Search

Karaciğer kanseri en sık rastlanan birincil kanserlerden olup, yılda 600.000 civarında ölüme sebep olmaktadır. Şu andaki en etkili tedavi yöntemi karaciğer transplantasyonudur ve tümör ablasyon yöntemi sadece tümör yeterince küçük ise uygulanabilmektedir. Kanserli hücreler kemoterapi ve radyoterapi gibi yöntemlere oldukça dayanıklıdırlar. Dahası, karaciğer kanseri sürekli siroz üzerine geliştiği için karaciğerin diğer hepatik fonksiyonlarını yerine getirmesini de engellediği için, sitotoksik ajanlar kullanmak oldukça tehlikelidir. Bu nedenle karaciğer kanserini yenmek için daha yeni ve geçerli terapatik yöntemlere ihtiyac duyulmaktadır.Bizim amacımiz karaciğer kanserinde yeni hedeflenebilir genleri keşfetmektir. Başka bir değişle, biz bu çalışma ile karaciğer kanserinde yeni hedefler ve yeni mekanizmalar keşfederek bunları potansiyel terapötik hedefler olarak kullanmayı amaçladık.Tez çalışmalarım sırasında, yeni hedefler ve yeni mekanizmalar keşfetmek için değişik yöntemler kullanmaya çalıştım:1-Karaciğer kanserinde kanonik Wnt sinyallenme yolağının rolü: karaciğer kanserı hücrelerini hepatosit spesifik, epitel ve mezenkimal markörler kullanarak ?iyi diferansiye? ve ?kötü diferansiye? hücre hatları olarak iki gruba ayırdık. Kötü diferansiye hücre hatlarında epitel ve hepatosit spesifik markörlerin negatif hale geldiğini, mezenkimal markörleri anlatmaya başladığını gösterdik. Wnt sinyal yolağında görev alan 45 genin, gen anlatım seviyelerini iki grupta inceledik. 6 Frizzled almaç geninin ve wnt3 ligandının her iki grupta da anlatıldığını gösterdik. Kanonik Wnt ligandı wnt8b`nin sadece iyi diferansiye grupta anlatıldığını ve Wnt4, Wnt5a, Wnt5b and Wnt7b gibi kanonik olmayan ligandların kötü diferansiye gruba spesifik olduğunu gösterdik. Kanonik Wnt sinyallenmesinin sadece iyi diferansiye hücrelerde seçici olarak aktif olduğunu değil, aynı zamanda kötü diferansiye tümörlerde de baskılandığını gösterdik. Kanonik olmayan hücre hattı, Snu449 da mutant beta-kateninin ektopik anlatımının TCF aktivitesini arttıramaması bu gruptaki hücrelerde baskılayıcı bir mekanizma olduğuna işaret etti. Kanonik olmayan wnt5a genini aday olarak test ettik. Wnt5a geninin mutant beta-kateninin aktive ettiği TCF aktivitesini baskıladığını gösterdik. Bazı kanser tiplerinde, APC, Axin ve beta-katenin gibi genlerde oluşan mutasyonlarla Wnt-beta-katenin sinyallenmesinin, Wnt ligandlarının olmadığı ortamda anormal olarak aktifleşip, beta-kateninin sitoplazma ve çekirdekte birikmesine sebep olup hedef genlerin aktivasyonuna yol açtığı biliniyor. Bu nedenle beta-kateninin hücre zarı, sitoplazma ve çekirdekteki fraksiyonlarını tanıyabilen monoklonal antikorlar üretip, bu antikorları kanserli dokularda test ederek klinik değerlerini karakterize ettik.2-Kinaz ve fosfataz genlerini potansiyel terapatik hedef olarak sistematik olarak taranması: Karaciğer kanserinde değişik sinyallenme yolaklarının aktif hale geldiği ve bu hastalarda multikinaz inhibitorü olan sorafenib ilacının, ileri derece hastaların ömürlerini uzattığı biliniyor. Bu amaçla yeni hedefler bulmak ve hücre yaşlanması indüklenmesi yönünde terapatik hedef gösterebilmek için çok fazla sayıda kinaz ve fosfatazları hedef alan RNA müdehalesi yöntemi ile tarama gerçekleştirdik. Toplamda 7 kinaz ve 5 fosfataz genini güçlü adaylar olarak gösterildi.3-Seçilen epigenetik hedeflerin potansiyel terapötik hedef olarak taranması: Yakın dönemde yapılan çalışmalar, hücre yaşlanması ve bundan kaçışın kromatin üzerindeki epigenetik değişiklikler ile düzenlendiğini gösterdi. Bu amaçla hücre yaşlanması ve bundan kaçış ile uyumlu histon asetillenmesi ve metillenmesi değişiklikleri tanımladık, bundan sorumlu histon enzimlerini bulup, bunları ?hücre yaşlanması öncüleyici? hedefler (kanserli hücreleri hücre yaşlanmasına götüren) olarak göstermeyi hedefledik. ATAD2 genini epigenetik hedef olarak tanımlayıp, karaciğer kanserinde normal hepatositlere göre daha fazla gen ifadesi olduğunu gösterdik. ATAD2 proteinin öncü-neoplastik ve ilk aşama karaciğer kanserlerine göre ileri aşama kanserlerde kademeli artış olduğu gösterildi. Kanserli hücrelerde siRNA tekniği kullanarak, ATAD2 proteinini azaltıp ve buna bağlı global histon asetillenmesinin arttığını, hücre çoğalmasının azaldığını, hücreleri apoptoza götürdüğünü ve MRC5 akciğer fibroblastlarında ise hücre yaşlanmasını indüklediğini gösterdik. ATAD2 geninin potansiyel artırıcı (östrojen, androjen ve myc hedefleri üzerinde) etkisinden dolayı karaciğer kanserinde aday terapötik hedef olduğunu işaret etmektedir. Hepatocellular carcinoma (HCC) kills nearly 600.000 people each year and the only effective therapy for this cancer is liver transplantation or tumor ablation only when the tumor is small enough. These tumors are surprisingly resistant to conventional therapies such as chemotherapy and radiotherapy. Moreover, as HCC is almost always associated with cirrhosis, the treatment with cytotoxic agents is dangerous as they will also affect hepatic functions of the diseased liver. Therefore, there is urgent need to find novel therapeutic approaches against HCC in order to diminish death toll. Our overall goal is to discover ?druggable target genes? in HCC. In other words, we wish to identify novel genes and novel mechanisms involved in these cancers in order to use them as potential therapeutic targets.During my thesis work, I developed different approaches to find new mechanisms and novel targets:1- Deciphering the role of canonical Wnt signaling in HCC: We classified human HCC cell lines into `well-differentiated` and `poorly differentiated` subtypes, based on the expression of hepatocyte lineage, epithelial and mesenchymal markers. Poorly differentiated cell lines lost epithelial and hepatocyte lineage markers, and overexpressed mesenchymal markers. Also, they were highly motile and invasive. We compared the expression of 45 Wnt pathway genes between two subtypes. Likewise, six Frizzled receptors, and canonical Wnt3 ligand were expressed in both subtypes. In contrast, canonical ligand Wnt8b and noncanonical ligands Wnt4, Wnt5a, Wnt5b and Wnt7b were expressed selectively in well- and poorly differentiated cell lines, respectively. Canonical Wnt signaling activity, as tested by a TCF reporter assay was detected in 80% of well-differentiated, contrary to 14% of poorly differentiated cell lines. TCF activity generated by ectopic mutant b-catenin was weak in poorly differentiated SNU449 cell line, suggesting a repressive mechanism. We tested Wnt5a as a candidate antagonist. It strongly inhibited canonical Wnt signaling that is activated by mutant b-catenin in HCC cell lines.2. Systematic screening of protein kinases and phosphatases as potential therapeutic targets: There is evidence of aberrant activation of several signaling cascades in HCC, and a multikinase inhibitor, sorafenib, has shown survival benefits in patients with advanced HCC. We used siRNAs to screen a large number of kinases and phosphatases to identify related genes involved in HCC cell survival. A total of 7 kinases and 5 phosphatases were identified as strong candidate targets.3-Screening of a set of selected epigenetic regulators as potential therapeutic targets: Recent studies have indicated that senescence arrest or senescence escape could be regulated by epigenetic changes on chromatin. We wanted to identify key histone methylation and acetylation changes associated with senescence or senescence escape, and select key histone modifying enzymes, as potential targets for ?pro-senescence? interventions (therapeutic interventions that allow senescence induction in cancer cells). We identified ATAD2 as an epigenetic target, and found ATAD2 gene overexpressed in HCC compared to normal liver. We also found a stepwise increase of ATAD2 protein expression in late stages with respect to pre-neoplastic and early stage during hepatocellular carcinogenesis. ATAD2 knockdown using siRNAs in cancer cells leads to increase in global histone acetylation and inhibit cell proliferation and induce caspase-3 dependent apoptosis in HCC and induce senescence in MRC5 cells. Its potentiator role (coactivator role with estrogen, androgen and myc targets) indicates ATAD2 as a potential therepeutic target for HCC. 218