Search

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone, Väitekirja peamiseks eesmärgiks on selgitada, kuidas toimub rakus kahjustatud mitokondrite selektiivne eemaldamine ehk mitofaagia. Mitofaagia on hädavajalik „vigaste“ ja „vananenud“ mitokondrite eemaldamiseks ja mitokondrite populatsiooni kvaliteedi parandamiseks rakus. Hästi on teada, kuidas PINK1-PARKIN-sõltuv mitofaagia eemaldab oma elutsükli lõppu jõudnud depolariseeritud mitokondrid. Samas ei ole aga sisemembraani depolariseerumine ainsaks mitofaagia eeltingimuseks. Vigased mitokondrid võivad säilitada oma membraanipotentsiaali, kuid samas ikkagi toota suures koguses peremeesrakku kahjustavaid vabu radikaale. Seega peab rakk ellujäämiseks omama ka mehhanismi, millega eemaldada mitokondreid, mis on oma membraanipotentsiaali säilitanud, kuid oma funktsioone kaotamas. Teaduslikus kirjanduses on küll pikalt spekuleeritud, et vabade radikaalide üleküllus aktiveerib mitofaagia ja viib vigastest mitokondritest vabanemiseni, kuid selle võimalikku molekulaarset mehhanismi pole siiski näidatud. Käesoleva väitekirja põhifookus ongi seetõttu suunatud mitofaagia regulatsioonile reaktiivsete hapnikuühendite poolt. Väitekirjas näidatakse, et juba suhteliselt mõõdukas mitokondriaalse superoksiidi ja vesinikperoksiidi ületootmine võib indutseerida KEAP1-sõltuvat mitofaagiat. KEAP1 (kelch like ECH associated protein 1) on üheks peamiseks rakusiseste reaktiivsete hapnikuühendite sensoriks. Oksüdatiivse stressi korral KEAP1 oksüdeerub ja dissotsieerub oma seostumispartneritest, sh ka PGAM5-st (PGAM family member 5, mitochondrial serine/threonine protein phosphatase), mis blokeerib PGAM5 lagundamise proteosoomide poolt. PGAM5 akumuleerumine viib omakorda mitokondrites mitofaagia indutseerimise eest vastutava PINK1 (PTEN induced kinase 1) akumuleerumiseni. Selle tulemusel liigub mitokondritesse teine mitofaagia seisukohalt ülioluline valk Parkin (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase), mis viib lõppkokkuvõttes liigselt vabu radikaale tootvate mitokondrite eemaldamiseni ning raku mitokondripopulatsiooni kvaliteedi paranemiseni. Väitekirja raames tuvastati uus täiendav lüli mitofaagia käivitamise mehhanismis, näidates, et Parkin interakteerub mitokondrite liikumise eest vastutavate Miro valkudega (ras homolog family member) mitofaagia varajaseimas etapis. Mitokondrites paiknevad Miro valgud on ilmselt inaktiivse Parkini nn dokkimiskohtadeks, hoides seega Parkinit potentsiaalsete substraatide vahetus läheduses ja hõlbustades seeläbi mitofaagiat. Väitekirjas näidatakse ka seda, kuidas uute mitokondrite tekke eest vastutava PGC-1α (PPARG coactivator 1 alpha) üleekspressioon viib mitokondrite koguarvu suurenemiseni aksonites, mis viitab sellele, et neuronite aksonaalseks kasvuks on vajalik mitokondriaalne biogenees. Arvestades PINK1, Parkini ning mitofaagia rolli Parkinsoni tõve patogeneesis on väitekirjas kirjeldatud mehhanismide teadmisest abi ka Parkinsoni tõve tekkemehhanismide mõistmisel. Kirjeldatud signaaliradade farmakoloogiline stimuleerimine võimaldab aktiveerida nõrgenenud mitofaagiat ja seeläbi kõrvaldada neuroneid kahjustavaid vigaseid mitokondreid., The main aim of this thesis was to unravel novel molecular mechanisms regulating mitophagy, selective removal of damaged mitochondria from the cell. The data presented here highlight crosstalk between the PINK1-Parkin mitophagy and the KEAP1-NRF2 pathway. PINK1-Parkin mediated mitophagy is the major mitophagy pathway regulated by the mitochondrial kinase protein PINK1 and the E3 ubiquitin ligase Parkin. Both proteins have been linked to the autosomal recessive form of Parkinson’s disease. KEAP1-NRF2 pathway, on the other hand, is the major oxidative stress-response pathway that activates cellular antioxidant defense mechanisms. The pathway is regulated primarily by nuclear erythroid factor-2 (NEF2)-related factor-2 (NRF2) and Kelch-like erythroid cell-derived protein with CNC homology (ECH)-associated protein 1 (KEAP1). The thesis also attempted to define the role of the mitochondrial transport protein Miro (mitochondrial rho GTPase) in the regulation of PINK1-Parkin‐mediated mitophagy. Miro is a mitochondrial outer membrane protein that is required for the transport of mitochondria along the microtubules. It is a well-known substrate of Parkin. Parkin subjects Miro for proteasomal degradation and thereby helps to uncouple damaged organelles from the functional mitochondrial network. Additionally, the thesis also briefly evaluated the role of mitochondrial biogenesis for neuronal development. To this end, the expression of PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α) was examined in axonal growth and mitochondrial density in neurons. PGC-1α is a transcriptional coactivator that plays an important role in mitochondrial biogenesis. Human, rat, and mice origin cell culture-based in vitro methods were used in this thesis. Briefly, the cells were first grown overnight, then transfected with desired DNA constructs and further incubated, and finally used for data acquisition by using techniques like microscopy imaging, fluorescence/luminescence assays, and western blotting. The data obtained allow us to propose a mechanism that enables the cell to eliminate damaged mitochondria by enhancing mitophagy. We demonstrate that increased mitochondrial ROS (reactive oxygen species) production disrupts the KEAP1-PGAM5 complex that will block PGAM5 (phosphoglycerate mutase 5) processing. Accumulation of PGAM5, in turn, will interfere with PINK1 processing leading to the stabilization of mitochondrial PINK1. This will stimulate Parkin translocation to mitochondria, activates mitophagy and leads to the removal of ROS-producing mitochondria. In such a way, enhanced ROS level ensures a negative feedback down-regulating mitochondria, the main source of ROS. We also identified a new additional step in the initiation of mitophagy by showing that Parkin interacts with mitochondrial Miro proteins prior to the onset of mitochondrial damage. This initial interaction does not involve the ubiquitination of Miro, nor does it require PINK1. Upon damage to mitochondria, this complex of Miro-Parkin activates and leads to the ubiquitination of Miro, enhances Parkin translocation, and subsequent initiation of mitophagy. Further, the results also briefly show that overexpression of PGC-1α led to an increase in the total number of mitochondria in the axonal tree, suggesting that mitochondrial biogenesis is required for the axonal growth of neurons. Knowledge of the mechanisms presented in this thesis might have important medical implications, especially in neurodegenerative diseases (like Alzheimer's and Parkinson's disease) where the accumulation of damaged mitochondria plays a central role. Pharmacological stimulation of the mentioned pathways could allow to activate the weakened mitophagy and thereby eliminate the damaged mitochondria. Further studies are needed to identify whether these mitophagy activators could bolster mitochondrial health and ameliorate cell viability in neurodegenerative pathologies., https://www.ester.ee/record=b5487887