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This report concerns the cytogenetic analysis, using both C-banding and fluorescence in situ hybridisation techniques, of a sterile mare. Results obtained revealed a 2n = 65, XXX condition with no sign of mosaicism. The work supports the suggestion that X trisomy, rare in horse, causes infertility in mares and is not associated to other clearly visible phenotypic features.

Il lavoro ricostruisce l'intero sistema di tela penale dell'ambiente, allargando una precedente ricostruzione con le importanti e numerose modifiche al settore introdotte con la L. 68/2015. Viene risistemata la catalogazione delle fattispecie, con il loro contenuto e le prassi giurisprudenziali, trattate le problematiche 'trasversali' ai diversi settori ed analizzata la parte sanzionatoria, compresa quella amministrativo-punitiva.

Down syndrome critical region gene 1-like 2 (DSCR1L2) belongs to the human DSCR1-like gene family, which also includes DSCR1 and DSCR1L1. Both DSCR1 and DSCR1L1 proteins interact with calcineurin, a calcium/calmodulin-dependent phosphatase. To date, no interactor has been described for DSCR1L2. The aim of this work was to perform a first functional study of DSCR1L2 using yeast two-hybrid analysis conducted on a human heart cDNA library. Here, we report the interaction between DSCR1L2 and the human cardiac troponin I (TNNI3), the heart-specific inhibitory subunit of the troponin complex, a central component of the contractile apparatus. This interaction was confirmed by both yeast cotransformation and GST (glutathione-sepharose transferase) fusion protein assay. Moreover, a new DSCR1L2 mRNA isoform, generated by alternative splicing, was identified and cloned in different tissues: it lacks two central exons, encoding the most conserved domains among the DSCR1-like protein family. A quantitative relative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay showed that in heart tissue the normalized expression level ratio for DSCR1L2 and DSCR1L2-E2E5 mRNA isoforms is 3.5 : 1, respectively. The yeast cotransformation and GST fusion protein assay demonstrated the interaction between this new DSCR1L2 variant and the human cardiac troponin I and the prominent role of DSCR1L2 exon 2 in determining binding between both DSCR1L2 isoforms and TNNI3. These data indicate an entirely new role for a DSCR1-like family gene, suggesting a possible involvement of DSCR1L2 in cardiac contraction.

Summary: Extracting the desired data from a database entry for later analysis is a constant need in the biological sequence analysis community; GeneRecords 1.0 is a solution for GenBank biological flat file parsing, as it implements a structured representation of each feature and feature qualifier in GenBank following import in a common database managing system usable in a personal computer (Macintosh and Windows environments). This collection of related databases enables the local management of GenBank records, allowing indexing, retrieval and analysis of both information and sequences on a personal computer. Availability: the current release, including the FileMaker Pro runtime application (built for Windows and Macintosh environments), is freely available at http://apollo11.isto.unibo.it/software/

Background CYYR1 is a recently identified gene located on human chromosome 21 whose product has no similarity to any known protein and is of unknown function. Analysis of expressed sequence tags (ESTs) have revealed high human CYYR1 expression in cells belonging to the diffuse neuroendocrine system (DNES). These cells may be the origin of neuroendocrine (NE) tumors. The aim of this study was to conduct an initial analysis of sequence, splicing and expression of the CYYR1 mRNA in human NE tumors. Methods The CYYR1 mRNA coding sequence (CDS) was studied in 32 NE tumors by RT-PCR and sequence analysis. A subtle alternative splicing was identified generating two isoforms of CYYR1 mRNA differing in terms of the absence (CAG- isoform, the first described mRNA for CYYR1 locus) or the presence (CAG+ isoform) of a CAG codon. When present, this specific codon determines the presence of an alanine residue, at the exon 3/exon 4 junction of the CYYR1 mRNA. The two mRNA isoform amounts were determined by quantitative relative RT-PCR in 29 NE tumors, 2 non-neuroendocrine tumors and 10 normal tissues. A bioinformatic analysis was performed to search for the existence of the two CYYR1 isoforms in other species. Results The CYYR1 CDS did not show differences compared to the reference sequence in any of the samples, with the exception of an NE tumor arising in the neck region. Sequence analysis of this tumor identified a change in the CDS 333 position (T instead of C), leading to the amino acid mutation P111S. NE tumor samples showed no significant difference in either CYYR1 CAG- or CAG+ isoform expression compared to control tissues. CYYR1 CAG- isoform was significantly more expressed than CAG+ isoform in NE tumors as well as in control samples investigated. Bioinformatic analysis revealed that only the genomic sequence of Pan troglodytes CYYR1 is consistent with the possible existence of the two described mRNA isoforms. Conclusion A new "subtle" splicing isoform (CAG+) of CYYR1 mRNA, the sequence and the expression of this gene were defined in a large series of NE tumors.

Background All standard methods for cDNA cloning are affected by a potential inability to effectively clone the 5' region of mRNA. The aim of this work was to estimate mRNA open reading frame (ORF) 5' region sequence completeness in the model organism Danio rerio (zebrafish). Results We implemented a novel automated approach (5'_ORF_Extender) that systematically compares available expressed sequence tags (ESTs) with all the zebrafish experimentally determined mRNA sequences, identifies additional sequence stretches at 5' region and scans for the presence of all conditions needed to define a new, extended putative ORF. Our software was able to identify 285 (3.3%) mRNAs with putatively incomplete ORFs at 5' region and, in three example cases selected (selt1a, unc119.2, nppa), the extended coding region at 5' end was cloned by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Conclusion The implemented method, which could also be useful for the analysis of other genomes, allowed us to describe the relevance of the "5' end mRNA artifact" problem for genomic annotation and functional genomic experiment design in zebrafish. Open peer review This article was reviewed by Alexey V. Kochetov (nominated by Mikhail Gelfand), Shamil Sunyaev, and Gáspár Jékely. For the full reviews, please go to the Reviewers' Comments section.

Il gene umano RCAN3 (Regulator of Calcineurin 3, anche conosciuto come DSCR1L2), localizzato sul cromosoma 1 (1p36.11), appartiene alla famiglia genica RCAN, di cui gli altri membri sono i geni RCAN1 ed RCAN2. Recentemente il Comitato internazionale HUGO ha proposto per i geni e le proteine di questa famiglia la nomenclatura presentata per la prima volta in questo lavoro; nomenclatura che è stata ampiamente discussa anche nell’ambito di un “Forum article” in via di pubblicazione. Il gene RCAN3 è costituito da 5 esoni e ad oggi sono state identificate due isoforme alternative: RCAN3-2,3,4b,5, che manca di 30 nucleotidi all’inizio dell’esone 4 e codifica per una proteina priva di 10 amminoacidi nella sua porzione centrale (RCAN3-2,3,4b,5) ed RCAN3-2,5 che manca degli esoni 3-4 e codifica per una proteina di 115 amminoacidi, con una porzione proteica C-terminale diversa da RCAN3, a causa di uno scivolamento del modulo di lettura a partire dall’esone 5 (RCAN3-2,5). Ad oggi più di un centinaio di lavori sono stati pubblicati sulla famiglia RCAN e nella maggior parte sono presentati studi sulle funzioni di RCAN1 ed RCAN2. Solo due lavori si sono occupati dei possibili ruoli di RCAN3. Recentemente il nostro gruppo di ricerca, mediante un saggio dei due ibridi condotto in una genoteca di cDNA di cuore umano, ha dimostrato che RCAN3 ed RCAN3-2,5 sono in grado di interagire con la troponina inibitoria cardiaca (TNNI3), una delle principali componenti dell’apparato contrattile muscolare; inoltre Mulero e colleghi hanno identificato nella calcineurina, una fosfatasi calcio-calmodulina dipendente, un altro possibile interattore di RCAN3. Lo scopo del presente lavoro è stato condurre una analisi delle diverse isoforme di RCAN3 e delle rispettive proteine da un punto di vista molecolare, bioinformatico, di espressione genica e funzionale. In primo luogo sono state identificate grazie ad un clonaggio mediante RT-PCR due nuove isoforme di RCAN3, in accordo con l’elevato numero di splicing dimostrato nei geni umani: RCAN3-2,4,5 che manca dell’esone 3 ed RCAN3-2,3,5, che manca dell’esone 4. Sequenze di cDNA per le isoforme alternative di RCAN3 sono state identificate solo in Homo sapiens, utilizzando come strumenti per tale ricerca il programma BLASTN, ECgene Browser e Genome Browser; solo per l’isoforma RCAN3-2,4,5 sono state ritrovate 2 EST. In seguito è stata condotta una RT-PCR quantitativa relativa per analizzare il pattern di espressione delle 5 isoforme note in 7 tessuti umani normali (cuore, cervello, polmone, prostata, testicolo, leucociti, intestino tenue), basandosi su dati precedentemente raccolti che dimostravano come il gene RCAN3 fosse espresso in diversi tessuti.Tutte le isoforme sono risultate espresse nei singoli tessuti e in tutti i tessuti si è dimostrato che l’isoforma più espressa è RCAN3. Inoltre il livello di espressione dell’intero locus RCAN3 è risultato confrontabile in tutti i tessuti, dimostrandone l’ubiquitarietà. Infine, grazie ad un saggio di cotrasformazione in lievito e ad un saggio in vitro di legame alla GST, è stata dimostrata l’interazione delle due nuove isoforme identificate RCAN3-2,4,5 e RCAN3-2,3,5 con la TNNI3, così come si poteva ipotizzare grazie alla presenza dell’esone 2, il cui prodotto è ritenuto essere sufficiente per il legame a tale proteina cardiaca.

L’analisi del trascrittoma (l’insieme degli RNA trascritti) di un tessuto, o di un campione cellulare, è uno degli strumenti fondamentali per comprendere le proprietà biologiche globali del tessuto in esame (System Biology). Attualmente, la metodica più utilizzata per tale analisi è lo studio dei profili di trascrizione mediante microarray, che si basa sulla creazione di sonde specifiche per RNA noti da utilizzare per valutare la quantità degli RNA stessi presenti nel tessuto in esame. Le sonde possono essere costituite da cDNA oppure da oligonucleotidi creati tramite la tecnologia brevettata dalla ditta Affymetrix, che ne fornisce anche la piattaforma d’analisi. Uno degli scopi prioritari degli studi attuali dei profili di trascrizione è determinare quali regioni cromosomiche sono trascritte (mappe di trascrizione) al fine di comprendere i meccanismi di regolazione genica. Abbiamo sviluppato il software “TRAnscript Map Analizer” (TRAMA) per generare mappe di trascrizione genica umana da dati d’espressione, ottenuti da esperimenti sia mediante la piattaforma Affymetrix sia mediante array a cDNA. Il software richiede per funzionare la previa importazione delle informazioni riguardanti i cDNA umani noti, e se necessario quelle relative alle sonde Affymetrix del set umano U133, tutte prelevabili dal sito web “Genome Browser”. Inoltre, occorrono i dati aggiornati della banca dati UniGene, ottenibili anche utilizzando il software “UniGene Tabulator”. In seguito alla importazione dei dati di espressione da analizzare, il software genera una tabella per ogni tipo di cromosoma umano (per un totale di 24 tabelle) in cui ogni riga (record) contiene i dati di un segmento cromosomico di lunghezza fissata dall’utente, in bp, a cui sono associati i dati dell’espressione di quella regione e le informazioni sui geni in essa contenuti (indicati mediante il loro simbolo genico, o il relativo cluster di UniGene se il simbolo non è disponibile). L’espressione di ciascun segmento è visualizzabile come barra colorata dal verde al rosso proporzionalmente all’espressione media del cromosoma, rispettivamente più alta o più bassa. Successivamente, il software genera una seconda tabella per ogni cromosoma, contenente i segmenti con un’espressione pari ad almeno la media dell’espressione genica per quel cromosoma nell’esperimento analizzato. Inoltre il software genera, in una tabella separata, una singola mappa genomica virtuale che dispone in maniera contigua tutti i cromosomi umani, per analizzare l’espressione complessiva del genoma in un singolo esperimento. Il software può elaborare due diversi profili di espressione, generando in questo caso anche una mappa di trascrizione basata sul rapporto di espressione tra i due profili. In questo modo è possibile applicare il programma allo studio dei dati di espressione del genoma umano per la identificazione di "cluster" di geni coespressi (moduli funzionali) localmente definiti sulla mappa. Il software TRAMA è basato su FileMaker Pro 8.5, un gestore di basi di dati (databases) di semplice utilizzo, ed è distribuito come applicazione stand-alone per le piattaforme Macintosh e Windows corredato di una guida descrittiva per l’uso.

The activation of the insulin-like growth factor 1/IGF1 receptor system (IGF1/IGF1R) is a critical event in the transformation and tumorigenicity processes in a wide variety of human tumors. The IGF1/IGF1R system has been recently studied in carcinoid tumors that often arise in the gastrointestinal tract; these tumors are characterized by hypersecretion of bioamines and neuropeptides, leading to functional tumor disease. Two alternatively spliced IGF1R mRNA transcripts have been described to differ by only three nucleotides (CAG) in the coding sequence, resulting in an amino-acid change from the originally described Thr-Gly to an Arg in the extracellular portion of the receptor beta subunit. In transfected Chinese hamster ovary cells, the form without CAG (CAG-) exhibited an approximate 2-fold increase in IGF1 stimulation of activities required for its mitogenic properties. In this study, we examine the relative expression of the two IGF1R mRNA isoforms by a semiquantitative RT-PCR approach using highly standardized conditions, beta-2 microglobulin (B2M) as a reference gene and gel imaging analysis. We analyzed a large series of human neuroendocrine tumors (32 samples) and 9 normal tissues. A significant higher expression of both isoforms in the tumor samples (approximately 2-fold increase) was found, while a constant CAG+/CAG- IGF1R mRNA isoforms of an approximate 3:1 ratio was observed in all tumoral and normal cell types studied. The phylogenetic study of the IGF1R locus in several species suggests that human IGF1R CAG- mRNA isoform is evolutionarily more recent compared to the IGF1R CAG+ mRNA isoform and it could be used by the splicing apparatus at this intron/exon junction with a lower efficiency. This study highlights the relevance of IGF1R mRNA expression in neuroendocrine tumor cells, and the constant presence of 'subtle' alternative splicing for the IGF1R locus.

UniGene è un sistema sperimentale per ripartire in maniera non ambigua le sequenze nucleotidiche contenute in GenBank ed attribuirle a gruppi di sequenze (cluster) rappresentativi di geni trascritti. Nella costruzione di UniGene, ad ogni locus genico è assegnato un gruppo di sequenze di RNA che possono essere determinate sperimentalmente in modo accurato “finished”, etichette di sequenze espresse (EST) o sequenze predette. Come conseguenza, UniGene risulta fondamentale in tutte le analisi bioinformatiche che coinvolgono dati a partire da sequenze nucleotidiche, come l’attribuzione di sonde nucleotidiche utilizzate nell’analisi del profilo d’espressione genica, l’integrazione dei dati tra banche dati differenti, l’identificazione di nuovi geni e la predizione della funzione o, infine, l’analisi di profili d’espressione per specifici tessuti o per posizione di mappa genica. Esistono due modalità per l’accesso ai dati UniGene: la ricerca di specifiche schede attraverso il portale web “Entrez” selezionando UniGene tra la lista di banche dati, o il prelievo dell’intera banca dati dal sito “ftp” abilitato. In entrambi i casi, il risultato è l’ottenimento di un file di testo semplice (flat file) da cui le informazioni necessarie devono essere estratte appositamente per essere utilizzate. Il processo di estrazione dati da un file di testo (parsing) richiede l’applicazione di conoscenze informatiche complesse, come i linguaggi BioPerl, JAVA o C++ utilizzati per analizzare le banche dati MedLine (Oliver et al. 2004) ed Entrez Gene (Liu and Grigoriev, 2005), o l’utilizzo di pacchetti software mirati, ad esempio GeneRecords (D’Addabbo et al. 2004) per analizzare il formato GenBank. Tuttavia, ad oggi, non esistono pubblicazioni riguardanti algoritmi o applicazioni dedicati al parsing del formato UniGene. UniGene Tabulator è stato da noi sviluppato per gestire i dati contenuti nel formato UniGene: il file di testo semplice viene importato direttamente in una banca dati apposita, al cui interno avviene il parsing delle informazioni. La banca dati è costituita da sei tabelle, una per ogni tipo di informazione presente nella scheda UniGene (informazioni generali, somiglianze con altre proteine note, sequenze STS note, dati di relativi alla mappa di trascrizione ed informazioni sulle genoteche utilizzate per la creazione delle EST, associate nel cluster UniGene) relazionate tra loro mediante l’identificativo del cluster UniGene. Ogni “record” di una tabella contiene i dati di una singola sequenza, o di un cluster solo per le informazioni generali, ed è suddiviso in campi che contengono i valori estratti. Ogni campo è indicizzato per eseguire rapidamente ricerche specifiche ed il risultato può essere esportato in un file di testo per essere utilizzato per ulteriori analisi o altre ricerche. UniGene tabulator è basato su FileMaker Pro 8, un gestore di basi di dati di semplice utilizzo, ed è distribuito come applicazione stand-alone per piattaforme Macintosh e Windows corredato di una guida descrittiva delle operazioni utili ad importare il file UniGene con i dati per la specie animale in studio.

È noto che i metodi classici di clonaggio del cDNA sono influenzati da una potenziale incapacità di amplificare efficacemente la regione 5´ dell’mRNA. Dato che la sequenza amminoacidica dei prodotti genici è di norma dedotta dalla sequenza dei nucleotidi del relativo cDNA clonato, è importante verificare che una sequenza codificante identificata (o open reading frame, ORF) sia quanto più possibile completa al relativo 5´. In studi precedenti abbiamo dimostrato, mediante analisi bioinformatica accurata e successivo clonaggio del cDNA (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione, RT-PCR), che in 4 su 109 geni noti localizzati sul cromosoma 21 umano, le ORF annotate erano incomplete all’estremità 5´. Scopo del presente lavoro è stato valutare la completezza nella regione 5´ delle sequenze ORF di mRNA di Danio rerio (zebrafish), organismo modello sempre più utilizzato in studi di genomica. Abbiamo sviluppato un innovativo metodo automatizzato che consente di: 1) confrontare in modo sistematico le EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) disponibili con tutte le sequenze di mRNA conosciute di Danio rerio; 2) identificare eventuali tratti di sequenza da aggiungere nella regione 5´; 3) verificare la presenza di tutte le condizioni necessarie a dimostrare l’esistenza di una nuova ORF estesa. Queste condizioni sono, in breve, la presenza di un nuovo “primo codone AUG” in fase con quello precedentemente descritto e la mancanza di uno qualsiasi dei tre codoni di stop in fase tra il codone di recente identificazione e quello inizialmente annotato. Il nostro programma ha analizzato gli 8.528 mRNAs di Danio rerio estratti dal database RefSeq (disponibili al 31/12/2005) e ha permesso di identificare 265 (3,1%) mRNA con ORF potenzialmente incomplete nella regione 5´. Attraverso RT-PCR e sequenziamento automatico abbiamo dimostrato per tre geni (selt1a, unc119, nppa), scelti tra quelli candidati, che la regione codificante all'estremità 5' era stata caratterizzata in modo incompleto nelle descrizioni originali. La conoscenza delle ORF complete dell’mRNA assume una particolare valenza in zebrafish per gli studi di localizzazione del prodotto genico, di sovraespressione genica nonché per la realizzazione di organismi knockdown mediante oligonucleotidi morfolinici. Il metodo sviluppato, la cui utilizzazione è applicabile anche all’analisi di altri genomi, ha consentito di descrivere in questo lavoro la rilevanza del problema dell’incompleta caratterizzazione delle estremità 5´ degli mRNA e di sottolinearne le possibili conseguenze nell’ambito dell'annotazione genomica e degli esperimenti funzionali eventualmente progettati in zebrafish.

Summary: UniGene Tabulator 1.0 provides a solution for full parsing of UniGene flat file format; it implements a structured graphical representation of each data field present in UniGene following import into a common database managing system usable in a personal computer. This database includes related tables for sequence, protein similarity, sequence-tagged site (STS) and transcript map interval (TXMAP) data, plus a summary table where each record represents a UniGene cluster. UniGene Tabulator enables full local management of UniGene data, allowing parsing, querying, indexing, retrieving, exporting and analysis of UniGene data in a relational database form, usable on Macintosh (OS X 10.3.9 or later) and Windows (2000, with service pack 4, XP, with service pack 2 or later) operating systems-based computers. Availability: The current release, including both the FileMaker runtime applications, is freely available at Contact: pierluigi.strippoli@unibo.it Supplementary information: We also distribute a precalculated implementation for current Homo sapiens (build #190, March 2006) and Danio rerio (zebrafish, build #90, March 2006) UniGene data.

Tramite analisi di sequenze EST (Expressed Sequence Tags) è stato osservato che il gene umano CYYR1 (cysteine/tyrosine-rich 1) mostra un’alta espressione in cellule appartenenti al sistema APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylation). E’ noto che anomalie del differenziamento cellulare in cellule APUD sono spesso alla base di alcuni tipi di tumore di origine neuroendocrina (APUDomi), come le neoplasie endocrine multiple, i tumori carcinoidi, il feocromocitoma e il melanoma. E’ stata analizzata, mediante RT-PCR specifica e successivo sequenziamento, l’intera sequenza codificante (CDS) dell’mRNA di CYYR1 umano in 32 tumori neuroendocrini (NE). In tutti i campioni analizzati la CDS di CYYR1 è risultata sovrapponibile a quella di riferimento con eccezione della sequenza ottenuta dall’unico tumore localizzato nel collo, un carcinoma scarsamente differenziato con aspetti neuroendocrini. In quest’ultimo caso, l’analisi ha evidenziato la presenza di una mutazione, in eterozigosi, in posizione 333 della CDS (T al posto di C) che porta alla sostituzione amminoacidica P111S. L’analisi di sequenza, inoltre, ha mostrato chiaramente l’esistenza di due isoforme di mRNA dovuta alla presenza di due possibili siti accettori di splicing all’estremo 3¢ dell’introne 3 che termina con la sequenza CAGCAG (splicing alternativo “sottile”). Tale splicing alternativo è presente anche nei tessuti normali. Le due isoforme di mRNA prodotte differiscono per una tripletta CAG (CAG-: assenza della tripletta, CAG+: presenza della tripletta); ne derivano due prodotti proteici putativi diversi per assenza o presenza di un residuo di alanina nel punto di giunzione fra esone 3 ed esone 4. E’ stata successivamente quantificata l’espressione relativa delle due isoforme messaggeriali (CAG- e CAG+) in 29 tumori NE e in 8 tessuti normali tramite un metodo che si basa su una RT-PCR condotta in condizioni altamente standardizzate e stringenti. Il metodo impiega la beta-2 microglobulina (B2M) come gene di riferimento e i risultati della elettroforesi dei prodotti di PCR sono elaborati con un analizzatore di immagini (Gel Doc 2000). Nei campioni tumorali è stata ritrovata una espressione significativamente più bassa della isoforma CAG- rispetto ai controlli normali in un rapporto di 2:3 (p=0,022). Infine abbiamo condotto un’analisi bioinformatica per verificare o meno la presenza delle due isoforme degli ortologhi di CYYR1 in altre specie: solo in Pan troglodites si può ipotizzare l’esistenza delle due isoforme per la presenza, nella sequenza genomica, di un confine introne-esone analogo a quello umano.

Background Formal description of a cell's genetic information should provide the number of DNA molecules in that cell and their complete nucleotide sequences. We pose the formal problem: can the genome sequence forming the genotype of a given living cell be known with absolute certainty so that the cell's behaviour (phenotype) can be correlated to that genetic information? To answer this question, we propose a series of thought experiments. Results We show that the genome sequence of any actual living cell cannot physically be known with absolute certainty, independently of the method used. There is an associated uncertainty, in terms of base pairs, equal to or greater than μs (where μ is the mutation rate of the cell type and s is the cell's genome size). Conclusion This finding establishes an "uncertainty principle" in genetics for the first time, and its analogy with the Heisenberg uncertainty principle in physics is discussed. The genetic information that makes living cells work is thus better represented by a probabilistic model rather than as a completely defined object.

Nel corso dello studio del gene umano CYYR1 (Vitale et al., 2002), localizzato sul cromosoma 21, abbiamo isolato e clonato in vettore un cDNA corrispondente a una isoforma di splicing che differisce di 3 basi (CAG) dalla forma precedentemente da noi identificata e descritta. La sequenza del cDNA della isoforma permette di prevedere la codifica di un prodotto polipeptidico con un amminoacido aggiuntivo (alanina) inserito tra P111 e G112. Lo studio mediante RT-PCR (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione) semiquantitativa ha permesso di dimostrare che le due isoforme sono espresse differenzialmente in diversi tessuti normali studiati. L’analisi genomica ha rivelato che l’origine dello splicing alternativo risiede nella sequenza terminale dell’introne 3 del gene CYYR1 (CAGCAG), che presenta due siti accettori di splicing canonici “AG” distanti tre basi tra loro ed entrambi utilizzabili dalla cellula. E’ stata quindi eseguita una revisione sistematica, basata su analisi bioinformatica e in alcuni casi anche sul clonaggio mediante RT-PCR, degli mRNA umani che si presentano in due possibili isoforme differenti per la presenza o l’assenza di una tripletta CAG. In particolare, abbiamo analizzato con uno specifico programma da noi sviluppato le sequenze di circa 30.000 introni umani (banca dati SRS), dimostrando che in 39 casi (0,13 %) un introne umano termina con la sequenza CAGCAG. In 10 casi, l’analisi della banca dati EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) mostrava l’effettiva esistenza di mRNA differenti per la tripletta CAG. In alcuni casi, la tripletta aggiuntiva si trova nella regione codificante, permettendo la previsione di una sequenza amminoacidica del prodotto variante più lunga di 1 amminoacido. Abbiamo dimostrato la presenza di splicing alternativo, mediante RT-PCR, per i geni: SGNE1 (secretory granule, neuroendocrine protein 1), G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase), PKD1 (polycystic kidney disease 1 gene). Nel caso di IGF1R (codificante il recettore per l’insulin-like growth factor 1), dati di letteratura precedenti hanno mostrato che i prodotti polipeptidici tradotti a partire dalle due differenti isoforme di mRNA e differenti per un singolo amminoacido possono svolgere una diversa funzione biologica (in termini di oncogenicità in saggi di trasfezione cellulare). La identificazione sistematica di isoforme di splicing minimamente differenti con produzione di catene polipeptidiche varianti, oltre ad aver permesso l’identificazione rapida di nuove isoforme di splicing di geni umani noti da tempo e svolgenti azioni biologiche fondamentali, amplia la nozione di variabilità dei prodotti di trascrizione genica che possono essere originati da un singolo locus e prelude alla ricerca di meccanismi simili operanti a livello dei siti donatori di splicing o di altre analoghe sequenze a livello dei siti accettori.

Il gene DSCR1L2 (1p35.3-p33), identificato e clonato nel nostro laboratorio, appartiene alla famiglia genica umana DSCR1L (Down Sindrome critical region 1-like) di cui fanno parte anche i geni DSCR1 (21q22.12) e DSCR1L1 (6p12.3). Le sequenze del cDNA di questi geni non presentano alcuna somiglianza con quelle di membri di famiglie geniche note. L’analisi genomica mostra che, mentre gli invertebrati contengono un solo gene di tipo DSCR1-like, nei vertebrati sono presenti tre membri della famiglia. Lo studio dei loci DSCR1, DSCR1L1 e DSCR1L2 mostra l’esistenza nel genoma umano di una nuova regione di paralogia segmentale di circa 500 kb che comprende l’1,4% del cromosoma 21, nella quale si trovano nello stesso ordine tre membri delle tre famiglie geniche DSCR1L, Runt (AML, acute myeloid leukemia) e CLIC (chloride intracellular channel). L’analisi filogenetica mostra una divergenza tardiva di DSCR1L1 e DSCR1L2 dal gene DSCR1 più ancestrale, e la conservazione della paralogia segmentale fin dai vertebrati inferiori. Lo studio dell’mRNA di DSCR1L2 mostra una espressione ubiquitaria del gene, con un livello molto alto di espressione nel tessuto muscolare, in particolare in quello cardiaco. L’analisi bioinformatica e mediante reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione (RT-PCR) ha permesso di identificare tre isoforme di mRNA generate da splicing alternativo. Una delle isoforme si ottiene per perdita degli esoni 2 e 3 del gene, con conseguente perdita della regione codificante per il dominio ricco in prolina caratteristico della famiglia, una seconda forma mostra la perdita dell’esone 2, mentre la terza si caratterizza per la mancanza di 30 basi codificanti per 10 amminoacidi nella regione centrale della proteina. E’ stato recentemente dimostrato da altri Autori che le proteine DSCR1 e DSCR1L1 si legano alla Calcineurina (CnA), una fosfatasi calcio-calmodulina dipendente che modula l’espressione genica nel muscolo scheletrico e cardiaco durante lo sviluppo e in condizioni di ipertrofia provocata da stress ambientali o da patologie. Da parte di più Autori è stato supposto il legame anche di DSCR1L2 con la CnA stessa nonostante l’assenza di prove sperimentali, solo sulla base dell’omologia di sequenza. Il test dei due ibridi in lievito da noi eseguito per individuare l’interazione proteina-proteina tra DSCR1L2 e una o più proteine tradotte a partire dai cDNA presenti in una genoteca di cuore umano non ha potuto tuttavia rilevare nessuna interazione con la CnA. E’ stata invece dimostrata l’interazione tra DSCR1L2 e la troponina I (TNNI3) cardiaca umana, la subunità inibitoria del complesso delle troponine coinvolte nella contrazione muscolare. L’interazione con TNNI3 della proteina DSCR1L2 mostra un caso interessante di divergenza funzionale nell’ambito della famiglia genica DSCR1L, e contribuisce alla chiarificazione dei complessi proteici implicati nella contrazione muscolare. Inoltre, abbiamo identificato un secondo interattore proteico di DSCR1L2, corrispondente a un cDNA tradotto secondo un modulo di lettura non fisiologico; questo polipeptide non naturale di 48 amminoacidi potrebbe risultare di interesse farmacologico per il suo eventuale ruolo nella modulazione della funzione di DSCR1L2. L’interazione tra DSCR1L2 e TNNI3 è stata confermata mediante cotrasformazione in lievito dei due plasmidi contenenti DSCR1L2 e TNNI3. Una ulteriore conferma di tale interazione viene da esperimenti di coimmunoprecipitazione in vitro. La zona di interazione è stata infine mappata mediante cotrasformazione del cDNA corrispondente alla isoforma di splicing di DSCR1L2 mancante degli esoni 2 e 3 e del cDNA di TNNI3. I risultati mostrano l’assenza di interazione, individuando la zona di interazione nei domini codificati dagli esoni 2 e 3.

The amino acid sequence of gene products is routinely deduced from the nucleotide sequence of the relative cloned cDNA, according to the rules for recognition of start codon (first-AUG rule, optimal sequence context) and the genetic code. From this prediction stem most subsequent types of product analysis, although all standard methods for cDNA cloning are affected by a potential inability to effectively clone the 5′ region of mRNA. Revision by bioinformatics and cloning methods of 109 known genes located on human chromosome 21 (HC 21) shows that 60 mRNAs lack any in-frame stop upstream of the first-AUG, and that in five cases (DSCR1, KIAA0184, KIAA0539, SON, and TFF3) the coding region at the 5′ end was incompletely characterized in the original descriptions. We describe the respective consequences for genomic annotation, domain and ortholog identification, and functional experiments design. We have also analyzed the sequences of 13,124 human mRNAs (RefSeq databank), discovering that in 6448 cases (49%), an in-frame stop codon is present upstream of the initiation codon, while in the other 6676 mRNAs (51%), identification of additional bases at the mRNA 5′ region could well reveal some new upstream in-frame AUG codons in the optimal context. Proportionally to the HC 21 data, about 550 known human genes might thus be affected by this 5′ end mRNA artifact. © 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

Background : The ADARB1 gene is located in 21q22.3 region, previously linked to familial bipolar disorder, and its product has a documented action in the editing of the pre-mRNA of glutamate receptor B subunit. Dysfunction of glutamatergic neurotransmission could play an important role in the patophysiology of bipolar disorder (BD). Glutamate excitatory neurotransmission regulation is a possible mechanism of the initial effect of anticonvulsants in regulating mood. Methods : To investigate the hypothesis of an involvement of ADARB1 gene in the BD, the ADARB1 cDNA has been cloned and sequenced in seven selected bipolar I disorder patients with evidence of familiarity of mood disorders. A detailed investigation of the gene nucleotide sequence in the open reading frame has been performed. Results : No alteration in the sequence of the ADARB1 gene cDNA was found in any patient, except a common neutral polymorphism in three out of seven patients. Conclusions : Mutations in ADARB1 gene are not commonly associated with bipolar I disorder, therefore other genes in the 21q22 region could be associated with bipolar illness in some families, likely in the context of a multifactorial transmission model.