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Poster Abstract

Jede Zelle besitzt tausende verschiedene Proteine, die sich in einer Vielzahl von Eigenschaften unterscheiden. Um sicher zu stellen, dass alle Proteine aktiv sind und im richtigen zellulären Kompartiment vorliegen, hat die Evolution effiziente Kontroll-mechanismen hervorgebracht. Als Modell zur Untersuchung dieser elementaren Mechanismen eignet sich das Periplasma von E. coli, denn es besitzt alle für die Proteinqualitätskontrolle wichtigen Faktoren (Chaperone, Proteinfaltungskatalysatoren und Proteasen). Obwohl Struktur, Funktion und Regulation der einzelnen periplasmatischen Faltungsfaktoren gut untersucht sind, ist über ihre mögliche Organisation in Faltungswege oder Netzwerke kaum etwas bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, erste Einblicke in bisher unbekannte Netzwerke der Proteinqualitätskontrolle zu erlangen und ihre Schlüsselelemente zu identifizieren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Herstellung und Charakterisierung von E. coli-Mutanten lieferte zahlreiche Erkenntnisse, die zum besseren Verständnis der periplasmatischen Proteinfaltung beitragen. Durch die Herstellung synthetisch letaler Phänotypen erlangten Rizzitello et al. erste Erkenntnisse zur Organisation von periplasmatischen Faltungsfaktoren. Deletionsstudien ergaben letale Kombinationen für Nullmutationen in surA und skp bzw. surA und degP. Da nur diese beiden Paarungen synthetisch letale Phänotypen ergaben, die skp degP-Doppelmutante jedoch gänzlich unauffällig war, folgerten Rizzitello et al., dass es sich bei SurA und DegP bzw. Skp um redundante Faktoren handelt, die in zwei unterschiedlichen Faltungswegen organisiert sein müssen (Rizzitello, 2001). Zur Charakterisierung möglicher Faltungswege der Proteinqualitätskontrolle wurden daher im Rahmen der vorliegenden Arbeit 84 Mutanten konstruiert, die jeweils zwei ausgewählte Faltungsfaktoren nicht exprimieren. Die Identifizierung letaler Kombinationen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen (optimale Bedingungen, verschiedene Stressbedingungen) und die Charakterisierung der Membranintegrität aller Doppel-KO-Stämme ergab 11 synthetische Phänotypen bzw. genetische Interaktionen, die Einfluss auf die Proteinqualitätskontrolle der Zellhülle besitzen. Anhand dieser Interaktionen konnten Rückschlüsse auf funktionelle Redundanzen der entsprechenden Genprodukte und ihre mögliche Organisation in verschiedene Faltungswege gezogen werden. Die 11 auf diese Weise identifizierten Doppelmutanten, wurden anhand von Untersuchungen zu metabolischen Prozessen und durch qRT-PCR-Analysen genauer charakterisiert. Die Ergebnisse dieser Studien konnten die Bedeutung der genetischen Interaktionen von degP dsbA, degP tsp, surA dsbA, surA ptrA, surA yfgC, dsbA fkpA und tsp ydgD für die Proteinqualitätskontrolle belegen. Zudem wurden SurA, DegP, Tsp und DsbA als Schlüsselelemente von Proteinfaltungsprozessen identifiziert, denn an jedem Phänotyp, der auf deutliche Faltungsdefekte hinwies, war entweder eine Nullmutation in surA, degP, tsp oder dsbA beteiligt. Mögliche funktionelle Redundanzen der verschiedenen Faltungsfaktoren ließen sich größtenteils auf Proteinebene bestätigen. So konnten durch Western Blot-Analysen gemeinsame Substrate für die Prolinisomerase SurA und die Metalloproteasen PtrA bzw. YfgC, sowie für die Serinprotease DegP und die Oxidoreduktase DsbA bzw. die Serinprotease Tsp identifiziert werden. Darüber hinaus konnten anhand dieser Methode weitere genetische Interaktionen von degP belegt werden, die in den vorhergehenden Untersuchungen der vorliegenden Arbeit keine Besonderheiten zeigten. So besitzen die Prolinisomerase PpiD und die Metalloprotease YfgC ebenfalls gemeinsame Substrate mit DegP. Eine mögliche redundante Funktion von DegP und Tsp konnte zusätzlich durch biochemische Analysen, wie Aktivitätstests und Studien zur Sequenzspezifität von PDZ-Domänen bestätigt werden. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten Redundanzen lassen eine strikte Trennung der untersuchten Faltungsfaktoren in starre Faltungswege nicht zu. Vielmehr belegen die Ergebnisse erstmals, dass die Proteinqualitätskontrolle als flexibles Netzwerk organisiert ist, dass sich in Abhängigkeit von Umweltbedingungen an die jeweiligen Substrat anpasst. SurA, DegP, Tsp und DsbA könnten als zentrale Elemente die einzelnen Zweige des dynamischen Faltungsnetzwerks miteinander verbinden. Diese ersten Einblicke in das bisher unbekannte Netzwerk der Proteinqualitätskontrolle und die Identifizierung der Schlüsselelemente können dazu beitragen rekombinante Proteine (z. B. therapeutische Antikörper) effizienter in Bakterien zu produzieren und eröffnen mögliche Angriffspunkte für neue Antibiotika.

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a life-threatening lung disease of hematological malignancy or bone marrow transplant patients caused by the ubiquitous environmental fungus Aspergillus fumigatus. Current diagnostic tests for the disease lack sensitivity as well as specificity, and culture of the fungus from invasive lung biopsy, considered the gold standard for IPA detection, is slow and often not possible in critically ill patients. In a previous study, we reported the development of a novel non-invasive procedure for IPA diagnosis based on antibody-guided positron emission tomography and magnetic resonance imaging (immunoPET/MRI) using a [64Cu]DOTA-labeled mouse monoclonal antibody (mAb), mJF5, specific to Aspergillus. To enable translation of the tracer to the clinical setting, we report here the development of a humanised version of the antibody (hJF5), and pre-clinical imaging of lung infection using a [64Cu]NODAGA-hJF5 tracer. The humanised antibody tracer shows a significant increase in in vivo biodistribution in A. fumigatus infected lungs compared to its radiolabeled murine counterpart [64Cu]NODAGA-mJF5. Using reverse genetics of the pathogen, we show that the antibody binds to the antigenic determinant β1,5-galactofuranose (Galf) present in a diagnostic mannoprotein antigen released by the pathogen during invasive growth in the lung. The absence of the epitope Galf in mammalian carbohydrates, coupled with the enhanced imaging capabilities of the hJF5 antibody, means that the [64Cu]NODAGA-hJF5 tracer developed here represents an ideal candidate for the diagnosis of IPA and translation to the clinical setting., Theranostics, 7 (14), ISSN:1838-7640