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Les canaux HCN (cycliques nucléotidiques) activés par hyperpolarisation appartiennent à la superfamille des canaux cationiques voltage-dépendants et sont responsables de la génération de courant drôle (If) dans les cellules cardiaques et neuronales. Malgré la similitude structurelle globale avec le potassium voltage-dépendant (Kv) et les canaux ioniques cycliques nucléotidiques (CNG), ils montrent un modèle de sélectivité distinctif pour les ions K+ et Na+. Plus précisément, leur perméabilité accrue aux ions Na+ est essentielle à son rôle dans la dépolarisation des membranes cellulaires. Ils sont également l'une des seules protéines connues à sélectionner entre les ions Na+ et Li+, faisant des HCN des canaux semi-sélectifs. Ici, nous étudions les propriétés de sélectivité uniques des canaux HCN à l'aide de simulations de dynamique moléculaire. Nos simulations suggèrent que le pore HCN1 est très flexible et dilaté par rapport aux canaux Kv et qu'il n'y a qu'un seul site de liaison ionique stable dans le filtre de sélectivité qui les distingue des canaux Kv et CNG. Nous observons également que la coordination et l'hydratation des ions diffèrent dans le filtre de sélectivité de HCN1 par rapport aux canaux Kv et CNG. De plus, la coordination des ions K+ par les groupes carbonyle du filtre de sélectivité est plus stable par rapport aux ions Na+ et Li+, ce qui peut expliquer les propriétés de sélectivité distinctes du canal., Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels belong to the voltage-gated cation channel superfamily and are responsible for the generation of funny current (If) in cardiac and neuronal cells. Despite the overall structural similarity to voltage-gated potassium (Kv) and cyclic nucleotide-gated (CNG) ion channels, they show distinctive selectivity pattern for K+ and Na+ ions. Specifically, their increased permeability to Na+ ions is critical to its role in depolarizing cellular membranes. They are also one of the only known proteins to select between Na+ and Li+ ions, making HCNs semi-selective channels. Here we investigate the unique selectivity properties of HCN channels using molecular dynamics simulations. Our simulations suggest that the HCN1 pore is very flexible and dilatated compared to Kv channels and that there is only one stable ion binding site within the selectivity filter which discriminates them from both Kv and CNG channels. We also observe that ion co-ordination and hydration differ within the selectivity filter of HCN1 compared to Kv and CNG channels. Additionally, the co-ordination of K+ ions by the carbonyl groups of the selectivity filter is more stable compared to Na+ and Li+ ions, which may explain the channel's distinct selectivity properties.

Pediculus humanus corporis est un ectoparasite humain transmettant respectivement le Rickettsia prowazeki, le Bartonella quintana et le Borrelia recurrentis, responsables respectivement du typhus épidémique, de la fièvre du tronc et de la fièvre récurrente. Malgré les multiples traitements disponibles, l'infestation est répandue dans le monde en raison de l'utilisation incorrecte des pédiculicides et du développement des résistances.Les canaux ioniques ligands-dépendants jouent un rôle essentiel dans la transmission synaptique du système nerveux central et la jonction neuromusculaire chez les insectes et représentent donc les principales cibles pour le développement de nouvelles molécules à visée pharmacologiques. De nombreux gènes codant pour les récepteurs synaptiques tels que l'acide γ-aminobutyrique (GABA) et le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (nAchR) ont été identifiés dans les bases de données génomiques de Pediculus humanus, suggérant leur existence chez les poux. Afin de les caractériser plus précisément, notre stratégie a consiste d'abord à identifier tous les transcrits de ces récepteurs afin de cloner les transcripts les plus représentatifs puis de tester leurs fonctionnalités en utilisant l’oeuf de Xénope.En utilisant la RACE-PCR, nous avons identifié de nombreux sites de transcription (TSS) ainsi que des extrémités 3' pour la sous-unité GRD du récepteur (GABA), suggérant l’existence de multiples transcrits codant pour ce récepteur. De plus, les analyses des séquences ont révélé des séquences de transcripts différentes de celle présentes dans les banques de données ainsi que des erreurs dans l'annotation du génome de Pediculus humanus corporis. La même technique a été utilisée pour identifier les extrémités des transcripts des sous-unités nAChR, mais pour le moment, nous n’avons pas été en mesure de cloner l’extrémité 5 'de ces transcripts, en raison d’amplifications non spécifiques. Seule une extrémité 3 'unique pour les sous-unités nAchR α1 et α4 ont été clonées jusqu'à présent, tandis que pour les sous-unités nAchR α5 et α7 ni l'extrémité 3' ni l'extrémité 5 'ont été obtenues suggérant une expression faible ou inexistante de ces gènes.Globalement, l’ensemble de ces travaux à terme, permettront d'élaborer de nouvelles stratégies pour rendre les pédiculicides plus efficaces et moins nocifs pour l'homme et l'environnement.

Parascaris sp. is the largest parasitic nematode of horse causing digestive and respiratory disorders to the animal. The control of equine ascaridiosis relies on anthelmintic treatments including macrocyclic lactones (MLs) as the gold standard. However, control of infestation is increasingly difficult due to the emergence of resistant parasites throughout the world. In the free-living model nematode Caenorhabditis elegans, glutamate-dependent chloride channel receptors (GluCls) were identified as the main targets of MLs. However, in Parascaris sp, the mode of action of MLs remain poorly understood. Here we identified the Parascaris sp. GluCls and characterized the effect of a wide range of MLs. Using a candidate gene approach, we identified the orthologs of 6 genes encoding GluCls subunits in Parascaris sp. The complete cDNAs encoding these subunits were amplified by PCR and cloned into a transcription vector. The corresponding cRNAs were synthesized in vitro and then microinjected into Xenopus laevis oocytes. Two-electrode voltage-clamp experiments were performed on recombinant GluCls to investigate their pharmacological properties. Thus, the expression of a single subunit and combination of different subunits in Xenopus oocytes allowed us to obtain the functional homeric and heteromeric GluCls of Parascaris sp. The receptors were both sensitive to glutamate and ivermectin but the effect of seven different ML compounds revealed striking differences. The physiological function and the impact of MLs on these receptors in vivo are in progress. This study, provides a better understanding of the pharmacology of GluCls as well as the mode of action of MLs in nematode parasites.

Ticks are strict blood-feeding arthropods (Acari), which represent a major health issue for wild or domesticated animals and humans, due to their potential to transmit disease agents. Control of ticks is increasingly difficult due to the development of drug-resistant parasites. Ligand-gated ion channels of the tick central nervous system are the primary targets of acaricides. Among those receptors, the γ-aminobutyric acid-gated chloride ion channels (GABACls) are the main synaptic inhibitory receptors. Lotilaner is a recently developed parasiticide from the isoxazoline chemical class that was shown to be a non-competitive antagonist of GABACls from the livestock tick Rhipicephalus microplus. In the present study, we characterized the GABACls from the European tick species Ixodes ricinus. We extracted RNAs from Ixodes ricinus nymphs. Taking advantage of the phylogenetic closeness of I. ricinus and R. microplus in the Arthropoda phylum, we identified the I. ricinus GABACl subunit homologue. The cDNA encoding the Iri- GABACl was cloned and the corresponding in vitro synthesized cRNAs were micro-injected into Xenopus laevis oocytes to investigate its pharmacological properties. Functional expression and two-electrode voltage clamp studies demonstrated that the GABACl subunit formed a homomeric receptor gated by GABA. Importantly, the insecticides like lotilaner, fipronil and picrotoxin efficiently blocked the GABA currents as previously observed for the R. microplus GABACl. Surprisingly, I. ricinus GABACl was not sensitive to the pesticide dieldrin, suggesting a potential naturally existing resistance mechanism involving alternative exons. Here we report the functional characterization of the first GABACl of I. ricinus demonstrating that it is an important molecular target for lotilaner. Transcriptomic analysis of I. ricinus are in progress to identify new acaricidal targets.

Drug resistance in the parasites field, including the cosmopolitan lice (Pediculus humanus), and the prevalence increasing despite the marketing of new therapies are an important challenge for our societies. The major pharmacological targets of insecticides like pyrethrins, malathion, spinosad and ivermectin (also used as nematicide and acaricide) are the ligand gated ion channels present in the nervous system of insects. Currently, targets of these molecules remain largely unknown in body lice. Among those channels receptors, γ-aminobutyric acid gated chloride ion channels (GABACl) are the main synaptic inhibitory receptors in insects, making them pertinent pharmacological targets. In the present study, we identified and characterized the targets of insecticides in lice to decipher the mode of action of insecticides in Pediculidae. Research in the genomic databases of Pediculus humanus allowed us to identify a GABACl subunit encoded by the Resistance to dieldrin (Rdl) gene. We cloned the corresponding full-length cDNA into a transcription vector and performed in vitro synthesis of the cRNAs, which were injected in the Xenopus oocysts system to reconstitute functional channels. Two-electrode voltage clamp recordings showed that Phh-RDL assemble into a homomeric receptor sensitive to different insecticides like fipronil, picrotoxin and lotilaner, a novel class of ectoparasiticide agent using to treat ticks and fleas of dogs (CredelioTM, Elanco). These results correlated with the efficacy of these drugs on lice in vivo. In conclusion, we report the functional characterization of the first GABACl of Pediculus humanus humanus. These results contribute to our understanding of the mode of action of insecticide compounds and will allow the development of new therapeutic strategies to control lice infestations.

International audience; In insects, δ-aminobutyric acid (GABA) is the major inhibitory neurotransmitter, and GABA-gated ion channels are the target of different classes of insecticides, including fipronil. We report here the cloning of six subunits (four RDL, one LCCH3, and one GRD) that constitute the repertoire of the GABA-gated ion channel family of the Varroa mite (Varroa destructor), a honey bee ectoparasite. We also isolated a truncated GRD subunit with a premature stop codon. We found that when expressed in Xenopus laevis oocytes, three of the four RDL subunits (VdesRDL1, VdesRDL2, and VdesRDL3) formed functional, homomultimeric anionic receptors, whereas GRD and LCCH3 produced heteromultimeric cationic receptors. These receptors displayed specific sensitivities toward GABA and fipronil, and VdesRDL1 was the most resistant to the insecticide. We identified specific residues in the VdesRDL1 pore-lining region that explain its high resistance to fipronil. VdesRDL4 did not form a functional receptor when expressed alone, but it assembled with VdesRDL1 to form a heteromultimeric receptor with properties distinct from those of the VdesRDL1 homomultimeric receptor. Moreover, VdesRDL1 physically interacted with VdesRDL3, generating a heteromultimeric receptor combining properties of both subunits. On the other hand, we did not detect any functional interaction between VdesLCCH3 and the VdesRDL subunits, an observation that differed from what was previously reported for Drosophila melanogaster. In conclusion, this study provides insights relevant to improve our understanding of the precise role of GABAergic signaling in insects and new tools for the development of Varroa mite–specific insecticidal agents that do not harm honey bees.

Ionotropic glutamate receptors are responsible for the vast majority of fast excitatory neurotransmission in the central nervous system. Among them, NMDA receptors (NMDARs) are key mediators of synaptic plasticity, which is considered as the cellular basis of learning and memory. NMDAR dysfunction is implicated in numerous neurological and psychiatric brain disorders such as Alzheimer and Parkinson’s disease, epilepsy and schizophrenia. NMDAR form massive hetero tetrameric complexes (>500 kDa) endowed with unique allosteric capacity provided by a cluster of eight extracellular clamshell-like domains arranged as two superimposed layers: the Nterminal domain (NTD) layer and the agonist binding domain (ABD) layer. Despite an increasing number of full-length NMDAR structures, the transduction mechanism by which these domains interact in an intact receptor to control its activity remained poorly understood. Combining experimental and in silico analysis, we identify a rolling motion at an interface between the two constitute dimers in the ABD layer as a key determinant in NMDAR activation and modulation pathways. This rotation of the two ABD dimers acts as a conformational switch that tunes channel opening depending on the conformation of the membrane-distal NTD layer. This work unveils how NMDAR domains move and operate in a concerted manner to transduce conformational changes between layers and command receptor activity. It illuminates our understanding of a major synaptic receptor of the central nervous system and paves the way for the development of new pharmacological tools targeting the elucidated allosteric mechanism.; Les récepteurs ionotropiques du glutamate sont responsables de la vaste majorité de la neurotransmission excitatrice rapide dans le système nerveux central. Parmi eux, les récepteurs NMDA (rNMDA) sont les médiateurs de la plasticité synaptique, fondement cellulaire des processus d’apprentissage et de mémoire. Leurs dysfonctionnements sont impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques comme les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, l’épilepsie et la schizophrénie. Les rNMDA forment des complexes hétérotétramériques massifs (>500 kDa) dotés de propriétés allostériques uniques grâce à un ensemble de 8 domaines extracellulaires bilobés organisé en deux strates superposées : la couche de domaines N-terminaux (NTD) et la couche de domaines de liaison de l’agoniste (ABD). Malgré un nombre croissant de structures complètes de rNMDA, le mécanisme de transduction permettant aux interactions entre ces domaines de contrôler l’activité du récepteur restait inconnu. En combinant analyse expérimentale et computationnelle, nous montrons qu’un mouvement de roulis à l’interface entre les deux dimères de la couche d’ABD est un déterminant clé du processus d’activation et de modulation des rNMDA. Cette rotation des deux dimères d’ABD constitue un commutateur conformationnel qui règle l’ouverture du canal en fonction de la conformation des NTD situés à l’opposé. Ce travail révèle comment des changements conformationnels concertés entre couches de domaines gouvernent l’activité des rNMDA. Il illumine notre compréhension d’un récepteur synaptique majeur du système nerveux central et ouvre la voie à la conception de nouveaux agents pharmacologiques ciblant le mécanisme allostérique élucidé.

Metaflumizone is the latest addition to the armamentarium of the Na+ channel inhibitor insecticide family. We used the Xenopus oocyte expression system and a Markovian model to assess the effect of metaflumizone on Apis mellifera Na+ channels (AmNaV 1). Our results reveal that metaflumizone inhibits AmNaV 1 channels by targeting the kinetics of recovery from slow inactivation. Multistate modeling of fast and slow inactivation of the AmNaV 1 channel made it possible to study the effects of metaflumizone on a set of rate constants underlying the transition between the open and inactivated conformations and provided insights into their specificity. We conclude that the methods we used could be extended to assessing the toxicity of other Na+ channel inhibitor insecticides.

Au cours de leur activité de butinage, les abeilles sont soumises au contact de nombreux polluants dont les produits phytopharmaceutiques ou pesticides. Les pesticides peuvent induire des effets létaux ou des effets sublétaux délétères qui compromettent la survie des colonies d’abeilles. La caractérisation des effets des pesticides peut s’effectuer a priori, c’est à dire dans un cadre règlementaire avant homologation du produits phytopharmaceutique, soit a posteriori, c’est dire dans le cadre de recherches développées après homologation. Cependant, le cadre réglementaire est marqué par une carence en méthodes toxicologiques validées et reconnues pour évaluer ou prédire la toxicité des pesticides pour les abeilles. Le développement de telles méthodes nécessite de connaître au mieux la physiologie des abeilles et de savoir caractériser les effets délétères. Deux exemples sont ici traités pour illustrer le développement de méthodes d’évaluation de la toxicité en se fondant sur des travaux de recherche fondamentaux sur la neurotoxicité et la reprotoxicité des pesticides.

Pollination is important for both agriculture and biodiversity. For a significant number of plants, this process is highly and sometimes exclusively, dependent on the pollination activity of honeybees. The large numbers of honeybee colony losses reported in recent years have been attributed to colony collapse disorder. Various hypotheses, including pesticide overuse, have been suggested to explain the disorder. Using the Xenopus oocytes expression system and two microelectrode voltage-clamp, we report the functional expression and the molecular, biophysical and pharmacological characterization of the western honeybee’s sodium channel (Apis Mellifera NaV1). The NaV1 channel is the primary target for pyrethroid insecticides in insect pests. We further report that the honeybee’s channel is also sensitive to permethrin and fenvalerate, respectively type I and type II pyrethroid insecticides. Molecular docking of these insecticides revealed a binding site that is similar to sites previously identified in other insects. We describe in vitro and in silico tools that can be used to test chemical compounds. Our findings could be used to assess the risks that current and next generation pesticides pose to honeybee populations.

Le canal calcique dépendant du voltage de type-T CaV3.2 joue un rôle important dans l’excitabilité neuronale et dans la perception de la douleur. Le canal CaV3.2 partage une grande homologie structurale et fonctionnelle avec les canaux NaV. Ces deux types de canaux sont activés par de faibles dépolarisations membranaires et possèdent des cinétiques de temps d’activation et d’inactivation plus rapides que les canaux CaV de type-L. Les structures cristallines à haute résolution des canaux bactériens NaVAb (Payandeh et al. 2011; Payandeh et al. 2012) et NaVRh (Zhang et al. 2012) suggèrent que l’hélice amphiphile S4S5 du domaine II peut être couplée avec les résidus de l’hélice S6 dans le domaine II ainsi qu’avec des résidus de l’hélice homologue dans le domaine adjacent, soit le domaine III, et ce, durant l’activation du canal. Pour déterminer les résidus fonctionnellement couplés, durant l’activation du canal CaV3.2, une analyse cyclique de doubles mutants a été effectuée par substitution en glycine et alanine des résidus clés entre l’hélice S4S5 du domaine II et le segment S6 des domaines II et III. Les propriétés biophysiques ont été mesurées à l’aide de la technique de « cut-open » sur les ovocytes. Les énergies d’activation ont été mesurées pour 47 mutations ponctuelles et pour 14 paires de mutants. De grandes énergies de couplage (ΔΔGinteract > 2 kcal mol-1) ont été observées pour 3 paires de mutants introduites dans les IIS4S5/IIS6 et IIS4S5/IIIS6. Aucun couplage significatif n’a été observé entre le IIS4S5 et le IVS6. Nos résultats semblent démontrer que les hélices S4S5 et S6 provenant de deux domaines voisins sont couplées durant l’activation du canal calcique de type-T CaV3.2., Voltage-activated T-type calcium channel CaV3.2 plays an important role in neuronal excitability and in pain perception. CaV3.2 channel bears a strong structural and functional homology with voltage-dependent NaV channels. In particular, these channels are activated by relatively small depolarization and display faster activation and inactivation kinetics than the L-type CaV channel. High-resolution crystal structures of bacterial NaVAb (Payandeh et al. 2011; Payandeh et al. 2012) and NaVRh (Zhang et al. 2012) suggest that the amphiphilic helix S4S5 in Domain II may be coupled with S6 residues both in Domain II and in the adjacent Domain III during channel activation.To determine whether residues in the S4S5 helix of Domain II are functionally coupled with residues in the S6 helix in Domain II and Domain III during the voltage-dependent activation of CaV3.2, a double mutant cycle analysis was performed by introducing pairs of glycine and alanine residues in the S4S5 helix of Domain II and the S6 region of Domains II and III. Biophysical properties were measured with the cut-open oocyte technique. Activation gating was measured for 47 single mutants and 14 pairs of mutants. Strong coupling energies (ΔΔGinteract > 2 kcal mol-1) were reported for 3 pairs of mutants introduced in IIS4S5/IIS6 and IIS4S5/IIIS6. No significant coupling was observed between IIS4S5 and IVS6. Altogether, our results demonstrate that the S4S5 and S6 helices from neighboring domains are energetically coupled during the activation of the low voltage-gated T-type CaV3.2 channel.

Des pompes et des canaux ioniques contrôlant la turgescence cellulaire assurent une capacité de mouvement chez les plantes. Journée de la Société de Biologie de Montpellier : "Le mouvement dans tous ses états"

Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal., Voltage-gated potassium channels are formed of four subunits, each one with six transmembrane segments (S1-S6) and a loop (p-loop) between S5 and S6 at the level of the pore. It is known that the voltage sensitive segment (S1-S4) undergoes a movement upon membrane potential changes. To open the channel, it is necessary to transfer the energy of the voltage sensor (generated by the displacement of the positive charges of S4) to the pore. The exact mechanism of this “electromechanical coupling” is still under investigation. The voltage sensor and pore are physically linked by the S4-S5 linker (S45L). The aim of this study is to determine the influence of S45L flexibility on the coupling process. In the S45L, three glycines are distributed at different positions and are responsible for the flexibility of the alpha-helix. These glycines (but not their exact position) are conserved within the potassium voltage-gated ion channels. The glycines were each replaced by an alanine using point mutagenesis. In a second step, a proline was introduced at the position in order to introduce a break in the helix. To study the behaviour of channels in this new conformation, we used the patch clamp technique to determine the effects during the pore opening (ionic current). With the cut-open voltage-clamp we determined the effects on voltage sensor movement (gating current) as well as the temporal correlation with the pore opening (ionic current). The data showed that when the flexibility of the S45L is reduced, the channel needs more energy to open. Exchange with proline suggests that the movement of the sensor is independent of pore opening.

Les canaux calciques dépendants du voltage CaV font partie de la famille structurale des canaux ioniques à 6 segments transmembranaires. Tout comme les canaux potassiques Kv, les canaux CaV possèdent une série de résidus chargés dans l’hélice S4 de chaque domaine ou sous-unité qui conférerait à la protéine une sensibilité aux changements de voltage. De plus les hélices S6 tapissent la paroi du pore et forment la porte d’activation de la protéine. Comment le mouvement des hélices S4 se traduit par l’ouverture de la porte d’activation des hélices S6 demeure une question encore non résolue. Suite à la publication de la structure cristalline du canal Kv1.2 en 2005, le groupe de MacKinnon a proposé que le mouvement des hélices S4 est mécaniquement couplé à la porte d’activation S6 à travers le glissement de l’hélice amphiphile S4-S5 selon un mécanisme nommé couplage électromécanique (Long et al. 2005b). Dans le but de déterminer si la région S4-S5 joue un rôle dans l’activation du canal calcique CaV2.3, nous avons étudié, par la méthode d’analyse cyclique de mutations doubles (« Double Mutant Cycle Analysis », (Horovitz 1996)), le couplage entre la boucle S4-S5 et l’hélice S6 du domaine II de ce canal. Les mesures d’énergies d’activation, ΔGact, obtenues en présence des sous-unités auxiliaires CaVα2δ et CaVβ3 ont affiché un couplage significatif pour l’activation entre les paires de résidus V593G/L699G, V593G/A700G, V593G/A702G, S595G/V703G L596G/L699G, L596G/A700G, L596G/I701G, L596G/A702G, L596G/V703G, L596G/D704G, M597G/I701G, et S602G/I701G. Aucune de ces paires de résidus n’a affiché de couplage lors de l’inactivation, suggérant que les effets observés sont spécifiques au mécanisme d’activation. Mis ensemble, ces résultats suggèrent que la boucle IIS4-S5 et l’hélice IIS6 interagissent et jouent un rôle déterminant dans l’activation de CaV2.3., Voltage dependent calcium channels share a strong structural homology with voltage gated potassium channels. Both families present a conserved series of charged residues present in the S4 helix of each domain that most certainly accounts for the voltage sensitivity of these proteins. Moreover, in both cases, the S6 helices seem to be lining up the pore. How does the movement of the S4 sensors translate into channel opening remains elusive in Ca2+ channels. Following the publication of the crystal structure of the Kv1.2 channel in 2005, the group of Roderick MacKinnon proposed that the voltage sensor is mechanically coupled to the S6 pore through the amphipathic S4-S5 helix that crosses over the S6 inner helix from the same subunit. To determine if the S4-S5 linker, that runs parallel to the membrane plane inside the cell in the Kv1.2 three-D structure, plays a role in the activation of the CaV2.3 calcium channel, we have studied by double mutant cycle analysis the coupling between the S4-S5 linker and the S6 helix of domain II of this channel. The activation energies, Gact, obtained from classical two electrode voltage clamp experiments in the presence of auxiliary subunits CaV2 and CaV3 displayed significant activation coupling coefficients for the pairs of residues V593G/L699G, V593G/A700G, V593G/A702G, S595G/V703G L596G/L699G, L596G/A700G, L596G/I701G, L596G/A702G, L596G/V703G, L596G/D704G, M597G/I701G, and S602G/I701G. None of these pairs displayed significant coupling in the inactivation mechanism, suggesting that the effects observed were specific to activation. Altogether, our results strongly suggest that the S4-S5 linker and the S6 helix of domain II are actively involved in the activation of CaV2.3.

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane., The L-type calcium channel, Cav1.2, plays an important role in the excitation-contraction coupling of the ventricular myocytes. It has been shown that the alternative splicing of Cavα1.2 subunit could lead to a truncated protein in the C-terminus at exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). Many groups have studied deletions in the C-terminus (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). The currents, measured in the whole cell configuration, were significantly higher with the full-length channel. We chose to test some of these deletions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) in the presence or absence of the Cavβ3 auxiliary subunit which is likely to interact with the C-terminus of the Cavα1.2 subunit through its SH3 domain (Lao, Kobrinsky et al. 2008). The truncated Cavα1.2 subunit, expressed in Xenopus Oocytes, showed macroscopic currents that were greater than those of the full length channel in presence of the Cavβ3 subunit. In addition, the truncated Cavα1.2 subunits displayed currents in the absence of the Cavβ3 subunit in contrast with the Cavα1.2 full length subunit. To investigate whether the larger macroscopic currents resulted in an increase in the number of Cavα1.2 subunits at the plasma membrane, we chose the FACS (« Fluorescence Activated Cell Sorting ») method. An HA-tag was inserted in an extracellular region of the Cavα1.2 subunit and a FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») coupled anti-HA antibody was used to measure fluorescence. Our results showed that the Cavα1.2-HA subunit of L- type channel is expressed at the plasma membrane in the presence of the Cavβ3 subunit whereas the Cavα1.2-HA subunit is slightly or not expressed at the plasma membrane in its absence. The same results were obtained for the three C-terminal deletions tested under the same conditions (CaVα1.2-HA ΔC1935, CaVα1.2-HA ΔC1856 and CaVα1.2-HA ΔC1733). Taken together, these results suggest that the increased macroscopic currents observed after a partial deletion of the C-terminus is not caused by an increased number of Cavα1.2 proteins expressed at the plasma membrane. Keywords

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Plasmodium falciparum alters the permeability of its host erythrocyte plasma membrane, inducing the formation of New Permeation Pathways (NPPs). These NPPs have been shown to have anion channel properties, and anion channels are active in the membrane of infected cells. Nevertheless conflicting data exist, regarding the number, nature and origin of these anion channels. In the present study, we could show the activity of two types of endogenous channels, IRC and ORC, in the infected red blood cell membrane. A third new type of channel, SCC, was also active in these cells. Further characterization of the channels activity demonstrated that SCC is the correlate of PSAC, a channel described in supra-physiological conditions, and that this channel could be an endogenous ClC-2 channel. Moreover, if ORC activity does not seem to be modified during infection, IRC is activated by the parasite and its behaviour is modified in presence of serum. Thus this could potentially explain the alteration of global conductance seen in the presence of serum on infected cell membrane. In the last part of this study, data suggesting the implication in the NPPs of the components of an endogenous PBR complex (Peripheral Benzodiazepine Receptor) were accumulated. This hypothesis could imply that the IRC seen in the membrane of infected cells is a substate of a large anion channel with multiple possible conductances. To summarize, this work brings some new elements for the comprehension of electrophysiological data obtained on the membrane of Plasmodium-infected erythrocytes, and proposes a new hypothesis regarding the nature of the pathways involved in the NPPs.; La perméabilité membranaire de l’érythrocyte humain est fortement modifiée au cours de l’infection par Plasmodium falciparum, et de nouvelles voies de perméabilités (NPPs) ayant des propriétés de canaux anioniques apparaissent. Des canaux sont actifs dans la membrane de l’érythrocyte infecté, néanmoins les données de la littérature divergent sur le nombre et la nature de ces canaux. Les premiers résultats de cette thèse montrent l’activité de deux types de canaux endogènes, l’IRC et l’ORC, lors de l’infection par Plasmodium falciparum. Un troisième type de canal, le SCC, a également pu être caractérisé. Par la suite, une caractérisation de l’activité de ces canaux a montré que le SCC était semblable au canal PSAC décrit dans des conditions supra-physiologiques; et qu’il s’agissait vraisemblablement d’un canal endogène de type ClC-2. Par ailleurs, si l’activité spontanée de l’ORC ne semble pas modifiée lors de l’infection, l’IRC est activé par le parasite et son comportement au niveau unitaire est modifié en la présence de sérum, expliquant les modifications observées sur la conductance globale. Enfin, dans la dernière partie de cette étude, des données suggérant l’implication d’un complexe endogène de type PBR (Peripheral Benzodiazepine Receptor) dans le phénomène des NPPs ont été accumulées. Dans cette hypothèse, l’IRC ne serait alors qu’un sous-état d’un canal anionique de conductance plus importante. Ce travail permet donc de mieux comprendre les données électrophysiologiques sur les canaux anioniques dans la membrane de l’érythrocyte infecté, et propose une nouvelle hypothèse quant à la nature des voies de perméabilité impliquées dans les NPPs.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Plasmodium falciparum, the parasite responsible for malaria, is able to invade the red blood cells of its host to grow and divide protected from the immune system. This rapid growth (48 hours) involves substantial metabolic needs accompanied by extensive production catabolites. Therefore appears a new way permeability (NPP) to deal with the increased flow of solutes required for its development. Measurements isotopic flux or isosmotic lysis performed on infected cells revealed that the NPP presents the functional characteristics of an anion channel.Recent work carried out within our team, highlight the existence of spontaneously active channels in the membrane of erythrocytes infected, which is not the case of non-infected cells. However identical ductal activity can be activated by phosphorylation by the PKAc.This thesis has two goals, firstly characterize and identify the CI channel uninfected red blood cells and, secondly, whether these channels are involved in the NPP. To answer these issues two types of erythrocytes were used: control cells in healthy volunteers and CF cells carrying cystic fibrosis patients in the F508 mutation. Using the patch-clamp technique to measure a CFTR-like type of activity in the two types of cells used. However, the CF cells having a total membrane conductance due to CFTR reduced compared to controls. Immunodetection of these proteins by Western blotting method shows that CFTR is present in the membrane of the two cell types, but in lesser quantities in the cells CF.This reduced amount does not affect the in vitro growth of P. falciparum. These cells have spontaneously active channels. However, the overall membrane currents recorded are lower than those of control cells infected. This result, correspondingly, the observations made on uninfected cells, to suppose that this differential conductance is mainly due to the reduced number of channels in the membrane of these cells. These differences thus indicate that P. falciparum uses CFTR-like channels to increase the intensity of trade across the erythrocyte membrane. Preliminary results obtained with alkaline phosphatase and PKI, allow us to assume that the parasite produces its own kinases and / or alters those of its host to potentiate the activity of ion channels from its host.; Plasmodium falciparum, le parasite responsable de la malaria, est capable d'envahir les globules rouges de son hôte afin de croître et de se diviser à l'abri de son système immunitaire. Cette croissance rapide (48 heures) implique d'importants besoins métaboliques accompagnés d'une production extensive de catabolites. Dès lors, apparaît une nouvelle voie de perméabilité (NPP) pour faire face à l'accroissement du flux de solutés nécessaire pour son développement. Les mesures de flux isotopiques ou de lyse isosmotique réalisées sur des cellules infectées révèlent que le NPP présente les caractéristiques fonctionnelles d'un canal anionique. Des travaux récents, menés au sein de notre équipe, mettent en évidence l'existence de canaux spontanément actifs dans la membrane de hématies infectées, ce qui n'est pas le cas des cellules non infectées. Toutefois une activité canalaire identique peut être activée par phosphorylation par la PKAc. Ce travail de thèse a un double objectif, d'une part caractériser et identifier les canaux CI des globules rouges non infectés et, d'autre part, déterminer si ces canaux sont impliqués dans le NPP. Pour répondre à ces questions deux types d'érythrocytes ont été utilisés : des cellules contrôle de volontaires en bonne santé et des cellules CF de patients atteints de mucoviscidose porteurs de la mutation ∆F508. L'utilisation de la technique du patch-clamp permet de mesurer une activité de type CFTR-like dans les deux types de cellules utilisés. Toutefois, les cellules CF présentent une conductance membranaire globale due au CFTR réduite par rapport à celle des contrôles. L'immunodétection de ces protéines par la méthode du western-blot montre que le CFTR est présent dans la membrane des deux types cellulaires mais en quantité moindre dans les cellules CF. Cette quantité réduite n'affecte en rien la croissance in vitro de P. falciparum. Ces cellules présentent des canaux spontanément actifs. Toutefois, les courants membranaires globaux enregistrés sont inférieurs à ceux des cellules contrôle infectées. Ce résultat, corrélativement, aux observations réalisées sur des cellules non infectées, permet de supposer que cette différence de conductance résulte essentiellement du nombre réduit de canaux dans la membrane de ces cellules. Ces différences indiquent donc que P. falciparum utilise les canaux CFTR-like pour augmenter l'intensité des échanges à travers la membrane érythrocytaire. Les résultats préliminaires obtenus avec la phosphatase alcaline et le PKI, nous permettent de supposer que le parasite produit ses propres kinases et/ou qu'il modifie celles de son hôte afin de potentialiser l'activité des canaux ioniques de son hôte.

Plasmodium falciparum, the parasite responsible for malaria, is able to invade the red blood cells of its host to grow and divide protected from the immune system. This rapid growth (48 hours) involves substantial metabolic needs accompanied by extensive production catabolites. Therefore appears a new way permeability (NPP) to deal with the increased flow of solutes required for its development. Measurements isotopic flux or isosmotic lysis performed on infected cells revealed that the NPP presents the functional characteristics of an anion channel.Recent work carried out within our team, highlight the existence of spontaneously active channels in the membrane of erythrocytes infected, which is not the case of non-infected cells. However identical ductal activity can be activated by phosphorylation by the PKAc.This thesis has two goals, firstly characterize and identify the CI channel uninfected red blood cells and, secondly, whether these channels are involved in the NPP. To answer these issues two types of erythrocytes were used: control cells in healthy volunteers and CF cells carrying cystic fibrosis patients in the F508 mutation. Using the patch-clamp technique to measure a CFTR-like type of activity in the two types of cells used. However, the CF cells having a total membrane conductance due to CFTR reduced compared to controls. Immunodetection of these proteins by Western blotting method shows that CFTR is present in the membrane of the two cell types, but in lesser quantities in the cells CF.This reduced amount does not affect the in vitro growth of P. falciparum. These cells have spontaneously active channels. However, the overall membrane currents recorded are lower than those of control cells infected. This result, correspondingly, the observations made on uninfected cells, to suppose that this differential conductance is mainly due to the reduced number of channels in the membrane of these cells. These differences thus indicate that P. falciparum uses CFTR-like channels to increase the intensity of trade across the erythrocyte membrane. Preliminary results obtained with alkaline phosphatase and PKI, allow us to assume that the parasite produces its own kinases and / or alters those of its host to potentiate the activity of ion channels from its host.; Plasmodium falciparum, le parasite responsable de la malaria, est capable d'envahir les globules rouges de son hôte afin de croître et de se diviser à l'abri de son système immunitaire. Cette croissance rapide (48 heures) implique d'importants besoins métaboliques accompagnés d'une production extensive de catabolites. Dès lors, apparaît une nouvelle voie de perméabilité (NPP) pour faire face à l'accroissement du flux de solutés nécessaire pour son développement. Les mesures de flux isotopiques ou de lyse isosmotique réalisées sur des cellules infectées révèlent que le NPP présente les caractéristiques fonctionnelles d'un canal anionique. Des travaux récents, menés au sein de notre équipe, mettent en évidence l'existence de canaux spontanément actifs dans la membrane de hématies infectées, ce qui n'est pas le cas des cellules non infectées. Toutefois une activité canalaire identique peut être activée par phosphorylation par la PKAc. Ce travail de thèse a un double objectif, d'une part caractériser et identifier les canaux CI des globules rouges non infectés et, d'autre part, déterminer si ces canaux sont impliqués dans le NPP. Pour répondre à ces questions deux types d'érythrocytes ont été utilisés : des cellules contrôle de volontaires en bonne santé et des cellules CF de patients atteints de mucoviscidose porteurs de la mutation ∆F508. L'utilisation de la technique du patch-clamp permet de mesurer une activité de type CFTR-like dans les deux types de cellules utilisés. Toutefois, les cellules CF présentent une conductance membranaire globale due au CFTR réduite par rapport à celle des contrôles. L'immunodétection de ces protéines par la méthode du western-blot montre que le CFTR est présent dans la membrane des deux types cellulaires mais en quantité moindre dans les cellules CF. Cette quantité réduite n'affecte en rien la croissance in vitro de P. falciparum. Ces cellules présentent des canaux spontanément actifs. Toutefois, les courants membranaires globaux enregistrés sont inférieurs à ceux des cellules contrôle infectées. Ce résultat, corrélativement, aux observations réalisées sur des cellules non infectées, permet de supposer que cette différence de conductance résulte essentiellement du nombre réduit de canaux dans la membrane de ces cellules. Ces différences indiquent donc que P. falciparum utilise les canaux CFTR-like pour augmenter l'intensité des échanges à travers la membrane érythrocytaire. Les résultats préliminaires obtenus avec la phosphatase alcaline et le PKI, nous permettent de supposer que le parasite produit ses propres kinases et/ou qu'il modifie celles de son hôte afin de potentialiser l'activité des canaux ioniques de son hôte.

Similar to most if not all pro-apoptotic members of the Bcl-2 family, Bid (and its truncated product t-Bid) triggers cell death via mitochondrial membrane permeabilization (MMP). This effect can be monitored in intact cells, upon microinjection of recombinant Bid protein into the cytoplasm, as well as in purified mitochondria, upon addition of Bid protein. Here we show that Bid-induced MMP can be inhibited, both in cells and in the cell-free system, by three pharmacological inhibitors of the permeability transition pore complex (PTPC), namely cyclosporin A, N-methyl-4-Val-cyclosporin A, and bongkrekic acid (a ligand of the adenine nucleotide translocase, ANT, one of the PTPC components). Bid effects on synthetic membranes were studied either in proteoliposomes or in synthetic bilayers subjected to electrophysiological measurements. Full length Bid preferentially permeabilizes membranes and induces the formation of large conductance channels at neutral pH, when added to liposomes or bilayers containing both purified ANT and Bax, yet has no or little effect combined with ANT or Bax alone. t-Bid acts on membranes containing ANT alone with the same efficiency as on those containing both ANT and Bax. These results suggest that the proapoptotic effects of Bid are mediated, at least in part, by its functional interaction with ANT, one of the major components of PTPC.