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Endófitos são microrganismos que em pelo menos uma fase do seu ciclo de vida, habitam o interior de tecidos da parte aérea de plantas assintomáticas. Foi realizado um estudo sobre a população bacteriana endofítica de dez porta-enxertos de citros, mantidos no Centro de Citricultura Sylvio Moreira - IAC. Foram isolados de explantes foliares principalmente dois grupos bacterianos: um deles constituído de isolados do gênero Bacillus (incluindo B. pumilus, B. megaterium, B. cereus, B. lentus) e outro, constituído por Erwinia herbicola. Verificou-se que a espécie mais frequente foi E. herbicola (24,45%); entretanto, se for considerado o gênero, Bacillus foi o mais frequente (50,98%). A presença em maior frequência de isolados deste gênero se deve provavelmente à resistência de seus endósporos ao tratamento para desinfecção superficial dos tecidos foliares, pois resultados obtidos da interação destas bactérias com o fungo endofítico Guignardia citricarpa e análise via marcadores de RAPD, sugerem que Bacillus spp. fazem parte da população epifítica destas plantas, e eventualmente podem entrar no hospedeiro por meio de aberturas como estômatos elou ferimentos, sendo nestes casos considerados como endófitos facultativos. Já, E. herbicola apresenta uma associação simbiótica com o fungo endofítico estudado, o qual deve favorecer a colonização bacteriana no hospedeiro. Esta característica aliada ao fato de que esta bactéria, frequentemente isolada de plantas como endófita, apresentou pequena divergência genética, detectada por marcadores de RAPD e perfil plasmidial, sugerem que deva ocorrer uma íntima interação entre o fungo G. citricarpa, a bactéria endofítica e a planta hospedeira, a qual deve manter reduzida a variabilidade genética neste grupo bacteriano. A constatação do estado endofítico de E. herbicola, juntamente com esta interação com a planta, mostra a possibilidade de se utilizar esta espécie para a introdução de características de interesse em porta-enxertos de citros. Endophytes are microorganisms which live inside aerial tissue of assyntomatic plants, during at least one phase of their life cycles. Ten rootstocks citrus were used. In order to get insights about their endophytic bacterial population. Endophytic bacteria were isolated from foliar tissue and could be divided in two main groups. The first group was formed by Bacillus (including B. megaterium, B. cereus, B. pumilus, B. lentus), and a second group was formed by Erwinia herbicola. The frequencies of bacteria from group one and two were 50,98% and 24,45%, respectively. The high frequency of the genus Bacillus found in the bacterial population is probably due to the endospore resistance to superficial desinfection of the leaf tissue. This observation was based on the interaction showed by these bacterias with the endophytic fungi Guignardia citricarpa and RAPD analysis, suggesting that Bacillus spp. is part of the epiphytic population of this plants. Eventually these epiphytic bacteria it may penetrate inside the host by stomats or injuries and in this case they could be considered facultative endophytes. However, E herbicola shows a simbiotic association with the studied endophytic fungi, which favours the bacterial colonization of the host. This finding, plus the low genetic divergence of several isolates from this bacteria, detected by RAPD and plasmidial profile, suggested that E. herbicola occurs in a close interaction with the fungus. The endophytic state of E. herbicola, added to its interaction with the host plants, suggests the possibility of using this species for the introduction of characteristics of interest in rootstocks citrus.

As mudanças climáticas é um dos principais fatores ocasionando alterações ambientais na criosfera e nos oceanos devido ao aumento das emissões de gases de efeito estufa na atmosfera. O Estreito de Gerlache é uma área caracterizada por alta produtividade biológica, confinada topograficamente e localizada na Península Antártica Ocidental (PAO), uma das áreas mais sensíveis às mudanças climáticas no planeta. Entender a estrutura, composição e principais fatores ambientais de influência das comunidades microbianas na coluna dágua do Estreito de Gerlache é um passo fundamental para antecipar possíveis efeitos das mudanças climáticas na composição e funções ecológicas dos microrganismos dessa região. O principal objetivo desse estudo foi acessar o microbioma marinho de Archaea e Bacteria do Estreito de Gerlache, caracterizando a diversidade, composição taxonômica e estrutura de comunidades, e determinar os principais fatores ambientais de influência no contexto das mudanças climáticas. Foram coletadas amostras de águas do mar das zonas epipelágica e mesopelágica e dados abióticos (salinidade, temperatura, oxigênio dissolvido) e bióticos (fluorescência) em dez estações oceanográficas durante as primaveras e verões austrais de 2013, 2014 e 2015. Através de técnicas moleculares, o DNA das 38 amostras foi extraído, a região V4 do gene 16S RNAr foi amplificada e sequenciada pela plataforma Illumina. As sequências foram analisadas através de ferramentas de Bioinformática. Nossos resultados mostraram a presença de 1279 ASVs, com dominância de Bacteria e revelaram que as comunidades microbianas são estruturadas pela sazonalidade e zonas pelágicas associadas às diferentes massas dágua. Amostras de águas profundas se mostraram mais diversas e ricas do que de superfície, inclusive para grupos raros. Em águas superficiais, o período de primavera teve maior riqueza de microrganismos do que o verão. A primavera apresentou uma mistura de táxons e metabolismos das duas zonas pelágicas encontradas no verão, mostrando importância na dinâmica sazonal das comunidades microbianas. O microbioma central foi composto por 19 ASVs de Bacteria, com composição similar à de outras regiões próximas na PAO. As famílias mais abundantes de bactérias foram Flavobacteriaceae, Cyanobacteria, Rhodobacteraceae, Thioglobaceae e Nitrincolaceae, enquanto que os táxons mais abundantes de arqueias foram Nitrosopumilaceae e Marine Group II da classe Thermoplasmata. As comunidades microbianas do Estreito de Gerlache demonstraram importância para os ciclos do carbono, nitrogênio e enxofre. Os principais parâmetros ambientais que influenciaram significativamente a riqueza das comunidades foram o nitrito e a salinidade, e para a diversidade, foram a temperatura e a salinidade. Outros parâmetros como nitrato, fosfato, silicato, amônia e fluorescência demonstraram importância secundária para a estrutura microbiana. As alterações nos parâmetros ambientais relacionadas às mudanças climáticas, como aumento de temperatura e alterações na salinidade apresentam uma alta possibilidade de afetar a composição, diversidade, riqueza e dinâmica sazonal das comunidades microbianas do Estreito de Gerlache, bem como os ciclos biogeoquímicos dos quais essas comunidades participam. Climate change is one of the most profund disturbances affecting the cryosphere and ocean systems due the consequences of increase greenhouse gases in the atmosphere. The Gerlache Strait is an area characterized by high biological productive, topographically confined area and localized in Western Antarctic Peninsula (WAP), one of the most sensitive areas to climate change in the planet. Understanding the structure, composition and environmental drivers in the microbial communities in the water column of Gerlache Strait is required to provide antecipate insights of climate change effects in the composition and ecological functions of these microbial communities in these region. The main goal of our study was to assess the marine microbiome of Archea and Bacteria of Gerlache Strait, characterizing the diversity, taxonomic composition, structure and environmental drivers in the context of global climate change. We collected seawater samples from epipelagic and mesopleagic zones and physical data (salinity, temperature, nutrients, oxygen dissolved) and biological data (fluorescence) at ten oceanographic stations during spring and austral summer of 2013, 2014 and 2015. Using molecular techniques, we extracted the DNA from 38 samples, the V4 region of 16S rRNA gene was amplified and sequenced by Illumina platform. The sequences were analyzed by Bioinformatic tools. Our results reveal the presence of 1279 ASVs with Bacteria dominance, and the results also reveal that microbial communities are structured by seasonality and pelagic zones associated with different water masses. Deeper waters presented more diversity and richness than surface, including rares groups. In surface waters, the spring season was richer than summer. The spring season presented a mix of taxa and metabolisms of two water column layers of summer, showing an importance for interannual dynamic of microbial communities. The core microbiome was composed by 19 ASVs of Bacteria, with similar composition of other close regions in the WAP. The most abundant bacterial families are Flavobacteriaceae, Cyanobacteria, Rhodobacteraceae, Thioglobaceae e Nitrincolaceae, where as the most abundant archeal taxa are Nitrosopumilaceae e Marine Group II from Thermoplasmata class. The microbial communities of Gerlache Strait have been shown to play an important role in carbon, nitrogen and sulfur cycles. The main environmental drivers with a significant influence on microbial richness is nitrite and salinity, and for diversity is temperature and salinity. Other environmental parameters such as nitrate, phosphate, silicate, ammonia and fluorescence showed secondary significance for microbial structure. The changes in environmental parameters related to climate change, such as the increase of temperature and disturbance of salinity, presented a high possibility to affect the composition, diversity, richness and interannual dynamic of microbial communities in Gerlache Strait and the biogeochemical cycles that these microrganisms are part of.

Espécies do gênero Burkholderia são fortemente associadas ao seu comportamento patogênico, devido ao agravamento do quadro de pacientes com o sistema imunológico comprometido. Apesar disso, existe um grande interesse nas bactérias desse gênero visando aplicações biotecnológicas, principalmente na área agrícola. Existem estudos que demonstram a importância de Burkholderia spp. na promoção de crescimento vegetal, biorremediação, controle biológico etc. A espécie Burkholderia seminalis tem sido isolada de diversos tipos de amostras como água, solo, rizosfera, sementes, plantas a clínicas, onde pode estar envolvida em infecções nosocomiais. Também é considerada fitopatogênica para damasco, em diversos modelos animais foi observado que essa espécie possui fraca virulência e, não apresenta capacidade de colonizar/infectar pulmões de ratos. A linhagem TC3.4.2R3 de B. seminalis, isolada das raízes de cana-de-açúcar, apresenta atividade antagônica frente a uma série de fungos fitopatogênicos. Além disso, apresenta uma atividade potencial para o controle de sintomas de necrose foliar em orquídeas causada pela espécie Burkholderia gladioli. Algumas características relacionadas à promoção de crescimento foram observadas nessa linhagem. A linhagem TC3.4.2R3 possui uma região que compreende às locus tags Bsem_02857 a Bsem_02860 (cluster n-TASE), ausente nos demais genomas de Burkholderia utilizados como referência para sua anotação (B. cenocepacia J2315 e B. ambifaria AMMD). Acredita-se que esse cluster tenha sido adquirido por transferência horizontal e mantido no genoma desta bactéria por pressão de seleção. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi entender a origem evolutiva desse cluster gênico, bem como o seu papel nos mecanismos de interação em TC3.4.2R3. Avaliou-se a história evolutiva do cluster n-TASE em TC3.4.2R3, por meio da combinação de métodos de estudo de HGT como filogenia, genômica comparativa e análise molecular. Posteriormente, foi realizada a caracterização do cluster n-TASE, por meio da obtenção de dois mutantes via mutagênese insercional com o plasmídeo pGP&#937Tp, SST57 com mutação no gene Bsem_02857 e SST28 com mutação no gene Bsem_02858. O cluster n-TASE de TC3.4.2R3 apresentou maior similaridade com as sequências homólogas de Aquamicrobium sp. SK-2 e B. contaminans LMG23361. Foi possível fornecer evidências de que o n-TASE foi adquirido por meio de um evento de HGT Observou-se uma correlação de natureza ainda desconhecida dos genes do n-TASE cluster com motilidade do tipo swarming, produção de biofilme, tolerância ao estresse oxidativo e sobrevivência bacteriana em hemolinfa de G. mellonella, mas não correlacionada à virulência bacteriana a este tipo de modelo de infecção. Futuramente, serão necessários experimentos para o melhor entendimento da forma como esses genes atuam nesses processos. Species of the Burkholderia genus are strongly associated with its pathogenic behavior, due to the worsening of patients with compromised immune systems. Despite this, there is a great interest in bacteria of this genus aiming at biotechnological applications, mainly in the agricultural area. There are studies that demonstrate the importance of Burkholderia spp. in the promotion of plant growth, bioremediation, biological control etc. The Burkholderia seminalis species has been isolated from different types of samples such as water, soil, rhizosphere, seeds, plants and clinics, where it may be involved in nosocomial infections. It is also considered phytopathogenic for apricots, in several animal models it was observed that this species has weak virulence and does not show the ability to colonize/infect rat lungs. The TC3.4.2R3 strain of B. seminalis, isolated from sugarcane roots, presents antagonistic activity against a series of phytopathogenic fungi. Furthermore, it has a potential activity to control symptoms of leaf necrosis in orchids caused by Burkholderia gladioli species. Some characteristics related to growth promotion were observed in this strain. The TC3.4.2R3 lineage has a region comprising the locus tags Bsem_02857 to Bsem_02860 (cluster n-TASE), absent in the other Burkholderia genomes used as reference for its annotation (B. cenocepacia J2315 and B. ambifaria AMMD). It is believed that this cluster was acquired by horizontal transfer and maintained in the genome of this bacterium by selection pressure. Thus, the main objective of this study was to understand the evolutionary origin of this gene cluster, as well as its role in the interaction mechanisms in TC3.4.2R3. The evolutionary history of the n-TASE cluster in TC3.4.2R3 was evaluated by combining HGT study methods such as phylogeny, comparative genomics and molecular analysis. Subsequently, the characterization of the n-TASE cluster was performed, by obtaining two mutants via insertional mutagenesis with the plasmid pGP&#937Tp, SST57 with mutation in the Bsem_02857 gene and SST28 with mutation in the Bsem_02858 gene. The n-TASE cluster of TC3.4.2R3 showed greater similarity with the homologous sequences of Aquamicrobium sp. SK-2 and B. contaminans LMG23361. It was possible to provide evidence that n-TASE was acquired through an HGT event. A correlation of a still unknown nature of the n-TASE cluster genes with swarming motility, biofilm production, tolerance to oxidative stress and bacterial survival in G. mellonella hemolymph, but not correlated to bacterial virulence in this type of infection model. In the future, experiments will be needed to better understand how these genes act in these processes.

Comunidades microbianas possuem papéis importantes em processos que ocorrem em diversos ambientes, tais como solos, oceanos e o trato gastrointestinal dos seres humanos. Portanto, é de interesse a compreensão da estrutura e do funcionamento dessas comunidades. A estrutura dessas comunidades, em termos de organismos componentes, pode ser determinada com o uso do sequenciamento de nova geração em conjunto com as técnicas meta-ômicas e pela análise taxonômica das sequências obtidas com programas de classificação taxonômica. Se por um lado diversos programas estão disponíveis, por outro lado eles cometem erros, como a identificação parcial dos organismos presentes na amostra e a identificação de organismos que não estão presentes na amostra (os falsos positivos - FPs). Algumas abordagens foram propostas para a melhoria das classificações taxonômicas obtidas por esses programas com a redução desses FPs, porém elas abordam apenas um tipo de meta-ômica, a metagenômica. Neste trabalho, propomos uma nova abordagem através da integração de diferentes meta-ômicas - metagenômicas shotgun e de amplicons de 16S, e metatranscritômica. Exploramos os resultados de classificações de dados simulados e mocks para a extração de variáveis e desenvolvemos modelos de classificação para discriminação de predições de espécies de bactérias classificadas como corretas ou incorretas. Comparamos o desempenho dos resultados obtidos entre as meta-ômicas individuais e os obtidos através da integração observando o balanceamento entre a precisão e a sensibilidade. De acordo com as medidas calculadas com nossos conjuntos de dados, nossa abordagem demonstrou melhorias na classificação com a redução de FPs e aumentos para a medida F1, quando comparada com abordagens não integrativas, inclusive com o uso de métodos de combinação de classificadores. Para facilitar seu uso, desenvolvemos o Gunga, uma ferramenta que incorpora a abordagem desenvolvida em formato de pacote do R, com funcionalidades para a integração de dados de classificação taxonômica com diferentes meta-ômicas e a classificação das predições incorretas. Microbial communities play important roles in processes that occur in diverse environments, such as soils, oceans, and the gastrointestinal tract of humans. Therefore, it is of interest to understand the structure and functioning of these communities. The structure of these communities, in terms of component organisms, can be determined by the use of the next generation sequencing in conjunction with the meta-omics techniques and by the taxonomic analysis of the sequences obtained with taxonomic classification programs. If on the one hand several programs are available, on the other hand they make mistakes, such as the partial identification of the organisms present in the sample and the identification of organisms that are not present in the sample (the false positives - FPs). Some approaches have been proposed to improve the taxonomic classifications obtained by these programs with the reduction of these FPs, but they address only one type of meta-omics, the metagenomics. In this work, we propose a new approach by integrating different meta-omics - shotgun and 16S amplicon metagenomics, and metatranscriptomics. We explored the classifications results of simulated data and mocks for variable extraction and developed classification models for discriminating predictions of bacterial species classified as correct or incorrect. We compared the performance of the results obtained between the individual meta-omics and the obtained through the integration observing the balance between precision and sensitivity. According to the measures calculated with our data sets, our approach has shown improvements in the classification with the reduction of the FPs and increases for the F1 measure, when compared to non-integrative approaches, including the use of classifiers combination methods. To facilitate its use, we developed the Gunga, a tool that incorporates the developed approach in R package format, with features for the integration of taxonomic classification data with different meta-omics and the classification of the incorrect predictions.

O maior desafio para a produção de bioenergia continua sendo a precisa desconstrução da parede celular de vegetal. Tendo em vista viabilizar a produção de etanol de segunda geração (2G) em larga escala, bem como otimizar o procedimento de produção do etanol de primeira geração (1G), estudos vêm sendo desenvolvidos com foco na produção de enzimas lignocelulósicas, principalmente as de origem fúngica. Esses estudos visam o aperfeiçoamento de coquetéis enzimáticos, compostos principalmente por enzimas que atacam celulose e hemiceluloses. No entanto, sabemos que as paredes celulares vegetais possuem também pectinas e recentemente foi demonstrado que pectinases podem melhorar sensivelmente o processo de hidrólise (até 30%). Após o levantamento de dados referentes a diferentes enzimas pectinolíticas denominadas endopoligalacturonases (EPGs) já caracterizadas e catalogadas no banco de dados CAZy, foi possível verificar que aquelas produzidas por fungos filamentosos contabilizam mais de 65%. A partir disso foi realizada uma análise filogenética de todas as EPGs caracterizadas produzidas por diferentes organismos. O resultado demonstrou que enzimas dessa família produzidas por bactérias também com interesse biotecnológico são mais próximas de plantas do que dos próprios fungos. Além disso, a proporção de enzimas caracterizadas de bactérias e plantas era significativamente menor que o observado para EPGs de fungos. Isso evidenciou uma lacuna no conhecimento sobre enzimas de plantas, ainda pouco exploradas no contexto de biotecnologia e bioenergia. Este trabalho apresenta a clonagem, expressão heteróloga e caracterização da EPG de cana-de-açúcar recombinante. O principal objetivo é obter informações a respeito de uma enzima com atividade chave na degradação de parede celular, haja vista ter sido ela isolada de um processo de ataque endógeno à pectina da própria cana-de-açúcar. Como resultado, a endopoligalacturonase de Saccharum sp. foi eficientemente expressa em sistema de expressão heterólogo com Pichia pastoris X33. O clone produtor selecionado gerou os maiores valores de proteínas totais no sobrenadante de cultivo com 96 horas de indução com metanol. A partir do extrato bruto do sobrenadante coleta, os melhores valores de atividade enzimática foram obtidos quando da incubação por 22 horas a 45 C em tampão acetato de sódio pH 5,0. Sais, detergentes e quelantes atuaram como inibidores da atividade enzimática e, por outro lado, o agente redutor ditiotreitol (DTT) foi responsável pelo incremento de atividade enzimática. Por fim, os parâmetros cinéticos obtidos para a enzima caracterizada indicam a possibilidade de utilizá-la como complemento de coquetéis enzimáticos, conhecidamente pobres em pectinases. The biggest challenge for bioenergy production remains the disassembly of the extracellular matrix of some plant species. For the large-scale production of second generation ethanol (2G), and optimizing the first generation ethanol (1G) production process, studies have been developed focusing on the production of lignocellulosic enzymes, especially those of produced by fungi. These studies aim at the improvement of enzymatic cocktails, composed mainly of enzymes that are capable of attacking cellulose and hemicelluloses. However, it is a known fact that the plant cell walls also contain pectins and it has been recently demonstrated that pectinases could significantly improve the hydrolysis process (up to 30%). After an analysis of different pectinolytic enzymes known as endopoligalacturonases (EPGs), already characterized and cataloged under the CAZy database, it was possible to verify that fungi enzymes account for more than 65% of all of the characterized EPGs. The result has shown that enzymes from this family produced by bacteria - also with biotechnological interest - are closer to plants than fungi. Besides, the proportion of characterized enzymes from bacteria and plants was significantly lower than that observed for fungal EPGs. This evidenced a gap in knowledge about plant enzymes, still little explored in the context of biotechnology and bioenergy. This work presents the cloning, heterologous expression, and characterization of recombinant sugarcane EPG. The primary objective is to obtain information about an enzyme with key activity in cell wall degradation since it has been isolated from a process of an endogenous attack on sugarcane pectin itself. As a result, the endopoligalacturonase of Saccharum sp. was efficiently expressed through the heterologous expression system with Pichia pastoris X33. The selected clone generated the highest total protein values in the culture supernatant at 96 hours of methanol induction. From the crude extract of the supernatant collected, the best enzyme activity values were obtained upon incubation for 22 hours at 45°C in pH 5.0 sodium acetate buffer. Salts, detergents, and chelators acted as inhibitors of the enzymatic activity and, on the other hand, the reducing agent dithiothreitol (DTT) was responsible for the increase of enzymatic activity. Finally, the kinetic parameters obtained for the enzyme characterized indicate that it can be used as a complement to enzymatic cocktails, which are known to be poor in pectinases.

Cana-de-açúcar é uma planta agrícola com grande importância econômica para o Brasil. Os cultivares modernos de cana-de-açúcar apresentam uma alta complexidade genômica, devido ao seu genoma ser poliploide e com número cromossômico variando entre 100-120. As plantas de cana-de-açúcar estão sujeitas ao ataque de diversos tipos de patógenos, e sua tolerância depende da ação de genes de resistência. Estes podem desencadear uma cascata de reações ou interagir diretamente com uma molécula efetora, resultando em tolerância por parte da planta à presença do patógeno. O genoma dos cultivares moderno apresentam inúmeros elementos de transposição posicionados em diferentes regiões do genoma. Devido a essa abundância, os elementos de transposição estão sendo usados como marcadores moleculares, por exemplo, RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism), que identifica polimorfismos baseado na inserção de elementos do tipo retrotransposons. Esta técnica é capaz de diferenciar a presença e a ausência de um elemento de transposição em uma determinada região do genoma. Para a aplicação em organismos poliploides foi desenvolvida a técnica RBIP-qPCR, permitindo dosar a presença e ausência de um elemento de transposição em um organismo poliploide. Sendo assim este trabalho tem como objetivo aplicar a técnica de RBIP-qPCR em elementos de transposição alocados adjacentes a genes de resistência a fim de, posteriormente, verificar a existência de associação entre genes de resistência e elementos de transposição. Para isso foram analisadas três famílias de genes de resistência, I2C-2, Xa21 e Pti1. Foram realizadas análises de composição genômica de cada uma das regiões, genômica comparativa entre as variedades de R570 e SP80-3280 para a região genômica que contém o gene I2C-2, além de uma análise de expressão de genes e elementos de transposição vizinhos neste loco. A partir destes estudos foi possível selecionar um elemento de transposição, scDEL 5.1, para aplicar a técnica de RBIP-qPCR. Os resultados das análises de reconhecimento do ambiente genômico determinou a escolha de um elemento para aplicação da técnica. Verificamos que na ausência de scDEL 5.1 a metodologia RBIPqPCR foi eficaz em todos os genomas testados. As análises de presença de scDEL 5.1 no loco revelaram que elementos com elevado número de cópias no genoma não são adequados para a aplicação da metodologia. Sugarcane is an agricultural plant with great economic importance for Brazil. The modern cultivars of sugarcane present a high genomic complexity, due to their genome being polyploid and with chromosome number varying between 100-120. Sugarcane plants are targets of several types of pathogens, and their tolerance depends on the action of resistance genes. These can trigger a cascade of reactions or interact directly with an effector molecule, resulting in tolerance by the plant to the presence of the pathogen. The genome of modern cultivars presents several transposable elements allocated in different regions of the genome. Due to this abundance, transposable elements are being used as molecular markers, such as RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism), which identifies polymorphisms based on the insertion of retrotransposon. This technique is able to differentiate the presence and absence of a transposable element in a particular region of the genome. For the application in polyploid organisms the RBIP-qPCR technique was developed, allowing measuring the presence and absence of a transposable element in a polyploid organism. Therefore, the objective of this work is to apply the RBIP-qPCR technique to on a transposable element localized adjacent to resistance genes in order to, latterly, verify the existence of association between resistance genes and transposable elements. For this, three families of resistance genes, I2C-2, Xa21 and Pti1 were analyzed. Genomic composition analyzes of each region, comparative genomics between the R570 and SP80-3280 varieties for the genomic region containing the I2C-2 gene, as well as an analysis of genes and elements expression neighbors at this locus were performed. From these studies it was possible to select a transposition element, scDEL 5.1, to apply the RBIP-qPCR technique. The results of the genomic environment recognition analysis determined the choice the transposable element for the application of the technique. We verified that in the absence of scDEL 5.1 the RBIP-qPCR methodology was effective in all genomes tested. Analysis of the presence of scDEL 5.1 in the locus revealed that elements with high copy number in the genome are not suitable for the application of the methodology.

The current population growth will demand a higher productive agriculture to full the food requirement. To supply this need and preserve the environment, many resources are applied to promote sustainable agriculture. Phosphorus depletion is the main factor that limits crops yields in tropical soils, where the pH and clay content rapid fixate this nutrient. Plant breeders aim to solve this issue by changing the plant requirements for phosphorus and adapting them to low P availability. However, with these approaches the demand for phosphorus fertilizers will continue and so the depletion of the natural deposits. In this study is proposed that plants with contrasting phosphorus uptake efficiency, i.e. P-efficient and P-inefficient, recruits distinct rhizosphere microbiome specialized in phosphorus mobilization. This hypothesis was tested growing plants in a gradient of two sources of P, triple superphosphate or rock phosphate Bayovar. Thebean rhizosphere microbiome was assessed with culture dependent and independent approaches, enzymatic assays, predictive metagenomics and networks analysis. A differential enrichment of several OTUs in the rhizosphere of the P-inefficient common bean genotype, and the enrichment of bacterial chemotaxis functions and functions involved in phosphorus mobilization suggest that this genotype has superior communication with the rhizosphere microbiome and is highly dependent on it for phosphorus mobilization. As a proof of concept, the P-efficientefficient genotype was sown in soil previously cultivated with P-inefficientinefficient genotype. The results showed that P-efficientefficient genotype positively responded to the modified rhizosphere in early stages, that is, the microbiome selected and enriched by the P-inefficient genotype improved the P uptake in the genotype cultivated afterwards in the same soil. Taken collectively, these results suggest that plants partly rely on the rhizosphere microbiome for P uptake and that the exploration of these interactions during plant breeding would allow the selection of even more efficient genotypes, leading to a sustainable agriculture by exploring soil residual P. O atual aumento populacional irá demandar uma maior produção agrícola para completar a necessidade de alimento. Para suprir essa necessidade e preservar o meio ambiente, muitos recursos serão aplicados para promover a agricultura sustentável. A depleção de fósforo é um dos principais fatores que limita a produção agrícola em solos tropicais, onde o pH e o conteúdo de argila fixam rapidamente esse nutriente. Os melhoristas de plantas visam solucionar esse problema alterando a necessidade de fósforo das plantas e adaptando-as as baixas disponibilidade de fósforo. No entanto, com essas estratégias a demanda por fertilizantes fosfatados irá continuar assim como a exploração das reservas naturais de fósforo. Nesse estudo foi proposto que as plantas contrastantes em relação a eficiência na absorção de fósforo, i.e. P-eficiente e P-ineficiente, recrutariam um microbioma rizosférico distinto em relação a mobilização de fósforo. Essa hipótese foi testada cultivando plantas em um gradiente usando duas fontes distintas de P, triplo fosfato ou fosfato de rocha Bayovar. O microbioma da rizosfera de feijão foi então avaliado por técnicas dependentes e independentes de cultivo, análise enzimática, predição metagenômica e análises de network. Um enriquecimento diferencial de várias OTUs observado na rizosfera do genótipo de feijão P-ineficiente, e o enriquecimento de funções de quimiotaxia bacteriana e envolvidas na mobilização de fósforo sugerem que esse genótipo tem uma maior comunicação com o microbioma rizosférico e é altamente dependente deste para a mobilização de fósforo. Como prova de conceito, o genótipo P-eficiente foi plantado em solo previamente cultivadocom o genótipo P-ineficiente. Os resultados mostraram que o genótipo P-eficiente responde positivamente à rizosfera modificada nos estádios iniciais de crescimento, ou seja, o microbioma selecionado e enriquecido pelo genótipo P-ineficiente melhorou a absorção de fósforo no genótipo cultivado posteriormente no mesmo solo. Coletivamente, esses resultados sugerem que as plantas dependem parcialmente do microbioma da rizosfera para a absorção de P e que a exploraçãodestas interações durante o melhoramento vegetal permitiria a seleção de genótipos muito mais eficientes, conduzindo à uma agricultura sustentável explorando o fósforo residual do solo.

O Rio Tietê e o rio mais importante do Estado de São Paulo e um dois mais poluídos do Brasil. No seu percurso ele recebe altas concentrações de poluentes orgânicos e industriais que podem alterar as comunidades microbianas autóctones. Uma análise dos perfis metagenômicos realizada em pontos do Rio Tietê com diferentes qualidades de água, permitiu observar a influencia dos parâmetros ambientais na composição e funcionamento das comunidades microbianas presentes no rio. Locais eutróficos mostraram prevalência de micro-organismos e funções associadas à heterotrofia. Em contrapartida, nos locais oligotróficos foram detectadas comunidades microbianas e funções relacionadas a metabolismos autótrofos e litótrofos. Foi visto também que as pressões ambientais podem promover a aquisição, por parte dos micro-organimos, de características que lhes permitam sobreviver às condições ambientais adversas, como a tolerância a metais tóxicos. The Tietê River is the most important river of the State of São Paulo, in the southeastern of Brazil; it is also one of the most contaminated rivers of the country. On its watercourse, the river receives large amounts of anthropogenic and industrial pollutants that can alter the environmental conditions of the water, leading to possible shifts in the microbial diversity. Metagenomic profiles of river locations with different water qualities showed taxonomic and functional differences related to the sampling site and water quality. Eutrophic sites showed prevalence of microorganisms and functions associated with heterotrophy, in contrast, in oligotrophic sites were detected microbial communities and functions related to autotrophic and litotrophic metabolisms. Also was observed, that environmental pressures can promote the acquisition of characteristics that allow the local microorganism to survive to adverse environmental conditions, such as tolerance to toxic metals.

Os fungos endofíticos são microrganismos que vivem no interior de tecidos ou órgãos dos vegetais, sem causar danos aos seus hospedeiros. Dentre as inúmeras características desses microrganismos está o seu potencial biorremediador Este trabalho teve como objetivo a avaliação do potencial biorremediador do endófito Mucor sp. isolado de Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), verificando a tolerância e capacidade de absorção do metal pesado cádmio (Cd), os efeitos desse metal na morfologia celular e no sistema de defesa antioxidante do fungo, e também o comportamento da planta modelo Solanum lycopersicum cultivar Calabash Rouge, inoculada com o endófito na presença do metal cádmio. Os resultados apresentados indicaram que um fungo endofítico do gênero Mucor, isolado da macrófita aquática E. crassipes, oriunda de uma lagoa contaminada com metais pesados, apresentou resistência a altas concentrações do metal cádmio. Este fungo apresentou uma modificação na sua morfologia em altas concentrações do metal, além de possuir a capacidade de reter este metal, tanto no interior do seu citoplasma, quanto em sua parede celular, o que pode estar ligada a mecanismos de desintoxicação e sequestro de metais relacionados à formação de complexos Cd-GSH. O mesmo fungo também apresentou um aumento na relação GSH/GSSG nos tratamentos com o metal. Os resultados ainda demonstraram que o estresse causado pelo metal induziu a ativação de enzimas antioxidantes SOD, CAT e GR no isolado endofitico. Além disso, este endófito, quando inoculado em plantas de tomate (Solanum lycopersicum), aumentou a capacidade de absorção do metal na parte aérea desta planta, além de promover crescimento da mesma, nos tratamentos sem o metal, Desta forma o isolado endofítico (CM3) Mucor sp. mostrou um potencial biorremediador, podendo ser utilizado como ferramenta para diminuir os danos causados a saúde humana e ao meio ambiente pelos metais pesados, principalmente o metal cadmio, e também na promoção de crescimento de plantas Endophytic fungi live in the interior of plant tissues or organs, without causing harm to their hosts. Among several interesting characteristics of these microorganisms, some of them present a good potential for bioremediation. This study aimed at assessing the bioremediation potential of endophytic fungus Mucor sp. isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), analyzing chemical absorption ability and fungal tolerance to the heavy metal cadmium (Cd), besides testing the effects of cadmium on the cell morphology, the antioxidant defense system of the fungus, and the behavior of model plant (Solanum lycopersicum) variety Calabash Rouge inoculated with a spore suspension of Mucor sp. in the presence of cadmium. The results indicated that the endophytic fungus isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) plant located in a lagoon contaminated with heavy metals showed resistance to high concentrations of cadmium. The isolated fungus was identified as Mucor sp. The morphology studies demonstrated the occurrence of modifications on the fungus when in high concentrations of the metal. Furthermore, it was possible to verify that the fungus has a capacity to retain metal, both in the cytoplasm and cell wall. This aspect can be linked to detoxification and sequestration mechanisms of metals related to formation of Cd-GSH complexes, since this fungus also presented increase of GSH/GSSG ratio in the treatments with metal. The results also demonstrated that the stress caused by cadmium induces the activation of antioxidant enzymes SOD, CAT and GR in Mucor sp.. Moreover, the inoculation of this fungus in tomato plants increased the biosorption capacity of the cadmium in aerial parts of the plant, besides promoting its growth in the treatments without the metal. Thus the endophytic isolate (CM3) Mucor sp. presented a promising potential as a bioremediator, which can be used as a tool for reducing the damage caused by heavy metals, especially cadmium, to human health and environment

Unraveling soil microbial ecology is essential for improving sustainable agricultural productivity. Community-based studies revolutionized this field in the last decades, but much is yet to be disclosed. This thesis proposed an approach to increase the resolution of such studies by combining 16S rDNA high-throughput sequencing and population genomics, aiming to further explore the differences pointed by community analyses, as well as to overcome the limitations of using operational taxonomic units (OTUs) as ecological entities, and to introduce the evolutionary thinking in microbial ecology. Our main goal was to understand the features that make bacteria able to colonize sugarcane rhizosphere or live saprophytically in bulk soil. Rhizosphere and bulk soil are contrasting habitats for microbial life as they are highly distinct in its physical, chemical and consequently biological characteristics. Our results indicated that sugarcane shapes the rhizosphere microbiome and metabolism of D-galacturonic acid is a key function for colonizing this niche. Among the taxa prevailing in the rhizosphere, Pseudomonas genus was targeted for a more detailed study considering its known attributes for plant growth promotion. Seventy-six fluorescent Pseudomonas spp. were isolated and submitted to whole genome sequencing (WGS). A comparative genomic analysis was performed between populations from rhizosphere and bulk soil. Phylogenetic analyses classified the isolates in the P. fluorescens (57) or P. putida (19) groups. Twelve putative new species and two new proposed P. fluorescens subgroups were found in the prospected tropical soil. Comparative genomics revealed that phosphatases or xylose-utilization genes were significantly enriched in the rhizosphere and bulk soil populations of the P. fluorescens group, respectively. D-galactonate catabolism was higher in the rhizosphere population of the P. putida group based on both genotypic and phenotypic results. Growth in D-xylose was further explored using genetic modified strains and confirmed that this sugar is more used by members of the bulk soil than the rhizosphere population of the P. fluorescens group, a pattern also observed in the bulk soil microbiome. In summary, these findings constitute a step forward in understanding the ecology of rhizosphere and bulk soil bacteria, by overcoming some limitations of community-based analyses and showing genomic differences between bacterial populations of these habitats. Desvendar a ecologia microbiana do solo é essencial para aumentar a produtividade agrícola sustentável. Estudos baseados em comunidades revolucionaram esse campo nas últimas décadas, mas ainda há muito a ser revelado. Esta tese propôs uma abordagem para aumentar a resolução desses estudos, combinando sequenciamento em larga escala de rDNA 16S e genômica populacional, com o objetivo de explorar mais a fundo as diferenças apontadas por análises de comunidades, assim como superar as limitações do uso de unidades taxonômicas operacionais (UTOs) como entidades ecológicas e introduzir o pensamento evolutivo na ecologia microbiana. Nossa principal meta foi entender as características que tornam as bactérias hábeis em colonizar a rizosfera de cana-de-açúcar ou viver no solo saprofiticamente. Rizosfera e solo são hábitats contrastantes para a vida microbiana, já que são altamente distintos em suas características físicas, químicas e, consequentemente, biológicas. Nossos resultados indicaram que a cana-de-açúcar modifica o microbioma da rizosfera e o metabolismo do ácido D-galacturônico é uma função chave para colonizar este nicho. Dentre os táxons que prevalecem na rizosfera, o gênero Pseudomonas foi escolhido para um estudo mais detalhado, considerando os seus atributos de promoção de crescimento de plantas. Setenta e seis Pseudomonas spp. fluorescentes foram isoladas e submetidas ao sequenciamento do genoma. Uma análise de genômica comparativa foi realizada entre as populações obtidas do solo e rizosfera. As análises filogenéticas classificaram os isolados nos grupos P. fluorescens (57) ou P. putida (19). Doze prováveis novas espécies e dois novos subgrupos propostos de P. fluorescens foram encontrados no solo tropical prospectado. A genômica comparativa revelou que genes de fosfatases e de uso de xilose foram significativamente enriquecidos nas populações da rizosfera e solo do grupo P. fluorescens, respectivamente. O catabolismo do ácido D-galactônico foi maior na população da rizosfera do grupo P. putida, baseado tanto em resultados genotípicos quanto fenotípicos. O crescimento em D-xilose foi mais explorado usando linhagens geneticamente modificadas e confirmou que este açúcar é mais utilizado por membros da população do solo do que da rizosfera no grupo P. fluorescens, um padrão também observado no microbioma do solo. Em resumo, essas descobertas constituem um passo adiante no entendimento da ecologia bacteriana do solo e rizosfera, por superar algumas limitações de análises de comunidades e mostrar diferenças genômicas entre populações bacterianas destes hábitats.

Na agricultura moderna, formas alternativas de alcançar maior produtividade de modo sustentável são prioridades. Entretanto, o sucesso agrícola é ainda excessivamente dependente do emprego de fertilizantes químicos e de defensivos agrícolas. A severidade de algumas doenças é um fator preocupante na produção de várias culturas. Dentre alguns patógenos de planta, destaca-se o gênero Fusarium, o qual apresenta uma expressiva importância na agricultura por ser patógeno em várias culturas de interesse econômico.. Por outro lado, a utilização de microrganismos endofíticos como agentes de biocontrole vem se tornando cada vez mais atrativa, pois, surge como uma alternativa capaz de amenizar gastos excessivos com controle químico e danos ao meio ambiente. Dentre esses microrganismos, destaca-se o gênero Burkholderia, conhecidamente capaz de produzir uma vasta gama de antimicrobianos, com diferentes níveis de especificidade. Essas bactérias vivem em interações com diversos microrganismos e plantas, em um ambiente altamente competitivo, resultando em uma fonte de metabólitos secundários, bacteriocinas dentre outros pepitideos A linhagem TC3.4.2R3 Burkholderia seminalis, isolada endofiticamente de raízes de cana-de-açúcar, é capaz de controlar vários fungos e bactérias fitopatogênicas. Apartir dessa linhagem foi construída uma biblioteca de mutantes randômicos por meio de transposon. Assim, por meio dessa biblioteca, o objetivo do trabalho foi selecionar mutantes defectivos no controle de diferentes espécies de Fusarium, identificar e caracterizar os genes nocauteados, visando o melhor entendimento do controle da fusariose. Os resultados obtidos por meio da caracterização do teste de antagonismo demonstrou que a linhagem TC3.4.2R3 selvagem produz metabólitos capazes de inibir in vitro o crescimento de Fusarium spp. A partir da biblioteca de mutantes, foram obtidos 8 mutantes defectivos para o controle de Fusarium verticilioides FV-01-CTC que não apresentaram alta especificidade quando avaliados contra outros Fusarium spp. Dentre os genes nocauteados foram identificadas sequências codificadoras para a proteína glutamato sintase, TolB e FAD. Até o momento não foi encontrado relatos sobre o glutamato como um biocontrolador de patógenos, entretanto o uso de mutantes sítio dirigido para esse gene confirmou o papel do mesmo no controle de FV-01-CTC. TolB é uma proteína relacionada ao transporte de substâncais e pode ter seu papel de controle relacioanado à secreção de metabolítos secundários, visto que in silico, no genoma da TC3.4.2R3, foram encontrados 18 clusters resposáveis pela produção de metabólitos secundários. Assim, o presente trabalho abre novas perspectivas de estudo, visto que, os mecanismos de controle da fusariose por B. seminalis TC3.4.2R3 são amplos e sinergisticos. Há uma enorme perspectiva em desvendar o papel do glutamato e TolB no controle de fitopatógenos. Os mutantes caracterizados, pode ser fonte de novos estudos para o complexo entendimento da interação microrganismo-planta-patógeno, visto que há a possibilidade de verificar por exemplo o papel do glutamato proveniente da linhagem TC3.4.2R3 na promoção de crescimento vegetal. In modern agriculture, alternative ways of achieving high productivity with sustainability are priority. However, agricultural success is still excessively dependent on the use of chemical fertilizers and pesticides. The severity of some diseases are worrying factor in the production of differents crops. Among plant pathogens, the genus Fusarium stands out, which has an important role in agriculture being disease causer in several crops such as: sugarcane, corn, passion fruit, tomato, banana, rice, and others. Fusarium can be found inhabiting soil in the most diverse geographical regions of the world, especially in tropical and subtropical climates. On the other hand, studies using endophytic microorganisms as biocontrol agents has become increasingly attractive, since they appear as an alternative to chemical control. Among these microorganisms, the genus Burkholderia stands out. This genis is able to produce a wide range of antimicrobials, with different levels of specificity. Moreover, Burkholderia has been received special attention because its potential plant growth promoter, bioremediation agents and recent studies aimed at biocontrol of diseases. These bacteria live in interactions with diverse microorganisms and plants in a highly competitive environment representing significant source of new bioactive secondary metabolites, bacteriocins among other pepitides. The B. seminalis strain TC3.4.2R3, endofitically isolated from sugarcane roots, is able to control diverse phytopathogenic fungi and bacteria. By Tn5 randomic mutations, it was obtained a library of TC3.4.2R3 mutantes. Thus, using this library, the objective of this work was select defective mutants to control of Fusarium spp., with the aimed the better understand the fusariose control by identificayion and characteriazation of knockouted genes. The results obtained through the characterization of the antagonism assays allowed us to conclude that wild-type TC3.4.2R3 produces many metabolites with antifungal activity under in vitro conditions, being able to control the growth Fusarium spp. From the mutants library we found 8 defectives mutants to control of F. verticilioides FV-01-CTC. Among the knockouted genes we found sequences enconding glutamato syntase, TolB and FAD. To date no reports have been found on glutamate as a pathogen biocontroller, however the use of mutant site directed to this gene confirmed the role of the same in the control of FV-01-CTC. TolB is a protein related to the transport of substances and may have its biocontrol role related to the secretion of secondary metabolites, since in silico analisys in the genome of TC3.4.2R3, 18 clusters were found as responsible for the production of secondary metabolites. Thus, the present work opens new perspectives of study, confirming that the mechanisms of control of fusariosis by B. seminalis TC3.4.2R3 are ample and synergistic. There is a huge prospect in unraveling the role of glutamate and TolB in controlling of plant pathogens. The characterized mutants may be the source of new studies for understanding the complex interaction among microorganism-plant-pathogen, since it is possible to verify, for example, the role of glutamate from the TC3.4.2R3 strain in the plant growth-promotion.

A biorremediação é uma metodologia eficiente na recuperação de ambientes poluídos. Ela emprega organismos capazes de degradar compostos tóxicos transformando-os em substâncias menos agressoras. Dentre os microrganismos que são utilizados para este fim, o gênero Gordonia tem se destacado bastante devido a sua grande versatilidade metabólica, o que permite a utilização de substratos complexos e tóxicos como fonte energética, eliminando-os do meio ambiente. O sequenciamento e a análise dos genomas de dois isolados de G. paraffinivorans (MTZ041 e 052) e de um isolado de G. sihwensis (MTZ096), provenientes da compostagem, demonstrou que esses microrganismos possuem os elementos genéticos que conferem a habilidade de degradar hidrocarbonetos, borracha sintética e borracha natural. Para comprovar a capacidade desses isolados em utilizar estas diferentes fontes de carbono, foram realizados ensaios contendo um indicador de óxido redução (2,6 DCPIP), cinéticas de crescimento, análises químicas (Cromatografia Gasosa, CG), qPCR e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os três isolados usados neste trabalho foram capazes de utilizar hidrocarbonetos como fonte única de carbono. Os resultados dos ensaios cromatográficos demonstram que G. paraffinivorans MTZ041 consumiu 28,92% do hexadecano presente no meio, contra 69,80% consumido por G. sihwensis MTZ096 ao longo de 168 horas. As curvas de crescimento também demonstraram que a biomassa acumulada por G. sihwensis MTZ096 é 3,3 vezes maior do que a biomassa de G. paraffinivorans MTZ041 para o tratamento com hexadecano, totalizando 3,68 mg/ml e 1,11 mg/ml, respectivamente. Conforme esperado, mediante estas observações, a presença de hexadecano como fonte única de carbono no meio de cultivo, levou ao aumento da expressão dos genes responsáveis pela degradação de hidrocarbonetos. Para o sistema CYP 153, os genes FER, CYP 153 e FER RED tiveram sua expressão aumentada 750, 232 e 110 vezes, respectivamente. Já os genes alk B, rub A3, rub A4, rub B e alk U do sistema alcano hidroxilase tiveram sua expressão aumentada em 248, 1576, 1296, 6,6 e 20 vezes respectivamente. Estes resultados confirmam dados prévios da literatura de que os isolados de Gordonia tem grande potencial para biotransformação de hidrocarbonetos. Em relação à capacidade de assimilação de borracha sintética e natural, as análises in silico demonstraram que somente os isolados da espécie G. paraffinivorans possuem o gene Lcp (Látex Clearing Protein) responsável pelo primeiro passo da assimilação destes substratos. As curvas de crescimento em borracha natural e sintética como fonte única de carbono foram realizadas ao longo de 11 semanas e demonstram a capacidade destes substratos em suportar o crescimento robusto. Durante 80 dias, foi possível evidenciar a presença de bacilos e a formação de biofilme na borracha sintética e natural por meio de MEV. Este é o primeiro relato na literatura de G. paraffinivorans assimiladora de borracha e a terceira espécie do gênero Gordonia com esta habilidade metabólica. Dada a grande complexidade deste substrato e a escassez de microrganismos com esta capacidade, a descrição e a caracterização deste isolado são de grande originalidade e relevância biotecnológica. Bioremediation is an efficient methodology on recovery of polluted environments. It acts employing microorganisms capable of degrading toxic compounds into less aggressive substances. Among the microorganisms used in bioremediation, the genus Gordonia has stood out due to its great metabolic versatility, which allows the use of complex toxic substrates as energy source, eliminating them from the environment. Sequencing and analysis of the genomes of two isolates of G. paraffinivorans (MTZ041 and 052) and an isolate of G. sihwensis (MTZ096) from composting, demonstrated that these microorganisms possess the genetic factors that confer the ability to degrade hydrocarbons, synthetic and natural rubber. To prove the capacity of growth of the isolates in these carbon sources, growth tests were carried out containing an oxide reduction indicator (2,6 DCPIP), kinetics growth, chemical analysis (gas chromatography, CG), qPCR and scanning electron microscopy (SEM). The three isolates used in this study were able to utilize hydrocarbons as sole carbon source. The results of the chromatographic assays show that G. paraffinivorans MTZ041 consumed 28.92% of the hexadecane present in the medium, against 69.80% consumed by G. sihwensis MTZ096 over 168 hours. The growth curves also showed that the biomass accumulated by G. sihwensis MTZ096 is 3.3 times higher than the biomass of G. paraffinivorans MTZ041 for the hexadecane treatment, resulting in 3.68 mg/ml and 1.11 mg/ml, respectively. As expected by these observations, the presence of hexadecane as carbon source in the medium led to an increased expression of the genes responsible for the degradation of hydrocarbons. For the CYP 153 System, genes FER, CYP 153 and FER RED had an increased expression of 750, 232 e 110 times, respectively. As for the Alkane Hydroxylase System, genes alk B, rub A3, rub A4, rub B and alk U had an increased expression of 248, 1576, 1296, 6,6 e 20 times, respectively. These results confirm previous data from the literature that Gordonia isolates have a great potential for biotransformation of hydrocarbons. Regarding assimilation of synthetic rubber and natural, in silico analysis demonstrated that only the isolates from the species G. paraffinivorans have the Lcp gene (latex Clearing Protein) responsible for the first step of the assimilation of these substrates. The growth curves in natural and synthetic rubber as carbon source were conducted over 11 weeks and demonstrate the ability of these substrates to support the robust growth of G. paraffinivorans . During 80 days, it was possible to evidence the presence of bacilli and the formation of biofilms on natural and synthetic rubber by SEM. This is the first report in the literature of G. paraffinivorans as a rubber degrader and the third species of the genus Gordonia with this ability. Given the complexity of this substrate and the shortage of micro-organisms with this capacity the description and characterization of this isolate is of great originality and biotechnological relevance.

O processo fermentativo da Saccharomyces cerevisiae para a produção de etanol tem grande relevância para o Brasil por ser responsável por uma fonte de energia renovável que é amplamente usada na indústria automotiva. No entanto, em escalas industriais, a fermentação da levedura não ocorre em ambiente asséptico, sendo que diferentes micro-organismos contaminantes são capazes de crescer, competir por nutrientes e até mesmo interferir na fermentação da S. cerevisiae. A fim de melhor compreender quem são os micro-organismos contaminantes e o que fazem na dorna de fermentação, foi utilizado uma abordagem polifásica. O levantamento da microbiota bacteriana presente nas usinas do estado de São Paulo foi realizado através de técnicas independentes de cultivo. Posteriormente, foram realizados ensaios fermentativos com S. cerevisiae CAT-1 na presença do contaminante Lactobacillus fermentum (I-2) para a análise da interação destes na dorna de fermentação. A análise foi realizada por metabolômica acessada através da cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS) e, para isso, inicialmente foi estabelecida uma metodologia eficiente para análise através de GC-MS. Nas usinas, foi reportada uma porcentagem de Lactobacillus maior do que a descrita e a população bacteriana pareceu ser característica de cada usina e persistente ao longo do tempo. Já o estabelecimento da metodologia de análise de metabólitos da fermentação por GC-MS possibilitou a identificação de 261 metabólitos, e as três classes mais abundantes foram Carbohydrates and carbohydrate conjugates (16%), Carboxylic acids and derivatives (12%) e Fatty Acyls (5%). E no ensaio de S. cerevisiae CAT-1 na presença do contaminante L. fermentum (I-2), possibilitou a identificação de 208 metabólitos, onde 50 foram diferencialmente abundantes. Além disso, a via glicolítica foi reforçada na fermentação de S. cerevisiae CAT-1, sendo que nas fermentações de S. cerevisiae (CAT-1) na presença de L. fermentum (I-2), a produção de aminoácidos a partir do glutamate pareceu ser importante. Desta forma, uma análise polifásica pode auxiliar no esclarecimento da relação dos micro-organismos contaminantes com a levedura dentro da dorna de fermentação. The fermentation of Saccharomyces cerevisiae for ethanol production has great importance to Brazil since it is responsible for the production of a renewable energy source that is widely used in the automotive industry. However, in industrial scale, the yeast fermentation does not occur in an aseptic environment, where different contaminant microorganisms are capable of growing, competing for nutrients and even interfering with the S. cerevisiae fermentation. In order to better understand who the contaminating microorganisms are and what they do in the fermenter, it was used one polyphasic approach. The survey of the bacterial microflora present in two different São Paulo state distilleries was carried out by cultivation independent techniques. Subsequently, fermentation assays were performed with S. cerevisiae CAT-1 in the presence of the contaminant Lactobacillus fermentum (I-2) to analyze the interaction of these microorganisms in the fermenter. The analysis was performed through metabolomics accessed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and, for that, initially was established an efficient methodology for fermentation metabolite analysis by GC-MS. In the distilleries, it was reported a higher percentage of Lactobacillus than ever described and bacterial population appeared to be characteristic of each distillery and persistent over time. After the establishment of fermentation metabolite analysis methodology by GC-MS, it was possible to identify 261 metabolites, and the three most abundant classes were Carbohydrates and carbohydrate conjugates (16%), Carboxylic acids and derivatives (12%) and Fatty acyls ( 5%). In the fermentation assay of S. cerevisiae CAT-1 in the presence of the contaminant L. fermentum (I-2), it was possible to identify 208 metabolites, where 50 were differentially abundant. In addition, the glycolytic pathway was enhanced in the fermentation of S. cerevisiae CAT-1, and in fermentation of S. cerevisiae (CAT-1) in the presence of L. fermentum (I-2), the production of amino acids from glutamate appeared to be important. Thus, a polyphasic analysis can help in the understanding of the relationship between contaminating microorganisms with the yeast in the fermenter.

O material lignocelulósico, presente na biomassa vegetal, representa uma importante fonte de energia, entretanto necessita da ação das enzimas lignocelulolíticas para sua degradação. A busca por novas enzimas que atuam na quebra da parede celular da planta em comunidades microbianas evoluídas naturalmente em um ambiente de degradação de biomassa como o rúmen oferece uma estratégia promissora para a prospecção de genes. Com isso, o projeto teve como objetivo a identificação de genes degradarores de biomassa vegetal em microrganismos do rúmen de ovinos usando a abordagem metagenômica. Para tanto, foram coletadas amostras da fase sólida do rúmen de 6 animais fistulados (Ovis aries) divididos em dois grupos e submetidos a duas dietas por 60 dias: tratamento controle e tratamento com dieta contendo bagaço de cana-de-açúcar. O DNA metagenômico total das amostras foi extraído e sequenciado na plataforma MiSeq Personal Sequencer (Illumina®). A análise dos dados para a anotação taxônomica e funcional foi realizada no software MG-RAST. A caracterização dos genes degradadores de biomassa vegetal foi feita na plataforma CLC Genomic Workbench v.5.5.1(CLC Bio, Denmark) e a anotação de 4,68 gigabases de dados foi feita no banco de dados CAZy. A análise taxonômica mostrou uma predominância do domínio Bacteria compondo mais de 96% de todas as amostras, sendo os filos mais abundantes Bacteroidetes, Firmicutes, seguido de Proteobacteria. Entre todos os filos anotados, cinco tiveram a abundância aumentada no tratamento com adição de bagaço de cana-de-açúcar na dieta, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes e Verrucomicrobia, e dois filos foram mais abundantes no tratamento controle, Bacteroidetes e Synergistetes. De modo geral, a análise de ordenação não mostrou correlação entre a composição do microbioma e o tipo de dieta, porém, na análise funcional, essa correlação foi observada uma vez que houve separação entre os tratamentos. A abundância relativa das famílias de enzimas relacionadas à degradação de carboidratos segue um padrão similar em todas as amostras metagenômicas. O módulo catalítico da família de Glycoside Hydrolases (GH), o qual foi anotado em 129 subfamílias diferentes, foi o mais abundante em todas as amostras (45,5%), seguido da família GT (Glicosyl Tranferase), anotada em 97 subfamílias diferentes e CBM (Carbohydrete-Bining Module), em 78 subfamílias. A montagem do metagenoma resultou em aproximadamente 110.000 contigs e possibilitou a identificação de 15 diferentes genes completos codificados nas subfamílias GH1, GH2, GH3, GH16, GH20, GH25, GH32, GH97 e GH127. A análise comparativa dos diferentes tratamentos mostrou uma maior abundância dessas enzimas no rúmen dos animais alimentados com a dieta enriquecida com bagaço de cana-de-açúcar. Em conclusão, a manipulação da dieta de ovinos por meio da substituição de parte da fração fibrosa da dieta por bagaço de cana-de-açúcar promove o enriquecimento de enzimas que degradam a biomassa vegetal no rúmem, favorecendo a prospecção e identificação de genes ativos em carboidratos. The lignocellulose present in the plant biomass is a promising source of energy generation. However, the breakdown of plant biomass into simple sugars for bioethanol production is still inefficient and costly due to the recalcitrant nature of the plant fiber. The sheep rumen microbiome is specialized in degradation of plant material, but most members of this complex community are uncultured in the laboratory. Therefore, the search for new lignocellulolytic enzymes in microbial communities naturally evolved in biomass degradation environments, such as the rumen, using the exploration of the metagenome, is a promising strategy for identifying new genes. In this context, this study aimed to prospect plant biomass-degrading genes, selected from the sheep rumen microorganisms. The rumen samples were collected from 6 fistulated animals (Ovis aries), divided into two groups and subjected to two diets: control treatment and a treatment with a diet amended with sugarcane bagasse. The animals were fed for 60 days before sampling. To characterize the composition and functions of the rumen microbiome followed by the search of biomass-degrading genes, the metagenomic DNA was extracted from the solid contents of rumen and sequenced in MiSeq Personal Sequencer platform (Illumina®). The taxonomic and functional data were performed using MG-RAST software. For the characterization of the plant biomass degrading genes, they were analyzed on the CLC platform Genomic Workbench v.5.5.1 (CLC Bio, Denmark) and 4.68 gigabases of data was annotated against the CAZy database. The taxonomic analysis showed a predominance of the Bacteria domain composing more than 96% of all the samples, being the most abundant phyla Bacterioidetes, Firmiutes, followed by Proteobacteria. Five bacterial phyla were significantly more abundant in the treatment were sugarcane bagasse was added, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes and Verrucomicrobia, and two phyla were more abundant in the control treatment, Bacteroidetes and Synergistetes. In general, the ordination analysis did not show correlation between diet type and rumen microbiota, but in the functional analysis, this correlation was observed since there was separation between the treatments. The relative abundance of enzyme families related to carbohydrate degradation follows a similar pattern of abundance across all metagenomic samples. The catalytic module of the GH (Glycoside Hydrolases) family, which was annotated in 129 different subfamilies, was the most abundant in all samples (45.5%), followed by the GT family (Glycosyltransferase), annotated in 97 different subfamilies and CBM (Carbohydre-Bining Module) in 78 sub-families. Metagenome assembly resulted in ~110,000 contigs enabled the retrieval of 15 complete different genes encoded in the subfamilies GH1, GH2, GH3, GH16, GH20, GH25, GH32, GH97 and GH127. A comparative analysis between the groups of animals in the different treatments showed a greater abundance of enzymes, with no metagenome of the fiber proven from the group of animals fed a diet enriched with sugarcane bagasse. These results show the sheep rumen microbiome as an untapped source of potential new fibrolytic enzymes. Using a diet amended with sugarcane bagasse increases the abundance of CAE and provide a substantially expanded catalog of genes participating in the deconstruction of plant biomass.

Vibrio cholerae é uma bactéria autóctone em ecossistemas aquáticos, os fatores responsáveis pela virulência podem contribuir com a patogenicidade, influenciados por fatores genéticos e ambientais. Considerando a importância de conhecer e monitorar o V. cholerae, o estudo pretende caracterizar isolados da especie e padronizar uma metodologia para detecção em amostras de água. Os isolados foram avaliados por metodologias clássicas e moleculares, para confirmar espécie. Também, foi avaliada a presença de genes de virulência, susceptibilidade aos antibióticos e resposta em modelo invertebrado. Tres marcadores moleculares foram avaliados por PCR quantitativa. Observou-se que setenta dos isolados pertenciam a espécie V. cholerae e mostraram variação na prevalência dos genes de virulência e ao perfil de suscetibilidade ao antibióticos. Mostrou uma influencia da temperatura e concentração do inoculo no modelo invertebrado. Os marcadores moleculares selecionados mostraram a viabilidade da metodologia proposta neste estudo pela alta especificidade e sensibilidade. Vibrio cholerae is an autochthonous bacterium in aquatic ecosystems, factors responsible for virulence may contribute to pathogenicity, influenced by genetic and environmental factors. Considering the importance of knowing and monitoring V. cholerae, the study pretend to characterize selected isolates and to standardize a methodology for detection in water samples. The isolates were evaluated by classical and molecular methodologies to confirm species. Also, the presence of factors associated with virulence, antibiotics susceptibility and response in invertebrate model were evaluated. Three molecular markers were evaluated by quantitative PCR. It was observed that seventy of the isolates belonged to the V. cholerae species and showed a variation in the prevalence of the virulence genes and the antibiotic susceptibility profile. Also, showed an influence of the inoculum temperature and concentration on the invertebrate model. The selected molecular markers showed the viability of the methodology proposed in this study for the high specificity and sensitivity.

No controle da qualidade da água, parâmetros microbiológicos são avaliados e devem estar de acordo com os limites estipulados em portarias e resoluções. Todas as metodologias de monitoramento microbiano demandam o cultivo dos organismos-alvo. Em muitos casos, as cepas isoladas devem ser analisadas por teses fenotípicos para determinação da espécie. Por meio de inóculos de E. coli, demonstrou-se que a variação na técnica de plaqueamento se deve especialmente à falta de consistência entre as diluições. Além disso, para a análise de réplicas, comarando-se as médias de dois métodos de diluição, foi demonstrado que ser utilizado apenas uma série de diluição derivada de um único inóculo. Utilizando-se culturas puras de E. coli, E. faecalis e P. aeruginosa, a recuperação foi similar entre os meios seletivos respectivos (m-Endo, m-EI, m-PA-C) e meio não seletivo (Tripticase Soy Agar). A utilização da técnica de membrana filtrante resultou em contagens significativamente maiores para E.coli e E. faecalis em comparação ao método de spread plate. A microbiota natural presente na água potável (torneira) não influenciou significativamente as contagens de E. coli, E. faecalis e P. aeruginosa em meios seletivos. Entretanto, na água mineral engarrafada inoculada artificialmente com P. aeruginosa, a contagem foi significativamente maior na réplica estéril. Na análise de água marinha, e na réplica não estéril inoculada com E. faecalis, a contagem foi signifivativamente menor e as células de P. aeruginosa produziram colônias atípicas. Analisando-se amostras do meio ambiente (biofilmes de estação de tratamento de água, lodo de esgoto e água de córrego contaminado), 45 colônias típicas isoladas em meios de cultura seletivos foram identificadas por meio do sequenciamento do gene 16S rRNA, testes bioquímicos e MALDI-TOF. Os resultados de sequenciamento do gene 16SrRNA tiveram baixa correlação com a identificação dos organismos por testes bioquímicos (46,6% em nível de gênero e 20% em nível de espécie) e MALDI-TOF (60% em nível de gênero e 48,8% em nível de espécie). Para as cepas identificadas como E. coli e Enterococcus spp., a correlação entre o sequenciamento e MALDI-TOF foi de 75% e 62%, respectivamente. Uma vez que a quantificação de micro-organismo por membrana filtrante depende do micro-organismo em análise e do tipo de água, é necessário que os laboratórios realizem testes de padronização antes de implementar essa metodologia. Os resultados demonstram que os métodos convencionais utilizados não são adequados e suficientes para a análise da qualidade da água e, portanto, novas metodologias devem ser empregadas. Idealmente devem ser utilizadas técnicas baseadas em características fenotípicas, genômica e proteômica cujos resultados são complementares e fornecem uma identificação mais acurada. All over the world regulatory agencies specify microbiological water quality parameters to guarantee water safety. Conventional microbiological water quality analysis is based on the cultivation of the target organisms. In many analysis protocols, phenotypic assays of isolated strains are mandated for species determination. Reference samples are required for quality assessment and quality control of analytical protocols. Using E. coli as a model organism, it was demonstrated here that the variability of plate counts of reference cultures is caused mainly by the spread of counts in individual serial dilutions. Besides, comparing the means obtained by two dilution approaches, it was demonstrated that in the analysis of replicates it is possible to use only a set of dilutions derived for a unique inoculum. Recovery of pure cultures of E. coli, E. faecalis and P. aeruginosa was similar on selective culture media (m-Endo, m-EI, m-PA-C) and with the non-selective medium (Tripticase Soy Agar). The membrane filter technique yielded significantly higher counts for E.coli and E. faecalis in comparison to spread plate method. The autochthonous microbiota of potable water (tap water) did not influence the counts of E. coli, E. faecalis and P. aeruginosa on selective culture media. However, the sterile replica of mineral water spiked with P. aeruginosa showed higher counts for these bacteria. For marine water analysis, the non-sterile replica spiked with E. faecalis yielded low counts and P. aeruginosa produced an atypical colony. Both, sample-induced variation in target strain recovery and colony appearance on culture plates indicates the requirement for method evaluation tests on particular sample matrices before implementing routine microbiological analysis by culture-based methods in the laboratory. 45 typical colonies obtained from environmental samples in selective culture media (biofilms from activated sludge, drinking water treatment plants and water from creek contaminated with raw sewage) were analyzed by 16S rRNA gene sequencing, biochemical phenotypic assays and MALDI-TOF. Sequencing showed low correlation with phenotypic assays (46,6% at the genus level and 20% at the species level) and MALDI-TOF (60% at the genus level and 48,8% at the species level). On the other hand, the strains identified as E. coli an Enterococcus spp. by 16S rDNA gene sequencing demonstrated a high correlation with MALDI-TOF (75% and 62%, respectively). Since the results showed that conventional methods aren´t suitable and sufficient to assess water quality, new technologies should be employed. Ideally, techniques should be based on phenotypic, genomic and proteomic features since the results are complementary and provide a more accurate identification.

Burkholderia seminalis tem sido encontrada tanto em interações patogênicas, quanto não patogênicas. O gene wcbE codifica uma glicosiltransferase e pertence ao cluster wcb, que está relacionado à síntese de cápsula. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel do gene wcbE e da temperatura nas interações microbianas de B. seminalis TC3.4.2R3. A produção de biofilme, EPS e compostos antifúngicos foi maior a 28 ºC. Por outro lado, a motilidade, virulência e respostas ao estresse foram maiores a 37 ºC. wcbE produziu menos biofilme que WT e foi atenuada em G. mellonella a 37 ºC, destacando a importância da glicosiltransferase na patogênese. Além disso, wcbE perdeu a habilidade de inibir fungos fitopatogênicos. Embora B. seminalis seja um membro do Bcc, é eficiente contra patógenos clínicos e ambientais, indicando que esta linhagem pode ter interações múltiplas no ambiente. A temperatura e o gene de glicosiltransferase desempenharam um papel crucial nas interações ambientais de B. seminalis TC3.4.2R3. Burkholderia seminalis has been found in both pathogenic and nonpathogenic interactions. The wcbE gene encodes a glycosyltransferase and belongs to the wcb cluster, which is related to capsule synthesis. The aim of this work was to investigate the role of the wcbE gene and temperature in the microbial interactions of B. seminalis TC3.4.2R3. The production of biofilm, EPS and antifungal compounds was higher at 28 ºC. On the other hand, the motility, virulence and stress responses were higher at 37 ° C. wcbE produced less biofilm than WT and was attenuated in G. mellonella at 37 ° C, highlighting the importance of glycosyltransferase in the pathogenesis. Furthermore, wcbE lost the ability to inhibit phytopathogenic fungi. Although B. seminalis is a member of Bcc, it is effective against clinical and environmental pathogens, indicating that this strain may have multiple interactions in the environment. The temperature and the glycosyltransferase gene played a crucial role in the environmental interactions of B. seminalis TC3.4.2R3.

A aplicação de microrganismos capazes de adsorver metais se destaca dentre as técnicas para biorremediação ambiental. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar bactérias com potencial de emprego nesta tecnologia. A partir de amostras de solo, água e sedimentos coletadas da mina Sossego da VALE em 4 eventos de coleta, foram isoladas 73 bactérias resistentes à altas concentrações de Cu2+. Para a identificação dos isolados utilizaram-se diversos métodos: MALDI-TOF; sequenciamento de parte dos genes 16S rRNA e rpoD; construção de árvores filogenéticas; e provas bioquímicas. Foram selecionadas 12 bactérias pertencentes a pelo menos, 8 espécies diferentes, sendo a maioria pertencente ao gênero Cupriavidus. 75% dos isolados apresentou resistência a Cu2+ superior a de C. metallidurans CH34, bactéria mais resistente a Cu2+ conhecida. Valores de adsorção de Cu2+ superiores aos desta bactéria também foram observados em 5 isolados. Os resultados obtidos indicam que os isolados selecionados apresentam alto potencial para aplicação em biorremediação ambiental. The application of microorganisms capable of adsorbing toxic metals stands out from other bioremediation techniques. This study aimed to isolate and identify bacteria with potential for bioremediation of environments contaminated by copper ions. From soil, water and sediment samples collected at VALE`s Sossego mine collected at 4 different occasions, 73 copper resistant bacteria were isolated. For the identification of the isolates, various methods were used: MALDI-TOF, sequencing of part from the genes rRNA and rpoD; construction of phylogenetic trees; and biochemical tests. 12 bacteria that belong to at least 8 different species were selected. 75% of the isolates were resistant to Cu2+ exceeding C. metallidurans CH34, the, most resistant bacteria to Cu2+ known. The ion adsorption capacity of 5 isolates was greater than those for C. metallidurans. The results obtained for the bacterial isolates indicate that they have a high potential for application in environmental bioremediation.

Fungos aquáticos são o maior grupo microbiano decomponedor de sustâncias orgânicas, atuando na ciclagem de nutrientes, fluxo de energia e equilíbrio biológico. O Brasil é tido como um dos países com a maior biodiversidade, porém, existem poucos estudos sobre a diversidade microbiana em ambientes aquáticos e o prejuízo e consequências dos poluentes. O Rio Tietê foi estudado com o objetivo de caracterizar a diversidade de fungos da água e do sedimento por meio de técnicas dependentes e independentes de cultivo e correlacioná-las às variáveis ambientais. A diversidade fúngica foi avaliada em 30 pontos de água, entre Agosto e Novembro de 2013, e Fevereiro à Abril de 2014 e 10 pontos de sedimento, entre agosto a outubro de2013 e de julho a setembro de 2014. Foram obtidos 451 e 442 fragmentos terminais de restrição (TRFs) para a primeira e segunda coleta de água, 349 e 354 TRFs para o sedimeto. As análises de Redundância (RDA) agruparam as amostras de acordo com o índice de qualidade de agua, sendo os parâmetros de pH, temperatura, nitrato e D.O. os mais significativos para a estruturação na água; e cadmio, níquel e zínco para o sedimento, confirmando que a alteração destes pode modificar a estrutura da comunidade fúngica do Rio Tietê. Aquatic fungi are the most decomposer microbial group of organic substances, developing a key role in nutrient cycling, energy flow and biological equilibrium. Brazil is considered one of the countries with the highest biodiversity, hence, few studies exist about microbial diversity in aquatic environments and the damage of pollution. Tiete River was studied in order to characterize the diversity of water fungi and the sediment of the river basin through independent and dependent culture techniques and correlate them to environmental variables. Therefore, the fungal diversity was evaluated in 30 points of water between August - November of 2013, and February - April of 2014 and 10 sediment points, between August - October of 2013 and July - September of 2014. 451 and 442 Terminal Restriction Fragments - TRFs were obtained for the first and second collection of water, and 349 and 354 TRFs for the sediment collection. The redundancy analyses - RDA showed the grouping of samples according to water quality index, being the pH, temperature, nitrate and DO the most significant parameters for the structuring of water; and cadmium, nickel and zinc of sediment, confirming that the change of these parameters may modify the structure of the fungal community in Tiete River.

O comércio mundial de enzimas industriais estava estimado em 2.3 bilhões de dólares entre detergentes (U$ 789 milhões), aplicações alimentícias (U$ 634 milhões), agricultura (U$ 237 milhões), entre outros. Neste contexto, as enzimas lipolíticas estão atraindo enorme atenção devido ao seu potencial biotecnológico, visto que estas podem catalisar múltiplas reações (hidrólise, acidólise, interesterificação e glicerólise). Enzimas lipolíticas de origem microbiana são economicamente atrativas por serem biodegradáveis, atuarem normalmente em condições brandas, e serem quimio-seletivas propiciando à indústria farmacêutica a obtenção de drogas com efeito colateral reduzido. Neste projeto, quatro genes potenciais codificadores de esterases/lipases, advindos de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, foram clonados em vetores de expressão e expressos em Escherichia coli BL21 (DE3), e as proteínas correspondentes foram submetidas a ensaios funcionais e estruturais. The global trade of industrial enzymes is estimated at 2.3 billion U.S. dollars, divided mainly between detergents (US$ 789 million), food applications (US$ 634 million), and agriculture (US$ 237 million). Within this trade, lipolytic enzymes have attracted enormous attention because of their biotechnological potential as catalysts of multiple reaction types (including hydrolysis, acidolysis, interesterification and glycerolysis). Lipolytic enzymes of microbial origin are economically attractive because they are easily biodegradable, usually act in mild conditions, and are chemo-selective, providing the pharmaceutical industry a method for obtaining drugs with reduced side effects. In this project, four individual genes encoding putative esterases/lipases identified in a metagenomic library obtained from a microbe consortium isolated from diesel oil-contaminated soil were cloned into expression vectors and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and their corresponding recombinant proteins were used for functional and structural studies.

N-acetil-glucosamina é um composto de importância biotecnológica com grande potencial de aplicação nas áreas de farmácia, medicina e dermatologia. É atualmente produzido pela hidrólise química da quitina, o polissacarideo mais abundante no ambiente marinho e o principal constituinte do exoesqueleto dos artrópodes. No entanto, os processos geralmente utilizados são prejudiciais ao meio ambiente, têm baixo rendimento e alto custo. Este estudo demonstra um dos mais eficientes processos de produção enzimática de N-acetil-glucosamina a partir de -quitina utilizando quitinases bacterianas como uma alternativa sustentável aos processos atuais e isolados de A. caviae com grande potencial para produção de quitinases e derivados de quitina. N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) is a compound of biotechnological importance with great application potential in the areas of pharmacy, medicine and dermatology. GlcNAc is currently produced by the chemical hydrolysis of chitin, the polysaccharide most abundant in the marine environment and the principal constituent of the exoskeleton of arthropods. However, the processes generally used are environmentally unfriendly, have low yield and high cost. This study demonstrates the most efficient processes for enzymatic production of N-acetyl-glucosamine from -chitin using bacterial chitinases as a sustainable alternative to the current processes and A. caviae isolates with great potential for chitinases and chitin derivatives production.

Burkholderia sacchari é uma espécie de bactéria capaz de acumular polihidroxialcanoatos em condições de limitação de um nutriente essencial e excesso de fonte de carbono. A partir do substrato sacarose, acumula o polímero poli-3-hidroxibutirato (P3HB), poliéster biodegradável de propriedades semelhantes às dos plásticos de origem petroquímica. A partir de sacarose e propionato como fontes de carbono, ela é capaz de acumular o copolímero poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (P3HB-co-3HV), que é mais maleável que o polímero P3HB. No entanto, apenas uma pequena porcentagem do propionato fornecido é convertida em 3HV. Isto se deve à presença de outras vias de catabolismo muito eficientes que transformam o propionato em biomassa, reduzindo a eficiência na produção do copolímero. Estudos em mutantes UV prp-, indicaram que duas vias de catabolismo de propionato podem atuar em B. sacchari: α-oxidação e o ciclo de 2-metilcitrato (2MCC). Esta última teve sua comprovação molecular comprovada, já a outra ainda está sendo estudada, mutantes afetados no consumo de intermediários da α-oxidação foram complementados fragmentos de DNA, obtidos de uma biblioteca genômica de B. sacchari os quais, após sequenciamento e comparação do banco de dados, verificou-se codificarem um regulador transcricional LysR. A análise dos genes adjacentes ao regulador sugeriu que poderiam compor um operon de uma via de α-oxidação. Diante disso, este trabalho busca a comprovação molecular da via da α-oxidação para o catabolismo de propionato em B. sacchari. Burkholderia sacchari is a species of bacteria capable of accumulating polyhydroxyalkanoates under limiting conditions of an essential nutrient and excess carbon source. From the sucrose substrate, it accumulates polymer poly-3-hydroxybutyrate (P3HB), biodegradable polyester with properties similar to those of petrochemical plastics. From sucrose and propionate as carbon sources, it is able to accumulate the poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (P3HB-co-3HV) copolymer, which is more malleable than the polymer P3HB. However, only a small percentage of the supplied propionate is converted into 3HV. This is due to the presence of other very efficient catabolic pathways that transform the propionate into biomass, reducing the production efficiency of the copolymer. Studies on prp- UV mutants have indicated that two pathways of propionate catabolism may act on B. sacchari: the α-oxidation and the 2-methylcitrate cycle (2MCC). The latter had its molecular proof proven, while the other is still being studied, mutants affected in the consumption of α-oxidation intermediates were complemented DNA fragments obtained from a genomic library of B. sacchari which, after sequencing and comparison of the bank Coding for a LysR transcriptional regulator. Analysis of the genes adjacent to the regulator suggested that they could compose an operon of an α-oxidation pathway. In view of this, this work seeks the molecular proof of the α-oxidation pathway for the propionate catabolism in B. sacchari.

Vulcões ativos na Antártica contrastam com a paisagem predominantemente gelada do continente. Eles fornecem condições únicas capazes de selecionar uma grande variedade de adaptações microbianas. A Ilha Deception localiza-se na região da Península Antártica e difere de outros vulcões antárticos especialmente pela influência marinha e temperaturas mais elevadas. Foram coletadas amostras de sedimentos associados a fumarolas e geleiras em dois sítios geotermais de Deception, com temperaturas variando entre 0°C a 98°C. Diferentes técnicas independentes de cultivo foram empregadas com o intuito de entender como as comunidades microbianas respondem as variações ambientais extremas produzidas pela atividade vulcânica. Os resultados indicaram que a co-ocorrência de arqueias hipertermófilas e suas adaptações com micro-organismos metabolicamente diversos adaptados a regiões geladas representa uma estrutura de comunidades única para ecossistemas antárticos. Este trabalho forneceu dados ineditos sobre questoes centrais de diversidade e adaptacao microbiana a ambientes geotermais polares. Active volcanoes in Antarctica contrast with the predominately icy landscape. They harbor unique conditions capable to select an extreme range of microbial adaptations. Deception Island is located in the Antarctic Peninsula region and differs from other Antarctic volcanoes specially by its higher temperatures and marine influence. We collected sediment samples associated to active fumaroles and glaciers on two geothermal sites of Deception Island, with temperatures ranging from 0°C to 98°C. Different cultivation-indepedent techniques were used to understand how microbial communities respond to extreme environmental variations produced by volcanic activity. The results indicate that co-occurrence of hyperthermophiles and their specific adaptations with metabolically diverse cold-adapted micro-organisms represents a unique community structure for antarctic ecosystems. This study provided primordial data on central questions about microbial diversity and adaptation to polar geothermal environments.

A crescente resistência dos micro-organismos patogênicos aos fármacos já existentes gera intensa demanda por novos agentes terapêuticos. Em contrapartida, a eficiência na descoberta de compostos com novas estruturas químicas diminuiu nos últimos anos. Tendo em vista a vasta biodiversidade existente de micro-organismos, a redução da eficiência na descoberta de novos produtos naturais não indica que todos compostos existentes já foram descritos, mas sim que as metodologias para isolamento dos mesmos devem ser aperfeiçoadas e diversificadas, e novos nichos devem ser explorados. Esta tese compreende três capítulos, que trazem abordagens que podem ser utilizadas na busca por produtos naturais. O capítulo 1 aborda a aplicação de conhecimentos de biologia molecular na pesquisa de produtos naturais, através da metagenômica. O capítulo 2 aborda o conceito de química ecológica para estimular o metabolismo secundário, através da utilização de interações microbianas. O capítulo 3 aborda o uso de genome mining para entender a capacidade metabólica de uma linhagem bacteriana, bem como o uso de variações nos parâmetros da cultura para alterar o metabolismo desta. Metagenômica: a triagem anti-parasitária das bibliotecas metagenômicas detectou clones bioativos contra Leishmania major. As análises químicas e biológicas das culturas destes clones não permitiram a identificação dos compostos responsáveis pelas atividades observadas. Esta abordagem apresenta grandes desafios técnicos e tem passado por ajustes envolvendo sequenciamento e bioinformática para aumentar a taxa de sucesso em seu uso. Interações microbianas: esta metodologia mostrou-se promissora para a busca por compostos bioativos, tendo em vista que diversos pares exibiram nova atividade antibiótica, corroborando a hipótese que interações microbianas podem levar à expressão diferenciada do metabolismo secundário. Foi escolhida para caracterização química e biológica a interação entre uma actinobactéria rara (Krasilnikovia sp. T082) e uma actinobactéria endossimbionte de besouro (Streptomyces sp. SPB78). Esta interação é robusta e estimula a biossíntese de um antibiótico polar capaz de inibir o crescimento de uma bactéria multirresistente. Diversas técnicas foram testadas para o isolamento do composto indutor e do antibiótico induzido. Este processo foi desafiador devido ao caráter polar de ambos compostos e pelo fato da atividade antibiótica ser instável. Foi demonstrado que o antibiótico induzido é capaz de inibir o crescimento do micro-organismo indutor, sugerindo importância ecológica deste composto. A utilização desta abordagem metodológica permitiu a identificação de uma linhagem pertencente a um gênero de actinobactéria rara que nunca teve seu metabolismo secundário estudado (Krasilnikovia). Isto foi realizado através da investigação de seu genoma e também através do isolamento de compostos produzidos por esta linhagem. Esta linhagem demonstrou potencial para a produção de metabólitos secundários, apresentando pelo menos 21 potenciais clusters gênicos biossintéticos detectados pelo antiSMASH em seu genoma. Esta linhagem foi cultivada em dois meios de cultura (ISP2 e TSB) e diferentes metodologias de extração foram empregadas. O metabolismo secundário desta linhagem é expresso de maneira diferente de acordo com a metodologia de cultivo, evidenciando a importância da variação da composição do meio de cultura para o acesso da real capacidade metabólica de microorganismos. Foram identificadas algumas dicetopiperazinas, que são conhecidas por seu amplo espectro de atividades biológicas, e três compostos pertencentes a uma classe de peptídeos nãoribossomais não usuais com atividade antibiótica, que possuem estrutura química complexa e incomum para produtos naturais Increasing drug resistance among microbial pathogens is a public health threat; therefore, new antibiotics are needed. On the other hand, the rate of discovering new compounds has diminished. Considering the wide biodiversity of microorganisms, reduced efficiency on the discovery of new natural products does not indicate that all existing compounds have been described, but that methods for isolation should be improved and diversified and new niches should be explored. This thesis comprises three chapters that demonstrate approaches that can be used in the search for natural products. Chapter 1 demonstrates the application of molecular biology tools on the search for natural products through metagenomics. Chapter 2 discusses the concept of chemical ecology for the stimulation of secondary metabolism by the use of microbial interactions. Chapter 3 discusses the use of genome mining to understand the metabolic capacity of a bacterial strain as well as the use of different culture parameters to alter bacterial metabolism. The anti-parasitic metagenomic screening on metagenomic libraries detected bioactive clones against L. major. Chemical and biological analysis of cultures of these clones did not permit identifying the compounds responsible for the observed activities. This approach faces diverse technical challenges and is currently being improved by the use of sequencing and bioinformatics analysis in order to increase its hit rate. Microbial interactions: this approach has shown to be promising in the search for bioactive compounds, considering that several pairs exhibited new antibiotic activity, supporting the hypothesis that microbial interactions can stimulate differential expression of secondary metabolism. It was chosen for chemical and biological characterization the interaction between a rare actinobacteria (Krasilnikovia sp. T082), which belongs to a genus that its secondary metabolism has not yet been studied in the literature, and an endosymbiont actinobacteria of beetle (Streptomyces sp. SPB78). This interaction is robust and stimulates the biosynthesis of a polar antibiotic capable of inhibiting the growth of multi-resistant bacteria. Several techniques have been tested for the isolation process of the inducer compound and the induced antibiotic. This process has been particularly challenging due to the polar character of both compounds, and because the antibiotic activity is unstable. It has been shown that the induced antibiotic is capable of inhibiting the growth of the inducer microorganism, suggesting an ecological importance of this compound. The use of this co-culture approach led to the identification of a strain belonging to a rare actinobacteria genus whose secondary metabolism has never been studied before (Krasilnikovia). This was accomplished through sequencing and analysis of its genome and also by isolating compounds produced by this strain (chapter 3). This strain has shown great potential for the production of secondary metabolites, exhibiting at least 21 biosynthetic gene clusters detected by antiSMASH in its genome, and only four of them showed high similarity to any known gene cluster. This strain was cultured in two different culture media (ISP2 and TSB), and different methods of extraction were used. The secondary metabolism of this strain is expressed differently according to the method of cultivation, showing the importance of variation in the composition of the culture medium to access the actual metabolic capacity of microorganisms. Some diketopiperazine were isolated, which are known for their wide spectrum of biological activities, and also three compounds belonging to a class of non-ribosomal peptides known for their high bioactivity, which have complex and unusual chemical structures for natural products

Os copolímeros de 3-hidroxibutirato e 3-hidroxihexanoato (P3HB-co-3HHx) são da família dos polihidroxialcanoatos (PHA), materiais termoplásticos e biodegradáveis acumulados por bactérias a partir de fontes de carbono renováveis. O P3HB-co-3HHx desperta interesse industrial para frações de 3HHx menores que 20 mol%, assemelhando-se ao polietileno de baixa densidade. Neste projeto, criou-se um sistema genético para controlar a composição do copolímero P3HB-co-3HHx pela indução de genes da biossíntese de precursores 3HB. Baseado no promotor lac foram construídas cinco versões do plasmídeo de controle de copolímero (pCC) utilizando o promotor Lac. Porém, mesmo com a versão mais aprimorada, não foi possível o controle de composição de P3HB-co-3HHx em Pseudomonas sp. LFM461. Através de experimentos de atividade enzimática e RT-qPCR do cDNA do gene phaA e phaB, foi possível indicar que o problema está na impossibilidade do promotor Lac de promover expressão dos genes de biossíntese de 3HB presentes nos pCC. Polyhydroxyalkanoates (PHA) are polyesters material accumulated by bacteria which has thermoplastic and biodegradable proprieties and can be produced from renewable feedstocks. Copolymers of 3-hydroxybutirate and 3-hydroxyhexanoate (P3HB-co¬-3HHx) which contain less than 20mol% of 3HHx have being researched for its industrial proprieties. Recently, our laboratory has been researching a Pseudomonas sp. strain, LFM461, which can produce high 3HHx content when hosting PHA biosynthesis genes from Aeromonas. In this project, it was design a genetic system for control of P3HB-co-3HHX composition through induction of 3HB monomers biosynthesis. Thus, five versions of a copolymer control plasmid (pCC) was built based on Lac promoter. However, even through improvements on stability and expression profile of pCC it was not possible to stablish an assay of successful PHA composition control in Pseudomonas sp. LFM461. By enzymatic activity and RT-qPCR of cDNA experiments we have indications of problems of Lac promoter on driving the expression of 3HB genes in pCC.

As compostagens abrigam uma grande riqueza microbiológica, englobando populações com distintos requerimentos e tolerâncias fisiológicas que se sucedem ao longo do processo de biodegradação aeróbica da matéria orgânica e que resultam na elevação espontânea de temperatura até 80° C. Com a utilização de abordagens de metagenômica e metatranscritômica, investigamos a composição e a diversidade taxonômica, bem como as funções metabólicas de comunidades microbianas da compostagem termofílica do Parque Zoológico de São Paulo. Foram analisadas amostras em série temporal de duas composteiras (ZC3 e ZC4), as quais exibiram temperaturas entre 50ºC-75ºC ao longo de 99 dias do processo. Verificamos que a degradação de toda a biomassa foi realizada essencialmente por bactérias, e que a estrutura e composição das comunidades microbianas variam ao longo do processo, com elevada abundância relativa das Ordens Clostridiales, Bacillales e Actinomycetales, assim como observado em outros sistemas de compostagem. Entre os organismos abundantes no processo, identificamos unidades taxonômicas operacionais (OTUs) referentes a organismos não-cultiváveis e/ou com genoma ainda desconhecido. O genoma parcial de uma destas OTUs foi reconstruído, a qual provavelmente pertence a um novo gênero da ordem Bacillales. A dinâmica do processo de compostagem foi evidenciada pela variação do número de OTUs e do índice de diversidade filogenética ao longo do tempo, sendo que o início do processo e a fase após a revira apresentaram a maior diversidade. Os resultados indicam que o processo de revira (aeração da massa de composto) impacta fortemente a estrutura e a composição da microbiota e que a desconstrução da biomassa vegetal ocorre de forma sinérgica e sequencial. A variedade de microrganismos e de funções metabólicas ativas na compostagem termofílica reforça o seu potencial de ser uma promissora fonte de bactérias e enzimas termorresistentes úteis em processos industriais. Composting harbors considerable microbial richness, comprising populations with distinct physiological requirements and tolerances that succeed one another throughout the aerobic biodegradation of the organic matter, resulting in spontaneous temperature rise up to 80° C. Using metagenomic- and metatranscritomic-based approaches, we investigated the composition and taxonomic diversity as well as metabolic functions of microbial communities of a thermophilic composting operation in the São Paulo Zoo Park. We have analyzed time-series samples from two composting cells (ZC3 and ZC4) which exhibited sustained thermophilic profile (50°C-75°C) over 99 days of the process. We found that all biomass degradation was essentially performed by bacteria. The structure and composition of microbial communities vary throughout the process with a high relative abundance of Clostridiales, Bacillales and Actinomycetales, as observed in other composting systems. Among the organisms abundant in the process, we identify Operational Taxonomic Units (OTUs) of uncultivated organisms or with unknown genomes. The partial genome of one of these OTUs was obtained and shown to belong probably to a new genus of Bacillales. Our time-series data showed that the number of OTUs and phylogenetic diversity index changed during composting revealing the dynamics of the process, with the beginning and the stage after turning procedure presenting the highest diverse microbiota. These results indicate that the turning procedure (compost aeration) strongly impacts the microbiota structure and composition and that the deconstruction of the biomass occurs synergistically and sequentially. The huge diversity of microorganisms and metabolic functions active in thermophilic composting strengthen its potential as a promising source of new bacteria and thermostable enzymes that may be helpful in industrial processes.

Os manguezais são ecossistemas costeiros de transição formados entre o ambiente marinho e terrestre de zonas tropicais e intertropicais, e estão sujeitos ao regime de marés. Devido a tais condições, os microrganismos que vivem nos sedimentos sofrem constante pressão adaptativa. Nesse contexto, os Elementos Genéticos Móveis (EGMs) (fagos, plasmídeos e transposons) são fatores genéticos diretamente relacionados com a transferência horizontal de genes e podem facilitar processos de adaptação. Neste trabalho foram estudados os EGMs dos sedimentos de três áreas de manguezais do estado de São Paulo, duas localizadas no município de Bertioga e uma na reserva ambiental da Ilha do Cardoso, em Cananeia. Foram avaliadas a frequência e expressão dos diferentes tipos de EGMs no microbioma dos manguezais a partir de metagenomas e metatranscriptomas dos sedimentos, além da utilização de uma biblioteca de fosmídeos, montada a partir de DNA do sedimento de uma das áreas de Bertioga. As sequências de DNA e mRNA foram obtidas de três pontos amostrados por área, sequenciadas em equipamento Illumina HiSeq2000 e anotadas automaticamente na plataforma do MG-RAST. Para a biblioteca de fosmídeo, foi sequenciado um pool de todos os clones em equipamento Illumina HiSeq 2000. Contigs dessas sequências foram montados e fagos e profagos foram preditos e anotados automaticamente pelo pipeline VirSorter. As sequências preditas como fagos ou profagos foram anotadas manualmente. A partir da análise das sequências de metagenômica foi possível verificar que a participação dos EGMs no metabolismo total do microbioma dos manguezais corresponde de 6 a 15 % dos genes preditos, sendo que fagos e profagos correspondem a 90% dos genes associados aos EGMs. A partir dos contigs montados para as sequências da biblioteca, foram preditos e anotados automaticamente 27 fagos, dos quais nove fagos foram anotados manualmente em etapa posterior. Foram encontrados genes que codificam proteínas típicas de fagos, como capsídeo, transposase e integrase, além de genes acessórios potencialmente importantes, como relacionados ao sistema de transporte ABC e sistema de transporte tipo II. A partir da anotação manual, genes conservados de fagos foram utilizados como base para predição da linhagem viral. Foram identificados 6 tipos de vírus pertencentes à ordem Caudovirales, que infectam Proteobacteria e Firmicutes. Esse trabalho sustenta a hipótese de que os fagos infectam os grupos bacterianos mais abundantes nos manguezais e podem carregar genes importantes consigo, desempenhando papel chave na evolução das bactérias nesse ambiente. Mangroves are coastal transitional ecossystems between marine and terrestral environments of tropical and intertropical zones and are subject to tidal regime. Due those condictions, microorganisms that lives in the sediments suffer constant adaptative pressure. In this context, Mobile Genetic Elements (MGEs) (phages, plasmids and transposons) are genetic fators directly related with horizontal gene transfer and can facilitate adaptation processes. In this work MGEs were studied in the sediments of three mangrove areas in São Paulo state, two located in Bertioga county and one in environmental reserve of Ilha do Cardoso, in Cananeia. Frequency and expression were avaliated for diferente EGMs types in mangrove microbiome from the sediments metagenomes and metatranscriptomes, besides utilization os a fosmid library assembled from a Bertioga area sediment DNA. The sequences of DNA and mRNA were obtained from three sampled points, sequenced in Illumina HiSeq2000 equipment and automatically anotaded in MG-RAST plataform. A pool of all clone were sequenced for fosmid library in Illumina HiSeq2000 equipment. Contigs were assembled and phages and prophages were automatically predicted in VirSorter pipeline. The phages or prophages predicted sequences were manually anotaded. From the analisys os metagenomic sequences was possible to verify that the MGEs participation in total microbiome metabolism stands for 6 to 15% of predicted genes, wich 90% corresponds to phage associated genes. From contigs assembled of library sequences, 27 phages were predicted and annotaded, wich nine code for phage typical proteins, as capsid, transposase and integrase, besides accessory genes potencially important, as ABC transporter and type II transport related. Phage conserved genes were used as base for viral lineage prediction. 6 viral types belonging do Caudovirales order were identified, which infects Proteobacteria and Firmicutes. This work supports the hypothesis that phages infect the most abundant bacterial groups in mangroves and can carry important genes playing a key role in bacterial evolution in this environment.

As bromélias habitam os mais diferentes ambientes sendo que muitas são encontradas como epífitas. Essas últimas estão sujeitas a condições de disponibilidade de água e nutrientes com intermitência. Elas conseguem sobreviver a essas circunstâncias por serem dotadas de diversas adaptações morfológicas e fisiológicas. A bromélia tanque Guzmania monostachia tem sido bastante estudada por possuir uma grande plasticidade fotossintética, porém, pouco é conhecido a respeito de outras possíveis adaptações como a interação com micro-organismos. Sendo assim, o presente trabalho isolou bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) tanto da parte externa (epifíticas) quanto da parte interna (endofíticas) de diferentes porções (ápice, mediana e base) de folhas coletadas tanto no ambiente natural quanto na casa de vegetação. As bactérias foram selecionadas por meio do ensaio de redução de acetileno (ARA) e também pelo uso de quatro diferentes meios de cultura que não contém fonte de nitrogênio reduzido. As linhagens isoladas foram identificadas por meio do gene 16sRNA. Dois isolados Pseudomonas sp. e Burkholderia sp. foram escolhidos para serem marcados com um gene de fluorescência verde (GFP) e foram então inoculados (separadamente) em plantas de G. monostachia cultivadas em casa de vegetação. A colonização dos tecidos foliares foi monitorada com auxílio de um microscópio confocal. Além disso, foram estimadas as densidades populacionais epifíticas e endofíticas em diferentes grupos foliares (jovens e intermediários) e as folhas do grupo intermediário por serem maiores e totalmente expandidas foram divididas em porções (apical, mediana e basal). Também foram pesquisadas as seguintes moléculas descritas como importantes na interação entre planta e micro-organismo: óxido nítrico (NO), ácido salicílico (SA), etileno (ET) e ácido-indol-3-acético (IAA). Como resultados, a maioria das linhagens bacterianas foram classificadas como pertencentes ao grupo Proteobacteria, mas também foram encontrados isolados gram positivos pertencentes aos grupos Actinobacteria e Firmicutes. As bactérias endofíticas foram isoladas somente da porção basal foliar (tanto das folhas originadas do meio ambiente quanto das folhas originadas da casa de vegetação). Cabe ressaltar que após a inoculação de ambas bactérias marcadas com GFP, foi observado elas no interior dos tricomas foliares (estruturas presentes principalmente na base foliar). Após 20 horas da inoculação, ambas bactérias já foram visualizadas no interior da epiderme das folhas. Após 5 dias as bactérias foram se espalhando para regiões mais distantes do tricoma e também foram observadas no parênquima. Após 10 dias a bactéria Pseudomonas sp. foi encontrada nas paredes dos vasos condutores. Foram re-isoladas bactérias epifíticas e endofíticas da mediana e da base foliar, mas não da porção apical. Após 10 dias as bactérias foram isoladas como endofíticas somente da base. Essa porção não apresentou diferenças nas populações epifíticas e endofíticas. O NO aumentou nas folhas jovens e na base das intermediárias em um curto período de tempo após a inoculação. Aparentemente, ambas as bactérias não dispararam a via do SA. De acordo com os resultados aqui presentes, ambas as bactérias não pareceram ser prejudiciais à G. monostachia. Além disso, o presente trabalho mostra fortes evidencias de que as bactérias entram nos tecidos foliares por meio dos tricomas na base foliar e permanecem nessa porção, que é precisamente a mais importante para absorção de nutrientes Bromeliads inhabit different environments and many are found as epiphytes. These plants are often subjected to periods of water and nutrient shortage. For their survival, epiphytic bromeliads are endowed with different morphological and physiological adaptations. Guzmania monostachia is a tank-bromeliad that has been extensively studied because of its great photosynthetic plasticity. However, little is known about other possible survival adaptations, such as beneficial interactions with microorganisms. Here, we isolated nitrogen fixing (diazotrophc) bacteria from both the outside (epiphytic) and the inside (endophytic) of different leaf portions (apex, middle and base), collected in natural environment and in greenhouse-cultivated plants. The bacteria were selected using the acetylene reduction assay (ARA) and four different media that do not contain reduced nitrogen source. The strains were identified by 16S rRNA. Two isolates, Pseudomonas sp. and Burkholderia sp. has been chosen to be tagged with green fluorescent protein (GFP) and then inoculated in G. monostachia plants cultivated in greenhouse. The colonization of the leaf tissues was monitored with the aid of confocal microscopy and also we estimate the external and internal bacterial population densities in different leaf groups (younger and expanded) and portions (apex, middle and base). In addition, we studied some important molecules in plant-microbe interactions: nitric oxide (NO), salicylic acid (SA), ethylene (ET) and indol-3-acetic acid (IAA). As a result, most of the isolated strains belong to the Proteobacteria group, but gram positive strains were also found belonging to the Firmicutes and Actinobacteria group. The endophytic bacteria were isolated only from the basal portion (both from leaves of natural environment and from leaves of greenhouse cultivated plants). Interestingly, after the inoculation of both bacteria tagged with GFP they were visualized entering by trichomes present mainly in the basal portion. Twenty hours after the inoculation, the bacteria were visualized inside the epidermis of the leaves. After five days, the bacteria were detected in the parenchyma and, ten days after the inoculation Pseudomonas sp. was found on the vessels walls. It was possible to re-isolate epiphytic and endophytic bacteria from the base and middle portions, but not from the apex. After 10 days the endophytic bacteria were found only in the base. The base did not show differences between epiphytic and endophytic populations. NO increased in a short time after the inoculation in the younger leaves and in the basal portion of intermediate leaves. Apparently, the SA pathway was not triggered by any of the bacteria used. According to these results, the bacteria tested do not seem to be harmful to the plant. Furthermore, we strongly suggest that they enter through the trichomes on the leaf base and remain in this portion, which is precisely the most important for the absorption of nutrients

Epicoccum nigrum é um fungo ubíquo conhecido por sua capacidade de produzir vários metabólitos secundários bioativos e pelo seu uso potencial como agente de biocontrole contra vários fitopatógenos. Entre os compostos produzidos por E. nigrum, epicolactona é um policetídeo com uma estrutura bastante complexa. O objetivo desta tese foi identificar e caracterizar genes relacionados à biossíntese da epicolactona em E. nigrum. Três mutantes defectivos para a produção de epicolactona anteriormente gerados por mutagênese aleatória foram analisados. Entretanto, os resultados mostraram que o T-DNA provavelmente estava inserido em regiões regulatórias. Usando ferramentas de bioinformática, seis genes de PKSs foram selecionados para deleção. A deleção do gene PKSi12 mostrou que os seus produtos estão relacionados à atividade antagonista. A análise química permitiu a identificação putativa dos preditos precursores da epicolactona, os quais tiveram sua produção afetada no mutante ΔPKSi12. Uma possível via de biossíntese de epicoccona B e epicoccina por E. nigrum foi proposta. Epicoccum nigrum is a ubiquitous fungus mainly known for its ability to produce many bioactive secondary metabolites and for its potential use as a biocontrol agent against many phytopathogens. Among the compounds produced by E. nigrum, epicolactone is a polyketide with a very complex structure. The aim of this thesis was to identify and characterize genes related to epicolactone biosynthesis in E. nigrum. Three defective epicolactone mutants previously generated by random mutagenesis were analyzed. However, the results showed that the T-DNA was probably inserted in regulatory regions. Using a genome mining approach, six PKS genes were selected for deletion. The deletion of PKSi12 gene showed that its products are related to E. nigrum antagonistic activity against fungal phytopathogens. The chemical analysis allowed a putative identification of the previously proposed epicolactone precursors, which production was affected in the ΔPKSi12 mutant. A proposed biosynthesis of epicoccone B and epicoccine by E. nigrum was suggested.

As fontes hídricas disponíveis para o consumo humano vêm sendo comprometidas. Para resolver este problema, várias técnicas de detecção de contaminação fecal foram desenvolvidas. Em 1982, Manja e colegas desenvolveram método H2S que é simples, rápida e de baixo custo e detecta bactérias produtoras de H2S e, assim, a contaminação fecal. Neste trabalho foi analisada a eficácia de detecção de micro-organismos produtores de H2S frente a adição de L-cistina (125mg/L e 250mg/L) e desoxicolato de sódio (DS) (0,1% e 0,3%) e na presença de bactérias não produtoras de H2S para verificar se a presença destas bactérias interferem na detecção dos isolados H2S+. Assim, comparou-se o teste H2S com a membrana filtrante e o Colilert®. Os resultados deste estudo indicam que o meio H2S com adição de 0,3% de desoxicolato de sódio se mostrou mais rápido e sensível. Quando comparado com outras metodologias clássicas, o meio com 0,3% apresentou uma ligeira queda na sensibilidade mas o método H2S se mostrou mais sensível que o Colilert. Water supply for human consumption have been compromised. Several detection methods for fecal contamination have been developed to solve this problem. Manja and co-workers (1982) developed a simple, fast and low-cost method for fecal contamination based on detection of sulfate-reducing bacteria, the H2S method. This work aimed to analyse the detection efficiency of the H2S method under different conditions: with L-cystine (125mg/L e 250mg/L) and sodium deoxycholate (0.1% e 0.3%). Also, non-sulfate-reducing bacteria interference were evaluated. Comparison tests were made through membrane filtration and Colilert®. Our results indicate a faster and more sensible for the 0.3% sodium deoxycholate condition. Compared to other classic methodologies, the 0.3% sodium deoxycholate condition slightly decrease the sensibility. However the H2S method was more sensitive than the Colilert one.

O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja. Novas tecnologias que possibilitem um aumento na produção desse grão, sem causar impactos no ecossistema, são de grande interesse ambiental, social e econômico. Com objetivo de desenvolver um pacote biotecnológico foram realizados quatro grupos de estudos. Em ensaios in vitro e in vivo foram selecionados, um rizóbio (Ensifer fredii) e duas bactérias promotoras de crescimento vegetal (Pseudomonas fluorescens e Paenibacillus edaphicus) para serem co-inoculadas em sementes de soja. Por meio de estudos em casa-de-vegetação foram desenvolvidas duas tecnologias aplicadas ao inoculante contendo o rizóbio ( fatores Nod e cobamamida), que foram avaliados em conjunto (pacote biotecnológico) em campo de cultivo de soja, que mostrou-se capaz de aumentar a nodulação, o desenvolvimento da planta e rendimento dos grãos dessa leguminosa. Brazil is the worlds second largest producer of soybean. New technologies that increase the production of this grain, without causing environmental impacts, they are of great enviromental, social and economic importance. In order to develop a biotechnological package it was conducted four study groups. Using in vitro and in vivo assays were selected, one rhizobium (Ensifer fredii) and two plant growth promoters bacterias (Pseudomonas fluorescens e Paenibacillus edaphicus) to b eco-inoculated in soybean seeds. Through studies in greenhouses, two technologies applied to agricultural inoculant have been developed (Nod factors and cobamamide), which were evaluated together (biotecnhological package) in soybean crop field, wich proved capable to increase nodulation, plant growth and yield grain of this legume.

Duas enzimas do clone PL14.H10 de biblioteca metagenômica de consórcio microbiano degradador de óleo diesel, EST3, da família IV, e EST5, da família V das enzimas lipolíticas, foram caracterizadas. Os modelos estruturais mostraram cap-domínio e grande cavidade interna. A EST3 hidrolisou pNP-ésteres de até 12 carbonos, com Kcat/Km para pNP-acetato foi 1533,27 s-1.mM-1. Já a EST5 hidrolisou pNP-ésteres de 2 a 14 átomos de carbono, com maior atividade em pNP-valerato, e Kcat/Km de 1732,3 s-1.mM-1. Ambas apresentaram o fenômeno da ativação térmica. A atividade máxima da EST5 se deu a 45°C e em pH 7,5. A EST3 exibiu atividade máxima em pH 6,0, a 41°C. A atividade das enzimas aumentou na presença de quase todos os íons testados, e a EST5 quase não foi influenciada por detergentes. Foram relativamente estáveis em solventes orgânicos. Um dos cristais da proteína EST5 difratou a 2,311 Å e espera-se resolver a estrutura desta proteína. Os resultados deste trabalho revelaram interessantes características da EST3 e EST5 para possíveis aplicações biotecnológicas. Two enzymes of PL14.H10 clone from a metagenomic fosmid library from a microbial consortium specialized for diesel oil degradation, EST3, from family IV, and EST5, from the V of lipolytic enzymes were characterized. Structural models showed cap-domain and large internal cavity. EST3 hydrolyzed pNP-esters of up to 12 carbons, with Kcat/Km in pNP-acetate of 1533.27 s-1.mM-1. EST5 hydrolyzed pNP-esters from 2 to 14 carbon atoms, with greater activity on pNP-valerate, and Kcat/Km of 1732.3 s-1.mM-1. Both showed the thermal activation phenomenon. EST5 activity was optimal at 45°C and pH 7.5. EST3 exhibited maximum activity at pH 6.0, 41°C. The esterases activity increased in the presence of almost all ions tested, and EST5 was not influenced by detergents. They were relatively stable in organic solvents. One of the crystals of EST5 protein diffracted at 2.311 Å and is expected to solve the structure of this protein. The results of this study revealed interesting features of the EST3 and EST5 proteins for possible biotechnological applications.

Os micro-organismos são profícuas fontes de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos usados clinicamente é produzida por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces. A resistência a múltiplas drogas por microorganismos patogênicos e também pelas células tumorais leva à necessidade por novos fármacos antibacterianos e antitumorais. Actinobactérias endofíticas têm demonstrado grande potencial para a busca de produtos naturais bioativos. O presente trabalho relata o estudo químico de duas linhagens de actinobactérias endofíticas, Streptomyces sp. RTd 22 e Streptomyces sp RTd 31, isoladas das raízes de Tithonia diversifolia. As frações ativas nos ensaios biológicos foram fracionadas para a identificação dos compostos bioativos, sendo eles os antibióticos macrolídeos concanamicinas A (S31-1) e B (S31-2), anidro-agliconas das concanamicinas A (S31-3) e B (S31-4), todos produzidos por Streptomyces sp RTd31, e o ionóforo poliéter grisorixina (S22-2), produzido por Streptomyces sp. RTd22. Foi realizado o monitoramento da produção desses compostos bioativos por UPLC-MS através do modo SIM. As concanamicinas A e B tiveram um máximo de produção com 96h, já a grisorixina obteve um máximo com 192h. Outros compostos identificados por desreplicação dos extratos butanólicos de ambas as actinobactérias foram os sideróforos norcardamina (S31-7) e desoxi-nocardamina (S31-8), já o sideróforo desferrioxamina B (S31-9) foi identificado apenas nos extratos butanólicos de Streptomyces sp RTd31. Experimentos de variação do meio de cultivo e co-cultura com bactérias patogênicas foram empregados a fim de estimular a biossíntese de novos compostos, porém nenhum novo metabólito foi identificado. O sequenciamento genético da actinobactéria Streptomyces sp. RTd22 permitiu verificar a presença de vários clusters biossintéticos nesse micro-organismo através da análise feita pelo antiSMASH. Foi possível identificar o cluster da himastatina (S22-4) e da coeliquelina (S22-5), sendo que ambos os compostos não foram biossintetizados nas condições de cultivo utilizadas. O cluster biossintético da grisorixina foi determinado e o experimento de recombinação homóloga para a deleção do gene análogo a flavina mono-oxigenase da nigericina nigC foi realizado. Dois mutantes foram obtidos e um deles foi cultivado para a análise do perfil metabólico por espectrometria de massas. Não houve a produção da grisorixina nem do seu possível precursor pelo mutante, mas outros metabólitos foram produzidos Microorganisms are prolific sources of bioactive natural products. Several clinically important drugs have microbial origin, and most of the therapeutically used antibiotics are produced by actinobacteria, mainly from the genus Streptomyces. The multidrug resistance observed in pathogenic microorganisms and tumor cells lead to the need for new antibacterial and antitumor drugs . Endophytic actinobacteria have shown great potential in the search for bioactive natural products. This work describes the chemical study of two endophytic actinobacteria strains: Streptomyces sp. RTd 22 and Streptomyces sp RTD 31, isolated from Tithonia diversifolia roots. Active fractions in biological assays were further fractionated for identifying the bioactive compounds, which are: the macrolide antibiotics concanamycins (S31-1) and B (S31-2), anhydrous aglycones of concanamycins A (S31-3) and B (S31-4), all four produced by Streptomyces sp. RTd31, and the ionophore polyether grisorixin (S22-2), produced by Streptomyces sp. RTd22. The production of these bioactive compounds was monitored by UPLC-MS via the SIM mode. Concanamycins A and B had maximum production at 96 h, and grisorixin at 192 h. Other compounds identified by the dereplication of buthanolic extracts of both actinobacteria were the siderophore norcardamine (S31-7) and deoxy-nocardamine (S31-8), the siderophores desferrioxamine B (S31-9) was identified only in buthanolic extracts of Streptomyces sp RTd31. Experiments varying media and co-culture were tested to stimulate the biosynthesis of novel compounds, but nothing new was identified. By genome sequencing of Streptomyces sp RTd22 and antiSMASH analysis it was possible to verify the presence of several biosynthetic clusters in the genome of this strain. It was possible to identify the biosynthetic clusters of himastatin (S22-4) and its analogous compound coelichelin (S22-5); however, these compounds were not biosynthesized in the culture conditions used. The grisorixin biosynthetic cluster was determined, and homologous recombination was performed for deleting the analogue gene of nigericin flavin monooxygenase nigCI. Two mutants were obtained, and one of them was cultured for analyzing its metabolic profile by mass spectrometry. There was no production of grisorixin or its possible precursor by the mutant, but others compounds were produced.

O Brasil é um dos países com a maior biodiversidade do mundo, embora existam ainda poucos estudos sobre a biodiversidade microbiana dulcícola, assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade e estrutura das comunidades bacterianas presentes no corpo e afluentes do Rio Tietê e relacioná-las às variáveis ambientais. Foram obtidos 385 fragmentos terminais de restrição representando a temporada de estiagem em 2013 e 217 TRFs representando a temporada de cheias em 2014. As análises de Redundância (RDA) apresentaram separação entre as amostras de acordo com o período de coleta seguida da qualidade da água de origem e a temporada 2013 apresentou maior riqueza e diversidade com relação à 2014. Já a técnica de sequenciamento por MiSeq Illumina, apresentou 2.130.122 sequências com boa qualidade e o parâmetro temperatura representou a principal variável ambiental agindo sobre a riqueza das comunidades avaliadas, além disso, a localização geográfica dos rios e suas conexões representaram fatores importantes para a distribuição dos gêneros observados. Brazil is considered one of the countries with the highest biodiversity; however, there are few studies on microbial diversity in freshwaters. Thereby, the aim of present work was to evaluate the diversity and structure of bacterial community present in Tietê river and its tributaries, for that, 28 points along Tietê River Basin were evaluated by T-RFLP and 14 points were chosen based on these results for partial sequencing of rRNA 16S gene by MiSeq Illumina. 385 Terminal Restriction Fragments were obtained for season 2013 and 217 for 2014 and Redundancy Analysis presented separation between samples according to seasons followed by water quality group separation. Season 2013 presented higher richness and diversity compared to season 2014 and high throughput sequencing presented 2.130.122 sequences with good quality. Temperature parameter represented the main environmental variable acting on the richness of assessed communities, in addition, the geographic location of the rivers and their connections were important factors for the distribution of observed genera.

A cana-de-açúcar é atualmente a cultura de maior importância agrícola do Estado de São Paulo e tem papel de destaque entre as principais culturas do Brasil. Dentro de um contexto de maior produtividade unida a sustentabilidade, o papel da comunidade microbiana presente nos solos pode ter fundamental importância, auxiliando no melhor desenvolvimento da planta, suprindo a mesma com nutrientes ou diminuindo a ocorrência de doenças e pragas. Contudo, pouco se sabe sobre a comunidade microbiana existente nos solos cultivados com cana-de-açúcar, sendo que um conhecimento da distribuição espacial desta comunidade pode auxiliar para uma melhor compreensão dos processos aos quais estes microrganismos estão envolvidos. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo estudar, em um enfoque biogeográfico, a diversidade de bactérias e arquéias existente em solos de cana-de-açúcar do Estado de São Paulo, focando nos grupos de arquéias e bactérias. Uma análise de 285 amostras de solos, obtidas em 10 regiões produtoras distintas, foi realizada utilizando técnicas independentes de cultivo como: quantificação da abundância total por meio da aplicação de PCR em tempo real (qPCR), análises da estrutura da comunidade por polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminal (T-RFLP), e determinação da sua afiliação filogenética por sequenciamento em larga escala de genes ribossomais. Os resultados obtidos demonstraram que o principal modulador destas comunidades foram as características física e química do solo (pH, granulometria, matéria orgânica). Além disso, a comunidade de arquéias demonstrou ser influenciada por práticas de manejo (colheita mecanizada e adição de vinhaça e torta de filtro). Adicionalmente, foi observada uma relação inesperada da estruturação destas comunidades com a distribuição geográfica das amostras analisadas. Os resultados demonstram a complexidade da comunidade de bactérias e arquéias ao longo de um gradiente espacial, sugerindo que estudos posteriores devem considerar uma amostragem mais ampla em distintas regiões. Este trabalho é embasador de estudos futuros que visem desenvolver práticas agrícolas baseadas na exploração da funcionalidade dos microbiomas dos solos. Sugarcane is currently the most important culture of the State of São Paulo and has a prominent role among the crops in Brazil. Into the context of a better productivity with greater sustainability, the role of the microbial community present in the soil could have huge importance, aiding a better plant development, supplying it with nutrients or reducing the occurrence of diseases and pests. However, little is known about the microbial community existing in soils cultivated with sugarcane, where a knowledge of the spatial distribution of this community could be helpful to a better understanding of the processes that these organisms are involved. This project aimed to study in a biogeographic approach, the bacteria and archaea diversity in soils of sugarcane in the São Paulo State, focusing on the groups of archaea and bacteria. Analyses of a total of 285 soil samples, obtained in 10 producing distinct regions was performed using independent cultivation techniques such as quantification of total abundance by applying quantitative PCR (qPCR), analysis of the community structure by terminal restriction of length polymorphism (T-RFLP) and determination of its phylogenetic affiliation by high-throughput sequencing of 16S ribosomal genes. The results showed that the main drivers of these communities were the physical and chemical characteristics of the soil (pH, granulometry and organic matter). In addition, the results have shown that archaea community was influenced by management practices (mechanical harvest, vinasse and filter cake adding). Additionally, an unexpected relationship between the structures of these communities with the geographic distribution of the samples was observed. The results demonstrate the complexity of the community of bacteria and archaea along a spatial gradient, suggesting that future studies should consider a broader sampling of the distinct regions. This work supports upcoming studies that aim at developing agricultural practices exploring the soil microbiomes functionality.

Os micro-organismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas. Uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares, que ajudam na degradação da matéria orgânica e são cada vez mais procuradas e exploradas pela indústria. Essa propriedade aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas e é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose por meio da quebra da ligação β,1-4. A partir dessa característica da celulase, foi realizada uma expressão heteróloga relacionada com a hidrólise da celulose em biblioteca metagenômica de solo da Caatinga. Foram realizados testes de produção enzimática por meio dos quais selecionamos os clones 283/A8 e 307/E11 como melhores produtores de endoglicanases. Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases pelos clones, estes foram inoculados em diferentes fontes de celulose, pH e temperatura. A faixa ideal de pH foi 5,0 e de temperatura, 50º C, verificada para as enzimas Celulase Total, Endoglicanase e β-glicosidase. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 60% da atividade inicial após 2 horas de incubação a 50º C. O perfil de proteínas analisado por SDS-PAGE demonstrou que os clones secretam um conjunto de enzimas celulolíticas com 25 a 100 KDa, quando cultivado em farelo de trigo, e 30 a 60 KDa, quando cultivados em CMC. No ensaio de cromatografia para o clone 307/E11, foram selecionadas 5 frações que obtiveram melhores resultados na dosagem enzimática e testados frente ao pH e à temperatura. O resultado obtido foi que o complexo enzimático bruto, extraído do sobrenadante produzido pelo clone, possui melhor atividade frente ao pH e à temperatura do que as frações parcialmente purificadas. Microorganisms are distinguished by a wide genetic diversity and they perform unique and crucial functions concerning the maintenance of ecosystems. One of those functions is the production of extracellular enzymes, which help in the degradation of organic matter and which are increasingly wanted and explored by industry. Such feature boosts the search of enzymes that can be exploited in several industrial sectors with improved full use and low cost. Cellulase belongs to such class of enzymes and it is composed of a multi-enzymatic complex which is able to hydrolyse cellulose through the breaking of the chemical bond β,1-4. Considering such attribute of the cellulase, a heterologous expression, related to cellulose hydrolysis in a metagenomic inventory of the soil of Caatinga, was realized. Tests of enzymatic production were performed, and through them, we could elect the clones 283/A8 and 307/E11 as the best endoglicanase producers. Those clones were inoculated in different cellulose sources, pH and temperature, so that we could analyse the kinetic of cellulase production between them. The ideal pH range was 5.0 and the ideal temperature range was 50º C (122º F), verified for the enzymes Total Cellulase, Endoglicanase and β-glucosidase. With regard to thermostability, the present enzymes kept more than 60% of the initial activity after 2 hours of incubation at 50º C (122º F). The proteins profile analysed with the help of SDS-PAGE proved that the clones secrete a group of cellulolytic enzymes with a weight average of 25 to 100 KDa, when cultivated in wheat bran, and of 30 to 60 KDa, when cultivated in CMC. Five fractions with the best results, regarding enzymatic dosage and tested before pH and temperature, were chosen by the chromatography research for the clone 307/E11. The achieved result proved that the raw enzymatic complex, extracted from the supernatant produced by the clone, develops a better activity before pH and temperature than the fractions partially purified.

Na Antártica e no Ártico, a vida microbiana é presente e diversificada, tendo se adaptado a condições similares às encontradas em mundos que despertam interesse à astrobiologia. Este estudo investigou as alterações fisiológicas e fenotípicas do extremófilo psicrotrófico Exiguobacterium antarcticum B7 sob diferentes temperaturas. Foram utilizadas técnicas de eletroforese de proteínas em duas dimensões associada a espectrometria de massa, juntamente com técnicas de microscopia. E. antarcticum foi também submetida a condições físicas encontradas em Marte e no ambiente interplanetário. Seguindo evidências de que micro-organismos psicrotróficos podem também ser resistentes a períodos prolongados de dessecação, foi investigada a presença de linhagens microbianas resistentes a anidrobiose em solos da Antártica e permafrost do Ártico. Por fim, voltando-se à ecologia microbiana de solos polares permanentemente congelados, foi estudada a diversidade microbiana de três estratos de permafrost do ártico canadense com o uso de sequenciamento de DNA de nova geração. In Antarctica and the Arctic, microbial life is present and diverse, having adapted to low temperature and low humidity conditions, similar to the worlds that arouse more interest to astrobiology. This study investigated the physiological changes of the psychrotrophic extremophile Exiguobacterium antarcticum B7 at different temperatures. Two dimensional protein electrophoresis techniques was used for proteome analysis in conjunction with mass spectrometry, as well as microscopy techniques. E. antarcticum was also subjected to physical parameters found on Mars and in the interplanetary environment. Following evidence that psychrotrophic microorganisms may also be resistant to prolonged periods of desiccation, it was investigated the presence of microbial strains resistant to anhydrobiosis on Antarctic soils and Arctic permafrost. At last, turning the attention to the microbial ecology of permanently frozen polar soils, it was studied the bacterial diversity of three Arctic permafrost strata with next-generation high throughput DNA sequencing.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas e que podem colonizar endofiticamente a planta. Algumas espécies deste gênero são capazes de promover o crescimento vegetal e reduzir o ataque de fitopatógenos. A linhagem de M. mesophilicum SR1.6/6 foi isolada de ramos de citros e devido a sua interação com a planta hospedeira e com patógenos associados a planta, tem sido foco vários trabalhos. Os sistemas de secreção e as bombas de efluxo podem estar envolvidos na modulação das interações de bactérias endofíticas com seus ambientes. Assim, neste estudo foi analisada a composição dos exsudatos produzidos pelas plantas de milho e citros na interação com a SR1.6/6 por GC-MS, foi realizada a reanotação de genes relacionados ao sistema de secreção e bombas de efluxo e foi avaliada a expressão de alguns genes destes sistemas na interação com Zea mays e Citrus sinensis por qPCR. Foram encontrados sistemas de secreção tipo I, II e V, vias SEC e TAT e bombas de efluxo, principalmente super-expressos durante a interação com a planta hospedeira. Methylobacterium genus is composed by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria. Some species of this genus are able to promote plant growth and reduce the incidence of pathogens. The SR1.6/6 strain of Methylobacterium mesophilicum is a bacterium isolated from citrus and due to its interaction with the plant has been the focus of several studies. Multidrug efflux pumps and secretion system can be involved modulating the interactions of bacteria with their environments. In this work was analised the root exsudates composition from two host plants citrus and corn interacting with SR1.6/6 by GC-MS technique, additionally was searched and reannotated genes related to secretion system and some multidrug efflux pumps and finally evaluated the gene expression of some of this genes during the interaction with Zea mays and Citrus sinensis by qPCR. Type I, II and V secretion system, SEC and TAT pathway and some multidrug efllux pumps were found in this strain according gene expression. This systems were up-regulated mainly during interaction with host plant.

A cana-de-açúcar é uma cultura agrícola de grande importância econômica para o Brasil, e a expansão de seu cultivo para solos marginais requer uma maior utilização de fertilizantes à base de nitrogênio (N). Na maioria dos países produtores, a adubação nitrogenada se baseia em altas doses de aplicação, enquanto, no Brasil, o seu uso é relativamente baixo devido, em parte, ao processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) pela ação de bactérias diazotróficas. Além da FBN, as plantas adquirem fontes de N, como amônio e nitrato, por meio de transportadores de membranas localizados nas raízes. Há evidências que a associação com microrganismos pode favorecer as plantas por meio da regulação dos genes de transportadores de N. Desta forma, este trabalho teve como objetivo caracterizar o transporte de amônio e nitrato, avaliando a expressão gênica dos principais transportadores de N em cana-de-açúcar cultivada in vitro sob o efeito da associação com bactérias diazotróficas. Também foi descrita a comunidade bacteriana de plântulas in vitro, bem como o efeito da fertilização com N e da inoculação com bactérias diazotróficas em plantas maduras. Plântulas de \'SP70- 1143\' e \'Chunee\', que contrastam para FBN, foram empregadas em ensaios in vitro sob diversas concentrações e fontes de N em associação ou não com uma estirpe de Gluconacetobacter diazotrophicus ou um mistura de bactérias diazotróficas (G. diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans, Azospirillum amazonense e Burkholderia tropica). A caracterização do transporte de N por meio de ensaios de absorção de nitrato e amônio marcados (15N) revelou que a interação entre cana-de-açúcar x G. diazotrophicus induziu a expressão do gene do transportador de nitrato ScNRT2.1, o que levou a uma tendência no aumento no influxo de nitrato, assim como dos genes de transportadores de amônio ScAMT1.1 e ScAMT1.3, resultando em maiores influxos de amônio apenas para a cultivar \'SP70- 1143\'. Já a associação da cana-de-açúcar com a mistura de bactérias diazotróficas revelou que somente houve indução transcricional de ScAMT1.1, o que resultou na maior absorção de amônio em \'SP70-1143\'. Por sua vez, quando analisada a interação in vitro por 30 dias, a presença da bactéria, apesar de transiente, possivelmente favoreceu a expressão dos genes de transportadores de nitrato ScNRT1.1 e ScNRT2.1, e do transportador de amônio ScAMT1.1, resultando no maior acúmulo de 15N-nitrato de amônio nas plantas de \'SP70-1143\'. Foi detectada uma comunidade bacteriana associada a plântulas micropropagadas, a qual é distinta entre os genótipos \'SP70-1143\' e \'Chunee\' e se altera com a inoculação com G. diazotrophicus. Para as plantas cultivadas em campo, a comunidade bacteriana existente foi alterada pela fertilização de N, mas não pela inoculação com diazotróficas. Portanto, a inoculação com bactérias diazotróficas parece induzir a expressão dos principais genes transportadores de amônio e nitrato em plântulas do genótipo \'SP70-1143\' resultando na maior absorção de fontes inorgânicas de N. Sugarcane has a large economic importance to Brazil, and it\'s the expansion of cultivation to marginal soils requires a larger application of nitrogen fertilizers (N) to maintain yield. In most producing countries, N fertilization is based on high application rates, whereas in Brazil N fertilization is relatively low, possibly due in part, to the process of biological nitrogen fixation (BNF). In addition, plants acquire inorganic N sources from the soil by membrane transporters that may be regulated by association with microorganisms. This study aimed to characterize the ammonium and nitrate transport evaluating the gene expression profile of the major transporters grown in vitro in association with diazotrophic bacteria. It was also described the bacterial community in micropropagated plants, as well as the effect of N fertilization or inoculation with nitrogen fixing bacteria in mature plants. \'SP70-1143\' and \'Chunee\' which contrasted to BNF, were used in in vitro experiments in several concentrations and N source, in association or not with a strain of Gluconacetobacter diazotrophicus or a bacteria mixture (G. diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans, Azospirillum amazonense and Burkholderia tropica). The characterization of the N transport by uptake assays with 15N-labeled ammonium and nitrate, revealed that the interaction between sugarcane x G. diazotrophicus induced, the nitrate transporter gene ScNRT2.1 expression, which lead to trend to increase nitrate influx, as well as the ammonium transporter genes ScAMT1.1 and ScAMT1.3, resulting in higher ammonium influx in \'SP70-1143\'. Sugarcane associated with the bacterial mixture revealed a transcriptional induction of ScAMT1.1 resulting in larger ammonium acquisition in \'SP70-1143\'. Further, the presence of bacteria in vitro for 30 days, although transient, possibly favored the expression of nitrate transporters ScNRT1.1 and ScNRT2.1, and the ammonium transporter ScAMT1.1, resulting in accumulation of 15N-ammonium nitrate in \'SP70-1143\'. A bacterial community associated with in vitro plants of \'SP70-1143\' and \'Chunee\' was detected with different composition between genotypes, and which changed with artificial inoculation. For plants grown in the field, the bacterial community was affected by N fertilization but not by inoculation with diazotrophic. These results indicate that the inoculation with diazotrophic bacteria appears to induce the expression of the major ammonium and nitrate transporters genes in \'SP70-1143\' plants resulting in higher uptake of inorganic N sources.

Os fungos do gênero Metarhizium são entomopatogênicos e ainda apresentam relações endofíticas e podem viver saprofiticamente no solo. A associação desses microrganismos com insetos é bem conhecida, mas as interações diretas com as plantas ainda são incipientes. Objetivou-se com este estudo, determinar a capacidade de colonização endofítica em raízes de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) de M. robertsii, M. anisopliae e três linhagens brasileiras recém-descobertas, bem como revelar o potencial destes fungos como antagonistas a dois fungos fitopatogênicos responsáveis pela podridão-vermelha (Fusarium moniliforme e Colletotrichum falcatum) e no controle de duas importantes pragas, a broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis e o nematóide-das-galhas, Meloidogyne javanica. Foram utilizados 24 isolados de Metarhizium spp. nos experimentos de promoção de crescimento de plantas após a inoculação em gemas de cana-de-açúcar em condições de casa-de-vegetação e campo. O efeito da inoculação do fungo em mudas de cana-de-açúcar foi investigado quanto a mortalidade e redução no desenvolvimento de D. saccharalis e redução nas populações de M. javanica. Experimentos de inibição in vitro em cultivo pareado foram conduzidos com os fungos F. moniliforme e C. falcatum e Trichoderma harzianum. Além disto, foram realizados testes qualitativos \"in vitro\" para avaliar a capacidade desses fungos em produzir β-1,3-Glucanase e Sideróforos. A inoculação de Metarhizium de todas as espécies testadas promoveu o crescimento de parte aérea, peso úmido e seco de raízes em relação ao controle (água). Enquanto o tratamento de gemas rotineiramente usado na usina onde se realizou a produção de mudas pré-brotadas com aplicação do fungicida Comet® + o fertilizante Biozyme TF resultou em pegamento de 32% e 59,6%, apenas com o uso de isolados de Metarhizium spp. estes valores foram de até 50% e 86,4%, nos dois experimentos em campo, respectivamente. As mortalidades observadas em lagartas de D. saccharalis que se alimentaram das plantas inoculadas com isolados de Metarhizium spp. atingiram valores de até 80%, sendo a mortalidade confirmada pela esporulação do fungo de até 55%. As lagartas sobreviventes apresentaram menor peso do que aquelas do controle não tratado. A inoculação de Metarhizium spp. em mudas de cana-de-açúcar conferiu proteção a M. javanica, resultando em uma densidade de massa de ovos por grama de raiz nas mudas inoculadas com o fungo até 59,8% menor no primeiro experimento e 64,1% menor no segundo em relação as mudas sem inoculação. Os ensaios de antagonismo mostraram que, todos os isolados de Metarhizium spp. apresentaram alguma forma de inibição tanto para F. moniliforme como para C. falcatum. Dos 24 isolados testados, 20,8% produziram a enzima hidrolítica, β-1,3-glucanase, o que pode estar associado a capacidade de inibição dos fungos fitopatogênicos. Constatou-se que 8 (33,3%) dos isolados produziram sideróforos e sugere que esses fungos apresentam mecanismos de disponibilização do ferro. O conhecimento gerado com este estudo poderá subsidiar novas estratégias de utilização de Metarhizium spp. em campo na produção de MPB de cana-de-açúcar. The fungi of the genus Metarhizium are entomopathogenic and still have endophytic relations and can live in the soil as saprophytes. The association of these microorganisms with insects is well known, but the direct interactions with the plants are still incipient. The objective of this study was to determine the endophytic colonization capacity in sugarcane roots (Saccharum spp.) of M. robertsii, M. anisopliae and three new Brazilian lineages and to reveal the potential of these fungi as antagonists to two pathogenic fungi responsible for red rot (Fusarium moniliforme and Colletotrichum falcatum) and in control of two major pests, the sugarcane borer, Diatraea saccharalis and nematode, Meloidogyne javanica. Twenty four isolates of Metarhizium spp. were used in plant growth promoting experiments after inoculation in sugarcane plantings in greenhouse and field. The effect of fungal inoculation of sugarcane seedlings was investigated on mortality and development of D. saccharalis, and populations reduction of M. javanica. Inhibition experiments were conducted by in vitro cocultivation with the fungi F. moniliforme and C. falcatum and Trichoderma harzianum. Moreover, qualitative tests were carried out \"in vitro\" for evaluating the capacity of fungi to produce beta-1,3-glucanase and Siderophores. The inoculation of Metarhizium of all species tested promoted the shoot growth, wet and dry root weight compared to control (water). While chemical treatment of seedlings routinely used in sugarcane mills with fungicide application COMET® and fertilizer (Biozyme TF) resulted in 32% and 59.6% efficacy, only with the use of Metarhizium spp. these values were 50% and 86.4%, in both experiments in the field, respectively. Mortalities observed in caterpillars of D. saccharalis that fed the plants inoculated with isolates of Metarhizium spp. reached values of 80%, with the rate of confirmed mortality up to 55%. Caterpillars survivors had lower weight than the untreated control. The inoculation of Metarhizium spp. in sugarcane seedlings conferred protection to M. javanica, resulting in density of egg mass per gram of root in seedlings inoculated with the fungus 59.8% lower in the first experiment and 64.1% lower in the second compared to the seedlings without inoculation. Antagonism assays showed that all isolates of Metarhizium spp. had somehow inhibiting both F. moniliforme and C. falcatum. Among the 24 isolates tested, 20.8% produced the hydrolytic enzyme beta-1,3-glucanase, which may be associated with the ability of inhibiting the phytopathogenic fungi. It was found that eight (33.3%) isolates produced siderophores and suggests that these fungi have iron delivery mechanisms. The knowledge generated by this study may help new strategies for use of Metarhizium spp. on field to produces sugarcane seedlings.

Neste estudo, o extrato bruto obtido da cultura do fungo E. nigrum foi extraído com hexano (HEX), diclorometano (DCM) e acetato de etila (AE). Após fracionamento por HPLC, a atividade antifúngica das frações foi avaliada pelo ensaio de concentração inibitória mínima (CIM) contra Candida albicans (CA), Trychophyton rubrum (TR), Cryptococcus neoformans (CN) e Aspergillus fumigatus (AF). O extrato de AE não foi efetivo, e os extratos HEX e DCM inibiram os patógenos na faixa de 31,25 a 250 µg/mL. Das frações hexânicas, apenas HEX-F9 apresentou atividade antifúngica, com CIM entre 31,25 e 250 mg/mL, exceto sobre AF. As frações DCM-F3, F5, F6, F9 e F10 apresentaram atividade antifúngica com CIM de 31,25 a 500 mg/mL contra todos os patógenos testados. A fração DCM-F9 foi efetiva com CIM entre 62,5 e 250 mg/mL contra CA, TR e CN. As frações DCM-F9 e DCM-F11 estão em fase final de purificação para posterior caracterização físico-química. The aim of this study was to purify the crude extract produced from E. nigrum and characterize antifungal isolated molecules. E. nigrum was cultivated and the culture supernatant extracted with hexane (HEX), dichloromethane (DCM) and ethyl acetate (AE). Fractions were obtained by HPLC. The antifungal activity were evaluated by minimal inhibitory concentration (CIM) against C. albicans (CA), T. rubrum (TR), C. neoformans (CN) and A. fumigatus (AF). The HEX extract inhibited all pathogens with CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL while DCM from 62,5 to 250 mg/mL. From HEX fractions only HEX-F9 showed antigungal activity with CIM from 31,25 to 250 mg/mL, except AF. The DCM-F3, F5, F6, F9 and F10 fractions showed antifungal activity, mainly DCM-F6 (CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL against all pathogens) and DCM-F9 (CIM from 62,5 to 250 mg/mL against CA, TR and CN). DCM-F6 was not produced anymore by the fungus in subsequent cultures. DCM-F9 LC/MS, CG/MS and RMN results suggested impure fraction, making difficult to determine the main compound. New approaches are being considered.

O conhecimento da associação entre plantas carnívoras e a comunidade bacteriana pode mostrar uma diversidade ainda não conhecida, além de proporcionar um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na interação de ambas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade microbiana presente em utrículos de Utricularia foliosa através da análise de bibliotecas do gene 16S rRNA obtida por pirosequenciamento. Os resultados indicam que no ponto 1, Proteobacteria (58%), Firmicutes (11%), Cyanobacteria (11%), Acidobacteria (7%), Verrucomicrobia (5%), Actinobacteria (3%) Chlamidiae (2%) e Bacteroidetes (1%) foram os grupos dominantes. Já no ponto 2 houve uma maior presença de Eukaryota (51%), sendo que os grupos mais presentes foram Streptophyta (88%), Bacillariophyta (7%) e Chlorophyta (2%). A grande presença de algas encontradas pode estar relacionada à disponibilidade de nutrientes nos utrículos e gerar um acréscimo de carbono e nitrogênio à cadeia alimentar no interior da armadilha. Knowledge of the association between carnivorous plants and the bacterial community can show a diversity not yet known, and provide a better understanding of the mechanisms involved in the interaction of both.The aim of this study was to evaluate the microbial diversity present in utricles of Utricularia foliosa and evaluate the effect of plant growth site in this diversity. For this the 16S rRNA gene library was sequenced by pyrosequencing (454-Roche). The results indicate that in point 1, the dominants groups were composed by Proteobacteria (58%), Firmicutes (11%), Cyanobacteria (11%), Acidobacteria (7%), Verrucomicrobia (5% ) Actinobacteria (3%) Chlamidiae (2%) and Bacteroidetes (1%), while in the point 2, Eukaryota (51%), such as Streptophyta (88%), Bacillariophyta (7%) and Chlorophyta (2%) were dominant. The large presence of algae inside the utricles may be related to the availability of nutrients and increase the Carbon and nitrogen level inside the traps, allowing the growth of the plant and also the microbial community in this structures.

Xylella fastidiosa é o agente causal de uma série de doenças que ocorrem em plantas economicamente importantes como laranjeiras, videiras e cafeeiros, causando no Estado de São Paulo prejuízos relevantes à indústria citrícola. Esta bactéria Gram-negativa é restrita ao xilema das plantas e à porção anterior do trato digestório dos insetos vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, conhecidos como cigarrinhas. Tentativas de elucidar os mecanismos de virulência e patogenicidade adotados por esta bactéria apontam a formação do biofilme como etapa fundamental para o estabelecimento da infecção e o consequente desenvolvimento da doença na planta, mas fatores adicionais parecem contribuir, tais como a produção de toxinas. As bacteriocinas são proteínas com atividade antibiótica contra cepas próximas à espécie produtora e que já foram associadas à virulência e patogenicidade de outras bactérias. Uma varredura in silico no genoma de X. fastidiosa 9a5c revelou 13 sequências codificadoras de microcinas putativas no cromossomo. Transcritos de todos esses genes foram detectados por RT-qPCR em culturas de X. fastidiosa 9a5c, e análises comparativas com genomas públicos (cepas Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 e GB514) e recém sequenciados por nosso grupo de pesquisa (cepas U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x e Fb7) revelaram que cada cepa possui seu próprio arsenal de bacteriocinas. Diferenças encontradas in silico entre os loci de bacteriocinas nas cepas foram demonstradas experimentalmente. Nossos resultados comprovam a variabilidade predita nos quatro clusters de bacteriocinas que identificamos, o que é esperado para genes relacionados à adaptação e patogenicidade. Destes loci, três foram detectados por RT-PCR como transcritos policistrônicos. Nossa tentativa de detectar essas proteínas em culturas de X. fastidiosa (através de sequenciamento de polipeptídeos por HPLC-MS/MS) foi capaz de identificar uma das bacteriocinas putativas e, portanto, o conjunto de nossas observações apóia a continuidade dos estudos para elucidar o papel das bacteriocinas na fisiopatologia de X. fastidiosa. Xylella fastidiosa is the causal agent of diseases that affect several economically important crops such as sweet orange trees, grapevines and coffee trees, causing in the State of São Paulo considerable losses mainly to the citrus industry. This Gram-negative bacterium is restricted to the plant xylem and to the upper gastrointestinal tract of its insect vectors, the sharpshooters from the Cicadellidae and Cercopidae families. Attempts to elucidate the virulence and pathogenicity pathways employed by this bacterium point the biofilm formation as a fundamental step for the establishment of the infection and the consequent development of the plant disease, but additional factors seem to contribute to these processes, such as the production of toxins. Bacteriocins are proteinaceous antibiotics that act against closely-related species and have been previously associated with virulence and pathogenicity in other bacteria. An in silico screening of the X. fastidiosa 9a5c genome revealed 13 coding sequences as putative microcins in the chromosome. Transcripts from all those genes were detected through RT-qPCR in X. fastidiosa 9a5c cultures, and comparative analyses on the public genomes (Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 and GB514) plus the ones recently sequenced by our group (U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x and Fb7) revealed that each strain possesses its own arsenal of bacteriocins. Differences found in silico among the loci in all strains were experimentally confirmed. Our results demonstrated the predicted variability in the four bacteriocins clusters as expected for adaptation and pathogenicity-related genes. Three out of the four bacteriocins loci were detected by RT-PCR as polycistronic transcripts. Our attempt to detect these proteins in X. fastidiosa cultures (using HPLC-MS/MS polypeptide sequencing) identified one of the putative bacteriocins, and therefore our observations warrant further efforts to elucidate the role of bacteriocins in the X. fastidiosa physiopathology.

A imensa diversidade de micro-organismos no solo leva a uma inevitável riqueza de interações entre espécies. Neste intuito, esse projeto é inovador na identificação dos cogumelos da Mata Atlântica, e na descrição da comunidade bacteriana associada às suas micosferas. Usando corpos de frutificação dos fungos (cogumelos) como indicadores para sistemas ricos em nutrientes, as amostras foram coletadas para investigar as interações entre os fungos (maioria do domínio Basidiomycota) e as bactérias presentes no solo em volta das micélios fúngicos (ambiente micosférico). As análises foram feitas com técnicas independentes de cultivo (análise PCR-DGGE, sequenciamento Sanger de fragmentos de ITS/18S e pirosequenciamento de tags da região V4 de 16S DNAr). As famílias fúngicas Marasmiaceae e Lepiotaceae, do domínio Basidiomycota foram as mais abundantes entre os cogumelos amostrados (13 e 5 cogumelos, respectivamente), e estavam presentes entre todas as três parcelas de estudo. As demais amostras foram alocadas dentro das famílias Marasmiaceae, Lepiotaceae, Inocybaceae, Lachnocladiaceae, Bolbitiaceae, Entolomataceae, Hygrophoraceae, Hymenogastraceae, Mycenaceae e Strophariaceae, além de dois do domínio Ascomycota. Baseado na análise de DGGE, é bastante claro que existe uma grande diferença na comunidade bacteriana (de toda a comunidade bacteriana, de ?- proteobacteria e de ?-proteobacteria) entre os solos associados ou não com os corpos de frutificação. Os dados de pirosequenciamento indicaram que dentro dos tratamentos as amostras se agruparam baseado nas famílias fúngicas ou no substrato onde os cocumeglos ocorrem (solo ou serrapilheira), sendo clara em algumas micosferas as alterações na ocorrência de grupos microbianos. O grupo de UTOs mais induzidas na região da micosfera foi composto dos grupos Burkholderia, Acidobacteria Gp1, Comamonadaceae, Sphingobacteriaceae, Burkholderiaceae, Chitinophagaceae), Schlesneria, Acidobacteria Gp3 e Spartobacteria gênero incertae sedis. Isto indica que existe um processo de seleção para bactérias específicas dependendo das diversas variáveis e fatores ambientais presentes no microhabitat micosfera. The immense microbial diversity in the soil leads to inevitable richness in inter-species interactions. For this reason, this is a novel project that focuses on identifying mushrooms and the associated bacterial community with their mycospheres in the Brazilian Atlantic Rainforest. Using fungal fruiting bodies (mushrooms) as indicators of nutrient-rich systems, samples were taken to investigate the interactions between fungi (mostly of the domain Basidiomycota) and bacteria present in the soil surrounding fungal mycelia (mycosphere environment). The analyses were conducted using culture-independent techniques, where isolating DNA of bacteria and/or mushrooms attempts to provide information on microbial functionality. These culture-independent analyses (PCR-DGGE, Sanger sequencing of ITS/18S fragments, and pyrosequencing of tags from the V4 region of 16S rDNA) generated extensive data on the bacterial diversity selected for in the presence of fungal structures in the soil. The fungal families Maramiaceae and Lepiotaceae, of the domain Basidiomycota were the most abundant among the mushrooms sampled (13 and 5 mushrooms, respectively) and were present in all of the three sampling sites. The rest of the mushrooms were found to be within the families Marasmiaceae, Lepiotaceae, Inocybaceae, Lachnocladiaceae, Bolbitiaceae, Entolomataceae, Hygrophoraceae, Hymenogastraceae, Mycenaceae, and Strophariaceae, in addition to two of the domain Ascomycota. Based on DGGE analysis, it is clear that there is a great difference in the bacterial community (entire bacterial community, of ?- proteobacteria and of ?-proteobacteria) between all fungal fruiting body-associated and non-associated soils. The pyrosequencing data indicated that within each treatment group, the samples did not separate according to fungal families or substrate where the mushrooms were found (in the soil or amoung the leaf litter). However, some mycospheres exhibited clearly altered bacterial communities. The group of OTUs most induced in the mycosphere region consisted of Burkholderia, Acidobacteria Gp1, Comamonadaceae, Sphingobacteriaceae, Burkholderiaceae, Chitinophagaceae), Schlesneria, Acidobacteria Gp3, and Spartobacteria genus incertae sedis. This indicates that there is a selection process for specific bacteria depending on a wide range of variable and environmental factors acting in the mycosphere microhabitat.

Os manguezais estão localizados na interface entre o continente e o oceano em regiões intertropicais, possuindo condições ambientais únicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade e o potencial biotecnológico da comunidade de Pseudomonas spp. em sedimentos de manguezais com diferentes estágios de preservação, no Estado de São Paulo. A diversidade de Pseudomonas spp. foi avaliada por meio da detecção do gene 16S rRNA e do gene gacA de isolados de Pseudomonas, como também por métodos independentes de cultivo. Dos 83 isolados obtidos, 55 foram positivos para o gene gacA. De acordo com as análises de DGGE e da biblioteca de clones, os diferentes manguezais apresentam comunidades de Pseudomonas bem distintas. Entre as espécies caracterizadas, P. nitroreducens e P. fluorescens foram predominantes. Pseudomonas de manguezais halotolerantes produzem AIA, ACC deaminase, NH3, solubilizam fosfato e fixam nitrogênio. Estudos demonstraram o potencial de Pseudomonas para promoção de crescimento de milho e redução dos efeitos do estresse salino sobre a planta. Mangroves are located at the interface of continent and ocean in intertropical regions, possessing unique environmental conditions. The objective of this study was to evaluate the diversity and biotechnological potential of Pseudomonas spp. community in mangrove sediments under different stages of preservation in the São Paulo state. Pseudomonas spp. diversity was analyzed through the detection of 16S rRNA gene and gacA gene of Pseudomonas isolates, as well as through cultive independent methods. Of the 83 isolates, 55 were positive for gacA gene. According to DGGE and clone library analysis, the different mangroves showed very distinct Pseudomonas communities. Among the characterized species by 16S rRNA gene, P. nitroreducens and P. fluorescens were dominant. Pseudomonas mangrove halotolerant produce IAA, ACC deaminase, NH3, solubilize phosphate and fix nitrogen. Studies demonstrated the potential of Pseudomonas for maize growth promotion and reduce the effects of salt stress on the plant.

A contaminação ambiental por pesticidas é uma preocupação cada vez mais presente, como indicam estudos que detectam frequentemente estes compostos em água e solo, e visto a importância destes, faz-se necessário a compreensão do seu impacto em organismos não alvo. Dessa forma, o estudo da resposta adaptativa bacteriana a herbicidas vem de encontro com a necessidade descrita, além de fornecer novos dados a cerca da regulação metabólica na possível biotransformação destes compostos. Neste estudo, o sistema antioxidante foi alvo de análises para a compreensão de sua participação neste processo, além de evidenciar a regulação diferencial de isoenzimas em bactéria exposta à herbicida. Para tanto, inicialmente um estudo de biodegradação apontou que o isolado bacteriano Enterobacter asburiae SD1 é capaz de degradar s-metolachlor em cerca de 30% com 13 h de cultivo em meio mineral, na presença de 1,25 mM do herbicida. Porém, a biodegradação também ocorreu em meio de cultura com fonte de carbono alternativa ao s-metolachlor, o que juntamente com o crescimento diferencial entre os meios, sugeriu uma resposta fisiológica adaptativa à diferentes condições nas quais o herbicida estava presente. Conhecido em estudos de resposta global a estresse, o sistema antioxidante foi avaliado na presença do herbicida e em diferentes consituições de meio de cultura, o que culminou em vias preferenciais ativadas conforme as características dos meios. Na presença de somente s-metolachlor como fonte de carbono (meio mineral), a enzima glutation S-transferase foi ativada, mostrando prioridade no reconhecimento e metabolização do s-metolachlor. Já na presença de outras fontes de carbono, além do herbicida, as vias de combate ao estresse oxidativo, representadas pelas enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa redutase (GR), foram ativadas primeiramente. Além disso, foi possível também avaliar a ativação diferencial das isoenzimas de CAT e SOD frente ao s-metolachlor, sendo que a isoenzima Mn-SOD merece destaque pela importância na resposta adaptativa, visto que a deleção do gene sodA (Mn- SOD), causou danos a membrana e desequilíbrio no trabalho cooperativo enzimático no combate às ERO\'s (espécies reativas de oxigênio). Finalmente, a integração dos diferentes níveis de um metabolismo na resposta do sistema antioxidante bacteriano foi mostrado através do estudo com a via de controle traducional formada pela proteína EF-P (elongation factor P). Esta proteína atua na fidelidade do processo de síntese de proteína, e a deleção do gene efp que a codifica, bem como outras proteínas envolvidas na ativação desta via, resultou no desequilíbrio celular, gerando estresse oxidativo, potencializado pela presença do herbicida paraquat. Este trabalho reúne resultados bastante relevantes para a compreensão do papel do sistema antioxidante bacteriano, em condições de estresse gerado pela presença de herbicidas, e oferece dados importantes referentes a integração e regulação de vias bioquímicas na ativação do sistema antioxidante, bem como para uma eficiente resposta adaptativa deste sistema. The environmental contamination by pesticides is an increasing concern, as frequently showed in studies with detection of these compounds in water and soil. In fact, the understanding of pesticide effect on non-target organisms is necessary given the importance of pesticide and its sustentable use. The study of bacterial adaptive response to pesticide can show how the metabolic regulation happens, as well as provide new data about biotransformation of these xenobiotics. For this propose, firstly the biodegradation analyse showed the Enterobacter asburiae SD1 strain has capacity to degrade the s-metolachlor herbicide in around 30% of your initial concentration (1,25 mM), in 13 h of cultivation in mineral medium. However, the degradation was also observed on the presence of alternative carbon source, what suggests, together the differential growth, the bacteria can show an adaptive response to different conditions represented by the media constitution. The antioxidant system, a global sensor to stress, was evaluated in E. asburiae SD1 cultivated in different media, to see what is the effect of s-metolachlor herbicide in the antioxidant response. It was possible to observe preferential pathways activated according to medium characteristics, such as the activation of glutathione Stransferase in the presence of only s-metolachlor as carbon source. This result was explained by the bacterial need to recognize and metabolize a new molecule. On the other hand, in the presence of alternative carbon source, in addition to herbicide, the pathways to combat oxidative stress, as those constituted by catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione reductase (GR), were firstly activated. Besides this, the differential activation was observed among the isoenzymes of CAT and SOD, wich special attention to Mn-SOD, which one had an important role in the adptive responde to herbicide. This affirmation was justified when de delection of sodA gene (Mn-SOD) induced membrane damage and disruption in the cooperative work of antioxidant enzymes in bacteria exposed to s-metolachlor. Finally, the integration of different levels of metabolism in the antioxidant response was showed through study with a pathway envolved in the translational control which has the elongation factor-P (EFP) as one important protein. This enzyme acts in the fidelity during the protein synthesis, and its absence, caused by efp gene delection, as well others two protein important to activate the EFP, induced the oxidative stress, increased by the paraquat herbicide. The present work collects relevant results for understanding of the role of bacterial antioxidant system in the stress condition induced by herbicide presence, and also offers important data about integration and regulation of biochemical pathway in the antioxidant system activation for an efficient adaptative response.

A filosfera foi considerada um ambiente extremo durante muitos anos para os microrganismos. Estudos recentes envolvendo comunidades bacterianas na superfície das plantas têm demonstrado que esta é composta por uma enorme e variável diversidade, principalmente em plantas de ambientes naturais como as da Mata Atlântica. Comparar as comunidades de bactérias de plantas de ambientes naturais com as de sistemas agrícola é de extrema importância, visto que as matas abrigam uma enorme diversidade vegetal e esta vem sendo diariamente substituída pela agricultura. Fatores ambientais como radiação UV, compostos orgânicos liberados pelas plantas em resposta à proteção, estresse osmótico e disponibilidade de nutrientes também podem induzir ou reprimir a colonização dessas bactérias na filosfera das plantas. Portanto, este trabalho traçou dois objetivos, o primeiro foi avaliar a variabilidade na comunidade bacteriana da filosfera de plantas cultivadas (soja, cana-de-açúcar, e eucalipto), localizadas em regiões geograficamente distintas, utilizando sequenciamento de bibliotecas de clones de DNA do gene rRNA 16S e comparar com as comunidades da filosfera de plantas nativas (Trichilia clausenii, Trichilia catigua e Campomanesia xanthocarpa), e o segundo, foi verificar a influência dos compostos orgânicos voláteis (COVs) emitidos pela planta, os diferentes níveis de radiação solar e a sazonalidade na seleção das comunidades bacterianas na filosfera de Trichilia clausenii, usando sequenciamento de bibliotecas de clones de cDNA do gene rRNA 16S e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CGEM). A análise comparativa das bibliotecas de clones do gene rRNA 16S de plantas de ambientes naturais com cultivadas, confirmou que cada espécie de planta possui sua própria comunidade de bactérias, sendo a diversidade de UTOs na filosfera de C. xanthocarpa e T. clusenii maior que a de plantas cultivadas. O filo Proteobacteria. foi predominante em ambas as filosferas de plantas cultivadas e nativas, sendo as Alphaproteobacteria dominantes na soja e na cana-de-açúcar e as Gamaproteobacteria nas filosferas das três árvores da Mata Atlântica. Este resultado sugere que a filosfera de plantas cultivadas pode selecionar grupos específicos de bactérias que não são encontradas na filosfera de espécies arbóreas da Mata Atlântica, e vice-versa, e que a substituição de florestas por culturas agrícolas pode levar a uma redução da beta-diversidade de bactérias. Já os resultados da afiliação filogenética das amostras da filosfera de Tichilia clausenii submetida a diferentes intensidades de radiações UV, também mostraram uma predominância de clones associados à Proteobacteria em todas as bibliotecas avaliadas. O fator luminosidade e o da planta, quando avaliados na mesma época, não mostraram efeito sob a comunidade bacteriana, entretanto, o efeito da sazonalidade foi bastante evidente, apresentando uma maior diversidade e riqueza de espécies durante a estação chuvosa. Os dados sugerem que as bactérias epifíticas possuem um elevado grau de adaptação a diferentes condições ambientais que são expostas. The phyllosphere has been considered an extreme environment to microorganisms for many years. Recent studies involving bacterial communities on plant surfaces has shown that they comprise an abundant and dynamic variety, mainly in natural environments, such as the Atlantic Forest. The comparison of bacterial communities from plants in natural environments with those of agricultural systems is extremely important, since forests contain an enormous plant diversity which is being replaced daily by agricultural cultivation. Environmental factors such as UV radiation, organic compounds released by plants in response to protection, osmotic pressure, and nutrient availability can either induce or suppress the colonization of bacteria in the phyllosphere of plants. Therefore, this study aimed to evaluate the variability in phyllospheric bacterial communities of native plants (Trichilia clausenii, Trichilia catigua and Campomanesia xanthocarpa) and crops (soybean, sugar cane and eucalyptus) located in geographically distinct regions, using 16S rRNA gene sequences from clone libraries, the influence of volatile organic compounds (VOCs) emitted by each plant, the different levels of solar radiation, and seasonality in the selection of bacterial communities in the phyllosphere of Trichilia clausenii using 16S rRNA gene sequences from cDNA clone libraries and gas chromatography-mass spectrometry (GCMS). The comparative analysis of the 16S rRNA gene sequences from clone libraries of plants from natural environments confirmed that each plant species has its own community of bacteria, where the diversity of OTUs in the phyllosphere of C. xanthocarpa and T. clusenii was greater than that of cultivated plants. The phylum Proteobacteria was predominant in the phyllosphere of both cultivated and native plants, where Alphaproteobacteria was dominant in phyllospheres of soybean and sugar cane and Gamaproteobacteria was harbored on the three trees of the Atlantic Forest. These results suggest that the phyllosphere of cultivated plants can select for specific groups of bacteria that are not found in the phyllosphere of tree species in the Atlantic Forest, and vice versa, where the conversion of forests to agriculture may lead to a reduction of bacterial beta diversity. The results of the phylogenetic affiliation between the phyllospheres of Tichilia clausenii, subjected to different intensities of UV radiation, also showed a predominance of clones associated with Proteobacteria in the evaluated clone libraries. The light factor, which was evaluated during the same period, showed no effect on the bacterial community, however, seasonal effects were quite evident, showing a higher diversity and species richness during the rainy season. This data suggests that epiphytic bacteria are equipped with a high degree of adaptation to different environmental conditions that they are exposed to.