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Der Diabetes mellitus bezeichnet eine bislang unheilbare, metabolische Erkrankung, die mit schwerwiegenden Folgeerkrankungen einhergeht. Unter den potentiellen Strategien zur Heilung von Diabetes mellitus stellt die in vitro Generierung adulter β-Zellen des endokrinen Pankreas aus humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPS) einen vielversprechenden Ansatz dar. Zwar ermöglichen bisherige Protokolle die Herstellung von Zellen mit einem β-Zell-ähnlichen Charakter, jedoch zeigen diese eine zunächst eingeschränkte Funktion, die sich erst im Verlauf einer vollständigen, durch Transplantation induzierten, Reifung der Zellen, normalisiert. Vorangegangene Studien zeigen, dass sich die Extrazellularmatrix (EZM) von Geweben positiv auf das Überleben und die Funktion adulter, isolierter Langerhans-Inseln des Pankreas auswirkt. Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, ob Einflüsse der organspezifischen EZM die finale Reifung in vitro hergestellter β-Zellen herbeiführen können. Um diese Hypothese zu testen, wurde im Rahmen der vorliegenden Studie die Wirkung der pankreatischen EZM auf die in vitro Differenzierung von hiPS zu endokrinen Zellen des Pankreas untersucht sowie die Eignung der pankreatischen EZM zur Etablierung eines Organmodells des endokrinen Pankreas erprobt. Hierzu wurde zunächst eine pankreasspezifische EZM-Trägerstruktur (PanMa) durch Dezellularisierung von Pankreaten des Schweins mittels Natriumdesoxycholat hergestellt. Die generierte PanMa wurde anhand (immun-) histologischer Färbungen, Rasterelektronen-mikroskopie, Feststellung des DNA-Gehalts sowie durch Versuche zur Perfusion und Wiederbesiedelung mit Endothelzellen eingehend charakterisiert. Zudem wurde auf Basis der ermittelten Daten ein Bewertungssystem (PancScore) zur standardisierten Herstellung der PanMa entwickelt. Als Nächstes wurde untersucht, ob die PanMa über gewebespezifische EZM-Merkmale verfügt. Zu diesem Zweck wurden biophysikalische und strukturelle Eigenschaften wie Festigkeit, Porosität und Hygroskopie mittels rheologischer Messungen sowie Versuchen zur Teilchendiffusion und zum Wasserbindungsverhalten bestimmt und mit azellulären EZMs des Dünndarms (SISser) und der Lunge (LungMa) verglichen. Nach der eingehenden Analyse der PanMa wurde deren Effekt auf die Eigenschaften von Stammzellen sowie auf frühe Stadien der Stammzellentwicklung untersucht. Hierzu wurde die PanMa als Trägerstruktur während der Erhaltung sowie der spontanen Differenzierung von hiPS verwendet und der Einfluss der PanMa anhand von Genexpressionsanalysen und immunhistochemischer Färbungen analysiert. In einem nächsten Schritt wurde die Wirkung der PanMa auf die Differenzierung von hiPS zu endokrinen Zellen des Pankreas untersucht. Hierfür wurde die PanMa zum einen in flüssiger Form als Mediumzusatz sowie als solide Trägerstruktur während der Differenzierung von hiPS zu hormonexprimierenden Zellen (Rezania et al. 2012; Rezania et al. 2014) oder maturierenden β-Zellen verwendet (Rezania et al. 2014). Der Effekt der PanMa wurde anhand von Genexpressions-analysen, immunhistochemischer Färbungen und Analysen zur Glukose-abhängigen Insulinsekretion untersucht. In einem letzten Teil der Studie wurde die Eignung der PanMa zur verlängerten Kultivierung von hiPS-abgeleiteten endokrinen Zellen des Pankreas im Hinblick auf die Etablierung eines Organmodells des endokrinen Pankreas getestet. Hierzu wurde die PanMa zu einem Hydrogel weiterverarbeitet, welches zur Einkapselung und Kultivierung von hiPS-abgeleiteten hormonexprimierenden Zellen eingesetzt wurde. Um die Auswirkungen der Hydrogel-Kultur nachzuvollziehen, wurden die kultivierten Zellen mittels Genexpression, immun-histochemischer Färbungen und Analysen zur Glukose-abhängigen Insulinsekretion untersucht. Mittels Dezellularisierung porziner Pankreaten konnte eine zellfreie, pankreasspezifische EZM-Trägerstruktur mit geringen Restbeständen an DNA sowie einer weitgehend erhaltenen Mikro- und Ultrastruktur mit typischen EZM-Komponenten wie Kollagen I, III und IV hergestellt werden. Im Rahmen der Besiedelung arterieller Gefäße mit humanen Endothelzellen wurde die Zellkompatibilität der hergestellten PanMa sowie eine weitgehende Unversehrtheit der Gefäßstrukturen nachgewiesen. Verglichen zu SISser und LungMa zeichnete sich die PanMa als eine relativ weiche, stark wasserbindende, faserbasierte Struktur aus. Weiterhin konnten Hinweise für einen Effekt der PanMa auf den Stammzellcharakter und die frühe Entwicklung von hiPS beobachtet werden. Hierbei führte die Erhaltung von hiPS auf der PanMa zu einer leicht veränderten Expression von Genen des Kernpluripotenznetzwerks sowie zu einem reduziertem NANOG-Proteinsignal. Einhergehend mit diesen Beobachtungen zeigten hiPS während spontaner Differenzierung auf der PanMa eine verstärkte endodermale Entwicklung. Im Verlauf der pankreatischen Differenzierung führte die Kultivierung auf der PanMa zu einer signifikant verringerten Expression von Glukagon und Somatostatin, während die Expression von Insulin unverändert blieb, was auf eine Verminderung endokriner α- und δ-Zellen hinweist. Diese Veränderung äußerte sich jedoch nicht in einer verbesserten Glukose-abhängigen Insulinsekretion der generierten hormonexprimierenden Zellen. Unter Anwendung der PanMa als Hydrogel konnten hormonexprimierenden Zellen über einen verlängerten Zeitraum kultiviert werden. Nach 21 Tagen in Kultur zeigten die eingekapselten hormonexprimierenden Zellen eine unverändert hohe Viabilität, wiesen allerdings bereits eine erste veränderte Zellanordnung sowie eine leicht verminderte Glukose-abhängige Insulinsekretion auf. Zusammengefasst konnte in dieser Studie ein biologischer Effekt gewebespezifischer EZM-Merkmale auf die Differenzierung von hiPS nachgewiesen werden. Darüber hinaus weisen die Daten auf eine relevante Funktion der EZM im Rahmen der endokrinen Spezifizierung von hiPS während der pankreatischen Differenzierung hin. Diese Beobachtungen verdeutlichen die eminente Rolle der EZM in der Herstellung von funktionalen hiPS-abgeleiteten Zellen und plädieren für eine stärkere Einbindung organspezifischer EZMs im Bereich des Tissue Engineering und der klinischen Translation in der Regenerativen Medizin., Diabetes mellitus is an incurable, metabolic disease, which is associated with severe long-term complications. The in vitro generation of pancreatic β-cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent a promising strategy for a curative therapy of diabetes mellitus. However, current differentiation strategies largely fail to produce functional β-cells in vitro and require an additional in vivo transplantation to achieve terminal maturation. Previous studies demonstrated a beneficial effect of the extracellular matrix (ECM) on the survival and sustained function of adult, isolated islets of Langerhans. This raises the question whether organ-specific cell-ECM interactions might represent the missing link driving the final stage of β-cell development. In order to address this issue, this study investigated the impact of the pancreas ECM on in vitro β-cell differentiation and its use for the establishment of a pancreatic endocrine organ model. To this purpose, a pancreas-specific ECM scaffolds (PanMa) was derived from porcine pancreata using whole organ decellularization with Sodium Deoxycholate. In a first step, the generated PanMa was thoroughly characterized using (immuno-) histological stainings, scanning electron microscopy and DNA quantification as well as perfusion and recellularization experiments with endothelial cells. Based on these data, a scoring system (PancScore) for a standardized PanMa generation was developed. Next, the generated PanMa was tested for the presence of tissue-specific ECM features. Therefore, the biophysical and physico-structural characteristics, such as rigidity, porosity and hygroscopy were analyzed using rheological measurements, particle diffusion analyses as well as a water evaporation assay and compared to the properties of ECM scaffolds derived from porcine small intestine (SISser) and lung (LungMa) to examine organ-specific scaffold cues. Following the thorough scaffold characterization, the impact of the PanMa on pluripotency and early development of hiPSC was studied. To this purpose, gene and protein expression of hiPSCs during maintenance culture and spontaneous differentiation on the PanMa were assessed. In a next step, the impact of the PanMa on the pancreatic endocrine differentiation of hiPSCs was tested. Therefore, the PanMa was used as a liquid media supplement or as a solid scaffold during the directed differentiation of hiPSC towards either pancreatic hormone-expressing cells (Rezania et al. 2012; Rezania et al. 2014) or maturing β-cells (Rezania et al. 2014). The impact of the PanMa on the generated cells was examined by gene expression analysis, immunohistochemical staining of important stage markers, as well as glucose stimulated insulin secretion assays. In a last part of this study, the potential of the PanMa for the prolonged culture of hiPSC derived endocrine cells for the establishment of an in vitro organ model of the endocrine pancreas was examined. Therefore, a PanMa-derived hydrogel was generated and used for the encapsulation and culture of hiPSC-derived hormone-expressing cells (HECs). The influence of the PanMa-hydrogel culture was analyzed on gene, protein and functional level by gene expression analysis, immunohistochemical stainings and glucose stimulated insulin secretion. Whole organ decellularization resulted in the generation of an acellular PanMa scaffold, with low amounts of residual DNA and a preserved ECM micro- and ultrastructure, including important ECM components, such as collagen I, III and IV. Furthermore, the PanMa maintained an intact vessel system and was verified as cytocompatible as demonstrated by the successful recellularization of the arterial system with human endothelial cells. In comparison to SISser and LungMa, the PanMa was characterized as a relative soft, hygroscopic scaffold with a collagen-fiber based structure. Furthermore, the findings indicate that the ECM-specific properties have a relevant effect on the stem cell character and early multi-lineage decisions of hiPSCs. In this regard, maintenance of hiPSCs on the PanMa resulted in a slightly changed expression of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and a weak immunohistochemical signal for NANOG protein, indicating a PanMa-dependent impact on hiPSC pluripotency. Strikingly, this presumption was corroborated by the finding that culture on the PanMa promoted an endodermal development of hiPSCs during spontaneous differentiation. In line with that, pancreatic differentiation of hiPSC on both the PanMa and SISser resulted in a significant decrease of glucagon and somatostatin gene expression as well as an unaltered insulin expression, suggesting an ECM-driven suppression of the development of non β-cell endocrine cells. However, this change did not result in an improved glucose stimulated insulin secretion of the generated HECs. Moreover, use of the PanMa as a hydrogel allowed prolonged culture of these cells in a defined culture system. HECs were viable after 21 days of culture, however already showed an altered islet morphology as well as a slightly decreased glucose stimulated insulin secretion. Altogether, this study demonstrates a relevant biological effect of tissue specific ECM cues on the in vitro differentiation of hiPSCs. More specifically, the data indicate an involvement of the ECM in the endocrine commitment of hiPSC-derived pancreatic cells during directed differentiation highlighting the ECM as an important regulator of pancreatic development. Collectively, these findings emphasize the relevance of the ECM for the fabrication of functional hiPSC-derived cell types and suggest a much stronger consideration of organ specific ECM cues for tissue engineering approaches as well as clinical translation in regenerative medicine.

Fragestellung: Die Gelenkpunktion stellt weiterhin eine Schlüsseluntersuchung zur Diagnostik eines periprothetischen Infektes dar. Verschiedene Organisationen veröffentlichen Definitionen der periprothetischen Gelenkinfektionen (PJI/PPI) mit allerdingssignifikanten Unterschieden in den [zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL]

Ziel der folgenden Arbeit ist es epigenetische Muster regulatorischer Elemente in hämatopoetischen multipotenten Vorläuferzellen aufzudecken. Neueste Fortschritte der Einzelzell-Technologien ermöglichen Einblicke in die Komplexität der Regulationsmechanismen auf molekularer Ebene und werden zu einem umfassenderen Verständnis der epigenetischen Komponente in der Zelldifferenzierung führen. Für diese Arbeit wurden sechsunddreißig hämatopoetische multipotente Vorläuferzellen aus dem Oberschenkelknochen einer Maus entnommen. Durch FACS wurden die Zellkerne der Vorläuferzellen vom Zytoplasma getrennt. Es wurde eine Bisulfit-Sequenzierung mit den Zellkernen durchgeführt, um die DNA-Methylierungsmuster durch Umwandlung von unmethylierten Cytosinen in CpGs und die Chromatinzugänglichkeit durch in vitro Methylierung mit M.CviPI in GpCs zu untersuchen. Die DNA-Reinigung nach der Amplifikation wurde mit magnetischen Beads durchgeführt. Siebzehn der sechsunddreißig multipotenten Vorläuferzellen haben die Qualitätskontrolle bestanden. Die Promotorregionen der Zellen weisen eine Chromatinzugänglichkeit von 60% auf, während die codierende Gensequenz eine konstante DNA-Methylierungsrate zwischen 60% und 80% zeigt. Es wurde bestätigt, dass transponierbare Elemente (LINEs und LTRs) mit einer Rate von 90% stark methyliert sind, um die genomische Integrität zu bewahren. Die Bindungsstellen von zwei Architekturproteinen (p300 und CTCF) sind nachweislich bis zu 45% zugänglich, während die DNA-Methylierung an den Bindungsstellen von 60% bzw. 80% auf 30% bzw. 40% abnimmt. DNase I hypersensitive Regionen wurden untersucht, um zu überprüfen, ob die in vitro Methylierung durch M.CviPI erfolgreich zugängliches Chromatin annotieren kann. Es hat sich gezeigt, dass die Bisulfit-Sequenzierung in Einzelzellen hochauflösende Ergebnisse über die epigenetischen Muster in verschiedenen regulatorischen Regionen liefert und ein besseres Verständnis über die heterogenen Zustände in der Hämatopoese ermöglichen wird. The objective of the following work is to elucidate epigenetic patterns in regulatory elements of hematopoietic multipotent progenitor cells (MPPs) on a single-cell level. Recent advances in single-cell technologies have enabled new insights into the complexity of regulatory mechanisms on a molecular level and will lead to a broader understanding of the epigenetic component in the establishment of cell identity. For this work, thirty-six hematopoietic MPPs have been collected from the femur of a mouse. Through cell sorting, the nuclei of the MPPs have been separated from the cytoplasm. Single-cell bisulfite sequencing (scBS-seq) was performed on the nuclei to investigate DNA methylation patterns by bisulfite conversion of unmethylated cytosines in CpG sites and chromatin accessibility by in vitro methylation with M.CviPI in GpC sites. Purification after amplification of the DNA was completed using magnetic beads. Seventeen out of the thirty-six MPPs passed the quality control for sufficient genomic coverage and have been assessed in more detail. Promoter regions show chromatin accessibility up to 60%, while gene bodies maintain a constant rate of DNA methylation between 60% to 80%. Transposable elements (LINEs and LTRs) were confirmed to be highly methylated at a rate of 90% to preserve genomic integrity. The binding sites of two architectural proteins (p300 and CTCF) are shown to be accessible up to 45%, while DNA methylation at the binding sites decreases to 30% and 40% from 60% and 80%, respectively. DNase I hypersensitive sites have been investigated to verify that in vitro DNA methylation was used successfully to annotate accessible chromatin. ScBS-seq was shown to provide high-resolution results of epigenetic states at various regulatory regions in single progenitor cells and will enable further understanding of heterogeneity in hematopoiesis.

Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.

The analysis of cells in the cerebrospinal fluid (CSF) is a routine procedure that is usually performed manually using the Fuchs–Rosenthal chamber and cell microscopy for cell counting and differentiation. In order to reduce the requirement for manual assessment, automated analyses by devices mainly used for blood cell analysis have been also used for CSF samples. Here, we summarize the current state of investigations using these automated devices and critically review their limitations. Despite technical improvements, the lower limit for reliable leukocyte counts in the CSF is still at approximately 20 cells/µL, to be validated depending on the device. Since the critical range for clinical decisions is in the range of 5–30 cells/µL this implies that cell numbers < 30/µL require a manual confirmation. Moreover, the lower limit of reliable erythrocyte detection by automated devices is at approximately 1000/µL. However, even low erythrocyte numbers may be of clinical importance. In contrast, heavily hemorrhagic samples from neurosurgery may be counted automatically at an acceptable precision more quickly. Finally, cell differentiation by automated devices provides only a rough orientation for lymphocytes, granulocytes and monocytes. Other diagnostically important cell types such as tumor cells, siderophages, blasts and others are not reliably detected. Thus, although the automation may give a gross estimate sufficient for the emergency room situation, each CSF requires a manual microscopy for cytological evaluation for the final report. In conclusion, although automated analysis of CSF cells may provide a first orientation of the cell profile in an individual sample, an additional manual cell count and a microscopic cytology are still required and represent the gold standard., publishedVersion

Despite intensive research and progress in personalized medicine, pancreatic ductal adenocarcinoma remains one of the deadliest cancer entities. Pancreatic duct-like organoids (PDLOs) derived from human pluripotent stem cells (PSCs) or pancreatic cancer patient-derived organoids (PDOs) provide unique tools to study early and late stage dysplasia and to foster personalized medicine. However, such advanced systems are neither rapidly nor easily accessible and require an in vivo niche to study tumor formation and interaction with the stroma. Here, the establishment of the porcine urinary bladder (PUB) is revealed as an advanced organ culture model for shaping an ex vivo pancreatic niche. This model allows pancreatic progenitor cells to enter the ductal and endocrine lineages, while PDLOs further mature into duct-like tissue. Accordingly, the PUB offers an ex vivo platform for earliest pancreatic dysplasia and cancer if PDLOs feature KRASG12D mutations. Finally, it is demonstrated that PDOs-on-PUB i) resemble primary pancreatic cancer, ii) preserve cancer subtypes, iii) enable the study of niche epithelial crosstalk by spiking in pancreatic stellate and immune cells into the grafts, and finally iv) allow drug testing. In summary, the PUB advances the existing pancreatic cancer models by adding feasibility, complexity, and customization at low cost and high flexibility., publishedVersion

To optimise udder health at the herd level, identifying incurable mastitis cases as well as providing an adequate therapy and culling strategy are necessary. Cows with clinical mastitis should be administered antibiotic medication if it is most likely to improve mammary cure. The somatic cell count (SCC) in milk of the monthly implemented Dairy Herd Improvement (DHI) test represents the most important tool to decide whether a cow has a promising mammary cure rate. Differential cell count (DCC) facilitates the specification of the immunological ability of defence, for example by characterising leukocyte subpopulations or cell viability. The aim of this study was to assess the DCC and cell viability in DHI milk samples regarding the cytological (CC) and bacteriological cure (BC) of the udder within a longitudinal study, thereby gaining a predictive evaluation of whether a clinical mastitis benefits from an antibiotic treatment or not. The cows enrolled in this study had an SCC above 200,000 cells/mL in the previous DHI test. Study 1 assessed the CC by reference to the SCC of two consecutive DHI tests and included 1010 milk samples: 28.4% of the mammary glands were classified as cytologically cured and 71.6% as uncured. The final mixed logistic regression model identified the total number of non-vital cells as a significant factor associated with CC. An increasing amount of non-vital cells was related to a lower individual ability for CC. Cows which were in the first or second lactation possessed a higher probability of CC than cows having a lactation number above two. If animals developed a clinical mastitis after flow cytometric investigation, the BC was examined in study 2 by analysing quarter foremilk samples microbiologically. Taking 48 milk samples, 81.3% of the mammary glands were classified as bacteriologically cured and 18.7% as uncured. The percentage of total non-vital cells tended to be lower for cows which were cured, but no significance could be observed. This study revealed that the investigation of the proportion of non-vital cells in DHI milk samples can enhance the prognosis of whether an antibiotic treatment of clinical mastitis might be promising or not. Prospectively, this tool may be integrated in the DHI tests to facilitate the decision between therapy or culling.

Differenzierungsentscheidungen von Zellen werden durch die Integration mehrerer Stimuli bestimmt. Die Differenzierung von Helfer-T-Zellen (Th-Zellen) ist hierfür ein gut untersuchtes Beispiel: reife Th-Zellen entwickeln sich beim Kontakt mit einem für sie spezifischen Antigen zu einem spezialisierten Subtyp, der von den in ihrer Umgebung vorhandenen Zytokinen abhängt und exprimieren dann einen spezifischen Mastertranskriptionsfaktor. Die häufigsten Th-Zell-Subtypen sind T-bet-exprimierende Th1-Zellen und GATA-3-exprimierende Th2-Zellen. Neuere Entdeckungen bezüglich der Plastizität von Th-Zell-Subtypen sowie die Existenz von T-bet+GATA-3+ Hybrid-Phänotypen haben die detaillierte Untersuchung vom Differenzierungsprozessen von Th-Zellen mit komplexer Zytokinsignale motiviert. Dazu haben wir systematisch die Zytokine IFN-g, IL-12 und IL-4 während der primären Differenzierung Th-Zellen titriert und Signaltransduktion und Zielgenexpression quantifiziert. Der Umfang und die Komplexität der Daten machten eine systematische Analyse notwendig, um involvierte Mechanismen genau zu identifizieren. Lineare Regressionsanalyse wurde verwendet, um die Netzwerktopologie zu extrahieren, wobei schon bekannte und zahlreiche neue Interaktionen vorausgesagt wurden. Die prognostizierte Netzwerktopologie wurde dann verwendet, um ein mechanistisches, mathematisches Modell der Zytokinsignalintegration zu entwickeln. Diese Methode hat ein hochgradig vernetztes regulatorisches Netzwerk inferiert. Bisher nicht beschriebene Funktionen von STAT-Proteine, die die Neuverkabelung des Netzwerkes während der Differenzierung vermitteln, wurden vorhergesagt. Ausgewählte neue Interaktionen wurden in gezielten genetischen Experimenten bestätigt. Während gegenseitige Inhibitionsmotive oft als kanonische digitale Schalter interpretiert werden, funktioniert das Th-Zell-Netwerk als ein Rheostat, der Variationen der Zytokinsignale in graduelle Expressionsänderungen der Mastertranskriptionsfaktoren übersetzt. Unsere Arbeit erklärt mechanistisch das beobachtete Kontinuum von Th-Zelldifferenzierungszuständen entlang der Th1-Th2-Achse und beschreibt eine quantitative Methode für die datenbasierte Inferenz zellulärer Netzwerke der Signalintegration. Cell-fate decisions are governed by the integration of multiple stimuli. Th cell differentiation is a well-studied example thereof: mature Th cells differentiate into a specialised subtype upon encounter with their cognate antigen depending on the polarising cytokines present in their environment and start expressing specific master transcription factors. The most common Th cell subtypes are T-bet-expressing Th1 cells and GATA-3-expressing Th2 cells. Recent discoveries concerning the plasticity of Th cell subtypes as well as the existence of stable T-bet+GATA-3+ hybrid Th1/2 phenotypes have stimulated the detailed study of the differentiation process under different assumptions than the hitherto valid paradigm of single master transcription factor expression by using complex cytokine signals as inputs. Here, we developed a data-based approach for inferring the molecular network underlying the differentiation of T-bet- and/or GATA-3 expressing lymphocytes. We performed systematic titrations of the polarising cytokines IFN-g, IL-12 and IL-4 during primary differentiation of Th cells and quantified signal transduction as well as target-gene expression. The size and complexity of the dataset made a systematic analysis necessary to identify the mechanisms involved. To extract the network topology, we used linear regression analysis, retrieving known regulatory mechanisms and predicting numerous novel ones. This network topology was used to develop a mechanistic mathematical model of cytokine signal integration. This approach inferred a highly connected regulatory network. Previously undescribed functions of STAT proteins mediating network rewiring during differentiation were predicted. Selected new interactions were confirmed by experiments using gene-deficient cells. Importantly, while mutual-inhibition motifs are often considered canonical digital switches, the inferred Th-cell network acts as a rheostat, generating a continuum of differentiated states along the Th1-Th2 axis. This work explains the observed Th1-Th2 cell fate continuum mechanistically and provides a quantitative framework for the data-based inference of cellular signal integration networks.

Glioblastoma is the most common primary brain tumour in adults. Under the current first-line therapy with surgical resection as well as radiotherapy and concomitant or adjuvant chemotherapy, the median survival rate is only about 16 months, so that new therapies are urgently needed. In 88% of all glioblastoma patients, changes in the PI3K signalling pathway are found. Therefore in this study the influence of the inhibition of the PI3K signalling pathway on glioblastoma cells was investigated using the dual kinase inhibitor PI-103. It was shown that inhibition of the PI3K pathway can successfully inhibit the proliferation of both differentiated cells and stem cells. Furthermore, the migration of differentiated cells can be significantly reduced. Unfortunately, however, no effect on the apoptosis of the cells could be achieved and a sensitization to apoptosis triggered by chemotherapy was not possible.

Lipid metabolism influences stem cell maintenance and differentiation but genetic factors that control these processes remain to be delineated. Here, we identify Tnfaip2 as an inhibitor of reprogramming of mouse fibroblasts into induced pluripotent stem cells. Tnfaip2 knockout impairs differentiation of embryonic stem cells (ESCs), and knockdown of the planarian para-ortholog, Smed-exoc3, abrogates in vivo tissue homeostasis and regeneration—processes that are driven by somatic stem cells. When stimulated to differentiate, Tnfaip2-deficient ESCs fail to induce synthesis of cellular triacylglycerol (TAG) and lipid droplets (LD) coinciding with reduced expression of vimentin (Vim)—a known inducer of LD formation. Smed-exoc3 depletion also causes a strong reduction of TAGs in planarians. The study shows that Tnfaip2 acts epistatically with and upstream of Vim in impairing cellular reprogramming. Supplementing palmitic acid (PA) and palmitoyl-L-carnitine (the mobilized form of PA) restores the differentiation capacity of Tnfaip2-deficient ESCs and organ maintenance in Smed-exoc3-depleted planarians. Together, these results identify a novel role of Tnfaip2 and exoc3 in controlling lipid metabolism, which is essential for ESC differentiation and planarian organ maintenance., publishedVersion

During osteoporosis bone formation by osteoblasts is reduced and/or bone resorption by osteoclasts is enhanced. Currently, only a few factors have been identified in the regulation of bone integrity by osteoblast-derived osteocytes. In this study, we show that specific disruption of menin, encoded by multiple endocrine neoplasia type 1 (Men1), in osteoblasts and osteocytes caused osteoporosis despite the preservation of osteoblast differentiation and the bone formation rate. Instead, an increase in osteoclast numbers and bone resorption was detected that persisted even when the deletion of Men1 was restricted to osteocytes. We demonstrate that isolated Men1-deficient osteocytes expressed numerous soluble mediators, such as C-X-C motif chemokine 10 (CXCL10), and that CXCL10-mediated osteoclastogenesis was reduced by CXCL10-neutralizing antibodies. Collectively, our data reveal a novel role for Men1 in osteocyte–osteoclast crosstalk by controlling osteoclastogenesis through the action of soluble factors. A role for Men1 in maintaining bone integrity and thereby preventing osteoporosis is proposed., publishedVersion

Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des Small Conductance Potassium Channel 4 (SK4) auf die kardiale Differenzierung in IPS und ESCs zu untersuchen. Zum einen wurde überprüft, inwiefern verschiedene murine IPS, wie „Tail-tip fibroblast derived IPS” (TIPS) und „Nanog-GFP“ (NGFP), mit Hilfe der an murinen ESCs etablierten Zellkulturbedingungen effizient kardiale Vorläuferzellen bilden und welchen Einfluss die SKCas, insbesondere der Subtyp SK4, darauf ausüben. Zusätzlich wurde untersucht, welchen Effekt eine Überexpression von SK4 auf die kardiale Entwicklung in ESCs hat. In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich Zellen murinen Ursprungs verwendet.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung eines neuen Modells zur Beschreibung von Frakturheilungsprozessen. Hierfür wird eine Interface Capturing Technik verwendet, welche das Verfolgen von sich bewegenden Oberflächen ermöglicht. Diese Methoden sind bereits im Bereich der Strömungs- und Verbrennungssimulationen etabliert, finden jedoch auch in der numerischen Biomechanik immer mehr Beachtung. In einem ersten Schritt zeigen wir die Funktionalität dieser Methoden und übersetzen diese in den Kontext der Frakturheilung. Darüber hinaus diskutieren wir die nötigen Anpassungen, um den Aufbau von neuem Gewebe richtig zu modellieren. Ein Vorteil dieser Methoden ist die Verbindung zwischen Modellparameter und den Observablen eines Experiments. Dies gilt insbesondere für die Aufbaugeschwindigkeit neuen Gewebes. Der Aufbauprozess in diesem Modell wird durch mechanische Reize geregelt. Hierfür folgen wir der in Ulm entwickelten Differenzierungshypothese, welche jedem Prozess einen bestimmten Bereich von mechanischen Reizen zuordnet. Zunächst verifizieren wir experimentell das Konvergenzverhalten des numerischen Modells und diskutieren Probleme, die für bestimmte Belastungszustände entstehen können. Darauffolgend überprüfen wir die Aussagekraft des Modells, indem wir dessen Ergebnisse mit deren des existierenden Ulmer Heilungsmodells vergleichen. Darüber hinaus untermauern wir die Relevanz der Ergebnisse, indem wir diese mit experimentellen Daten, erhoben an Schafen und Mäusen, vergleichen. Hierfür zeigen wir die Übereinstimmung der gemessenen interfragmentären Bewegungen mit den Vorhersagen des neuen Modells und vergleichen die berechneten Gewebeverteilungen mit den Erkenntnissen aus den experimentellen Daten. Wir schließen diesen Abschnitt mit einer Sensitivitätsanalyse für verschiedene Modellparameter. Des Weiteren präsentieren wir eine Machbarkeitsstudie für die Simulation resorbierbarer Implantate. Hierfür betrachten wir zwei unterschiedliche Abbaugeschwindigkeiten, eine bezogen auf die Knochenwachstumsgeschwindigkeit schnelle und eine langsame. Die verwendeten Materialen sind typischerweise biokompatibel und weisen meist Eigenschaften auf, die als Osteokonduktivität und Osteoinduktivität bezeichnet werden. In einem letzten Schritt zeigen wir, dass die Beschreibung solcher Eigenschaften ebenfalls mit dem entwickelten Modell möglich ist., The thesis at hand is concerned with the development of a novel model which describes the fracture healing process by utilizing interface capturing techniques. Such techniques have been proven to work efficiently in fields like fluid dynamics and combustion simulation, and have gained increasing attention in biomechanics as well. We illustrate their functionality, translate these techniques into the field of tissue formation and discuss problem specific adjustments. One benefit of using interface capturing techniques is the connection of model parameters to measurable values in experiments, especially for tissue growth velocities. The process of tissue formation is triggered via mechanical stimuli, following the well-established mechanotransduction hypothesis previously developed in Ulm. In a first step, we experimentally verify the convergence behavior of the numerical model and point out problem specific issues, observable for particular load conditions. Afterwards, we benchmark the predictions of the developed model with those of the existing Ulm healing model. Moreover, we corroborate the numerical results with measurements provided by animal experiments on sheep and mice. For this, we demonstrate the ability of the model to predict the progression of the interfragementary movement as well as a time-dependent tissue distribution. The numerical results appear similar to the experimental observations. We conclude this part with a sensitivity analysis of the numerical model with respect to parameter variations, recognizing the limited accuracy of measurements in animal experiments. Afterwards, we present a case study for the description of biodegradable implants. With such implants there is no need for a surgery to remove the stabilizing device. This might be the next step of fracture treatment. We simulate two cases: a fast and a slow degradation of the implant. Typically, the materials used for such devices are highly biocompatible which is often accompanied with the effect of osteoconductivity or osteoinductivity. In a final step, we demonstrate the ability of the model to capture such surface properties as well.

Neurale Stammzellen stellen den Ursprung des gesamten zentralen Nervensystems dar. Dabei spielen diverse Signalwege eine Rolle, deren Regulation auf Basis post-translationaler Modifizierung (PTM) erfolgt. Ziel dieser Arbeit war daher die umfassende Analyse zugrundeliegender Änderungen im Proteom und Phosphoproteom der Zelle. Das erstellte Protokoll konnte mit großem Erfolg zum Einsatz gebracht werden. Die quantitative Analyse der Proben mittels Massenspektrometrie resultierte in der Identifizierung von mehr als 4.000 Proteinen und Phosphopeptiden. Unter den als reguliert identifizierten Kandidaten fanden sich zentrale Schaltstellen intrazellulärer Signalwege wie Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) und GTPasen der Rho-Familie wie Cdc42 oder Rac1 oder Vertreter der MapK-Familie. Während manche Proteine und Phosphorylierungsstellen bereits im Kontext der NSC-Differenzierung beschrieben waren, konnten weitere und bisher eher unbekannte mögliche Effektoren identifiziert werden.

Fettgewebe übernimmt eine Vielzahl endokrinologischer und immunologischer Aufgaben. In dieser Arbeit werden humane Fettgewebs-assoziierte mesenchymale Stammzellen auf ihr immunologisches Potential in unterschiedlichen Phasen der adipogenen Differenzierung hin untersucht. Während Leptin, RNase 7, TLR-2, TNF\(\alpha\), MCP-1 und IL-6 durch Lipopolysaccharid induzierbar sind, werden Adiponektin, PPARγ und LL-37 auf Differenzierungsstimulus hin hochreguliert. Die Überexpression des Host Defense-Peptides LL-37 ist eng mit der Initiation der Adipogenese assoziiert und geht mit fortschreitender Differenzierung verloren. Dies deutet darauf hin, dass LL-37 nicht der Pathogenabwehr dient, sondern durch Förderung der Angiogenese und Anbindung an das Blutgefäßsystem eine Rolle bei der Entstehung von Fettgewebe spielt. Eine Induktion von LL-37 in viszeralen Adipozyten könnte eine Hypertrophie-bedingte Gewebehypoxie und die darauffolgende chronische Inflammation und Insulinresistenzentwicklung verhindern.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse verschiedener genotoxischer Substanzen auf Säugertierzellen untersucht. Da ein Organismus der Ontogenese unterliegt und sich Zellen aus Stamm- und Vorläuferzellen entwickelt, gilt es diese ursprünglichen Zellen vor äußeren Einflüssen zu schützen. Da bisher kaum Untersuchungen von Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien durchgeführt wurden, wurden unter Verwendung vieler unterschiedlicher biologischer Endpunkte Effekte auf die Vitalität, Proliferation, Mitose und Apoptose dieser Zellen untersucht. Zudem erfolgte eine Interpretation der Ausbildung von Mikrokernen, Entstehung von DNS-Schäden und der zugrundeliegenden Reparaturmechanismen. So konnte mit Hilfe der Untersuchungen der hämatopoetischen Stammzellen und der TK6-Zellen postuliert werden, dass hämatopoetische Stammzellen weitestgehend weniger empfindlich gegenüber Zytostatika (Doxorubicin, Vinblastin, Methylmethansulfonat und Mitomycin C) sind als die lymphoblastoide Zelllinie TK6, welche in der Entwicklungshierarchie den Stammzellen folgt. Die Befürchtung, dass der Mikrokerntest in immortalisierten TK6-Zellen als Grundlage für Genotoxizitätsuntersuchungen nicht genügen würden, konnte mit Hilfe der Versuchsergebnisse dieser Arbeit widerlegt werden. Die Ergebnisse belegen, dass der Mikrokerntest in TK6-Zellen relevant ist, da TK6-Zellen empfindlicher auf genotoxische Agentien im Vergleich zu hämatopoetischen Stammzellen reagieren. Bei der Untersuchung der Leukämiezelllinie HL-60 wurden die Effekte klassischer (Vinblastin, Vincristin, Vinflunin und Vinorelbin) mit neu synthetisierten Vinca-Alkaloiden (4-Chlorochablastin, 4-Chlorochacristin, 16a, 17b und 18a) verglichen. Vinca-Alkaloide werden sehr häufig mit Nebenwirkungen, wie Neuropathien assoziiert, welche während einer Chemotherapie oftmals zu Therapieabbrüchen durch die Patienten führen. Aus diesem Grund war es erstrebenswert, neuartige Vinca-Alkaloide zu entwickeln, welche weniger Nebenwirkungen aber zugleich eine ähnliche Wirksamkeit aufweisen. Obwohl die Potenz der neuen Substanzen niedriger war als bei Vinblastin, Vincristin und Vinorelbin, zeigte ein Teil eine ähnliche Wirkung wie das Vinca-Alkaloid Vinflunin auf die Krebszelllinie HL-60 auf. Die Ergebnisse diese Arbeit können als erste Indikation in vitro genommen werden, dass sich diese Substanzen in der Krebstherapie als wirksam erweisen könnten und nach weiteren Ergebnissen in vivo als therapeutische Alternativen in Betracht gezogen werden. Auch bei der vergleichenden Untersuchung von exponentiell wachsenden mit differenzierten Zelllinien konnten Unterschiede detektiert werden. Die Zelllinie HT-22, welche selbst keine Krebszelllinie ist, zeigte nach Differenzierung zu nicht exponentiell wachsenden Zellen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Alkylanz Methylmethansulfonat, was auf einer verminderten Basenexzisionsreparatur beruhen könnte. Auch die differenzierte Form der Adenokarzinom-Zelllinie CaCo2 zeigte eine gesteigerte Sensitivität gegenüber dem Topoisomerase II-Inhibitor Etoposid auf, wohingegen der unselektive Topoisomerase II-Hemmer Doxorubicin keinen Effekt aufwies. Um den Sachverhalt zu klären ob die festgestellten Unterschiede auf das Enzym Topoisomerase II zurückzuführen oder zellartspezifisch waren, wurden weitere Analysen der Zelllinien HL-60 und deren differenzierten Zellart durchgeführt. Auch hier konnten signifikante Unterschiede bei der Einzelzellgelelektrophorese nach Behandlung mit Doxorubicin und Etoposid festgestellt werden. Neben den in dieser Arbeit nachgewiesenen Unterschieden bei der Reparatur zwischen den Zelltypen, könnten aber auch weitere Faktoren zu Varianzen führen und die Mutagenitätsforschung beeinflussen. Folglich ist davon auszugehen, dass zukünftige Testungen bei der pharmakologischen Substanzentwicklung in verschiedenen Zellsystemen von Nöten sind, bevor neue Substanzen zugelassen werden. Alles in allem konnte die Komplexität der Ergebnisse zwischen Zellen der verschiedenen Differenzierungsstadien in dieser Arbeit aufgezeigt werden. Deswegen sollte auch bei weiteren Forschungsvorhaben insbesondere ein Augenmerk auf den Differenzierungszustand der zu untersuchenden Zellpopulation geworfen werden., In the present study, the influences of different genotoxic substances on mammalian cells were investigated. Given that organisms develop on the basis of ontogenesis and cells develop from stem cells and progenitor cells, it is important to protect these original cells from external influences. Due to the fact so far only few studies have been carried out on cells in different differentiation stages, many different biological endpoints, like effects on vitality, proliferation, mitosis and apoptosis of these cells have been investigated. In addition, the formation of micronuclei, the development of DNA damage and the underlying repair mechanisms were interpreted. The investigations of hematopoietic stem cells and TK6 cells have shown that hematopoietic stem cells are predominantly less sensitive to cytostatic drugs (doxorubicin, vinblastine, methyl methanesulfonate and mitomycin C) than the lymphoblastoid cell line TK6, which follows the stem cells in the development hierarchy. The fear that the micronucleus test in immortalized TK6 cells would not be sufficient as a basis for genotoxicity studies could be refuted with the results of this work. The results show that the micronucleus test in TK6 cells is relevant because TK6 cells are more sensitive to genotoxic agents than hematopoietic stem cells. During the investigation of the leukemia cell line HL-60, the effects of classic vinca alkaloids (vinblastine, vincristine, vinflunine and vinorelbine) were compared with novel synthesized vinca alkaloids (4-chlorochablastine, 4-chlorochacristine, 16a, 17b and 18a). Vinca alkaloids are very often associated with side effects, such as neuropathies, which often lead to discontinuation of therapy by patients during chemotherapy. For this reason, it was desirable to develop novel vinca alkaloids with fewer side effects but similar efficacy. Although the potency on the cancer cell line HL-60 of the new substances was lower than in vinblastine, vincristine and vinorelbine, some showed a similar effect to the vinca alkaloid vinflunine. The results of this work can be taken as a first indication in vitro that these substances may prove effective in cancer therapy and will be considered as therapeutic alternatives in vivo according to further results. Differences were also detected in comparative investigations of exponentially growing with differentiated cell lines. The cell line HT-22, which itself is not a cancer cell line, showed an increased sensitivity to the alkylating agent methyl methanesulfonate after differentiation to non-exponentially growing cells, which could be due to reduced base excision repair. The differentiated form of the adenocarcinoma cell line CaCo2 also showed an increased sensitivity to the topoisomerase II inhibitor etoposide, whereas the non-selective topoisomerase II inhibitor doxorubicin had no effect. In order to clarify whether the found differences due to the enzyme topoisomerase II or were cell-type-specific, further analyses were carried out with the cell line HL-60 and their differentiated cell type. Again, significant differences in single cell gel electrophoresis after treatment with doxorubicin and etoposide were detected. In addition to the differences in repair between cell types shown in this study, other factors could also lead to variances and influence mutagenicity research. Therefore, it is reasonable to assume that future testings in different cell systems are necessary for the development of pharmacologically active substances before new substances will be approved. Altogether, the complexity of the results between cells in the different differentiation stages becomes apparent in this work, which also means that further research projects would pay particular attention to the differentiation stage of the investigated cell population.

by Kathrin Kobler Literaturverzeichnis: Blatt 75-84 Zusammenfassung/Abstract in deutscher und englischer Sprache Paris Lodron University Salzburg, Masterarbeit, 2018 (VLID)5003166

Transcription factors ensure skin homeostasis via tight regulation of distinct resident stem cells. Here we report that JunB, a member of the AP-1 transcription factor family, regulates epidermal stem cells and sebaceous glands through balancing proliferation and differentiation of progenitors and by suppressing lineage infidelity. JunB deficiency in basal progenitors results in a dermatitis-like syndrome resembling seborrheic dermatitis harboring structurally and functionally impaired sebaceous glands with a globally altered lipid profile. A fate switch occurs in a subset of JunB deficient epidermal progenitors during wound healing resulting in de novo formation of sebaceous glands. Dysregulated Notch signaling is identified to be causal for this phenotype. In fact, pharmacological inhibition of Notch signaling can efficiently restore the lineage drift, impaired epidermal differentiation and disrupted barrier function in JunB conditional knockout mice. These findings define an unprecedented role for JunB in epidermal-pilosebaceous stem cell homeostasis and its pathology., publishedVersion

Alginate cell-based therapy requires further development focused on clinical application. To assess engraftment, risk of mutations and therapeutic benefit studies should be performed in an appropriate non-human primate model, such as the common marmoset (Callithrix jacchus). In this work we encapsulated amnion derived multipotent stromal cells (MSCs) from Callithrix jacchus in defined size alginate beads using a high voltage technique. Our results indicate that i) alginate-cell mixing procedure and cell concentration do not affect the diameter of alginate beads, ii) encapsulation of high cell numbers (up to 10×106 cells/ml) can be performed in alginate beads utilizing high voltage and iii) high voltage (15–30 kV) does not alter the viability, proliferation and differentiation capacity of MSCs post-encapsulation compared with alginate encapsulated cells produced by the traditional air-flow method. The consistent results were obtained over the period of 7 days of encapsulated MSCs culture and after cryopreservation utilizing a slow cooling procedure (1 K/min). The results of this work show that high voltage encapsulation can further be maximized to develop cell-based therapies with alginate beads in a non-human primate model towards human application. DFG/EXC/62/1

Die adjuvante Behandlung von Brustkrebspatientinnen mit Bisphosphonaten wie Zoledronat bewirkt eine Prognoseverbesserung. Dies liegt an einer geringeren Metastasierungsrate des Primärtumors. Da Metastasen in allen Körpergeweben unter Bisphosphonattherapie seltener werden, wird ein direkter Effekt von Zoledronat auf Mammakarzinomzellen vermutet. Brustkrebszellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Zoledronat inkubiert. Die Zellen wurden auf Änderungen der Genexpression und der zellularen Proteinausstattung im RANK/NF-\(\kappa\)B-Signalweg untersucht um Unterschiede zu unbehandelten Brustkrebszellen zu finden. Die untersuchte Wirkung von Zoledronat auf einen der Effektorweg der Tumorigenese in Brustkrebszellen spiegelt sich nicht in einem veränderten Expressionsmuster von Zelldifferenzierungsparametern wider. Die beobachtete Verbesserung der Prognose nach Gabe von Zoledronat scheint nicht in erster Linie auf eine Redifferenzierung der Tumorzellen zurückzuführen zu sein.

Stammzellen in Meristemen ermöglichen ein stetes Wachstum von Pflanzen. In der vorliegenden Arbeit wurden drei bisher unbekannte Proteine in Arabidopsis thaliana funktionell charakterisiert und als wichtige Faktoren zum Erhalt der meristematischen Aktivität beschrieben. In vorangegangen Arbeiten wurde eine Mutante identifiziert, die starke Defekte im Wurzelmeristem zeigt, weshalb das betroffene Gen als MAINTENANCE OF MERISTEMS (MAIN) bezeichnet wurde. Mittels Homologieanalysen konnten drei sequenzverwandte Proteine ermittelt werden, die als MAIN-LIKE1, 2 und 3 (MAIL1, MAIL2 und MAIL3) bezeichnet wurden. Ihre gemeinsame Funktion sowie Unterschiede sollten in dieser Arbeit näher untersucht werden. Zur Charakterisierung der drei Kernproteine wurde zunächst ihre gewebespezifische Genexpression mithilfe von GUS- bzw. GFP-Fusionen untersucht. Diese Analysen ergaben eine besonders starke Expression aller drei Gene in den Apikalmeristemen des Sprosses und der Wurzel. Um die Funktion der drei Gene genauer zu untersuchen, wurden unter anderem T DNA Insertionsmutanten analysiert. Der zentrale Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Untersuchung von mail1-Mutanten, die einen besonders starken pleiotropen Phänotyp aufweisen. Dabei sind mail1-Mutanten durch Verzögerungen in Entwicklungsübergängen gekennzeichnet, beispielsweise vom heterotrophen Embryo zum photoautotrophen Keimling und von der vegetativen zur reproduktiven Phase. In zellulären Untersuchungen dieser Mutanten konnten sowohl in Spross- als auch in Wurzelapikalmeristemen starke Defekte in der Zellorganisation beobachtet werden. Mithilfe von Gewebefärbungen wurden in Meristemen von mail1-Wurzeln tote Zellen, vor allem Stammzellen sowie ihre Tochterzellen, nachgewiesen. Darüber hinaus treten in diesen Geweben DNA-Schäden, wie DNA-Doppelstrangbrüche, auf. In Genexpressionsanalysen wurde zudem eine konstitutive Hochregulierung der DNA Reparaturantwort in Wurzeln ermittelt. Gleichzeitig bilden sich oberirdisch neoplastische, callusähnliche Strukturen an Blättern und Hypokotylen der mail1 Keimlinge, die auf Defekte in der Differenzierung hindeuten. Dabei ist eine ektopische Expression von embryonalen Faktoren in mail1-Keimlingen feststellbar, deren Transkription nach der Keimung normalerweise durch Chromatinmodifikationen verhindert wird. In Folge dieser Untersuchungen kann eine mögliche Funktion von MAIL1 bei der chromosomalen Organisation, die Zellteilung und Differenzierung beeinflusst, geschlossen werden. Zur Charakterisierung der MAIL2 Funktion wurden knockdown Linien generiert, da keine T-DNA-Insertionsmutanten zur Analyse zur Verfügung standen. Erste Untersuchungen der Linien zeigten charakteristische Phänotypen vergleichbar mit mail1-Mutanten. So konnten Unregelmäßigkeiten in der zellulären Struktur des Sprossapikalmeristems sowie Defekte in der Phyllotaxis festgestellt werden. Für die Funktionsanalyse von MAIL3 wurden zwei unabhängige T DNA Insertionslinien, knockdown Linien sowie Überexpressionslinien untersucht. Allerdings konnte für keine dieser Linien ein Phänotyp unter den getesteten Bedingungen bestimmt werden. Bei Recherchen zu Homologien und phylogenetischer Herkunft wurde festgestellt, dass die drei MAIL Proteine zusammen mit MAIN eine kleine pflanzenspezifische Proteinunterfamilie bilden. Alle vier Gene kodieren für Proteine mit einer vorhergesagten aminotransferase-like, plant mobile Domäne, die aufgrund von Sequenzverwandtschaft als pflanzenspezifisches, mobiles Transposonelement mit noch unbekannter Funktion identifiziert wurde. Aufgrund der Ermittlung der chromosomalen Lokalisation von MAIN/MAIL Genen in heterochromatischen Bereichen, könnten die Gene einen transposonverwandten Ursprung besitzen. Da heterochromatische Bereiche durch epigenetische Modifikationen stillgelegt werden, wäre, aufgrund der in dieser Arbeit durchgeführten Mutantenanalysen, eine Funktion der MAIN/MAIL Proteine in der chromosomalen Organisation oder Strukturierung denkbar. Stem cells in meristems enable continuous growth of plants. In this work three Arabidopsis proteins with unknown function were characterized as important factors for the maintenance of meristem activity. In previous work, a mutant with strong defects in root meristems has been identified and the corresponding gene has been called MAINTENANCE OF MERISTEMS (MAIN). By sequence analysis, three related proteins which were named MAIN LIKE1, 2 and 3 (MAIL1, MAIL2 and MAIL3) were identified in Arabidopsis genome. In the present study overlapping and different functions of these proteins were analyzed. To study the tissue-specific gene expression of MAIL1 genes transgenic lines were generated fusing promoter and genomic sequences of MAIL genes to GUS or GFP marker genes. These analyses revealed strong expression of all three genes in meristematic tissues. For functional analysis of the MAIL gene products T-DNA insertion lines were used. The major topic of this work focused on the analysis of mail1 mutants which displayed a pleiotropic phenotype: the transition from heterotrophic embryonic growth to autotrophic seedling development was delayed as well as the switch from vegetative to reproductive phase. In cellular studies of root and shoot meristems defects in the cell organization were observed. Dead cells in the meristems, affecting especially stem cells and their early descendants, were detectable using tissue staining. In addition DNA damage, e.g. DNA double strand breaks, occurred in meristematic tissue. Analysis of the transcript levels of genes involved in DNA repair showed constitutive up-regulation in mail1 roots. At the same time neoplastic callus-like structures were formed at aerial parts such as cotyledons and hypocotyls indicating differentiation defects. Furthermore, ectopic expression of embryonic factors, normally repressed during germination by epigenetic modification, was observed in mail1 seedlings. Consequently, these data suggest a possible function for MAIL1 as a factor in chromosomal organization during proliferation and differentiation in Arabidopsis thaliana. For the functional characterization of MAIL2, knockdown lines had to be generated as no T DNA insertion line was available. The phenotype of MAIL2 knockdown lines was in some points comparable to that of mail1 mutants. They revealed cellular disorganization in shoot apical meristem and defects in phyllotaxy. To analyze the function of MAIL3, two independent T-DNA insertion lines, knockdown and overexpression lines were analyzed. However, none of these lines showed an obvious phenotype under normal conditions. Analyses of sequence homologies and phylogenetic analyses showed that MAIN and the three related MAIL proteins form a small plant–specific family. All four genes encode proteins with a predicted aminotransferase-like, plant mobile domain, which are typically found in transposon elements. The function of this domain, however, is unknown. MAIN/MAIL genes are localized in heterochromatic regions, which support the transposon–related origin of these genes. Heterochromatic regions are normally silenced by epigenetic modification. The analysis of the mail mutants in this work leads to the assumption that MAIN/MAIL proteins function in maintaining genomic stability through chromatin organization or remodeling.

Human induced pluripotent stem cells (iPS cells) resemble embryonic stem cells (ES cells) and can differentiate into all tissue types of our body. Hence human iPS cells serve as suitable candidates for disease modeling, drug development and cellular therapy. However, the differentiation efficiency of human iPS cells towards specific lineages is rather poor - particularly towards mesodermal and endodermal lineages, such as hematopoietic cells, hepatocytes and pancreatic cells. In this study, we aim to search for new approaches, which could enhance the differentiation efficiency of human iPS cells. Cell fusion exists physiologically in our body (e.g. muscle and liver cells), to make cells acquire increasing cellular function. In vitro, upon fusion of somatic cells with pluripotent stem cells, the somatic genome is reprogrammed into a pluripotent state. Hence, cell fusion is often used as a tool for studying reprogramming. We hypothesize that the somatic genome in such hybrids might contribute to their differentiation potential and thus enhances pluripotent stem cell differentiation. Therefore, we fused human iPS cells with hematopoietic stem cells (HSC) from cord blood to generate iPS/somatic cell hybrids, referred to as iPS hybrids. Shortly after fusion, iPS hybrids acquired similar characteristics as parental iPS cells, including gene expression profiles and epigenetic signatures. Different from parental iPS cells, iPS hybrids showed a prominent differentiation bias towards hematopoietic lineages but also towards other mesendodermal lineages. Interestingly, we found that the strong mesendodermal differentiation bias of iPS hybrids was already initiated at the primitive streak stage, when the first decision of mesendoderm or ectoderm specification is made. The prominent primitive streak development in iPS hybrids was directed by NODAL signaling. Accordingly, inhibition of NODAL signaling blunted the mesendodermal differentiation bias. Biomaterials can mimic properties of in vivo extracellular matrix (ECM) components and provide an in vitro cellular “niche”. Therefore biomaterials are expected to direct differentiation of pluripotent stem cells towards specific lineages. Similarly, small molecules activate or inhibit specific signaling pathways, which are crucial for cell fate specification and can affect differentiation capacity of pluripotent stem cells. To this end, we investigated whether the biomaterial Poly(L-lactide-co-D,L-lactide) (LR704) and the compound 1-ethyl-2-benzimidazolinone (EBIO), an activator of Ca2+-activated potassium channels (SKCas), affect human iPS cell differentiation. We found that both of LR704 and EBIO showed rather unspecific effects on the differentiation of human iPS cells. Thus, in the context studied here cell fusion of iPS cells with somatic cells is superior to biomaterials and small molecules in enhancing iPS cell differentiation. Taken together, we propose that cell fusion of iPS cells with somatic cells provides an efficient strategy for enhancing iPS cell differentiation towards cell types, which are notoriously difficult to obtain.

Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Isolation und Phänotypisierung migrationsfähiger chondrogener Progenitorzellen (CPC). Dazu wurden CPC aus makroskopisch intaktem arthrotischem Knorpelgewebe durch Migration isoliert und mittels Immunfärbung und Durchflusszytometrie hinsichtlich ihrer Oberflächenmarkerexpression charakterisiert. Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) aus dem Knochenmark dienten als Vergleichspopulation. Sowohl die Expression einzelner Marker, als auch die Expression von 25 verschiedenen Markerkombinationen aus Positiv- und Negativmarkern wurde für CPC und MSC miteinander verglichen. CPC zeigten sowohl bei Einzelfärbungen, als auch bei Mehrfachfärbungen ein ähnliches Expressionsprofil wie MSC. Mit Hilfe etablierter Differenzierungs-Assays konnte gezeigt werden, dass CPC in Chondrozyten, Adipozyten und Osteoblasten differenzieren können (2D). In einem weiteren Ansatz wurde ein Kollagen-Typ I-Gel als Matrix zur Isolation der CPC verwendet. Die CPC waren in der Lage in die 3D-Gerüstsubstanz einzuwandern und darin zu migrieren. Nach Stimulation mit Differenzierungsmedien konnten CPC zudem in Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten differenziert werden. Die chemotaktische Reaktion der CPC auf verschiedene Wachstumsfaktoren wurde mittels modifizierter Boyden-Chemotaxiskammer untersucht. CPC zeigten im Vergleich zu MSC eine signifikant höhere Basalmigration, was auf ein erhöhtes Migrationspotential hindeutet. PDGF-BB und IGF-1 wirkten sowohl bei CPC, als auch bei MSC als stärkste Chemoattraktants. TGF- Beta3 und BMP-2 konnten nur geringe, jedoch in MSC und CPC unterschiedliche migratorische Reaktionen auslösen. CPC konnten aufgrund des untersuchten Phänotyps, Differenzierungspotentials sowie der Migration auf chemotaktische Stimulation der Gruppe multipotenter mesenchymaler Stromazellen zugeordnet werden. Die Charakterisierung der CPC ermöglicht die Weiterentwicklung innovativer Therapieansätze zur In vivo-Regeneration von Gelenkknorpeldefekten.

Bacteria organize many membrane-related signaling processes in functional microdomains that are structurally and functionally similar to the lipid rafts of eukaryotic cells. An important structural component of these microdomains is the protein flotillin, which seems to act as a chaperone in recruiting other proteins to lipid rafts to facilitate their interaction. In eukaryotic cells, the occurrence of severe diseases is often observed in combination with an overproduction of flotillin, but a functional link between these two phenomena is yet to be demonstrated. In this work, we used the bacterial model Bacillus subtilis as a tractable system to study the physiological alterations that occur in cells that overproduce flotillin. We discovered that an excess of flotillin altered specific signal transduction pathways that are associated with the membrane microdomains of bacteria. As a consequence of this, we detected significant defects in cell division and cell differentiation. These physiological alterations were in part caused by an unusual stabilization of the raft-associated protease FtsH. This report opens the possibility of using bacteria as a working model to better understand fundamental questions related to the functionality of lipid rafts., IMPORTANCE The identification of signaling platforms in the membrane of bacteria that are functionally and structurally equivalent to eukaryotic lipid rafts reveals a level of sophistication in signal transduction and membrane organization unexpected in bacteria. It opens new and promising venues to address intricate questions related to the functionality of lipid rafts by using bacteria as a more tractable system. This is the first report that uses bacteria as a working model to investigate a fundamental question that was previously raised while studying the role of eukaryotic lipid rafts. It also provides evidence of the critical role of these signaling platforms in orchestrating diverse physiological processes in prokaryotic cells.

Hintergrund und Ziele: Nachdem seit der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts durch mehrere Experimente adulte Neurogenese schließlich nachgewiesen und somit Cajals Dogma widerlegt werden konnte, erlebten die Neurowissenschaften durch die Möglichkeit zur Isolation adulter neuraler Stammzellen ein exponentielles Wachstum. Gleichzeitig mit der basiswissenschaftlichen Aufarbeitung der adulten Neurogenese sowohl im Tier, als auch im Menschen, kam die Idee der therapeutischen Verwendung dieser, vor allem zur Therapie des Morbus Parkinson, auf. Die lediglich vereinzelt erfolgreichen Versuche der Transplantation von embryonalem oder fetalem mesencephalen Gewebe in das Corpus striatum von an Morbus Parkinson erkrankten Patienten bekräftigten zwar das Prinzip der Zellersatztherapie, zeigten jedoch auch die Notwendigkeit der weiteren Erforschung der Mechanismen in der Entwicklung dopaminerger Neurone aus (neuralen) Stammzellen. In dieser Arbeit soll die Möglichkeit überprüft werden, ob adulte humane hippocampale Stammzellen die Fähigkeit besitzen in dopaminerge Nervenzellen zu differenzieren. Hierfür soll ein vorbestehendes Differenzierungsprotokoll entsprechend modifiziert werden. Die experimentellen Arbeiten wurden im Zeitraum von 2009 bis 2011 durchgeführt und finanziell durch die Forschungsinitiative ForNeuroCell des Bayerischen Staatsministeriums für Wissenschaft, Forschung und Kunst unterstützt. Methoden: Aus dem Gyrus dentatus von sechs Patienten, die sich im Jahr 2009 an der Universitätsklinik für Neurochirurgie Erlangen aufgrund einer therapierefraktären Temporallappenepilepsie einem neurochirurgischem Eingriff unterzogen hatten, wurden adulte humane hippocampale Stammzellen isoliert. Diese wurden in der Zellkultur expandiert und schließlich einem siebentägigen Differenzierungsprotokoll zugeführt. Hierbei wurden verschieden Moleküle getestet, die für die dopaminerge Differenzierung wichtig sind, wie z.B. Sonic hedgehog (SHH) oder Fibroblast growth factor 8 (FGF8). Die anschließende Auswertung bezüglich eines dopaminergen Phänotyps der Zellen erfolgte durch Immunfluoreszenzfärbungen, Bestimmung der Proteinexpression durch Western-Blot-Analysen sowie der Genexpression durch PCR-Analysen und durch elektrophysiologische Untersuchungen. Ergebnisse und Beobachtungen: Adulte humane hippocampale Stammzellen konnten erfolgreich isoliert und expandiert werden. Die Analyse der Immunfluoreszenzfärbungen zeigte, dass durch die Anwendung des beschriebenen Differenzierungsprotokolls eine nennenswerte dopaminerge Differenzierung stattfindet, die vor allem auf den Einfluss der Signalmoleküle SHH und FGF8 zurückzuführen ist. Die Ergebnisse der Auswertung der Expression von Markern des neuronalen Reifungsprozesses, Nestin und ß-III-Tubulin, sowie von charakteristischen Marker mesencephaler dopaminerger Neurone, Tyrosinhydroxylase, Nurr1 und Pitx3, auf Gen- und Proteinebene waren allerdings nicht signifikant oder sogar widersprüchlich. Lediglich auf Proteinebene ergaben sich Hinweise auf eine dopaminerge Differenzierung der adulten humanen hippocampalen Stammzellen. In den elektrophysiologischen Untersuchungen konnten einwärts gerichtete Natriumströme als Kriterium funktioneller Neurone nachgewiesen werden. Praktische Schlussfolgerungen: Die Analyse der Immunfluoreszenzfärbungen weist auf das Potential adulter humaner hippocampaler Stammzellen hin, dopaminerge Nervenzellen durch spezifische Differenzierungsprotokolle zu generieren. Eine weitere detaillierte Charakterisierung der hierdurch gewonnenen Neurone ist notwendig. Die klinische Translation einer erfolgreichen Generierung dopaminerger Neurone aus adulten humanen hippocampalen Stammzellen würde das Spektrum der Therapie des Morbus Parkinson erweitern und wird in dieser Dissertation kritisch diskutiert. Naheliegend wäre der Ansatz der Transplantation von in vitro generierten dopaminergen Neuronen oder deren Vorläuferzellen. Alternativ besteht der Ansatz der zellfreien Therapie. Basierend auf den in in vitro gewonnenen Erkenntnissen über involvierte Signalkaskaden könnte eine Transplantation umgangen werden, indem der endogene Stammzellpool durch exogene Stimuli selbst zur Generierung neuer dopaminerger Neurone angeregt wird. Background and objective: Starting in the first half of the last century, several experiments have evidenced adult neurogenesis and, thereby, proven Cajal´s Dogma wrong. The successful isolation of adult neural stem cells led to further interest for translational studies. Increasing knowledge about neurogenesis in animals as well as in humans supported the idea of therapeutic application, especially in Parkinson´s Disease. Attempts of transplanting embryonic or fetal tissue into the corpus striatum of Parkinson´s disease patients have shown however little success and demonstrated the necessity of further basic research to unravel the development of dopaminergic neurons. This thesis will test the possibility of targeted dopaminergic differentiation of adult human hippocampal stem cells in vitro. Methods: Adult human hippocampal stem cells were isolated from dentate gyrus of six surgical hippocampal specimens. These were obtained from patients who underwent epilepsy surgery at the Erlangen Epilepsy Centre for drug-resistant mesial temporal lobe epilepsy. Adult human hippocampal stem cells were expanded in culture and finally differentiated for seven days using a modified differentiation protocol. Dopaminergic differentiation was determined by immunofluorescence analysis, protein analysis using Western-Blot, gene analysis using PCR and electrophysiological studies. Results and observations: Adult human hippocampal stem cells were successfully isolated and expanded in vitro. Immunofluorescence analysis proved a high percentage of dopaminergic differentiation, attributed to the addition of SHH and FGF8. Protein and gene analysis of nestin, ß-III-tubulin, Th, Nurr1 and Pitx3 showed no significant or inconsistent results. Only protein analysis pointed to a dopaminergic differentiation of the adult human hippocampal stem cells. Electrophysiological studies showed inward sodium currents pointing to a neuronal differentiation. Conclusions: The results of the immunofluorescence analysis proved dopaminergic differentiation of adult human hippocampal stem cells using this differentiation protocol. However, the nature of these differentiated neurons needs further evaluation. Clinical translation of a successful generation of dopaminergic neurons from adult human hippocampal stem cells should be considered as a further therapeutic approach to Parkinson´s disease. On the one hand, in vitro generated dopaminergic neurons or their precursors could be transplanted. On the other hand, the endogenous stem cell pool could be stimulated by exogenic stimuli using the knowledge deduced from in vitro studies.

Die Koordination von Wachstum und Differenzierung als Antwort auf verschiedene Signale und Umweltbedingungen ist eine grundlegende Eigenschaft von Organismen. Hierbei erfordern die Anpassung von Zellteilungszyklus und Stoffwechsel und morphologische Änderungen eine spezifische Regulation der Genexpression mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren. Eine zentrale Frage ist, welche Kombinationen von Transkriptionsfaktoren an welchen Promotoren bei der Regulation von Wachstum und Differenzierung überhaupt eine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde exemplarisch die kombinatorische und promotorspezifische Kontrolle des TEA-Transkriptionsfaktors Tec1 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Tec1 ist zusammen mit dem Transkriptionsfaktor Ste12 an der Regulation der Differenzierungsprogramme Biofilmbildung und Konjugation beteiligt und wird unter anderem über den Fus3/Kss1-MAPK-Signalweg gesteuert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Komplexbildung von Tec1 und Ste12 analysiert. Es stellte sich heraus, dass Tec1-Zielgene in eine Ste12-abhängig und in eine Ste12-unabhängig regulierte Klasse eingeteilt werden können. Ste12 kann die Stabilität von Tec1 über dessen C-terminale Domäne regulieren, die zudem eine Ste12-unabhängige Transkriptionsaktivierungsdomäne enthält. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Co-Regulatoren Msa1 und Msa2 als neue Interaktionspartner von Tec1 identifiziert. Tec1, Msa1 und Msa2 regulieren gemeinsam zelluläre Differenzierungsprogramme wie Biofilmbildung und Konjugation. Zudem wirken sie auf den Zellteilungszyklus und die Ribosomensynthese. Dies sind Prozesse, die das Wachstum und die Zellgröße beeinflussen. Tec1, Ste12, Msa1 und Msa2 können verschiedene Komplexe ausbilden und in unterschiedlichen Kombinationen an gemeinsam regulierte Promotoren binden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschreibt den Aufbau und die Validierung eines Mess-systems, mit dessen Hilfe man in lebenden Zellen die Signaltransduktionsdynamik im Fus3/Kss1-MAPK-Modul unter verschiedenen Bedingungen quantitativ messen kann. Dies geschieht durch Bestimmung von Menge, Lokalisierung und programm-spezifischer Aktivität der Regulatoren Tec1, Ste12, Dig1 und Dig2 mittels Fluoreszenz-mikroskopie.

Imprinted genes play important roles in brain development. As the neural developmental capabilities of human parthenogenetic embryonic stem cells (hpESCs) with only a maternal genome were not assessed in great detail, hence here the potential of hpESCs to differentiate into various neural subtypes was determined. In addition DNA methylation and expression of imprinted genes upon neural differentiation was also investigated. The results demonstrated that hpESC-derived neural stem cells (hpNSCs) showed expression of NSC markers Sox1, Nestin, Pax6, and Musashi1 (MS1), the silencing of pluripotency genes (Oct4, Nanog) and the absence of activation of neural crest (Snai2, FoxD3) and mesodermal (Acta1) markers. Moreover, confocal images of hpNSC cultures exhibited ubiquitous expression of NSC markers Nestin, Sox1, Sox2 and Vimentin. Differentiating hpNSCs for 28 days generated neural subtypes with neural cell type-specific morphology and expression of neuronal and glial markers, including Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 and GABA. hpNSCs also responded to region-specific differentiation signals and differentiated into regional phenotypes such as midbrain dopaminergic- and motoneuron-type cells. hpESC-derived neurons showed typical neuronal Na+/K+ currents in voltage clamp mode, elicited multiple action potentials with a maximum frequency of 30 Hz. Cell depicted a typical neuron-like current pattern that responded to selective pharmacological blockers of sodium (tetrodotoxin) and potassium (tetraethylammonium) channels. Furthermore, in hpESCs and hpNSCs the majority of CpGs of the differentially methylated regions (DMRs) KvDMR1 were methylated whereas DMR1 (H19/Igf2 locus) showed partial or complete absence of CpG methylation, which is consistent with a parthenogenetic (PG) origin. Upon differentiation parent-of-origin-specific gene expression was maintained in hpESCs and hpNSCs as demonstrated by imprinted gene expression analyses. Together this shows that despite the lack of a paternal genome, hpNSCs are proficient in differentiating into glial- and neuron-type cells, which exhibit electrical activity similar to newly formed neurons. Moreover, maternal-specific gene expression and imprinting-specific DNA-methylation are largely maintained upon neural differentiation. hpESCs are a means to generate histocompatible and disease allele-free ESCs. Additionally, hpESCs are a unique model to study the influence of imprinting on neurogenesis., Imprinted Gene spielen eine wichtige Rolle bei der Gehirnentwicklung. Da das neurale Entwicklungspotenzial von hpESCs bisher noch nicht ausführlich untersucht wurde, war das Ziel dieser Arbeit das Differenzierungspotenzial von hpESCs zu verschiedenen neuralen Subtypen zu untersuchen. Außerdem wurden die DNA-Methylierung und Expression imprinted Gene in hpESCs während der neuralen Differenzierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass von hpESCs abgeleitete neurale Stammzellen (hpNSCs) die NSC-Marker Sox1, Nestin, Pax6 und Musashi1 (MS1) exprimierten, Pluripotenzmarker-Gene (Oct4, Nanog) abschalteten und keine Aktivierung von Markern der Neuralleistenzellen (Snai2, FoxD3) sowie dem mesodermalen Marker Acta1 stattfand. Immunfärbungen zeigten weiterhin, dass aus hpESCs abgeleitete Stammzellen die NSC-Marker Nestin, Sox1, Sox2 und Vimentin auf Proteinebene exprimierten. Durch gerichtete neurale Differenzierung für 28 Tage konnten aus hpESCs neurale Subtypen abgeleitet werden, die eine neurale Zelltyp-spezifische Morphologie aufweisen und positiv für neuronale und gliale Marker wie Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 und GABA sind. Um aus hpNSCs dopaminerge und Motoneuronen abzuleiten, wurden während der Differenzierung Morphogene und trophische Faktoren zugegeben. Elektrophysiologische Analysen konnten zeigen, dass die in vitro differenzierten Neuronen, die von hpESCs abgeleitet wurden, für Neurone typische Na+/K+ Ströme sowie Aktionspotentiale (30 Hz) vorweisen ausbilden und auf ausgewählte pharmakologische Natrium- (Tetrodotoxin) und Kalium- (Tetraethylammonium) Kanal-Blocker reagierten. Desweiteren war der Großteil der CpGs von differentiell methylierten Regionen (DMRs) KvDMR1 in hpESCs und hpNSCs methyliert, während DMR1 (H19/Igf2 Locus) eine partiell oder komplett abwesende CpG-Methylierung zeigte, was dem parthenogenetischen Ursprung entspricht. Während der Differenzierung wurde die elternabhängige (parent-of-origin) spezifische Genexpression in hpESCs und hpNSCs aufrechterhalten, wie mit Genexpressionsanalysen imprinted Gene gezeigt werden konnte. In der Summe zeigen die hier dargestellten Ergebnisse, dass hpESCs, die kein paternales Genom besitzen, keine Beeinträchtigung im neuralen Differenzierungspotential zeigten und zu Gliazellen und Neurone differenziert werden konnten. Elektrophysiologische Analysen zeigten ferner, dass von hpESCs abgeleitete Neurone funktionell sind. Zudem wird die Expression maternal-spezifischer Gene und die Imprinting-spezifische DNA-Methylierung während der Differenzierung größtenteils aufrechterhalten. In der Summe stellen hpESCs ein einzigartiges Modell dar, um den Einfluss des Imprintings auf die Neurogenese zu untersuchen.

Formation oft the central nervous system (CNS) from multipotent neuronal stem cells (NSCs) requires a tightly controlled, step-wise activation of the neuronal gene expression program. Expression of neuronal genes at the transition from neural stem cell to mature neuron (i. e. neuronal cell differentiation) is controlled by the Repressor element 1 (RE1) silencing transcription factor (REST) complex. As a master transcriptional regulator, the REST-complex specifically inhibits expression of neuronal genes in non-neuronal tissues and neuronal progenitor cells. Differentiation of NSCs to mature neurons requires the activation of genes controlled by the REST-complex, but how abrogation of REST-complex mediated repression is achieved during neurogenesis is only poorly understood. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small regulatory RNAs that posttranscriptionally control target gene expression. Binding of miRNAs to target sequences in the 3’UTR of mRNAs, leads either to degradation or translational inhibition of the mRNA. Distinct neuronal miRNAs (e.g. miR-124) were shown to modulate REST-complex activity by silencing expression of REST-complex components. Interestingly, these miRNAs are also under transcriptional control of the REST-complex and inactivation of the REST-complex precedes their expression. Hence, additional factors are required for derepression of neuronal genes at the onset of neurogenesis. In this study function of the miR-26 family during neurogenesis of the zebrafish (Danio rerio) was analyzed. Computational target prediction revealed a number of REST-complex components as putative miR-26 targets. One of these predicted target genes, the C-terminal domain small phosphatase 2 (Ctdsp2) was validated as an in vivo target for miR-26b. Ctdsps are important cofactors of REST and suppress neuronal gene expression by dephosphorylating the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II (Pol II). Interestingly, miR-26b is encoded in an intron of the ctdsp2 primary transcript and is cotranscribed together with its host gene. Hence, miR-26b modulates expression of its host gene ctdsp2 in an intrinsic negative autoregulatory loop. This negative autoregulatory loop is inactive in NSCs because miR-26b biogenesis is inhibited at the precursor level. Generation of mature miR-26b is activated during neurogenesis, where it suppresses Ctdsp2 protein expression and is required for neuronal cell differentiation in vivo. Strikingly, miR-26b is expressed prior to miR-124 during neuronal cell differentiation. Thus, it is reasonable to speculate about a function of miR-26b in early events of neurogenesis. In line with this assumption, knockdown of miR-26b in zebrafish embryos results in downregulation of REST-complex controlled neuronal genes and a block in neuronal cell differentiation, most likely due to aberrant regulation of Ctdsp2 expression. This is evident by reduced numbers of secondary motor neurons compared to control siblings. In contrast, motor neuron progenitor cells and glia cells were not affected by depletion of miR-26b.This study identifies the ctdsp2/miR-26b autoregulatory loop as the first experimentally validated interaction between an intronic miRNA and its host gene transcript. Silencing of ctdsp2 by miR-26b in neurons is possible because biogenesis of the ctdsp2 mRNA and mature mir-26b is uncoupled at the posttranscriptional level. Furthermore the obtained data indicate a cell type specific role for miR-26b in vertebrate neurogenesis and CNS development., Die Entwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) aus multipotenten neuronalen Stammzellen erfordert eine stufenweise und genau regulierte Aktivierung der neuronalen Genexpression. Bei der Differenzierung neuronaler Stammzellen zu Neuronen wird die Expression neuronaler Gene durch den sogenannten „Repressor element 1 (RE1) silencing transcription factor (REST)”-Komplex gesteuert. Der REST-Komplex unterdrückt spezifisch in proliferierenden neuronalen Vorläuferzellen die Expression neuronaler Gene. Während der neuronalen Zelldifferenzierung wird die Expression dieser Gene jedoch benötigt. Wie die Inaktivierung neuronaler Gene durch den REST-Komplex während des Prozesses der Neurogenese aufgehoben wird ist bislang nicht genau bekannt. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische RNAs, die die Expression ihrer Zielgene auf posttranskriptioneller Ebene regulieren. Dazu binden miRNAs an Zielsequenzen in 3’UTRs von mRNAs, was zu einer Inhibition der Translation oder Abbau der mRNA führt. Auch Komponenten des REST-Komplexes stehen unter Kontrolle bestimmter neuronaler miRNAs (z.B. miR-124). Erstaunlicherweise stehen diese miRNAs selber wiederum unter der transkriptionellen Inhibition des REST-Komplexes und können daher nicht für die Inaktivierung des REST-Komplexes zu Beginn der Neurogenese verantwortlich sein. Übereinstimmend damit konnte beobachtet werden, dass der REST-Komplex aus differenzierenden Zellen entfernt wird, bevor die genannten neuronalen miRNAs exprimiert werden. Diese Umstände legen die Existenz weiterer, bis jetzt unbekannter Faktoren nahe, die die Expression des REST-Komplexes selber inhibieren und so die Neurogenese erlauben Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Funktion der miR-26 Familie während der Neurogenese des Zebrafisches (Danio rerio) untersucht. Eine bioinformatische Zielgenvorhersage für die miR-26 Familie ergab, dass unter anderem zahlreiche bekannte Komponenten des REST-Komplexes unter den Kandidatengenen sind. Für eines dieser vorhergesagten Zielgene, die sogenannte „C-terminal domain small phosphatase 2 (Ctdsp2)” wurde daraufhin gezeigt, dass seine Expression in der Tat durch die miR-26b inhibiert wird. Ctdsps sind wichtige Kofaktoren des REST-Komplexes und unterdrücken die Expression neuronaler Gene, indem die die C-terminale Domäne (CTD) der RNA Polymerase II dephosphorylieren und diese dadurch inaktivieren. In diesem Zusammenhang von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die miR-26b in einem Intron des ctdsp2 Gens kodiert ist und mit ctdsp2 zusammen transkribiert wird. Folglich beeinflusst die miR-26b die Expression ihres eigenen „Host genes“ in einer Art autoregulativer Rückkopplungsschleife. Die beschriebene negative Regulation ist in neuronalen Stammzellen nicht aktiv, da dort die Biogenese der miR-26b auf Vorläuferebene angehalten wird. Reife miR-26b wird erst während der Neurogenese produziert, wo sie daraufhin die Expression von Ctdsp2 Protein verhindert. Während der neuronalen Zelldifferenzierung wird die miR-26b deutlich früher exprimiert als zum Beispiel die miR-124. Daher liegt es nahe eine Funktion der miR-26b während früher Prozesse in der Neurogenese anzunehmen. In Übereinstimmung mit dieser Annahme führt ein „Knockdown“ der miR-26b zu einer schwächeren Expression von neuronalen Genen, die unter der Kontrolle des REST-Komplex stehen. Weiterhin führt ein reduziertes Maß an miR-26b zu fehlerhafter oder gänzlich ausbleibender neuronaler Zelldifferenzierung. Dies konnte anhand einer verringerten Anzahl differenzierter spinaler Motorneuronen aufgezeigt werden. Die Vorläufer dieser Motorneuronen und Gliazellen waren hingegen vom miR-26b-„Knockdown“ nicht beeinflusst. Die hier präsentierte Studie zeigt erstmals in experimenteller Weise das Vorhandensein einer direkten Interaktion zwischen einer intronischen miRNA und ihrem eigenen Primärtranskript. Die negative Regulation der Ctdsp2 Expression in Neuronen wird erst dadurch möglich, dass die Biogenese der ctdsp2 mRNA und der reifen miR-26b durch einen posttranskriptionellen Mechanismus voneinander getrennt werden. Weiterhin legen die Daten aus dieser Studie nahe, dass die miR-26b in der Tat eine spezifische Funktion in der Entwicklung des ZNS von Vertebraten hat.

Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death., Humaner adulter Knorpel besitzt weder Blutgefäße noch Nerven, weswegen diese Knorpelart im Vergleich zu anderen Gewebetypen ein verringertes Wachstum und Regenerierung wiederspiegelt. Den Hauptteil der Zellen im adulten Knorpel stellen die Chondrozyten (Knorpelzellen)dar, welche sich zuvor aus humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) entwickelt haben. Sie sind verantwortlich für die Bildung und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) des Knorpelgewebes, welche hauptsächlich aus Kollagen und Proteoglykanen besteht. Signale, die durch Chondrozyten erzeugt oder weitergeleitet werden, finden in der Regel durch Interaktion mit Molekülen der im Knorpel liegenden ECM statt. Mitglieder der CCN-Familie gelten hierbei als bedeutende extrazelluläre Matrixproteine, die bei verschiedenen regulatorischen Prozessen während der Skelettentwicklung und der Frakturheilung eine Rolle spielen. In dieser Doktorarbeit liegt das Hauptaugenmerk auf dem CCN Protein WISP1/CCN4. Dieses Protein gilt bereits in verschiedenen Zellen als ein notwendiger Überlebensfaktor und scheint desWeiteren eine regulatorische Funktion während der Differenzierung von hMSCs in Chondrozyten auszuüben. Die generelle Bedeutung von WISP1 für das muskuloskelettale System ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt und soll während dieser Doktorarbeit mittels einer Reihe von molekular- und zellbiologischer Methoden genauer untersucht werden. Hierfür wurde zu Beginn eine erfolgreiche Herunterregulierung endogen hergestellter WISP1 Transkripte mittels Genexpressionshemmung (gene-silencing) in verschiedenen muskuloskelettalen Zellen erzielt. Interessanterweise scheint WISP1 eine bedeutende Rolle für das Überleben dieser Zellen zu spielen, da ein Verlust bei allen untersuchten Zelllinien und primären hMSCs zum Zelltod führte. Um zu Grunde liegende Mechanismen genauer zu untersuchen, wurden daraufhin Microarray Analysen von hMSCs und Tc28a2 Chondrocyten durchgeführt (jeweils WISP1 herunterreguliert vs Kontrollzellen). In diesem Zusammenhang identifizierten bioinformatische Analysen differentielle Expressionen verschiedener apoptoseresponsiver Gene. So scheint eine Apoptoseinduktion über TRAIL und/oder p53 in hMSCs stattzufinden, wohingegen eine starke Regulation des MAPK-Signalweges in Chondrozyten detektiert wurde. Neben diesen Genregulationen, deckten die Analysen ebenso Gengruppen auf, die bei anderen wichtigen zellulären Abläufen eine Rolle spielen. Hier sind in WISP1 herunterregulierten hMSCs u.a. viele differenziell exprimierte Gene zu nennen, die durch Interferone induzierbar sind. In Chondrozyten dagegen scheint eine verringerte WISP1 Expression Genexpressionen zu beeinflussen, welche die Knorpelhomeostase regulieren. Die Ergebnisse, die während dieser Doktorarbeit erzielt wurden, verdeutlichen die Wichtigkeit von WISP1 für das Überleben von primären hMSCs und Chondrozyten. Darüberhinaus verstärken die bioinformatischen Analysen die Annahme, das WISP1 regulatorische Funktionen für die Knorpelhomeostase ausübt. Somit bietet diese Doktorarbeit ein essentielles Fundament, um die Rolle von WISP1 bei der Aufrechterhaltung der Knorpelhomeostase und des Zelltodes weiter zu erforschen.

Die Fruchtkörperentwicklung filamentöser Ascomyceten gilt als Modellprozess für die Untersuchung zellulärer Differenzierung in höheren Eukaryoten. Trotz des Nachweises zahlreicher beteiligter Entwicklungsgene in den vergangenen Jahren, ist die molekulare Kontrolle der Fruchtkörperdifferenzierung relativ unverstanden. Differenzierungsprozesse basieren allgemein auf der räumlich und zeitlich koordinierten Regulation der Expression zahlreicher Gene. Dabei gelten evolutionär konservierte Genexpressionsmuster als wichtiger Indikator für die funktionelle Relevanz betroffener Gene. Inhalt dieser Arbeit war somit ein methodischer Ansatz zur Identifizierung funktionell relevanter Gene, durch den Nachweis konservierter Muster differentieller Genexpression bei der Fruchtkörperentwicklung von \(\textit {Pyronema confluens}\), \(\textit {Sordaria macrospora}\) und \(\textit {Neurospora crassa}\). Entsprechend regulierte Gene, darunter ein putatives Histon-Chaperon, waren anschließend das Ziel weiterführender funktioneller Analysen.

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind multipotente adulte Stammzellen. Sie können aus einer Vielzahl verschiedener Gewebe isoliert werden, z.B. aus Knochenmark (BM), Fettgewebe (AT) und Nabelschnurblut (CB). Besondere Bedeutung haben MSCs als mögliche Zellquelle für neuartige klinische Stammzelltherapien, da sie relativ einfach aus adulten Patienten isoliert und in vitro expandiert werden können. Grundlage für die erforschten Therapieansätze ist häufig das Entwicklungspotential der MSCs. Es umfasst mesenchymale Zelltypen wie Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten, aber auch nicht-mesenchymale Zelltypen wie z.B. Hepatozyten oder Nervenzellen. Das Entwick-lungspotential von MSCs zu nicht-mesenchymalen Zelltypen ist jedoch umstritten und viele Differenzierungswege sind bisher nur in vitro gezeigt. Außerdem ist unklar, ob MSCs aus verschiedenen Ursprungsgeweben dasselbe Entwicklungspotential besitzen. Ein Ziel dieser Arbeit war deshalb das in vivo Differenzierungspotential von CB-, AT- und BM-MSCs vergleichend zu untersuchen. Dazu wurden die MSCs in murine Tag-3-Blastozysten injiziert. Diese wurden dann in Foster-Mäuse transferiert und die daraus entstandenen Embryonen am Tag 16 der Embryonalentwicklung (E16.5) analysiert. Dazu wurde gDNA aus verschiedenen embryonalen Geweben isoliert und mittels humanspezifischer quantitativer real-time PCR (qPCR) die Verteilung sowie das Ausmaß der humanen Donorkontribution bestimmt. Außerdem sollte der Differenzierungsstatus der humanen Zellen mittels in situ Hybridisierung und Antikörperfärbung analysiert werden..., Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult stem cells. They can be isolated from a multitude of tissues including bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and cord blood (CB). MSCs gained special importance as potential cell source for novel stem cell-based therapies, because their isolation is relatively easy from patients and they can be expanded in vitro. Current attempts to use MSCs as therapeutic are based on their developmental potential, which includes mesenchymal cell types, for example adipocytes, chondrocytes and osteoblasts as well as the non-mesenchymal cell types like hepatocytes and neural cell types. The developmental potential of MSCs towards non-mesenchymal cell types is controversial and so far often only showed in vitro. Further, it is not clear whether MSCs from different tissue origins have the same developmental potential. Hence the aim of this thesis was to evaluate and compare the in vivo differentiation potential of human MSCs from CB, BM and AT. Therefore MSCs were injected in murine embryonic day 3.5 blastocysts. Then the blastocysts were transferred into foster mice and the developing E 16.5 embryos were analyzed. For this analysis gDNA from a variety of embryonic tissues was isolated. Distribution and degree of human donor contribution was determined by quantification of the human gDNA sequences in the samples with human specific quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). In addition it was planned to analyze the differentiation status of the human cells by immunhistochemistry and in situ hybridization ...

A successful in vitro expansion of hematopoietic stem- and progenitor cells (HPC) is important for reliable cord blood stem cell transplantations with low cell numbers. For in vitro cultivation of HPC, there are no safe protocols existing which provide the ability to control self-renewal and differentiation. In this study, analyses of cell divisions and immunophenotype demonstrated that co-culture with mesenchymal stromal cells (MSC) especially stimulates proliferation of the primitive HPC subset (CD34+ CD133+ CD38-) and also maintenance of a more primitive immunophenotype. Without co-culture, the cells rapidly undergo maturation. In particular, early MSC passages were suitable for culture-expansion of HPC. The expression of specific adhesion proteins (N-Cadherine and VCAM1) and extracellular matrix binding-proteins (CD44 and ITGB1) was specifically inhibited by siRNA knockdown resulting in a higher proportion of quiescent HPC as well as maintenance of primitive immunophenotype. Subsequently, the effect of addition of 5 previously described cytokines (SCF, TPO, FGF, ANGPTL5 and IGFBP2) on proliferation and immunophenotype of HPC was analyzed in 20 different combinations with and without MSC-co-culture. Addition of SCF, TPO and FGF enhanced expansion of HPC without and with MSC-co-culture. Furthermore, transplantation experiments in a murine model showed an enhancement of hematopoietic reconstitution with co-cultured HPC. As a next step, factors were investigated that might regulate and control regeneration of hematopoiesis after chemotherapy. Serum was obtained from patients before and at different time points after autologous stem cell transplantation. 10% of serum was added to culture medium to test its influence on proliferation and immunophenotype of HPC cultured with and without MSC. Serum isolated 4 to 11 days after transplantation significantly enhanced proliferation, colony-stimulating activity and maintenance of primitive immunophenotype. This stimulating effect was hardly detectable with serum isolated more than 14 days after transplantation. Chemokine arrays were used to analyze the chemokine composition of serum samples. Among 174 chemokines, 8 (including 3 PDGF isoforms) were significantly down-regulated during hematopoietic stimulation on day 8, only concentration of monocyte-chemotactic protein 1 (MCP1) was increased. In conclusion, these results verify that co-culture with MSC enhances HPC-proliferation together with maintenance of stem cell function. This effect is further promoted by suitable chemokines. In addition, the hematopoietic reconstitution seems to be controlled through systemic mechanisms of regulation. Therefore, the results of this study further contribute to a better understanding of the regulative and controlling mechanisms in the hematopoietic stem cell niche.

Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine., Pluripotenz bezeichnet die Fähigkeit einer Stammzelle, jede Zelle des Körpers zu bilden. Zu den pluripotenten Stammzellen gehören embryonale Stammzellen (ESZ), aber auch so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (IPS Zellen), die durch Rückprogrammierung ausdifferenzierter Körperzellen in einen pluripotenten Status gewonnen werden. Außerdem wurde gezeigt, dass adulte Spermatogonien (SG) in Maus und Mensch pluripotent sind. Pluripotente Stammzellen sind von großer Wichtigkeit für Forschung und regenerative Medizin. Für letztere bieten diese Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, jede Körperzellen zu bilden, eine vielversprechende Möglichkeit, zerstörte Gewebe oder Organe zu ersetzen. In der Forschung stellen sie ein nützliches System dar, um Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse zu untersuchen, die in der physiologischen Situation z.B. der Embryonalentwicklung – schwer zugänglich sind. Eine wichtige Grundlage für diese Anwendungen sind jedoch Methoden, die die effiziente und gerichtete Differenzierung von Stammzellen in einen bestimmten Zelltyp erlauben. In dieser Arbeit wird zunächst das Differenzierungspotential von SG der Fischspezies Medaka (Oryzias latipes) untersucht, um festzustellen, ob Pluripotenz von SG, die bisher nur in Maus und Mensch gezeigt wurde, auch in anderen Wirbeltieren außerhalb der Säuger erhalten ist. Meine Ergebnisse zeigen, dass Medaka-SG fähig sind verschiedene somatische Zelltypen zu bilden. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Entwicklung einer Differenzierungsmethode, die nur auf der Expression einzelner so genannter Masterregulatoren (MR) beruht – Gene, die als essentiell für die Entwicklung bestimmter Zelltypen bekannt sind. Meine Ergebnisse zeigen, dass der Pigmentzell-spezifische Transkriptionsfaktor Mitf-M, von dem gezeigt wurde, dass er die Differenzierung von Medaka-ESZ in Pigmentzellen induzieren kann, die Bildung desselben Zelltyps in Medaka-SG induziert. Dieser Ansatz ermöglichte auch die Bildung anderer somatischer Zelltypen. So führte Überexpression der MR cbfa1 und mash1 in Medaka SG zur Differenzierung in Osteoblasten bzw. Neuronen. Interessanterweise wurde bei diesen Differenzierungsprozessen die Aktivierung von Genen beobachtet, die während der Embryonalentwicklung vor dem Differenzierung-auslösenden MR aktiviert werden. Weiterhin zeigen meine Ergebnisse, dass der Ansatz einer gerichteten Differenzierung, ausgelöst durch einzelne MR, auch auf Säuger-Stammzellen übertragen werden kann. So wurde durch Überexpression des neuronalen Genes ngn2 in murinen ESZ die effiziente und schnelle Bildung von Nervenzellen induziert, wobei auch hier die Aktivierung von Genen beobachtet wurde, deren Expression in der Embryogenese der von ngn2 vorangeht. Die Herstellung einer transgenen Zelllinie, in der die Überexpression von ngn2 aktiviert werden kann, erlaubte die Entstehung einer fast reinen Kultur funktionaler Neuronen. Der durch ngn2 ausgelöste Differenzierungsprozess war unabhängig von zusätzlichen Faktoren und lief sogar unter Bedingungen ab, die normalerweise den pluripotenten Zustand unterstützen. Außerdem führte Überexpression von ngn2 auch in IPS Zellen zur Bildung von Zellen mit neuronalem Phenotyp. Weiterhin konnte auch durch Transduktion des Ngn2-Proteins in murine ESZ neuronale Differenzierung ausgelöst werden, und zwar die Bildung neuronaler Vorläuferzellen. Zuletzt wird bewiesen, dass gerichtete Differenzierung von murinen ESZ durch einzelne MR Gene neben neuronalen Zelltypen auch die Bildung anderer somatischer Zellen erlaubt: Überexpression der Gene myoD oder cebpa induzierte die Differenzierung in Muskelzellen bzw. Macrophagen-ähnliche Zellen. Unter Verwendung transgener Zelllinien, die die Aktivierung jeweils eines MRs erlauben, war es möglich, gemischte Kulturen zu erhalten, in denen zwei verschiedene Differenzierungsprozesse parallel abliefen. Diese Studie zeigt, dass die Überexpression einzelner Gene ausreichend ist, um gerichtete Differenzierungsprozesse in einen bestimmten Zelltyp auszulösen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Ansatzes wird nicht nur mit verschiedenen Genen und somit verschiedenen resultierenden Zelltypen nachgewiesen, sondern auch in verschiedenen Stammzelltypen aus Fisch und Maus. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass bestimmte Gene in vitro das Schicksal von Stammzellen festlegen können und dass diese Fähigkeit eine konservierte Eigenschaft in Wirbeltieren zu sein scheint. Somit präsentiert diese Arbeit neuen Erkenntnisse über die Rolle von MR bei der Festlegung von Zellidentitäten und in Differenzierungsprozessen. Weiterhin wird eine neue Methode zur Induktion gerichteter Differenzierung in Stammzellen aufgezeigt, die mehrere Vorteile in Bezug auf Effizienz, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit hat. Auslösung von Differenzierung durch MR Gene bietet somit einen neuen vielversprechenden Ansatz mit potentieller Anwendung sowohl in Stammzellforschung, als auch in regenerativer Medizin.