The ZIK1V probe was immobilized on the GE/rGO/Polytir platform and the virus genomic material was detected by monitoring the electrochemical changes of the redox pair [Fe(CN)6]4/[Fe(CN)6]3 by differential pulse voltammetry. The analytical parameters were analyzed and the electrochemical genossensor showed detection limit of 10 fg/mL with current response decreasing less than 20% in the evaluated period of 90 days. In the optical and colorimetric platform the thiolated probe was immobilized followed by hybridization with target, spectrophotometer reading and visual changes of color. The platform was sensitive to variations in genetic material concentration and response decreasing less than by 5% in 90 days. Thus, the platforms developed here demonstrated efficient and cost-effective solutions in infection control and fills the gap of lack of diagnostic methods for the Zika virus. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior T. cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Esse protozoário, após entrar no hospedeiro vertebrado, é capaz de invadir inúmeras células nucleadas. Para isso, se utiliza de proteínas secretadas que têm atividade modulatória na infecção. A proteína P21 é secretada por T. cruzi e apresenta atividades biológicas importantes, como promover a fagocitose e a polimerização do citoesqueleto de actina nas células hospedeiras. Neste estudo, nós descobrimos outras atividades biológicas da P21. Utilizando modelo de inflamação crônica (esponja de poliéster) em murinos, demonstramos que a P21 possui atividade quimiotática, indução da produção de Interleucina-4 e fibrose e, inibição da angiogênese. Avaliamos ainda, a infecção crônica por T. cruzi comparado com a infecção por L. amazonensis, também em murinos, na presença da P21. Neste caso, a P21 foi capaz de aumentar a carga parasitaria de L. amazonensis e, de forma contrária, inibiu a replicação de T. cruzi in vivo e in vitro. Além disso, demonstramos que nos camundongos tratados com a rP21, o tecido cardíaco apresentou focos inflamatórios intensos, maior deposição de colágeno, e inibição da angiogênese. A partir disso, com o intuito de inibir a P21, nós realizamos uma série de ensaios in vitro, utilizando um peptídeo sintético (P1) ligante da proteína. Vimos que o P1 inibiu a polimerização de actina e a atividade anti-angiogênica da P21. E ainda, foi capaz de reduzir a invasão e induzir a replicação de T. cruzi em macrófagos. Portanto, a P21 apresenta importante papel no contexto da infecção por T. cruzi e pode ser um alvo em estudos terapêuticos para doença de Chagas. T. cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. This protozoan, upon entering the vertebrate host, is able to invade a wide of nucleated cells. For this, it uses secreted proteins that have modulatory activity in the infection. The P21 protein is secreted by T. cruzi and exhibits important biological activity, such as promoting phagocytosis and polymerization of the actin cytoskeleton in host cells. In this study, we discovered other biological activities of P21. Using a model of chronic inflammation (polyester sponge) in murine, we demonstrated that P21 has chemotactic activity, induction of Interleukin-4 production, fibrosis, and inhibition of angiogenesis. We also evaluated chronic T. cruzi infection compared to L. amazonensis infection, also in murine, in the presence of P21. In this case, P21 was able to increase the parasite load of L. amazonensis and, conversely, inhibited the replication of T. cruzi in vivo and in vitro. In addition, we demonstrated that in mice treated with rP21, cardiac tissue exhibited intense inflammatory foci, increased collagen deposition, and inhibition of angiogenesis. From this, in order to inhibit P21, we performed a series of in vitro assays using a synthetic peptide (P1) binding the protein. We have seen that P1 inhibited actin polymerization and the anti -angiogenic activity of P21. In addition, it was able to reduce invasion and induce replication of T. cruzi in macrophages. Therefore, P21 plays an important role in the context of T. cruzi infection and may be a target in therapeutic studies for Chagas' disease. Tese (Doutorado)

O exercício físico tem sido usado como modelo na investigação das interações metabólicas fornecendo informações essenciais sobre o controle e sinalização do metabolismo em níveis sistêmico e celular. Esse mesmo modelo pode auxiliar na formação de estratégias e metodologias para a melhora de performance de atletas de alto rendimento. Os estudos apresentados nessa tese foram desenvolvidos sob a ótica da esportômica, conceito criado num cenário em que as amostras, geralmente sangue e urina, são coletadas in loco, diretamente nos campos de competição e treinamento, simulando os desafios reais e as condições enfrentadas por atletas de elite durante as performances esportivas. A esportômica é o uso das ciências “–ômicas” em conjunto com as análises clinicas laboratoriais clássicas para entender as modificações induzidas pelo esporte. Neste trabalho serão apresentados estudos acerca das alterações metabólicas e de biomarcadores utilizando a metodologia esportômica em investigações conduzidas em protocolos de treino e competição em atletas de alto rendimento, a fim de contribuir para a melhora de seu rendimento e compreender o metabolismo sistêmico e celular. Physical exercise has been used as a model to investigate metabolic interactions providing essential information about controlling and signaling of systemic and cellular metabolism. This model can also help us to develop strategies and methods to improve the performances of elite athletes. The studies here presented have been developed from a sportomics viewpoint, a concept that proposes taking blood and urine samples direct in the field of play, mimicking the real challenges faced by elite athletes in training and competitions. Sportomics is similar to other ‘‘-omics’’ approaches combined with classic clinical laboratory analyses, allowing us to better understand the metabolic changes that are induced by exercise and sports. In this paper we will present studies about metabolic and biomarkers changes during training and competitions protocols of elite athletes, aiming on improving their performances and understanding systemic and cellular metabolism. Tese (Doutorado)

Universidade de Franca The growing exploration of nanoparticles (NPs) engineered structures that have at least one dimension between 1 and 100 nm has a wide range of applications in many fields. The aim of the present study was evaluate the cytotoxic, mutagenic and recombinogenic effects of: 1] Amorphous Zinc oxide (ZnO), used as cement in endodontic; 2] ZnO NPs (21 nm); 3] three different types of Titanium dioxide (TiO2) NPs: anatase TiO2 (5.2 nm), anatase TiO2 (9.1 nm) and rutile TiO2 (55.1 nm). The tests employed were the in vivo wing Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) in Drosophila melanogaster wings and the in vitro Cytokinesis-Block Micronucleus (CBMN) assay using Chinese hamster lung fibroblasts (V79 culture cells). D. melanogaster larvae of 72 ± 4 h, obtained from standard cross (ST) or high bioactivation cross (HB) were treated with 1.5625; 3.125; 6.25 or 12.5 mM to perform wing spot test (SMART). From both crosses, were obtained marker transheterozygous (MH) and balancer heterozygous (BH) descendants. The analysis of MH descendants showed that, for all composites, mutagenic and recombinogenic effects were observed only in HB cross. Statistically significant increase in the frequency of mutant spots was observed in individuals treated with 6.25 mM of amorphous ZnO and 12.5 mM of ZnO NPs, mainly due to induction of small single spots. The negative results observed in correspondent BH individuals, in witch is possible the detection only of mutation and chromosomal aberration, allow us to suggest that the increase in the frequency of small single spots observed in MH descendants is mainly due to recombination between flr3 and mwh loci. For TiO2 NPs, anatase of 5.2 nm was mutagenic at concentrations 1.5625 and 3.125 mM, and rutile phase of 55.1 nm significantly increased the frequency of mutant spots at all concentrations tested, except at 3.125 mM. Anatase TiO2 NPs (9.1 nm) did not cause mutagenic effects in wing of D. melanogaster neither in ST nor in HB crosses. The mutagenic effects observed in HB cross in contrast with ST cross in SMART assay can be justified possibly by the increase of metabolic activity in that cross, with an increasing production of reactive oxygen species and consequently higher DNA aggression. To determine the cell treatment for CBMN assay, several concentrations of ZnO NPs and three types of TiO2 NPs, ranging from 30.5 to 62,500.00 μM, were tested for cytotoxic activity by XTT colorimetric assay with xv V79 cells. ZnO NPs (21 nm) and anatase TiO2 NPs (5.2 and 9.1 nm) demonstrated similar cytotoxic intensity, showing decrease of V79 cell viability since concentration 224.1 μM. On the other hand, rutile TiO2 NPs (55.1 nm) cytotoxicity started later, at 7,812.00 μM. Among all NPs assessed, only ZnO (21 nm) and anatase TiO2 (5.2 nm) at highest concentration were able to induce genotoxicity in V79 cells. Both, anatase TiO2 NPs (9.1 nm) and rutile TiO2 NPs (55.1 nm) have not caused significant micronuclei increase. There are several physicochemical parameters that can influence on toxic effects of NPs, what corroborate to differences in cytotoxic and genotoxic patterns. In the experimental conditions performed in this study, we can affirm that both kinds of ZnO, as well, both, anatase and rutile phases of TiO2 NPs, were able to induce mutagenicity. Therefore, the use of these NPs should be closely monitored and its genotoxicity action mechanisms must be elucidated. A crescente exploração de nanopartículas estruturas sintetizadas artificialmente que apresentam pelo menos uma dimensão entre 1 e 100 nm está relacionada a vasta gama de aplicações em diferentes áreas. Devido às suas propriedades específicas, nanopartículas de óxido de zinco (NPs de ZnO) e nanopartículas de dióxido de titânio (NPs de TiO2) têm recebido muita atenção por causa das diversas possibilidade de utilização em produtos de consumo, principalmente em protetores solares, visto à eficácia aumentada na proteção contra luz UV e por serem menos opacas que os respectivos compostos de tamanho maior. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos citotóxicos, mutagênicos e recombinogênicos de NPs de ZnO (21 nm), ZnO comercial, e três tipos diferentes de NPs de TiO2: TiO2 anatase (5,2 nm), TiO2 anatase (9,1 nm) e TiO2 rutila (55,1 nm). O teste in vivo Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) em asa de Drosophila melanogaster e o teste do Micronúcleo com Bloqueio de Citocinese (CBMN), in vitro, utilizando fibroblastos de pulmão de hâmster Chinês (células V79) foram os escolhidos para realizar este trabalho. Larvas de 72 ± 4 h de D. melanogaster obtidas por meio do cruzamento padrão (ST) ou cruzamento de alta bioativação (HB) foram tratadas com 1,5625; 3,125; 6,25 ou 12,5 mM para o teste SMART. Para os dois tipos de compostos, ZnO e TiO2, foram observados efeitos mutagênicos apenas no cruzamento HB. Em relação ao ZnO, o comercial foi capaz de aumentar as frequências de manchas mutantes na concentração de 6,25 mM, enquanto NPs de ZnO induziram mutagenicidade na concentração mais alta. Para as NPs de TiO2, a fase anatase de 5,2 nm foi mutagênica nas concentrações 1,5625 e 3,125 mM, e a rutila de 55,1 nm aumentou de forma significativa a frequência de manchas mutantes em todas as concentrações avaliadas, exceto com 3,125 mM. NPs de anatase TiO2 (9,1 nm) não causaram efeitos mutagênicos em asas de D. melanogaster em nenhum dos cruzamentos. Os efeitos mutagênicos observados no cruzamento HB, em contraste com o cruzamento ST, no teste SMART podem ser justificados pela atividade metabólica aumentada inerente aos indivíduos HB, com aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e, consequentemente, maior dano ao DNA. Para determinar as doses utilizadas no tratamento do teste do micronúcleo, várias concentrações xiii de NPs de ZnO, e dos três tipos de NPs de TiO2, variando de 30,5 a 62.500,00 μM, foram avaliadas pelo teste colorimétrico XTT em células V79. NPs de ZnO e TiO2 anatase de 5,2 e 9,1 nm demonstraram intensidade citotóxica similar, sendo que a partir da concentração 244,1 μM foi observada significativa redução da viabilidade celular. Por outro lado, a citotoxicidade de NPs de TiO2 na fase de rutila (55,1 nm) começou mais tardiamente, a partir a concentração de 7.812,00 μM. Dentre as NPs avaliados, apenas ZnO (21 nm) e TiO2 anatase (5,2 nm) na maior concentração avaliada foram capazes de induzir genotoxicidade em células V79. As fases de TiO2 anatase (9,1 nm) e TiO2 rutila (55,1 nm) não causaram aumento significativo de micronúcleo. Existem vários aspectos fisicoquímicos que podem influenciar nos efeitos tóxicos das NPs, o que corrobora com diferenças nos resultados citotóxicos e genotóxicos. Nas condicões experimentais deste estudo, podemos afirmar que ambos os tipos de ZnO avaliados, bem como as fases anatase e rutila das NPs de TiO2 foram capazes de induzir mutagenicidade. Portanto, o uso desses nanomateriais deve ser cuidadosamente monitorado e os mecanismos de indução de genotoxicidade devem ser elucidados. Doutor em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais The purpose of this study is to evaluate the amount of transcripts from the Major Histocompatibility Complex (MHC) class I classical (BoLA-N *) and non-classical (BoLA-NC*), as well as of TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha) and TGF-β1 (Transforming Growth Factor beta 1) cytokines in bovine non-pregnant uterus, caruncles, cotyledons and blastocysts throughout the pregnancy period, in order to understand the immune and physiological mechanisms that occur in pregnancy in cows. The samples were analyzed by qPCR, the qualification (presence or absence) by conventional RT-PCR and the immune fluorescence with sheep monoclonal antibody against MHC class I. As positive control we used a sample of tissue from the bovine lymph node and/or spleen in all experimental tests. The amount of transcript BoLA-N* and BoLA-NC* was small (fold change 0 to 3) in blastocysts and cotyledons. Cotyledons transcription BoLA-NC* is greater than the transcription of BoLA-N*. Blastocysts transcription of BoLA-N* was higher than BoLA-NC*. Blastocysts transcribed more BoLA-NC2 than in cotyledons. Blastocysts not transcribed BoLA-NC4. Cotyledons transcribed BoLA-NC4 more than BoLA-NC2. The caruncles showed large amounts of transcripts (fold change 5 to 400), which were higher for pregnancy period of \"8-9\" month to BoLA-N* and one month for BoLA-NC*. Caruncles BoLA-NC2 transcription was higher than the BoLA-NC4. The uterus non pregnant had fewer transcripts BoLA-N* and BoLA-NC* than in caruncles. The uterus non pregnant no have transcripts of BoLA-NC2, but they had a small amount of transcripts of BoLA-NC4. Caruncles had large amounts of transcripts (fold change 50 to 500) of BoLA-NC2 with pregnancy age greater than one month; those are seemed to protect the fetus from rejection. TNF-α appears in greater amount in late gestation (8 and 9 months), showing the beginning of an inflammatory reaction, necessary to the adequate removal of the fetus and the placenta during delivery. Since TGF-β1 has a peak of expression in the sixth and seventh months of gestation, just when the fetus has its greatest growth, demonstrating a probable involvement of this cytokine in this phenomenon. Com o intuito de entender os mecanismos imunofisiológicos da gestação em vacas esta tese teve como objetivo avaliar a quantidade de transcritos do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) de classe I clássico (BoLA-N*) e não clássico (BoLA-NC*), bem como das citocinas TNF-α (Fator de Necrose Tumoral alfa) e TGF-β1 (Fator de Crescimento Transformador beta 1) em úteros não gestantes, carúnculas, blastocistos e cotilédones bovino durante todo o período gestacional. Utilizou-se a quantificação por qPCR, a qualificação (presença ou ausência) via RT-PCR convencional e a imunofluorescência com anticorpo primário monoclonal MHC de classe I ovino. Como controle positivo foi utilizado uma amostra de tecido de linfonodo e/ou baço bovino em todos os ensaios experimentais. A quantidade de transcrito de BoLA de classe I clássico e não clássico foi pequena (fold change variando de 0 a 3) nos blastocistos e cotilédones. Nos cotilédones a transcrição de BoLA-NC* foi maior do que a transcrição de BoLA-N*. Nos blastocistos houve maior transcrição de BoLA-N* do que de BoLA-NC*. BoLA-NC2 transcreveu mais nos blastocisto do que nos cotilédones. BoLA-NC4 não transcreveu nos blastocistos. Os cotilédones transcreveram mais BoLA-NC4 do que BoLA-NC2. As carúnculas apresentaram grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 5 a 400), que foram maiores nos períodos gestacionais de 8 a 9 para BoLA_N* e até 1 mês para BoLA-NC*. A transcrição de BoLA-NC2 foi maior do que a de BoLA-NC4 nas carúncula. O útero não gestante teve menor quantidade de transcritos de BoLA-N* e BoLA-NC* do que nas carúnculas. Não há transcrição de BoLA-NC2 no útero não gestante, mas há uma pequena quantidade de transcritos de BoLA-NC4 neste tecido. A presença de grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 50 a 500) de BoLA-NC2 nas carúnculas, com idade gestacional maior do que um mês, parece proteger o feto da rejeição. Nas carúnculas parece existir um pico de transcrição de TGF-β1 no sexto e sétimo meses de gestação, justamente quando o feto tem seu maior crescimento, sinalizando um provável envolvimento desta citocina neste fenômeno. O TNF-α surge em maior quantidade no final da gestação, tanto nas carúnculas quanto nos cotilédones, demonstrando o início de uma reação inflamatória, necessária para a adequada expulsão do concepto e da placenta durante o parto. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The use of iron perchlorate as a marker of injury in potato tubers may help preventloss of lots during storage and transport. The objectives of this study were to determine the concentration of iron perchlorate solution and the immersion time for the marking of pectolytic bacteria in potato tubers; the evaluation of potato batches for the presence of these bacteria; the biochemical, physiological and molecular characterization of Pectobacterium spp. isolates; and the indication of pectobacteria by iron perchlorate in inoculated and commercial batches of potato tubers. The experiments were done at the Universidade Federal de Uberlândia, from 2009 to 2011. Marking of pectolytic bacteria in potato tubers was done using iron perchlorate concentrations of 0, 8, 21 and 44%, in which a sample of 10 tubers were immersed for 10, 20 or 30 minutes, and evaluated after 10, 20 and 30 minutes at room temperature, evaluating the appearance dark spots on the tubers. The isolates were characterized culturally, biochemically and physiologically by the tests of: Gram, glucose fermentation, catalase, oxidase, growth at 37ºC, reduction of substances from sucrose, phosphatase activity, indol production and acid production from sorbitol, melibiose, citrate or lactose, hypersensibility reaction in tobacco and pathogenicity in potato baits. Molecular characterization was done using the primers: EXPCCR/EXPCCF; ECA1f/ECA2r, 1491f, L1RA/L1RG Br1f. The indication of pectobacteria by the product studied in inoculated seed potato tubers was done with the cultivars Ágata and Atlantic. The tubers were perforated, or not, with a needle and immersed in distilled water or in bacterial suspension (isolate UFU A14 of Pectobacterium spp.) for 5 minutes and incubated at different temperatures (22, 28 or 35°C) and times (0, 24, 48, 72 or 96 hours), and subsequently immersed in the de perchlorate solution for the evaluation of lesion diameter. The experimental design was randomized blocks with four repetitions, as split plots in space 5 x 4. The indication of pectobacteria by the product in commercial potato batches was done with cultivars Ágata and Asterix. The samples with six tubers were evaluated 12 and 24 hours after harvest and incubated in five temperatures (8, 18, 28, 38 or 48°C), and immersed in 8% iron perchlorate solution for 10 minutes, removed and left at room temperature for 20 minutes before evaluation with a rating scale, varying from 0 to 4. Immersion for 10 minutes in iron perchlorate at 21% and evaluation after 20 minutes at room temperature was adequate to indicate the presence of pectobacteria. The isolates could not be characterized biochemistry and molecular. The inoculation test was able to confirm the presence of pectobacteria in the tubers by perchlorate. Storage and transport of commercial potatoes should be done at lower temperatures; the cultivar Ágata was more susceptible than Asterix to the pectobacteria. O uso de percloreto de ferro como sinalizador de injúrias em tubérculos de batata poderá ajudar evitando perdas de lotes durante o armazenamento e transporte. Os objetivos do trabalho foram determinar a concentração da solução de percloreto de ferro e tempo de imersão para a sinalização de bactérias pectolíticas em tubérculos de batata; a qualificação de lotes de batata quanto à presença destas bactérias; a caracterização bioquímica, fisiológica e molecular de isolados de Pectobacterium spp. e indicação de pectobactérias por percloreto de ferro em tubérculos de batata inoculados e lotes comerciais. Os experimentos foram conduzidos na Universidade Federal de Uberlândia, entre os anos de 2009 e 2011. Para a sinalização de bactérias pectolíticas em tubérculos de batata, foram utilizadas as concentrações 0,0; 8,4; 21,0 e 44,0% de percloreto de ferro, em que amostras de 10 tubérculos ficaram imersas por 10, 20 e 30 minutos. Em seguida, avaliou-se, aos 10, 20 e 30 minutos e em temperatura ambiente, o surgimento de manchas escuras nos tubérculos. Os isolados foram caracterizados cultural, bioquímica e fisiologicamente pelos testes: Gram, fermentação de glicose, catalase, oxidase, crescimento à 37ºC, redução de substâncias a partir de sacarose, atividade da fosfatase, produção de indol e produção de ácido a partir de sorbitol, melibiose, citrato e lactose, reação de hipersensibilidade em fumo e patogenicidade em isca de batata. Para a caracterização molecular, foram utilizados os primers: EXPCCR/EXPCCF; ECA1f/ECA2r, 1491f, L1RA/L1RG Br1f. Para a indicação de pectobactérias pelo produto estudado em tubérculos de batata-semente inoculados, utilizou-se as cvs. Ágata e Atlantic. Os tubérculos foram perfurados e não perfurados com estilete e imersos em água destilada ou na suspensão bacteriana (isolado UFU A14 de Pectobacterium spp.) por 5 minutos e incubados em diferentes temperaturas (22°C, 28°C e 35°C) e tempos (0, 24, 48, 72 e 96 horas); em seguida, imersos em solução de percloreto de ferro com avaliação do diâmetro da lesão formada. O delineamento foi em blocos casualizados com quatro repetições, em esquema de parcelas subdivididas no espaço 5 x 4. Para a indicação de pectobactérias pelo produto em lotes comerciais de batata, foram utilizadas as cultivares Ágata e Asterix. As amostras com seis tubérculos foram avaliadas as 12 e 24 horas após a coleta e incubadas em cinco temperaturas (8°C, 18°C, 28°C, 38°C e 48°C), em seguida, foram imersas por 10 minutos na solução de percloreto de ferro a 8%, retiradas e deixadas em temperatura ambiente por 20 minutos para avaliação através de uma escala de notas variando de 0 a 4. Os tubérculos de batatas foram imersos por 10 minutos na solução de percloreto de ferro 21% e avaliados após 20 minutos no ambiente o que foi suficiente para indicar a presença de fitobactérias. Os isolados não puderam ser caracterizados bioquimica e molecularmente. O teste de inoculação conseguiu comprovar a presença de pectobactérias nos tubérculos pelo percloreto de ferro. Para os lotes comerciais, as menores temperaturas são mais indicadas para o armazenamento e transporte, e a cv. Ágata foi mais suscetível que Asterix. Doutor em Agronomia

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Although human rhinoviruses (HRV) have been shown to cause common cold, they are increasingly found in severe respiratory infections. Whether or not disease severity may be increased by the presence of a second virus or comorbidities was investigated, such as the HRV frequency. By using IFA and/or RT-PCR we tested 434 nasopharyngeal aspirates from children less than five years old presenting acute respiratory disease for presence of HRV, respiratory syncytial virus (RSV), influenza virus, parainfluenza virus, adenovirus and human metapneumovirus. HRV was characterized through VP4 genome analysis. Thus, at least one virus was detected in 384 samples and HRV was detected in 181 (41.7%) samples: in 107 as the single agent and in 74 with another virus. Moderate-to-severe cases rose significantly in co-infections (p=0.0070). However, RSV, which causes severe disease, was found in 32 co-infections. By removing these cases, moderate-to-severe cases in co-infections reduced to 35.7% (15/42), which is similar to the frequency found in single infections. Similar results was observed according to symptoms, in which URT involvement predominated in HRV single infections. Nevertheless, HRV was responsible for a considerable number of bronchiolitis and wheezing symptoms. Presence of comorbidities, specially early age, prematurity and congenital heart diseases, in single infections rose from 46.6% (34/73) in mild cases to 79.4% (27/34) in moderate-to-severe cases (p=0.0014). From 42 characterized HRV species, HRV-A and HRV-C presented similar proportions (21 and 19, respectively) with no difference of clinical severity. Two enterovirus, poliovirus and echovirus, were also identified. Despite HRV was related mostly with mild symptoms, our results showed that HRV were a very frequent respiratory agent found in many moderate-to-severe cases. The presence of another virus, except for RSV, may not be associated with increased disease severity, which may rather be caused by presence of comorbidities and by the HRV infection itself. We also did not found relation of increasing disease severity according to specie. Finally, we call attention for the possibility of enterovirus detection in RT-PCR HRV investigation, emphasizing the importance of molecular characterization of HRV. Further efforts must be done in attempt to include breast feeding and atopic diseases in parents to accurately evaluate other risk factors of developing severe respiratory disease by HRV infections, and include more samples in the molecular characterization of these agents. Apesar dos rinovírus humanos (HRV) serem mais relacionados com resfriado comum, esses agentes também estão associados com infecções respiratórias graves. Os possíveis fatores que levariam ao agravamento das doenças respiratórias pelos HRV foram investigados neste estudo, assim como a frequência desses vírus. A IFI e/ou RT-PCR foram utilizadas para testar 434 aspirados de nasofaringe de crianças menores de cinco anos de idade para identificar a presença do HRV, juntamente com vírus respiratório sincicial (VRS), vírus influenza, vírus parainfluenza, adenovírus e metapneumovirus. As espécies dos HRV foram identificadas através da análise da região genômica VP4. Pelo menos um vírus foi detectado em 383 amostras, sendo o HRV identificado em 181 (41,7%) amostras: 107 como único agente e 74 em co-infecções. A proporção de infecções moderadas a graves em relação às brandas, em infecções simples, aumentou comparando-se com co-infecções (p=0,0070). Entretanto, o VRS é reconhecidamente um agente causador de doenças respiratórias graves em crianças, sendo encontrado em 32 co-infecções com os HRV. Removendo esses casos, as infecções moderadas a graves foram reduzidas para 35,7% (15/42), o que foi similar com a frequência encontrada em infecções simples pelos HRV. Resultados similares foram observados para os tipos de sintomas, onde para os HRV predominou sintomas do TRS, embora houvesse um número significativo de casos de bronquiolite, pneumonia e bronquite sibilante. A presença de fatores de risco, incluindo tenra idade, prematuridade, doenças respiratórias não infecciosas e principalmente doenças congênitas cardíacas em infecções simples, aumentou de 46,6% (34/73) em casos brandos para 79,4% (27/34) em infecções moderadas a graves em infecções simples pelos HRV (p=0,0014). Das 42 espécies identificadas, os HRV A e C apresentaram proporções e gravidade clínica similares. Dois enterovírus, um poliovírus e um echovírus, também foram identificados. Nossos resultados mostraram que apesar dos HRV estarem relacionados principalmente com casos de doença branda, esses vírus foram muito frequentes e relacionados com uma quantidade significativa de casos moderados a graves em infecções simples. A presença de um segundo vírus respiratório, com exceção do VRS, pode não estar associada com um aumento da gravidade clínica, o que pode estar mais relacionado presença de fatores de risco. Em adição, não foi constatado maior gravidade dos sintomas pelo HRV relacionado à espécie. Chamamos a atenção para a possibilidade de detecção de enterovírus através do uso da RT-PCR, enfatizando a importância da caracterização molecular dos HRV. Futuramente, outros fatores de risco poderiam ser incluídos para avaliação mais detalhada das causas do paciente que poderiam levar a doenças mais graves frente a infecções pelos HRV, além de ampliar o estudo de caracterização molecular desses vírus através do aumento do número de amostras sequenciadas. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais The host-pathogen interactions of C. jejuni is a little explored subject in birds and humans. Thus, this study aimed to evaluate the passage and the effects of virulent strain of C. jejuni IAL 2383 in SPF embryos of birds, the expression of cytokines and morphological changes in SPF birds explants ileum infected with C. jejuni and verify the cytoskeleton and lysosomes participation in the processes of invasion and internalization of C. jejuni in Caco-2 cells and the cellular response by quantifying the expression of inflammatory cytokines. The experiment with eggs and embryos indicated that C. jejuni passes through the pores of the eggs, colonizes the vitellus and lead to high early embryonic mortality and increase the embryos enterocytes dimensions. In avian explants, the bacteria invades, increases the size of enterocytes and induces the expression of TGF-β3 and early IL-1β with 4hours of infection. The invasion process in Caco-2 cells is dependent on actin microfilaments and tubulin and to internalize the bacteria fused with lysosomes. The cellular response is the distention and cell expression of IL-8, a potent pro-inflammatory cytokine. These results indicate that C. jejuni is not just a commensal in birds. In addition, this microorganism invasion in Caco-2 cells is dependent on actin and tubulin and internalization leads to fusion with lysosomes, which causes bacterial degradation by inducing the production of inflammatory cytokines and cell strain. A interação patógeno-hospedeiro de C. jejuni é um assunto ainda pouco explorado em aves e humanos. Assim esse trabalho objetivou avaliar a habilidade de C. jejuni penetrar e colonizar ovos de aves e os efeitos da cepa virulenta de C. jejuni IAL 2383 em embriões de aves SPF; também foram avaliadas a quantificação de transcritos de citocinas e alterações morfométricas em explants de íleo de aves SPF infectados, a participação do citoesqueleto e dos lisossomos nos processos de invasão e internalização de C. jejuni em células Caco-2 e a resposta celular pela quantificação de transcritos de citocinas inflamatórias. O experimento com ovos e embriões indicou que C. jejuni é capaz de passar pelos poros dos ovos, colonizar o vitelo e levar a alta mortalidade embrionária precoce aumentando as dimensões dos enterócitos de embriões. Em explants de aves, a bactéria é capaz de invadir, aumentar o tamanho dos enterócitos e induzir a expressão de transcritos de TGF-β3 precocemente e IL-1β com 4horas de infecção. O processo de invasão em Caco-2 é dependente dos microfilamentos de actina e tubulina e ao se internalizar a bactéria se funde com lisossomos. A resposta celular a essa invasão é a distensão celular e a expressão de transcritos de IL-8 que é uma citocina pró inflamatória. Esses resultados indicam que C. jejuni não é apenas um microorganismo comensal em aves. Além disso, a invasão desse microorganismo em células Caco-2 é dependente de actina e tubulina e a internalização leva a fusão com lisossomos, o que provoca a degradação bacteriana induzindo a produção de citocinas inflamatórias e distensão celular. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

In bees, juvenile hormone (JH) is a important factor in determining castes and also has a role in age polyethism. The first steps in the synthesis of JH are known as mevalonate pathway. In this pathway are present, among others, the 3-hydroxy-3- methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) and farnesoic acid O-methyltransferase (FAMeT) enzymes. Thereafter, in insects occur successive reactions that culminate in JH-III production, in which the last reaction is catalyzed by the methylfarnesoate epoxidase (MFE). There is evidence that JH production is related both to the expression profile of these enzymes - in terms of mRNA production - and enzymatic activities. In this study, we analyzed the hmgr and mfe genes in different tissues, stages and castes of Melipona scutellaris. We also analyzed famet gene in larvae and adults of this species. Our results indicate that HMGR and MFE enzymes, in M. scutellaris, are probably involved in the synthesis of JH. Moreover, the MFE is a candidate for the rate limiting enzyme of this pathway. The FAMeT enzyme shows no evidence of relation to the synthesis of JH. Our results also suggest an inter-regulation between JH and ecdysteroids in M. scutellaris. Em abelhas sem ferrão do gênero Melipona, nas quais a diferenciação de castas não depende somente da quantidade e/ou qualidade do alimento larval, o Hormônio Juvenil (HJ) tem sido apresentado como agente responsável, juntamente com fatores ambientais, por mecanismos genéticos que promovem as diferenças casta específicas. Na via de biossíntese do HJ as enzimas 3-Hidroxi- 3-metilglutaril-CoA redutase (HMGR), O-metil transferase do ácido farnesóico (FAMeT) e metil-farnesoate epoxidase do hormônio juvenil (MFE) catalisam reações que culminam na produção do HJ-III. Nesse trabalho, foi analisada a expressão dos transcritos dos genes hmgr e mfe em diferentes tecidos, fases de desenvolvimento e castas de M. scutellaris, além da expressão dos transcritos do gene famet em larvas e adultos da mesma espécie. Nossos resultados indicam que as enzimas HMGR e MFE, em Melipona scutellaris estão envolvidas na síntese de HJ, sendo a MFE candidata à enzima limitante dessa via. A enzima FAMeT parece não ser enzima chave na via de síntese do HJ, pela análise dos transcritos gênicos aqui realizada. Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais CHAPTER II: In Brazil the Tocantins' State has three biomes, savannah, Amazon forest and caatinga, beyond transitional regions between them. These biomes harbor a diversity of species including several pollinators as bees. With the phenomenon of Colony Collapse Disorder (CCD), researchers worldwide are seeking an answer to the high mortality of bees and they claim that viruses could be as one of them. We are looking for seven viruses in the State by RT-PCR. Our analysis confirmed the presence of two viruses ABPV and DWV, showing that the northern region is already contaminated and prophylactic measures should be taken by beekeepers to avoid significant losses as occurred in the United States and Europe. CHAPTER III: Insects are a group extremely successful over time, due including their highly developed innate immune system and have colonized all the terrestrial habitats. In this study, we characterized and quantified transcripts by real-time PCR of the AmToll-1 gene in bees infected with deformed wing virus (DWV) and co-infected with acute bee paralysis virus (ABPV) and DWV. The analysis "in silico" showed that this gene has domain leucine-rich typical of Toll receptor. The quantification of transcripts of Toll gene revealed increased their expression significantly in individuals with co-infection. These data show that viral co-infection can modulate levels of gene transcripts AmToll-1. CHAPTER IV: Several tools are used to identify and quantify the different pathogens that attack the bees. We evaluated gene expression in infected bees with deformed wing virus (DWV) and bees co-infected with acute bee paralysis virus (ABPV) by analyzing two-dimensional gel SDS-PAGE. The preliminary results showed that there was a change in protein profile when compared to uninfected bees, with an increase of transcripts between bee infected and co-infected by the virus. CAPITULO 2: O Estado do Tocantins apresenta três biomas, cerrado, floresta Amazônia e caatinga, além de regiões de transição entre eles, abrigando uma diversidade de espécies incluindo vários polinizadores como as abelhas. Com o fenômeno da Colony Collapse Disorder (CCD), pesquisadores em todo mundo buscam uma resposta para a grande mortalidade das abelhas, colocando os vírus como uma delas. Detectamos a presença de sete vírus no Estado do Tocantins através de RT-PCR. Nossa análise confirmou a presença de dois vírus, Vírus da paralisia aguda (ABPV) e da Asa deformada (DWV) mostrando que a região norte já se encontra contaminada e medidas profiláticas devem ser tomadas pelos apicultores a fim de evitar perdas significativas como ocorreu nos Estados Unidos e Europa. RESUMO 3: Os insetos, que compõem um grupo extremamente bem sucedido devido ao seu sistema imune inato altamente elaborado, têm colonizado todos os habitats terrestres. Nesse trabalho caracterizamos e quantificamos transcritos por PCR em tempo real do gene AmToll-1 em abelhas infectadas pelo vírus da Asa deformada (DWV) e co-infectadas com o vírus da Paralisia aguda (ABPV) e DWV. As análises in silico mostraram que esse gene possui domínio rico em leucina, típico de receptor Toll. O filograma mostrou formação de agrupamentos entre os Hymenoptera e Diptera. A quantificação de transcrito revelou que esse gene é significativamente mais expresso nos indivíduos com co-infecção, mostrando que co-infecção viral modula os níveis de transcritos do gene AmToll-1. CAPITULO 4: Várias metodologias são utilizadas para identificar e quantificar os diferentes patógenos que acometem as abelhas. Avaliamos por meio da análise por gel bidimensional SDS-PAGE, a expressão de proteínas em abelhas infectadas com o vírus da asa deformada (DWV) e co-infectadas com o vírus da paralisia aguda (ABPV). Os resultados preliminares mostraram que houve alteração no perfil protéico quando comparadas abelhas não infectadas e infectadas, com aumento de transcritos nas infectadas e co-infectadas pelos vírus. Doutor em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Leprosy is a spectral disease caused by Mycobacterium leprae, whose clinical and laboratory diagnosis is performed by means of sputum smear techniques of low sensitivity and specificity, they do not detect the bacilli in paucibacillary (PB). In the present study were tested by qPCR molecular markers, in order to assist the diagnosis of disease, mainly in the form PB. The total DNA of skin lesion biopsy was taken from 185 treatment-naïve patients. The qPCR was performed using primer pairs for amplification of the sequence ML0024 and 85B of the genome of the bacillus. Both markers were highly specific. Detection of DNA of the bacillus by qPCR and qPCR ML0024 85B was 59.45% (110/185) and 57.29% (106/085), respectively, while the bacterial index (BI) smear and dermal skin lesion detected, respectively, the presence of the bacillus in 45.94% (85/185) and 44.86% (83/185) of cases. Among all cases negative for the IB dermal smear, the qPCR and qPCR ML0024 85B detected the presence of the bacillus DNA in 26.00% (26/100) and 23.00% (23/100), respectively. Among those negative for the IB skin lesions, the ML0024 qPCR was positive in 27.45% (28/102) and qPCR 85B in 23.52% (24/102). There was significant difference between positive molecular tests and two tests bacilloscopic (p

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Several physiological changes occur in parasitized hosts to promote the development of immature parasitoids. The objective of this work was to evaluate the cellular defense of the alternative host pupae, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) parasitized by Palmistichus elaeisis Delvare & LaSalle or Trichospilus diatraeae Cherian & Margabandhu (Hymenoptera: Eulophidae). Three situations were used to assess changes in the immune system of A. gemmatalis: 1) Effect of densities of parasitoid per pupa, 2) Parasitoid age effect on alternative host cellular defense 3) Host age effect on the ability of parasitoids to suppress the host cellular defense. In evaluating the effect of the density of parasitoids, the total number of hemocytes and encapsulation were lower with increasing the number of parasitoids per pupa, due to lower number of circulating plasmatocytes and granulocytes in the hemolymph of A. gemmatalis pupae, and parasitized pupae by P. elaeisis showed greater reduction of hemocytes than the parasitized by T. diatraeae. In evaluating the parasitoid age effect, the increasing parasitoids age promoted the absorption of oocytes formed. However, this absorption did not suggest a quantitatively or qualitatively reduction in possible substances from the ovary of female parasitoids that could be involved in host immune suppression. The total number of hemocytes in the hemolymph of A. gemmatalis reduced after parasitism by 24 or 48 hours old T. diatraeae. A similar phenomenon occurred in pupae of A. gemmatalis after parasitism by 72 or 96 hours old P. elaeisis. The number of circulating granulocytes in A. gemmatalis pupae only reduced after being parasitized by 24 hours old T. diatraeae or by 72 or 96 hours old P. elaeisis. However, the number of plasmatocytes in A. gemmatalis pupae reduced with 24 or 48 hours old T. diatraeae. The largest reduction occurred in plasmatocytes in pupae parasitized by 72 and 96 hours old P. elaeisis. The encapsulation of parasitized or not parasitized A. gemmatalis pupae was similar regardless of age of T. diatraeae or P. elaeisis. In the evaluation of host age, parasitized 24 hours old pupae had fewer granulocytes in relation to unparasitized pupae by T. diatraeae and a smaller reduction of plasmatocytes. The number of plasmatocytes in parasitized 48 hours old pupae was lower than those unparasitized by T. diatraeae. The encapsulation in 24 hours old pupae after parasitism by P. elaeisis was lower only than the unparasitized 48 hours old pupae. Moreover, 24 hours old pupae after parasitism by T. diatraeae showed lower encapsulation that parasitized and not parasitized 48 hours old pupae. The results indicate that both species P. elaesisis and T. diatraeae affect the number of hemocytes from the host A. gemmatalis. These results may contribute to understanding the interactions between parasitoid-host, enabling the optimization of mass production of natural enemies to control insect pests in biological control programs. Diversas alterações fisiológicas ocorrem em hospedeiros parasitados para favorecer o desenvolvimento de formas imaturas de parasitóides. O objetivo do trabalho foi avaliar a defesa celular de pupas do hospedeiro alternativo, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) parasitadas por Palmistichus elaeisis Delvare & LaSalle ou Trichospilus diatraeae Cherian & Margabandhu (Hymenoptera: Eulophidae). Três situações distintas foram utilizadas para avaliar as alterações no sistema imunológico de A. gemmatalis: 1) Diferentes densidades de parasitóides/pupa; 2) Diferentes idades dos parasitóides; 3) Diferentes idades do hospedeiro. Na avaliação do efeito da densidade de parasitóides, o número total de hemócitos e a encapsulação foram menores com o aumento do número de parasitóides por pupa, devido ao menor número de granulócitos e de plasmatócitos circulantes na hemolinfa de pupas de A. gemmatalis, sendo que pupas parasitadas por P. elaesis apresentaram maior redução de hemócitos que às parasitadas por T. diatraeae. Na avaliação do efeito da idade dos parasitóides, o aumento da idade dos parasitóides promoveu a absorção dos ovócitos formados. No entanto, essa absorção não sugeriu uma redução quantitativa e/ou qualitativa de possíveis substâncias presentes no ovário de fêmeas dos parasitóides que poderiam estar envolvidos na supressão da imunidade do hospedeiro. O número total de hemócitos na hemolinfa de A. gemmatalis reduziu após o parasitismo por T. diatraeae com 24 ou 48 horas de idade. Fato semelhante ocorreu em pupas de A. gemmatalis após o parasitismo por P. elaeisis com 72 ou 96 horas de idade. O número de granulócitos circulantes em pupas de A. gemmatalis somente reduziu após serem parasitadas por T. diatraeae com 24 horas de idade ou por P. elaeisis com 72 ou 96 horas de idade. No entanto, o número de plasmatócitos reduziu pelo parasitismo de T. diatraeae com 24 ou 48 horas de idade. A maior redução de plasmatócitos ocorreu em pupas parasitadas por P. elaeisis com 72 e 96 horas de idade. A encapsulação de A. gemmatalis foi semelhante em pupas parasitadas ou não independentemente da idade de T. diatraeae ou de P. elaeisis. Na avaliação da idade do hospedeiro, pupas com 24 horas parasitadas por T. diatraeae tiveram menor número de granulócitos em relação às pupas não parasitadas e menor redução de plasmatócitos também em pupas com essa idade. O número de plasmatócitos em pupas com 48 horas parasitadas por T. diatraeae foi menor que às não parasitadas nesta mesma idade. A encapsulação de pupas com 24 horas parasitadas por P. elaeisis foi menor somente que às não parasitadas com 48 horas. Por outro lado, pupas parasitadas com 24 horas por T. diatraeae tiveram menor encapsulação que pupas parasitadas e não parasitadas com 48 horas. Os resultados indicam que os parasitóides P. elaesisis e T. diatraeae afetam o número de hemócitos do hospedeiro A. gemmatalis. Esses resultados podem contribuir para o melhor entendimento das interações entre parasitóide-hospedeiro, possibilitando otimizar a produção massal de inimigos naturais para o controle de insetos-praga em programas de controle biológico.

Centro Universitário de Patos de Minas This study investigated the genotoxicity of Lapachol (LAP) evaluated by wing spot test of Drosophila melanogaster in the descendants from standard (ST) and high bioactivation (HB) crosses. This assay detects the loss of heterozygosity of marker genes expressed phenotypically on the fly s wings. Drosophila has extensive genetic homology to mammals, which makes it a suitable model organism for genotoxic investigations. Larvae of three days were used, resulting from ST cross (females flr3 /TM3, Bds x males mwh/mwh), with basal levels of the cytochrome P450 and larvae of high metabolic bioactivity capacity (HB cross) (females ORR; flr3/ TM3, Bds x males mwh/mwh). The results showed that LAP is a promutagen, exhibiting genotoxic activity in larvae from the HB cross, in other words, there is an increase in the frequency of spots occurring only in individuals with a high level of the cytochrome P450. Results also indicate that recombinogenicity is the main genotoxic event induced by LAP. As naftoquinonas possuem um grande histórico de investigação no desenvolvimento de possíveis drogas, com um amplo espectro de aplicações em diversas patologias humanas. Dentre as naftoquinas, temos a β-lapachona que atualmente tem chamado bastante atenção dos cientistas para a possível aplicação deste fármaco no combate ao câncer. Atualmente, existem quimioterápicos, utilizados no tratamento de pacientes com câncer, que trazem como efeitos colaterais a geração de radicais livres. Exemplo disso é o cloridrato de doxorrubicina (DXR). Em função do possível uso associado de agentes quimioterápicos e β-lapachona, utilizou-se o teste da mancha da asa em Drosophila melanogaster (Somatic Mutation And Recombination Test SMART) para avaliar os possíveis efeitos genotóxicos e/ou antigenotóxicos da β-lapachona nas concentrações (20, 40 e 60 μg/mL) isoladamente ou associada a DXR (0,125mg/mL). Foram utilizadas larvas de três dias de idade, resultantes dos cruzamentos padrão (ST) (fêmeas flr3 /TM3, Bds x machos mwh/mwh) e de alta capacidade de bioativação metabólica (HB) (fêmeas ORR; flr3 / TM3, Bds x machos mwh/mwh). Os resultados obtidos demonstraram que não houve aumento, estatisticamente significativo, nas freqüências de manchas mutantes, em ambos os descendentes do cruzamento ST e HB, quando se compara o controle negativo com a β-lapachona (P > 0,05). Por outro lado, quando a β- lapachona foi associada com a DXR houve uma significativa redução nas freqüências de manchas, nos descendentes do cruzamento padrão, em todas as concentrações testadas. Nos descendentes do cruzamento de alta bioativação tratados com a associação com DXR, esta redução das manchas mutantes ocorreu somente na maior concentração da -lapachona (60μg/mL) (P

Leprosy is an important health problem in Brazil, with a high detection rate despite the application of the multidrug therapy. The nasal mucosa is considered the preferential site of entry and exit of the Mycobacterium leprae, although some lesions have been found in the buccal mucosa. However, the buccal mucosa involvement in bacilli transmission has never been investigated. We have shown the presence of the M. leprae DNA in buccal swabs of leprosy patients (334) and household contacts (1288) through conventional polymerase chain reaction (PCR), and results were correlated with clinical and other laboratorial evaluations. The overall positivity for patients was 18.26%, divided into 12.03% and 21.23% for paucibacillary and multibacillary forms, respectively. Among contacts, the positivity reached 6.83%, which were considered either as healthy carriers or sub-clinically infected, when the ELISA test presented a positive anti-PGL-1 result. This study showed important evidences that the buccal mucosa may be a secondary site of M. leprae transmission and infection. Furthermore, contacts with positive PCR may be actively involved in the transmission. Our findings have great epidemiological relevance, especially for the leprosy control programs and for the dentistry clinics, and must be considered in the new strategies of control and prevention. A hanseníase é um importante problema de saúde pública no Brasil, com elevada taxa de detecção, apesar da aplicação da poliquimioterapia. A mucosa nasal é considerada o local preferencial de entrada e saída do Mycobacterium leprae, embora algumas lesões tenham sido encontradas na mucosa bucal. No entanto, o envolvimento da mucosa oral na transmissão do bacilo nunca foi investigado. Nós mostramos a presença do DNA do M. leprae em swab bucal de pacientes com hanseníase (334) e contatos domiciliares (1288) por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, e os resultados foram correlacionados com outras avaliações clínica e laboratorial. A positividade geral de pacientes foi de 18,26%, dividida em 12,03% e 21,23% para as formas paucibacilares e multibacilares, respectivamente. Entre os contatos, a positividade alcançou 6,83%, que foram considerados como portadores sadios ou infectados subclínicos, quando o teste ELISA anti-PGL-1 apresentou resultado positivo. Este estudo mostrou evidências importantes de que a mucosa bucal pode ser um sítio secundário de infecção e transmissão do M. leprae. Além disso, contatos com PCR positivo podem estar envolvidos ativamente na transmissão. Nossos resultados têm grande relevância epidemiológica, especialmente para os programas de controle da hanseníase e para as clínicas de odontologia, e devem ser considerados em novas estratégias de controle e prevenção. Mestre em Ciências da Saúde