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Fil: Muchut, Robertino José. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Euglena gracilis es un protista unicelular fotosintético capaz de crecer en condiciones auto-, hetero- y mixotróficas, sintetizando diversos bioproductos de interés, entre ellos el polisacárido de reserva paramilon, un beta-1,3-glucano, que presenta especial interés ya que se ha descripto como inmunoestimulante y bioactivo como antimicrobiano. En este contexto, se realizaron estudios en E. gracilis, relacionados a la partición del carbono en cuanto a la síntesis y degradación del paramilon. Abordando el análisis bioquímico de la UDP-glucosa pirofosforilasa (EC 2.7.7.9; UDP-Glc PPasa), la UDP-azúcar pirofosforilasa (EC 2.7.7.64; UDP-azúcar PPasa), la paramilon sintasa (EC 2.4.1.34; PS) y una beta-1,3-glucanasa de la familia de glicosil hidrolasa 17 (EC 3.2.1.39; GH17). Se caracterizaron los cultivos crecidos en diferentes condiciones evaluando la acumulación de paramilon. Se caracterizó en forma cinética, estructural y regulatoria a la UDP-Glc PPasa recombinante. Además de su funcionalidad in vivo mediante silenciamiento en la célula evaluándola conjuntamente a la UDP-azúcar PPasa. La PS, elonga el beta-1,3-glucano y al encontrarse anclada a la membrana que rodea al granulo de paramilon, se la utilizó en el diseño de una herramienta de marcación subcelular mediante anticuerpos policlonales. Para la degradación del paramilon influyen diferentes beta-1,3-glucanasas habiendo analizado la funcionalidad in vivo por silenciamiento de esta GH17. Además, la GH17 recombinante hidrolizó tanto el paramilon, como la laminarina siendo 3 veces menos eficiente por el primero. Así, los estudios in vitro se complementaron con análisis in vivo, permitiendo en conjunto aportar al conocimiento respecto al metabolismo del carbono en esta microalga fotosintética Euglena gracilis. Euglena gracilis is a photosynthetic unicellular protist, capable of growing under auto-, hetero- and mixotrophic conditions. E. gracilis can synthesize several bioproducts of interest including paramylon, a reserve polysaccharide. It is a beta-1,3-glucan, which has a special interest since it has been described as immunostimulant and bioactive as antimicrobial. Studies on E. gracilis, related to carbon partition in terms of synthesis and degradation of paramylon were executed. In this context, a biochemical analysis of UDP-glucose pyrophosphorylase (EC 2.7.7.9; UDP-Glc PPase), UDP-sugar pyrophosphorylase (EC 2.7.7.64; UDP-sugar PPase), paramylon synthase (EC 2.4.1.34; PS) and a beta-1,3-glucanase of the glycosyl hydrolase family 17 (EC 3.2.1.39; GH17) were carried out. E. gracilis cells grown under different conditions were characterized by assessing paramylon accumulation. The recombinant UDP-Glc PPase was characterized in a kinetic, structural and regulatory manner. On the other hand, functionality was analyzed in vivo by silencing. In addition, the functionality of the UDP-sugar PPase was analyzed together to UDP-Glc PPase. The PS, elongate the beta-1,3-glucan and as it is anchored to membrane surrounding paramylon granules. It was used in the design of a subcellular labeling tool using polyclonal antibodies. Different beta-1,3-glucanases influence paramylon degradation. Functionality, in vivo, GH17 was analyzed by silencing its translation. In addition, recombinant GH17 hydrolyzed both, paramylon and laminarin, being 3 times less efficient with first one. Thus, in vitro studies were complemented with in vivo analysis, allowing together to contribute on knowledge regarding carbon metabolism in this photosynthetic microalgae Euglena gracilis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Universidad Nacional del Litoral

Se evaluó el cambio en el comportamiento de las enzimas polifenoloxidasa (PFO) y beta-1,3-glucanasa (Glu) en tallos de plantas de clavel inoculadas con el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod) raza 2, con el fin de determinar su posible participación en la respuesta defensiva y en la resistencia de la planta al marchitamiento vascular. Se evaluaron parámetros para la extracción y determinación de actividad de dichas enzimas. Las condiciones que proporcionaron los mejores resultados de extracción fueron: obtención de polvos de acetona previa al tratamiento con buffer de fosfatos pH 6,5 con 3% de PVPP para PFO y con buffer de fosfatos pH 6,5 para Glu. La cuantificación de PFO se llevó a cabo usando catecol a pH 7,0 y 37 ºC y midiendo los productos de reacción a 420 nm, y la de Glu usando laminarina digitata a 37 ºC y pH 5,5. Una vez establecidos los métodos, esquejes de clavel de una variedad altamente tolerante (Carolina) y de una susceptible (Uconn) fueron inoculados con el patógeno y sometidos al análisis de las enzimas a diferentes tiempos post-inoculación. Mientras que en la variedad susceptible la actividad PFO no se vio afectada, en la tolerante se presentó una importante y significativa inducción de esta enzima a las 12 h y 24 h, indicando que puede desempeñar un papel clave en la defensa de la planta, en fenómenos metabólicos probablemente relacionados con lignificación y síntesis de fenólicos. La enzima Glu presentó inducción en ambas variedades, aunque a diferentes tiempos, lo cual hace parte de una respuesta metabólica inespecífica, no relacionada con mecanismos de defensa activa del clavel contra el patógeno causal del marchitamiento vascular. We evaluated the changes on the dynamics of polyphenoloxidase (PFO) and beta-1,3-glucanase (Glu) enzymes in carnation steems, which had been previously inoculated with the pathogen Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 (Fod). We established the experimental conditions in order to obtain the extract of the enzymes from the carnation steems with the aim to evaluate their enzymatic activity. The best results for PFO were obtained when acetone powder formation, before the extraction with phosphate buffer pH 6,5 aditionated with 3% PVPP, was used, and for Glu, phosphate buffer pH 6.5. The PFO activity quantification was done using catecol at pH 7.0, 37 ºC and measuring the products on 420 nm and, for Glu activity using “laminarina digitata” at 37 ºC and pH 5.5. Then, carnation’s cutting from a highly tolerant variety (Carolina) and a susceptible (Uconn) to Fod race 2, were inoculated with the pathogen, then submitted to the enzymes analysis at different post-inoculation time-lapses. For the susceptible variety, the PFO activity was not affected, whereas in the highly illness resistant variety, there was an important inducement 12 h and 24 h post-inoculation, meaning that this enzyme could be playing a significant rol in the defense response, in metabolisms related with the lignification and synthesis of phenolic precursors. Alternatively, the Glu enzyme showed activity inducement in both varieties which seems to comprise a fraction of a non-specific response, uncorrelated with the active defense mechanisms of the carnation against this pathogen.