Search

National audience

La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatives. Sa production est associée à différentes pathologies, dont le développement de cancers. Un lien de causalité a été établi entre dommages à l’ADN, mutagénèse et cancérogenèse. Or, différentes études ont classé CDT dans la famille des génotoxines bactériennes. L’action génotoxique de CDT repose sur l’activité de sa sous-unité catalytique CdtB, connue pour induire des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN génomique eucaryote. Cependant, des travaux de l’équipe ont montré qu’à des doses 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans la littérature, CDT induit des dommages primaires (probablement de type cassure simple-brin), qui dégénèrent en CDB lors de la phase S. Afin de mieux documenter ce modèle, nous avons étudié ici les systèmes de réparation impliqués dans la réponse aux dommages à l’ADN induits par CDT. Nous avons ainsi confirmé l’importance des voies de réparations des CDBs (Homologous Recombinaison et Non-Homologous End-Joining). Nous avons également montré que le Nucleotide Excision Repair, impliqué dans la réparation des adduits à l’ADN, n’est pas impliqué dans la prise en charge des dommages induits par CDT. En revanche, nous avons démontré, pour la première fois, l’implication de systèmes de réparation de dommages plus précoces, comme le Single-Strand Break Repair et la voie de l’Anémie de Fanconi. Pour finir, afin de mieux caractériser ces dommages et leur induction, nous avons initié des travaux visant à étudier, in vitro, l’activité catalytique de CdtB. Dans ce but, différents mutants catalytiques ont été générés, purifiés, et leur activité nucléase a été testée. Une activité nucléase similaire entre les CdtB sauvages et mutantes a été obtenue lors d’un test in vitro (digestion d’un plasmide super-enroulé). Cependant, un test cellulaire (expression nucléaire en cellules eucaryotes de la sous-unité CdtB sauvage ou mutante) indique bien la perte de l’activité nucléase de la sous-unité mutante. Nos résultats montrent donc l’importance de tester les différentes sous-unités dans différents contextes. En conclusion, notre travail conforte les données selon lesquelles CDT induit des CSB, et non des CDB directes de l’ADN. De plus, notre travail a permis d’éclaircir les processus cellulaires activés dans la cellule hôte, suite aux dommages à l’ADN induits par CDT.

La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatives. Sa production est associée à différentes pathologies, dont le développement de cancers. Un lien de causalité a été établi entre dommages à l’ADN, mutagénèse et cancérogenèse. Or, différentes études ont classé CDT dans la famille des génotoxines bactériennes. L’action génotoxique de CDT repose sur l’activité de sa sous-unité catalytique CdtB, connue pour induire des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN génomique eucaryote. Cependant, des travaux de l’équipe ont montré qu’à des doses 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans la littérature, CDT induit des dommages primaires (probablement de type cassure simple-brin), qui dégénèrent en CDB lors de la phase S. Afin de mieux documenter ce modèle, nous avons étudié ici les systèmes de réparation impliqués dans la réponse aux dommages à l’ADN induits par CDT. Nous avons ainsi confirmé l’importance des voies de réparations des CDBs (Homologous Recombinaison et Non-Homologous End-Joining). Nous avons également montré que le Nucleotide Excision Repair, impliqué dans la réparation des adduits à l’ADN, n’est pas impliqué dans la prise en charge des dommages induits par CDT. En revanche, nous avons démontré, pour la première fois, l’implication de systèmes de réparation de dommages plus précoces, comme le Single-Strand Break Repair et la voie de l’Anémie de Fanconi. Pour finir, afin de mieux caractériser ces dommages et leur induction, nous avons initié des travaux visant à étudier, in vitro, l’activité catalytique de CdtB. Dans ce but, différents mutants catalytiques ont été générés, purifiés, et leur activité nucléase a été testée. Une activité nucléase similaire entre les CdtB sauvages et mutantes a été obtenue lors d’un test in vitro (digestion d’un plasmide super-enroulé). Cependant, un test cellulaire (expression nucléaire en cellules eucaryotes de la sous-unité CdtB sauvage ou mutante) indique bien la perte de l’activité nucléase de la sous-unité mutante. Nos résultats montrent donc l’importance de tester les différentes sous-unités dans différents contextes. En conclusion, notre travail conforte les données selon lesquelles CDT induit des CSB, et non des CDB directes de l’ADN. De plus, notre travail a permis d’éclaircir les processus cellulaires activés dans la cellule hôte, suite aux dommages à l’ADN induits par CDT.

International audience; The Cytolethal Distending Toxin (CDT) is produced by many pathogenic gram-negative bacteria and its production has been associated to various diseases, including tumorigenesis. The CDT-related pathogenicity relies on the action of the catalytic subunit CdtB, which has been shown to induce double-strand breaks (DSB) on the host cell DNA. Different studies pointed out the importance of DSB repair mechanisms for cells to survive CDT, emphasizing on the homologous recombination repair pathway. Previously, we reported that another type of DNA lesion precede DSB formation through replicative stress. Since various repair pathways allow cells to respond different type of DNA damage, we speculated that non-DSB repair mechanisms might contribute to the cellular resistance to CDT-mediated genotoxicity. To address this question, we use an innovative proliferation assay, on human cell lines depleted in the major DNA repair pathways. Firstly, we confirm that homologous recombination is involved in the management of CDT-induced lesions, but also of Non Homologous End Joining, the second major DSB repair mechanism. Next, we show that nucleotide excision repair is not important to take care of CDT-induced damage, whereas base excision repair (BER) impairment sensitize CDT-treated cells, suggesting that CDT induce single-strand breaks or base modifications. Finally, we demonstrate for the first time the involvement and the activation of the Fanconi Anemia repair pathway in response to CDT. In conclusion, our work supports that CDT-induced damage are plurals and involve different repair pathways. This reinforces a model where CDT induces base damage and underlines the importance of cell proliferation to generate DNA double-strand break damage.

National audience

National audience

International audience

National audience; The Cytolethal Distending Toxin (CDT) is a virulence factor produced by many pathogenic bacteria like Escherichia coli, Salmonella typhi, etc. The CDT production allows bacteria to persistently colonize the body and to evade the immune system. Moreover, the production of CDT by Helicobacter hepaticus leads to the development of pre-cancerous lesions liver, in a rat model. It is essential to understand effects of CDT on our body and so characterize the effect of CDT on eukaryotic cells. Into cells, CDT induces DNA double-stranded breaks (DSB), leading to a block of the proliferation and to cell death. However, we have shown that at doses 1000 times lower than those used in the literature, CDT induces single-strand breaks, and after replication, this damages will degenerate into DSB. The importance of the replication passage suggests that proliferating cells are more sensitive to CDT than quiescent cells. Some bacteria producing CDT colonize the intestinal epithelium, where some cells proliferate a lot. This raises the question of the involvement of CDT in the carcinogenesis of this epithelium. To better characterize the effect of CDT on our DNA and especially during replication, we are studying the catalytic activity of CDT and its interaction with the DNA.

International audience; The Cytolethal Distending Toxin (CDT) is a virulence factor produced by many pathogenic bacteria like E. coli, H. hepaticus, H. ducreyi etc. The CDT Production allows bacteria to persistently colonize the body, evade the immune system, induce inflammation and trigger genetic instability. In fact, CDT induces DNA double-stranded breaks (DSB), leading to cell cycle arrest and to cytotoxicity, associated with a characteristic cellular distension. Our objectives are to characterize the type of DNA damage induced by CDT and study the cell sensitivity to different CDT doses, with the cell cycle as read-out. Thanks to comet assay and immunofluorescence, we have shown that at doses 1000 times lower than those used in the literature, CDT induces multiple single-strand breaks. When cells are going through S phase, a replicative stress is induced and DNA damage degenerate into DSB. Indeed, with a PCNA marker, we observed a S phase slowing down and an increase of the number of cells in late S-phase. Moreover, these CDT-induced DNA damage cause the activation of the pathway involving the RPA, ATR and CHK1 proteins, characteristics of a replicative stress. Finally, the activation of the ATM pathway, due to DSB induction, happens later after the CDT treatment. Therefore, the importance of the S-phase passage for the CDT cytotoxicity suggests that proliferating cells are more sensitive to CDT than quiescent cells. Another part of our project is to better characterize the CDT catalytic activity. As CdtB, the catalitic sub-unit of CDT, display DNase and phosphatase activities, we are developing specific mutants to dissociate these activities. The experiments are progressing and the results will be presented. Our work underlines the complex mechanism of CDT action. It will help in the characterization of CDT-expressing bacteria and may open new therapeutic approaches, for example by targeting the mechanisms of associated genotoxicity.

National audience; La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes (Escherichia coli, Helicobacter hepaticus, Haemophilus ducreyi, etc)) colonisant la cavité buccale, le tractus intestinal, le foie etc. La présence de bactéries produisant des génotoxines dans la flore intestinale, comme E. coli, pourrait représenter un facteur prédisposant au développement de cancer, dont celui du côlon, responsable de 500 000 décès par an dans le monde. La toxine CDT a été découverte à partir d’isolats cliniques de patients souffrant de diarrhées causées par une infection à Escherichia coli (Johnson and Lior., 1988) Plusieurs études ont montré que la toxine CDT est un facteur de virulence, jouant un rôle dans la pathogénicité des bactéries qui la produisent (Ge et al., 2008). En effet, la toxine CDT est essentielle pour que Helicobacter hepaticus et Campilobacter jejuni colonisent durablement le système gastro-intestinal et puissent induire une inflammation sévère des muqueuses ou du foie, dans un modèle murin. De plus, dans un modèle murin immunocompétent, l’expression de CDT par H. hepaticus stimule le développement d’infections hépatiques et l’apparition de nodules dysplasiques hépatiques (Ge et al., 2007). Compte tenu du rôle de CDT dans la pathogénicité des bactéries qui la produisent, il est donc fondamental de caractériser précisément le mécanisme d’action de cette toxine sur les cellules eucaryotes. Dans la littérature, il a été caractérisé que CDT induit des cassures double-brin (CDB) de l’ADN, conduisant à un arrêt du cycle cellulaire en G1/S ou G2/M, une activation des systèmes de réparation de l’ADN, une inhibition de la prolifération et une augmentation de la mort des cellules par apoptose. CDT agit donc comme une génotoxine et une cyclomoduline. Afin de protéger l’intégrité de leur génome, les cellules eucaryotes possèdent des mécanismes de détection et de signalisation des dommages à l’ADN. L’induction de dommages à l’ADN par la toxine CDT entraîne une cascade de signalisation similaire à celle activée en réponse aux irradiations. En effet, la voie de réponse aux CDB dépendante des kinases ATM et CHK2 est activée (Alaoui-El-Azher et al., 2010 ; pour revue, Jinadasa et al., 2011). Cependant, nous avons montré qu’à des doses 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans la littérature, CDT induit des cassures simple-brins multiples qui, lors de la réplication, induisent un stress réplicatif avant de dégénérer en CDB. Ces dommages entraînent une activation de la voie impliquant les protéines RPA, ATR, et CHK1, caractéristiques d’un stress réplicatif, avant une activation de la voie ATM. En se basant sur ces résultats, nos futurs objectifs seront 1- de caractériser la sensibilité des cellules en fonction des différentes phases du cycle cellulaire, 2- de définir les dommages induits ainsi que 3- définir le(s) mécanisme(s) de réparation(s) impliqué(s) dans la prise en charge de ces dommages.