Search

La tesi que es presenta per optar al grau de doctor en biologia titulada: “Anàlisi de l’expressió del receptor scavenger CD36 en els leucòcits: conseqüències funcionals en la inflamació” ha estat acceptada per ser presentada per compendi de publicacions. Aquesta consta de dos articles: • Functional consequences of CD36 downregulation by TLR signals. Carlos Zamora et al. Cytokine 2012 Oct; 60(1): 257-65. • Functional consequences of platelet binding to T lymphocytes in inflammation. Carlos Zamora et al. Journal of Leukocyte Biology 2013 Sep; 94(3): 521-9. La inflamació és un conjunt de processos biològics que tenen com a finalitat comú protegir a l’organisme dels patògens i dany. Durant el procés inflamatori, intervenen diferents components cel·lulars a través de diferents receptors de membrana i citoquines proinflamatòries i antiinflamatòries. Un dels receptors involucrats en aquest procés inflamatori és el receptor scavenger CD36. En els monòcits, el CD36 és una molècula capaç de reconèixer i captar lipoproteïnes modificades, patògens, neutròfils apoptòtics i actuar com a coreceptor dels Toll-like receptors (TLRs) perquè es doni una eficient resposta inflamatòria. Fins al moment es desconeixia si els TLRs modulaven el CD36 en els monòcits i les conseqüències funcionals comportarà aquesta modulació. Per altra banda, es desconeixia si l’expressió de CD36 en limfòcits era extrínseca a ells i quines funcions podria tenir la subpoblació de limfòcits T que l’expressen. En el primer article, vam observar que els lligands de TLR2 i TLR4 disminuïen l’expressió de CD36 en la superfície de les diferents subpoblacions de monòcits, internalitzant-se cap al interior d’aquests. Aquesta, era parcialment deguda al TNFα produït en els cultius de TLRs. La reducció de l’expressió de CD36 en els monòcits va donar lloc a una disminució de la fagocitosis de neutròfils apoptòtics, un procés clau en el manteniment de l’homeòstasi en els teixits. En el segon article, vam observar que l’expressió de CD36 en una petita subpoblació de limfòcits T CD4+ era extrínseca a ells, provenint de les plaquetes unides a ells que presentaven. Aquesta subpoblació de limfòcits T CD4+ amb plaquetes unides presentava una disminució de la capacitat proliferativa i de producció de citoquines inflamatòries (IL-17 i IFNγ). En els pacients d’artritis reumatoide, s’observa un grup de pacients amb un augment de limfòcits T CD4+ amb plaquetes unides. Aquet grup de pacients van ser els que van presentar un fenotip menys sever de la malaltia, suggerint així que la unió de plaquetes als limfòcits era un mecanisme immunoregulador., Thesis presented to obtain the degree of Biology PhD entitled: “Analysis of scavenger receptor CD36 in leukocytes: functional consequences in inflammation” has been accepted to be presented to collection of published articles. This thesis contain two articles: • Functional consequences of CD36 downregulation by TLR signals. Carlos Zamora et al. Cytokine 2012 Oct; 60(1): 257-65. • Functional consequences of platelet binding to T lymphocytes in inflammation. Carlos Zamora et al. Journal of Leukocyte Biology 2013 Sep; 94(3): 521-9. Inflammation is a set of biological processes that aim to protect from the harmful effects of pathogens and cellular damage. During inflammatory process, different cells are involved, such as monocytes and lymphocytes, through different membrane receptors and pro- and antiinflammatory cytokines. One of the receptors involved in this inflammatory process is scavenger receptor CD36. In monocytes, CD36 molecule is able to recognize and capture modified lipoproteins, pathogens, apoptotic neutrophils, and act as a coreceptor of Toll-like receptors (TLRs) to give an efficient inflammatory response. Until now, it was not known whether TLRs modulate CD36 on monocytes and functional consequences that involve modulation in these cells. Moreover, it was not known whether the expression of CD36 on lymphocytes was extrinsic to them and how this T lymphocyte CD36+ subpopulation functions. In the first article, we observed that TLR2 and TLR4 ligands decreased the expression of CD36 on the surface of different subpopulations of monocytes, internalizing towards the inside of them. This was partially due to the TNFα production after TLRs cultures. Reduced expression of CD36 on monocytes resulted in a decrease of phagocytosis of apoptotic neutrophils, a key process in the maintenance of tissue homeostasis. In the second article, we observed that CD36 expression in a small subpopulation of CD4+ T lymphocytes was extrinsic to them, deriving from platelet bind to them. This subpopulation of CD4+ T cells with bound platelets showed a decreased proliferate capacity and inflammatory cytokine production (IL-17 and IFNγ). In rheumatoid arthritis patients, we observed a group with increased CD4+ T cells with bound platelets. This group of patients was those who had a less severe phenotype of the disease, suggesting that the binding of platelets to lymphocytes was an immunoregulador mechanism.

El vessament pleural maligne (VPM) es defineix com l'acumulació significativa de líquid pleural acompanyat de cèl·lules tumorals. És una complicació clínica força freqüent associada al càncer de pulmó avançat; en particular, a l'adenocarcinoma. L'aparició del VPM es relaciona amb un mal pronòstic i els tractaments són més aviat pal·liatius. Malgrat disposar de diverses tècniques de diagnòstic, s'estima que al voltant del 20% dels casos queden sense diagnosticar o són classificats erròniament. L'anàlisi de la composició molecular i cel·lular del líquid pleural pot ser útil per a trobar nous marcadors que confereixin un diagnòstic més ràpid i acurat del VPM o ajudin a predir la progressió de la malaltia. El VPM constitueix un medi únic per estudiar les interaccions entre les cèl·lules tumorals i les cèl·lules del sistema immunitari. Hi ha evidències de l'increment de molècules antiinflamatòries en els VPM, com el TGF-B i la IL-10 suggerint un entorn immunosupressor. Els factors secretats per les plaquetes també juguen un paper important promovent el creixement i la disseminació tumoral. L'objectiu general de la tesi ha estat caracteritzar a nivell cel·lular, molecular i funcional els VPMs per identificar molècules implicades en la modulació de la resposta immunitària, en especial aquells factors solubles derivats de la plaqueta. L'objectiu clínic ha estat determinar el valor diagnòstic i/o pronòstic dels factors immunomoduladors alterats en el VPM. Es van recollir líquids pleurals de pacients amb adenocarcinoma pulmonar (VPM; n=47) i líquids pleurals de pacients amb insuficiència cardíaca congestiva (IC) (vessaments pleurals benignes (VPB); n=25), aquest últim com a grup control. Per tal d'estudiar l'efecte del VPM sobre les funcions dels limfòcits T i dels neutròfils es va dissenyar un model de cultiu in vitro amb líquids pleurals que simulés el microambient tumoral del VPM. Els resultats mostren que la composició molecular i les associacions entre els factors immunomoduladors dels VPs varien en funció de l'etiologia. Els VPMs estan enriquit en factors derivats de la plaqueta, com són el TGF-B, el PF4, la P-selectina i el VEGF, en comparació amb els VPBs. En particular, el PF4 es va veure implicat en la supressió de la resposta dels limfòcits T observada en els cultius amb VPMs. Concentracions pleurals elevades d'aquesta molècula es relacionaven amb una menor activació, proliferació, i activitat citotòxica dels limfòcits T CD4+ i CD8+. A més a més, els limfòcits T estimulats en presència de VPMs adquirien un fenotip antiinflamatori, amb un augment de la producció de IL-10. L'elevat contingut de PF4 dels VPMs provenia parcialment d'una major producció local per part de les cèl·lules del líquid pleural, inclosos els limfòcits T activats, tot i no ser-ne la font principal. Malgrat no detectar un nombre significatiu de plaquetes, no es descarta que la principal via d'entrada puguin ser les micropartícules derivades de la plaqueta. Pel que fa als neutròfils, el microambient tumoral del VPM estimulava l'activitat protumoral d'aquesta cèl·lula promovent la desgranulació i la NETosi, mentre que frena l'esclat oxidatiu en comparació amb els VPBs. La NETosi es va associar positivament amb la concentració pleural de P-selectina i PD-L1 soluble en VPMs indicant la participació dels factors derivats de la plaqueta en la modulació de l'activitat del neutròfil. La concentració dels productes de desgranulació (MPO, lactoferrina i MMP-9) i IL-8, eren més elevades en VPMs i permetien distingir-los dels VPBs, convertint-los en possibles marcadors de diagnòstic. Clínicament, la concentració pleural de PF4 i la capacitat del VPM d'induir la NETosis van resultar útils com a variables independents predictores de la supervivència dels pacients amb VPM derivat d'adenocarcinoma pulmonar. En ambdós casos, valors elevats s'associaven a un mal pronòstic. El derrame pleural maligno (DPM) se define como la acumulación significativa de líquido pleural acompañado de células tumorales. Es una complicación clínica bastante frecuente asociada al cáncer de pulmón avanzado; en particular, al adenocarcinoma. La aparición del DPM se relaciona con un mal pronóstico y los tratamientos son mayoritariamente paliativos. A pesar de disponer de diversas técnicas de diagnóstico, se estima que en torno al 20% de los casos quedan sin diagnosticar o son erróneamente clasificados. El análisis de la composición molecular y celular del líquido pleural puede ser útil para encontrar nuevos marcadores que confieran un diagnóstico más rápido y preciso del DPM o ayuden a predecir la progresión de la enfermedad. El DPM constituye un medio único para estudiar interacciones entre las células tumorales y las células del sistema inmunitario. Existen evidencias del incremento de moléculas antiinflamatorias en los DPM, como el TGF-B y la IL-10, sugiriendo un entorno inmunosupresor. Los factores secretados por las plaquetas también juegan un papel importante promoviendo el crecimiento y diseminación tumoral. El objetivo general de la tesis ha sido caracterizar a nivel celular, molecular y funcional los DPMs para identificar moléculas implicadas en la modulación de la respuesta inmunitaria, especialmente aquellos factores solubles derivados de la plaquita. El objetivo clínico ha sido determinar el valor diagnóstico y/o pronóstico de los factores inmunomoduladores alterados en el DPM. Se recogieron líquidos pleurales de pacientes con adenocarcinoma pulmonar (DPM; n=47) y líquidos pleurales de pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva (IC) (derrames pleurales benignos (DPB); n=25), este último como grupo control. Para estudiar el efecto del DPM sobre las funciones de los linfocitos T y de los neutrófilos se diseñó un modelo de cultivo in vitro con líquidos pleurales que simulara el microambiente tumoral del VPM. Los resultados muestran que la composición molecular y las asociaciones entre los factores inmunomoduladores de los DPs varían en función de la etiología. Los DPMs están enriquecidos en factores derivados de la plaqueta, como son el TGF-β, el PF4, la P-selectina, y el VEGF, en comparación con los DPBs. En particular, el PF4 se vio implicado en la supresión de la respuesta de los linfocitos T observada en los cultivos con DPMs. Concentraciones pleurales elevadas de esta molécula se relacionaban con una menor activación, proliferación y actividad citotóxica de los linfocitos T CD4+ y CD8+. Además, los linfocitos T estimulados en presencia de DPMs adquirían un fenotipo antiinflamatorio, con un aumento de la producción de IL-10. El elevado contenido de PF4 de los VPM provenía parcialmente de una mayor producción local por parte de las células del líquido pleural, incluidos los linfocitos T activados, a pesar de no ser su fuente principal. Pese a no detectar un número significativo de plaquetas, no se descarta que la principal vía de entrada puedan ser las micropartículas derivadas de la plaqueta. En cuanto a los neutrófilos, el microambiente tumoral del DPM estimulaba la actividad protumoral de esta célula promoviendo la desgranulación y la NETosis, mientras que frenaba el estallido oxidativo en comparación con los DPBs. La NETosis se asoció positivamente con la concentración pleural de P-selectina y PD-L1 soluble en DPMs indicando la participación de factores derivados en gran medida de la plaqueta en la modulación de la actividad del neutrófilo. La concentración de los productos de desgranulación (MPO, lactoferrina y MMP-9) e IL-8, eran más elevadas en DPMs y permitían distinguirlos de los DPBs, convirtiéndolos en posibles marcadores de diagnóstico. Clínicamente, la concentración pleural de PF4 y la capacidad del DPM de inducir la NETosis se asociaron independientemente con un un mal pronóstico en pacientes con DPM derivado de adenocarcinoma pulmonar. Malignant pleural effusion (MPE) is defined as the significant accumulation of pleural fluid accompanied by tumor cells. It is a common complication associated with advanced lung cancer; in particular, adenocarcinoma. It is related to a poor prognosis and treatments are rather palliative. Despite having several diagnostic techniques, it is estimated that around 20% of cases remain undiagnosed or are misclassified. The analysis of the molecular and cellular composition of the pleural fluid can be useful to discover new biomarkers that confer a more accurate diagnosis of MPE or predict the progression of the disease. The MPE constitutes a unique milieu for studying the interactions between tumor and immune cells. There is evidence of increased anti-inflammatory molecules in MPE, such as TGF-B and IL-10, suggesting an immunosuppressive environment. Factors secreted by platelets also play an important role in promoting tumor growth and dissemination. The main aim of the thesis was to characterize MPE at a cellular, molecular and functional level to identify molecules involved in the modulation of the immune response, especially those soluble factors derived from platelets. The clinical aim was to determine the diagnostic and/or prognostic value of altered immunomodulatory factors in MPE. We collected pleural fluids from lung adenocarcinoma patients (MPE; n=47) and pleural fluids from patients with congestive heart failure (HF) (benign pleural effusions (BPEs); n=25), as a control group. To study the effect of MPE on T lymphocyte and neutrophil functions, we designed an in vitro culture model with pleural fluids to simulate the MPE tumor microenvironment. The results showed that molecular composition and associations between the immunomodulatory factors of the pleural fluids vary depending on the etiology. MPE is enriched in platelet-derived factors, such as TGF-B, PF4, P-selectin, and VEGF, compared to BPEs. We observed that PF4 was implicated in the suppression of the T lymphocyte response observed in MPE cultures. High pleural levels of this molecule were related to lower activation, proliferation, and cytotoxic activity of CD4+ and CD8+ T lymphocytes. In addition, T lymphocytes stimulated in the presence of VPMs acquired an anti-inflammatory phenotype, with increased IL-10 production. The high PF4 content of MPE was partially due to increased local production by pleural fluid cells, including activated T lymphocytes, although they weren't the main source. Despite not detecting a significant number of platelets, it cannot be ruled out that platelet microparticles could be the main route of entry.