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Currently, many patients with acute myeloid leukemia (AML) relapse after treatment. Monitoring minimal residual disease (MRD) is essential for the evaluation of the efficacy of therapies and for the prognosis, but lack of standardization in flow cytometry (CMF). Today, the LAIP/DfN approach aims to track blasts with the Leukemia Associated ImmunoPhenotype (LAIP) while the more innovative LSC approach aims to assess the presence of leukemic stem cells (LSC) in the immature myeloid compartment CD34+/CD38-. These LSCs are stated to be the cause of relapses. This prospective study from January 2020 to September 2020 including patients with AML at the CHU of Caen proposes a robust and reproducible CMF analysis strategy for these two approaches allowed by the panel of LSC antibodies currently evaluated in several centres in France by the MRD CMF LAM LSC group. Concrete examples of patients illustrate and validate the relevance of the evaluation by CMF of MRD using this double approach combining LAIP and LSC. Due to the small size of the study, this strategy needs to be evaluated on a larger scale but offers good prospects for the monitoring and management of patients with AML.; Actuellement, de nombreux patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) rechutent après traitement. La recherche de la maladie résiduelle minimale (MRD), capitale pour l’évaluation de l’efficacité des thérapeutiques et pour le pronostic, manque de standardisation en cytométrie en flux (CMF). Aujourd’hui, l’approche LAIP/DfN a pour but de traquer les blastes au phénotype aberrant associé à la leucémie (LAIP) tandis que l’approche LSC, plus novatrice, a pour objectif d’évaluer la présence de cellules souches leucémiques (LSC) dans le compartiment de l’immaturité myéloïde CD34+/CD38-. Ces LSC sont stipulées comme étant à l’origine des rechutes. Cette étude prospective de janvier 2020 à septembre 2020, incluant des patients atteints de LAM au CHU de Caen, propose une stratégie d’analyse en CMF robuste et reproductible pour ces deux approches permises par le panel d’anticorps LSC actuellement évalué en multicentrique en France par le groupe MRD CMF LAM LSC. L’illustration par des exemples concrets valide la pertinence de l’évaluation en CMF de la MRD par cette double approche LAIP/LSC dans les LAM, son intérêt pronostique n’étant plus à démontrer. De par le faible effectif de l’étude, cette stratégie nécessite d’être évaluée à plus grande échelle mais offre de belles perspectives pour le suivi et la prise en charge des patients atteints de LAM.

Tous les patients de soins intensifs reçoivent des solutés cristalloïdes. Ils sont souvent dans un état inflammatoire sévère. Parmi ces solutés cristalloïdes, le Normal Salin (NS) a des concentrations élevées en chlorure et en sodium ce qui a été associé à divers effets immuno-activateurs. Nous visons à évaluer l’effet des différents solutés sur les cellules immunitaires de sujets sains et sur un modèle d’inflammation aiguë sur sang total. Dans cette étude de type chassé-croisé, 11 sujets sains ont été recrutés pour recevoir 1L de chaque soluté. Grâce aux prélèvements sanguins pris en pré et post-infusion, nous évaluons le phénotype des leucocytes par cytométrie en flux et les cytokines plasmatiques par multiplex. Les tests ex vivo sont faits en exposant du sang total aux solutés suite à une stimulation au LPS. Notre étude suggère une diminution de l’activation des neutrophiles par le LR et le PL par rapport au NS. On constate aussi une augmentation des monocytes totaux et classiques circulants suite au NS. Le NS augmente les concentrations de la cytokine pro-inflammatoire Interleukine (IL)-17A et diminue certains facteurs anti-inflammatoires comme IL-10 et basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) par rapport aux deux autres solutés. Ex vivo, l’ajout de NS augmente l'activation des monocytes par rapport au LPS seul par rapport au LR et au PL. Le PL diminue aussi l’activation précoce des lymphocytes T. Nos résultats suggèrent que le NS a un effet plus immunoactivateur que les 2 autres solutés. Une meilleure compréhension de ces effets pourrait mener à une utilisation personnalisée des cristalloïdes pour un retour plus efficace à l’homéostasie inflammatoire., Intensive care unit patients' inflammatory status can switch from an early pro-inflammatory to a late anti-inflammatory phase, which favors infections. They can receive different crystalloids, either Normal Saline (NS), Ringer’s Lactate (RL) or Plasma-Lyte (PL). NS has high NaCl concentrations which has been associated with inflammatory effects on immune cells. Our aim is to evaluate the impact of these three different crystalloid fluids on immune cells in healthy subjects and on a whole blood model of acute inflammation. Using our comprehensive immunomonitoring platform, we assessed the immunological phenotype of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and neutrophils in humans. 11 healthy subjects received a liter of NS, RL and PL in a randomized cross-over fashion. Blood samples were taken before and 6h later. PBMC and neutrophil phenotypes were assessed by flow cytometry and cytokine concentrations were measured by a multiplex assay. Ex vivo assays were performed by exposing whole blood to the different crystalloids following a stimulation with LPS. Study of healthy subject’s PBMCs suggested that RL and PL reduced activation of neutrophils compared to NS. Total and classical monocytes were increased with NS compared to RL and PL. RL and PL also increase plasma levels of anti-inflammatory cytokine Interleukin (IL)-10 and pro-repair cytokine basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) compared to NS, while NS increased plasma levels of the pro-inflammatory cytokine IL-17A. In whole blood assays, following LPS stimulation, NS increased monocytic activation compared to LR and PL. In T cells, PL decreased early activation. Conclusions: Our results suggest that crystalloids have different immune consequences with NS being more immune activating than RL and PL. A better understanding of their immune modulation could lead to personalization of their use according to the inflammatory status of patients to restore their immune homeostasis.

CD43 expression is inconstant in mantle cell lymphoma (MCL). However, its implication on survival has not been highlighted. A retrospective study from 2014 to 2019 was carried out on 42 patients with MCL at the teaching hospitality of Caen in order to perform CD43 impact on overall survival (OS) and progression-free survival (PFS). This study is based on the quantification of the intensity of CD43. It’s more developed in lymph node rather than blood (371.7 and 174.3 respectively, p= 0.038). CD43 positivity was admitted for an MFI (mean of fluorescence) greater than 300 (peripheral blood) and 500 (lymph node). In peripheral blood, despite reduced survival for patients with CD43+, OS and PFS are not significantly different. In lymph node, the CD43’s positivity would be linked to a less favorable OS ((5.11 vs 1.35) and PFS (4.70 vs 1.35), p= 0.033. In this study, the positivity of CD43 would be a marker of poor prognosis, confirmed by a multivariate analysis. Due to the small size of this study, these data must be confirmed by a larger cohort.; L’expression du CD43 est variable dans le lymphome du manteau. Toutefois, son implication sur la survie n’a pas été exploitée. Une étude rétrospective de 2014 à 2019 a été réalisée sur 42 patients atteints d’un lymphome du manteau (MCL) au centre hospitalo-universitaire de Caen afin d’évaluer l’impact du CD43 sur la survie globale (OS) et la survie sans progression (PFS) dans le MCL. Cette étude est basée sur la quantification de l’intensité du CD43. Cet antigène est davantage exprimé par les cellules du manteau ganglionnaire plutôt que sanguine (371.7 et 174.3 respectivement, p=0.038). La positivité du CD43 a été admise pour une MFI (médiane d’intensité de fluorescence) supérieure à 300 dans le sang périphérique et 500 dans le ganglion. Dans le sang périphérique, malgré une survie moindre des patients CD43+, l’OS et la PFS ne sont pas significativement différentes. Dans le ganglion, la positivité du CD43 serait en lien avec une OS (5.11 vs 1.35) et une PFS (4.70 vs 1.35) moins favorable (p= 0.033). Dans cette étude, la positivité du CD43 serait un marqueur de mauvais pronostic. De par le faible effectif de l’étude, ces données doivent être confirmées par une cohorte plus importante.

Master; Avec l’élévation de la température moyenne des océans liée au réchauffement climatique global, l’augmentation de la fréquence d’épisodes d’efflorescences* de cyanobactéries (microalgues potentiellement toxiques) est une problématique qui prend de l’ampleur (Wells et al., 2015 ; Gobler et al., 2017). Ce phénomène est également exacerbé par l’eutrophisation* des eaux continentales et côtières liée aux activités anthropiques*. Les conséquences de ces efflorescences sur l’environnement sont multiples : au-delà de l’hypoxie provoquée localement et qui contribue à créer des zones « mortes », certaines proliférations s’accompagnent d’émissions de cyanotoxines* présentant un risque notable pour la santé humaine et animale. De ce fait, leur prolifération est désormais considérée comme un enjeu économique et environnemental important pour les services de l’État et les gestionnaires en charge de la surveillance et de la gestion des ressources en eau. Afin de pallier le risque lié à la présence des cyanobactéries, la directive européenne 2006/7/CE impose une surveillance et une gestion des cyanobactéries dans les zones de baignade en complément du contrôle de leur qualité microbiologique. Actuellement, ce suivi réalisé par microscopie optique en laboratoire compromet la réactivité des gestionnaires à prendre des mesures adéquates pour protéger la population car les étapes de dénombrement et d’identification sont chronophages et requièrent d’importantes compétences taxonomiques (Jaouen, 2015). Ces dernières années, le développement des technologies scientifiques analytiques pourrait permettre une meilleure connaissance et gestion de ces milieux aquatiques. Le FlowCAM, outil développé dans les années 2000, est un appareil combinant la microscopie optique et la cytométrie en flux pour la mesure et la classification d'organismes et de particules (de 20 à 200 µm) présents dans un milieu liquide. Générant des images numériques en couleur, il donne accès aux dimensions des cellules et permet leur classement selon des filtres définis par l’opérateur en quelques minutes. L’objectif de ce stage est de finaliser le protocole du FlowCAM pour la surveillance spécifique des cyanobactéries en eau douce dans le cadre des travaux de recherche de l’équipe ECOVEA d’INRAE Cestas-Gazinet et de définir son périmètre de validité. Le travail réalisé lors de ce stage a consisté à analyser la bibliographique* disponible puis synthétiser les informations pertinentes. L’INRAE, structure au sein de laquelle ce stage a été réalisé sera présentée dans un premier temps, suivi d’une description du FlowCAM et des objectifs détaillés de cette mission. Enfin, la méthodologie et les résultats obtenus seront présentés partiellement et discutés, de même que les limites et les perspectives de cet outil.

But de l’étude : la prise en charge des patients présentant un syndrome coronarien aigu (SCA) sans sus décalage du segment ST dépend de l’exploration coronarographique. Ces patients justifient d’un transfert vers un centre de cardiologie interventionnelle, ces transports étant assuré par le SAMU. Se pose la question d’étudier les complications durant ces transferts et à la phase hospitalière, afin d’analyser les caractéristiques de cette population. Dans un second temps d’étudier les performances pronostiques de scores utilisés en pratique dans la prédiction de ces complications.Méthode : il s’agit d’une étude descriptive multicentrique rétrospective entre le 1er janvier 2017 et le 31 janvier 2017, incluant tous les patients présentant un SCA non ST+ diagnostiqué dans les hôpitaux périphériques et transférés par l’intermédiaire du SAMU 13 afin de répertorier les évènements indésirables (EI) graves.Résultats : 397 patients ont été inclus, 1 patient a présenté une complication durant la phase pré hospitalière. 19 patients ont présenté des EI pendant l’hospitalisation. Le seul facteur de risque statistiquement significatif dans la population, compliqué est l’Insuffisance rénale Chronique (p = 0.001). Seul le score TIMI>= 6 est statistiquement significatif dans la prédiction des EI (p = 0.04).Conclusion : la faible incidence des EI ne justifie pas la médicalisation systématique des transferts inter hospitalier des scores SCA non ST. Le score TIMI >= 6 nous paraît peu utilisable car trop peu Sensible 20% (IC 95% : 7-42) Même si le score ESC n’est pas statistiquement significatif sur la prédiction des EI, il semble le plus pertinent comme outil de régulation pour décider d’une médicalisation (Se 95% (IC 95% : 74-100)).

The basophil activation test (BAT) is complementary to skin tests (ST) and specific IgE assay (sIgE) and an alternative to the provocation test. This ex vivo test determines the activation of basophils by flow cytometry. The objective of this work was to assess the implementation and diagnostic contribution of the TAB for drug hypersensitivity at University Hospital of Bordeaux. Secondly, the objective was to assess current practices and procedures of BAT in French laboratories. We retrospectively analyzed the records of patients for whom TABs for drugs were requested between 2015 and 2020 at University Hospital of Bordeaux. To evaluate the current practices, we conducted a national survey (AllergoBioNet network). Information’s requested were : annual prescription volume, procedures, indications and interpretation. We observed a diagnostic contribution in 50% of the records analyzed. In Bordeaux, the total number of BAT is increasing since 2017. They mainly concern antibiotics (57%) and curares (19%). The 2 major indications were a discrepancy between the clinical history and the result of ST and/or sIgE (27%) or inconclusive or unavailable ST and/or sIgE (28%). The French laboratories perform BAT from whole blood (EDTA) (92.9%), sent in less than 24h (100%) using a commercial kit (100%). The positivity thresholds and BAT interpretation remained very variable. Developing the BAT for the diagnosis of drug allergy makes sense because of its diagnostic contribution. At the national level, the standardization of BAT interpretation is necessary., Les hypersensibilités médicamenteuses (HSM) sont fréquentes. Le test d’activation des basophiles (TAB) est complémentaire des tests cutanés (TC) et de la recherche des IgE spécifiques (IgEs) et une alternative au test de provocation. Ce test ex vivo quantifie l’activation des basophiles par Cytométrie de flux. L’objectif de ce travail était d'évaluer la mise en place et l'apport diagnostique du TAB pour l’exploration des HSM au CHU de Bordeaux. Dans un second temps, l'objectif était de faire le point sur la réalisation pratique des TAB dans les laboratoires français. Nous avons analysé rétrospectivement les dossiers des 52 patients pour lesquels des TAB aux médicaments ont été demandés entre 2015 et 2020 au CHU de Bordeaux. Parallèlement, nous avons réalisé un questionnaire qui a été envoyé aux biologistes du réseau AllergoBioNet. Les informations demandées étaient : le volume annuel de prescription, l'organisation, la réalisation, les indications et l'interprétation des TAB. Nous avons observé un apport diagnostique dans 50 % des demandes analysées. A Bordeaux, les demandes sont en hausse depuis 2017 (400%). Elles concernent majoritairement les antibiotiques (57 %) et les curares (19 %). Les deux indications majeures étaient une discordance entre l’histoire clinique et le résultat des TC et/ou de la recherche des IgEs (27%) ou des TC et/ou les IgEs non contributifs ou indisponibles (28%). Le laboratoire « type » réalise le TAB à partir de sang total (EDTA) (92,9 %), sur rendez-vous (92,8 %), acheminé en moins de 24 h (100 %) à l’aide d’un kit commercial adapté ou non (100 %). Les seuils de positivité et l’interprétation restaient très variables. Développer le TAB pour le diagnostic des HSM prend tout son sens devant l’augmentation des prescriptions et son apport diagnostique. Au niveau national, la standardisation du TAB est en cours mais des travaux sont encore nécessaires pour harmoniser son interprétation.

Les lymphomes cérébraux primaires du système nerveux central sont des tumeurs très agressives. Actuellement, le délai diagnostique reste long : environ 1 à 1,5 mois en raison de l'absence de spécificité clinique et radiologique, et du délai de réalisation des biopsies cérébrales (BC) après la consultation initiale. La technique de référence pour établir le diagnostic est l'analyse histologique de BC. Cependant les cellules présentes dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) ou le liquide de rinçage de trocart biopsique (LRTBC) peuvent être étudiées par cytométrie en flux (CMF). Notre étude consiste à évaluer les performances de cette technique vis à vis de l'analyse histologique traditionnelle. Entre janvier 2017 et janvier 2019, 34 patients ayant bénéficiés d'analyses conjointes immunohistochimiques sur BC et cytométriques sur LCR et LRTBC pour suspicion de lymphomes cérébraux primitifs ont été inclus dans notre étude. L'analyse des LCR était non contributive, toutes techniques confondues. La sensibilité et spécificité d'analyse des LRTBC par CMF étaient respectivement de 68% et 100%. Sept faux négatifs étaient reportés. La présence de ceux-ci étaient liés : d'une part à une absence d'harmonisation des techniques de prélèvements (rinçage multiple : liquide riche en cellules, vs rinçage unique : liquide pauvre en cellules), et d'autre part à la présence d'une corticothérapie dans les 2 semaines précédant la biopsie. L'analyse des LRTBC permettait de raccourcir le délai diagnostique (1,7 jours vs 10 jours) et d'initier plus précocement un traitement adapté. Du fait d'une sensibilité de 68%, tout résultat négatif doit être confronté au résultat histologique avant d'écarter la possibilité d'un lymphome.

Le laboratoire UMR STLO vise à développer une expertise publique sur les composants du lait et de l’œuf et à augmenter la qualité et la sécurité des produits laitiers fermentés, via notamment l’isolement et la caractérisation de souches de bactéries bénéfiques d’intérêt alimentaire. L’une des approches consiste à exploiter les propriétés « 2-en-1 » de certaines souches, c’est-à-dire leurs propriétés techno-fonctionnelles (élaboration de produits laitiers fermentés aux caractéristiques désirées) ainsi que leurs propriétés probiotiques. Certaines bactéries mises en œuvre dans l’élaboration de produits laitiers fermentés peuvent en effet exercer un effet bénéfique sur la santé de l’homme.Les bactéries propioniques laitières, dont P. freudenreichii, sont responsables de l’ouverture et de l’arôme caractéristique de l’Emmental, via la production de CO2 et des acides gras à chaîne courte acétate et propionate. Ces derniers sont à l’origine de l’aptitude de P. freudenreichii à moduler la prolifération et l’apoptose, au niveau de cellules épithéliales digestives. Ainsi, la bactérie, un produit laitier fermenté par cette bactérie, ainsi que ses métabolites, induisent le scénario suivant, au contact de cellules cancéreuses gastriques ou intestinales. Arrêt du cycle cellulaire, dépolarisation des mitochondries, accumulation d’espèces réactives de l’oxygène, déplétion de l’ATP, fragmentation en corps apoptotiques, autant de paramètres qui ont été suivis par cytométrie en flux.Les bactéries propioniques laitières, dont P. freudenreichii, ont une composition de surface (surfaceome) extrêmement variable, d’une souche à l’autre. De même, leur capacité à adhérer aux cellules de l’hôte et leur capacité immunomodulatrice, deux paramètres intimement liés, sont variables. Les protéines de surface impliquées dans ce type d’interactions ont été étudiées par une approche pluridisciplinaire combinat génomique, transcriptomique, protéomique et cytométrie en flux. Ainsi, une protéine de la famille des Surface Layer Proteins (Slp), SlpB, s’est révélée cruciale dans le dialogue entre P. freudenreichii et l’hôte.Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans le domaine du développement d’aliments sains, sûrs, hédoniques et fonctionnels (bactéries lactiques et propioniques) issus de la fermentation du lait. Ils peuvent aider, en complément des traitements existants, à prévenir et/ou à soigner des pathologies (cancers, maladies inflammatoires chroniques) dont l’incidence croit dans les pays développés comme le nôtre.

Caractérisation du lignage épithélial de la glande mammaire bovine. 23.Congrès de l'association francaise de cytométrie

Thèse présentée sous la forme d'une "Thèse Article"; Introduction : le gène PIG-A, impliqué dans la biosynthèse de l’ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI), constitue un biomarqueur génotoxique chez les rongeurs. L’objectif principal de cette étude est d'évaluer prospectivement, chez l’Homme, le test PIG-A en tant que biomarqueur de génotoxicité lors d’une radiothérapie externe à visée thérapeutique.Matériels et méthodes : trente patientes atteintes d'un cancer du sein, réparties en 2 groupes, radiothérapie mammaire exclusive (RTME) ou radiothérapie mammaire et ganglionnaire (RTMG) ont été incluses de janvier 2016 à juin 2017. La fréquence de granulocytes GPI-déficients a été déterminée par cytométrie de flux sur quatre prélèvements sanguins. L’induction de micronoyaux a été mesurée lors du premier et du troisième prélèvement.Résultats : la radiothérapie n'a pas augmenté significativement la fréquence des granulocytes GPI-déficients, quel que soit le groupe ou la dose de rayonnement. Les taux de micronoyaux étaient significativement plus élevés à la fin de la radiothérapie chez tous les patients (p = 3,1 x 10-5), dans le groupe traité par RTME (p = 0,016), par RTMG (p = 0,003), et dans le groupe RTMG par rapport au RTME (p = 0.012). En analyse multivariée, les micronoyaux étaient significativement corrélés avec l'âge (p = 0,043) et l'irradiation (p = 0,0001). Conclusion : le test PIG-A sur granulocytes ne révèle pas la génotoxicité radio-induite. La confirmation du caractère génotoxique de l’irradiation mammaire par le test du micronoyau encourage à évaluer le test PIG-A après d'autres expositions génotoxiques ou dans d'autres cellules circulantes telles que les érythrocytes ou les réticulocytes.

Le virus herpès simplex de type 1 (VHS-1) est un agent infectieux hautement contagieux qui constitue un véritable problème de santé mondiale causant de nombreuses pathologies allant de l'herpès labial jusqu’aux plus graves comme l'encéphalite et les complications chez les nouveau-nés. Le virus comporte 4 composants structurels distincts : un génome viral d’ADN double brin linéaire englobé dans une capside icosaèdrale de 125 nm, une couche de protéine appelée tégument, et une enveloppe lipidique dérivée de l'hôte dans laquelle les glycoprotéines virales sont ancrées. Le tégument est un réseau très dense et très complexe comprenant des milliers de copies de protéines de différentes tailles qui relient structurellement l'enveloppe virale à la capside. Ces protéines multifonctionnelles remplissent plusieurs fonctions importantes tout au long du cycle viral. Elles sont impliquées dans le transport des capsides entrantes jusqu’aux pores nucléaires, la maturation et la sortie des particules virales nouvellement formées ainsi que l'acquisition de l'enveloppe finale. Les protéines du tégument ont été largement étudiées dans le but de déterminer leurs rôles dans l'infection et la virulence. Cependant, étant limitées par les techniques conventionnelles, toutes ces études considèrent que l'ensemble de la population virale est responsable du phénotype de l'infection sans tenir compte de l'hétérogénéité possible des protéines tégumentaires entre les particules virales et son impact sur l'infectiosité. Après la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane plasmique conduisant à l'entrée du virus, le génome viral est livré au noyau, où il se réplique afin d’amorcer l'assemblage des nouvelles capsides. À ce stade, quatre espèces distinctes de capsides non enveloppées sont présentes. Les procapsides thermodynamiquement instables, les capsides A et B qui ne parviennent pas à incorporer correctement le génome viral, et les capsides C qui incorporent le génome viral et formeront finalement des virions enveloppés matures. Ces capsides peuvent être distinguées les unes des autres sur la base de leurs composition (ADN et protéines) ainsi que de leur apparence en microscopie électronique. Les capsides A et B sont considérées comme abortives et seuls les C-capsides matures peuvent traverser les deux membranes nucléaires par un mécanisme d'enveloppement / dé-enveloppement et sont finalement réenveloppées dans le TGN. L'acquisition de la couche de tégument est supposée se faire de façon séquentielle du noyau au TGN en passant par le cytoplasme. Cette acquisition est favorisée par un réseau très complexe d’interactions protéiques impliquant la capside et les protéines du tégument. Cependant, la séquence exacte d’addition de ces protéines est encore mal définie. Dans le premier article présenté dans cette thèse et qui a été publié dans Journal of Virology, nous avons analysé la teneur en protéines tégumentaires des particules individuelles du virus de l'herpès simplex 1 en utilisant une approche innovatrice de cytométrie en flux que nous avons développée en laboratoire. Nos données confirment que si certaines protéines virales sont incorporées en quantités contrôlées, d'autres varient considérablement. Ces résultats nous ont également permis de mettre en évidence l’existence d’une corrélation entre l'abondance de protéines tégumentaires spécifiques et l’infectiosité du virus. Dans le deuxième article, l’emploi de la virométrie en flux nous a également permis non seulement d’analyser les capsides nucléaires, mais aussi d’enrichir la pureté des capsides C. Et pour la première fois, on a été capable d’analyser trois types de capsides nucléaires (A, B et C) par spectrométrie de masse et de déterminer leur composition protéique globale. Ceci appuie fortement la doctrine selon laquelle l’acquisition du tégument démarre hâtivement au niveau du noyau et soutient l’implication probable de ces protéines dans l’enveloppement primaire des capsides. Nous avons également découvert la présence de protéines de l’hôte associées aux capsides., Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a highly contagious infectious agent that constitutes a real global health problem and can cause many pathologies ranging from cold sores to encephalitis and systemic disease in newborns. The virus is composed of 4 distinct structural components: a linear double-stranded DNA viral genome encompassed within a 125 nm icosahedral capsid, a layer of protein called the tegument, and a host-derived lipid envelope in which the viral glycoproteins are anchored. The tegument is a very dense and very complex network comprising thousands of proteins of different sizes that structurally bridge the viral envelope to the capsid. These multifunctional proteins perform several important functions throughout the viral cycle. They are involved in transport and targeting of incoming capsids to nuclear pores, maturation and egress of newly made viral particles, and the acquisition of the final envelope. Tegument proteins have been extensively studied to determine their roles in infection and virulence. However, being limited by conventional techniques, all these studies consider the entire viral population to be responsible for the infectious phenotype without considering the possible heterogeneity of specific tegument proteins among viral particles and its effect on infectivity. Following fusion of the viral envelope with the plasma membrane leading to entry of the virus, the viral genome is delivered to the nucleus, where it replicates and leads to the assembly of new capsids. Here, four distinct nonenveloped capsid species are present. The thermodynamically unstable procapsids, the A‐capsids that fail to properly incorporate the viral genome, the B‐capsids that also lack viral DNA and the C‐capsids that incorporate the viral genome and ultimately form mature enveloped virions. Those capsids can be distinguished from each other based on their composition (DNA and proteins) contents and their appearance in electron microscopy. A- and B-capsids are considered to be abortive and only mature C-capsids can travel across the two nuclear membranes by an envelopment/de‐envelopment mechanism and are ultimately re‐enveloped in the TGN. The acquisition of the tegument layer is believed to be sequential from the nucleus to the TGN via the cytoplasm. This acquisition is favored by a very complex network of protein interactions involving the capsid and the proteins of the tegument. However, the exact sequence of addition of these proteins is still poorly defined. The first paper presented in this thesis has been published in Journal of Virology. Here, we analyzed the protein content of individual herpes simplex virus 1 particles using an innovative flow cytometry approach we developed in the laboratory. Our data confirm that while some viral proteins are incorporated in controlled amounts, others vary substantially. We also highlighted the correlation between the abundance of specific tegument proteins and the infectivity of the virions. In the second paper, the use of flow virometry enabled us not only to analyze the nuclear capsids, but also to increase the purity of C-capsids. And for the first time, we were able to analyze three types of nuclear capsids (A, B and C) by mass spectrometry and determine their overall protein composition. These observations strongly support the hypothesis that acquisition of the tegument proteins starts early at the nucleus and support the likely involvement of these proteins in the primary envelopment of the capsids. We also noted the presence of host proteins associated with capsids.

Background: Sickle cell trait (HbAS) confers partial protection against malaria by reducing the adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to host receptors, but little is known about its potential protection against placental malaria. Methods: Using flow cytometry, we assessed the recognition of HbAA and HbAS VAR2CSA-expressing infected erythrocytes, by plasma from 159 Beninese pregnant women with either HbAA (normal) or HbAS. Using multivariate linear models adjusted for gravidity, parasite infection at delivery, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, and α-thalassemia carriage, we observed significantly reduced cell surface antibody binding of HbAS-infected erythrocytes by plasma from HbAS compared with HbAA women (P < 10–3). Results: The difference in cell surface antibody binding was only observed when infected erythrocytes and plasma were associated according to the same hemoglobin genotype. Similar levels of VAR2CSA-specific antibody were measured by enzyme-linked immunosorbent assay in the 2 groups, suggesting that the altered interaction between VAR2CSA and HbAS women's antibodies could reflect abnormal display of VAR2CSA on HbAS erythrocytes. Conclusions: Our data stress the need for assessments of erythrocyte disorders such as the sickle cell trait in a population group when studying immunological responses to P falciparum.

Le risque de rechute post-allogreffe de moelle dans un contexte de leucémie myéloïde aigue (AML) varie entre 35 et 45% selon différentes variables considérées, et dépasse 50% dans le cas des syndromes myélodysplasiques (MDS). Une immunité anti-tumorale défective, au coeur d’interactions immunologiques complexes, en constitue l’une des causes majeures. Nous nous sommes intéressés au profil lymphocytaire de patients ayant rechuté après allogreffe de moelle dans un contexte d’AML ou de MDS ainsi qu’à des variables cliniques précises afin d’établir d’éventuelles corrélations clinico-biologiques. Cette analyse fait suite au protocole « DLI-Vidaza » ayant testé l’efficacité du Vidaza + DLI chez des patients rechuteurs, dont elle constitue en partie l’objectif tertiaire.

Interleukin 17A-producing T helper cells (Th17) are CD4+ T cells that are crucial to immunity to extracellular bacteria. The roles of these cells in the bovine species are poorly defined, because the characterization of bovine Th17 cells lags behind for want of straightforward cultivation and isolation procedures. We have developed procedures to differentiate, expand, and isolate bovine Th17 cells from circulating CD4+ T cells of adult cows. Using polyclonal stimulation with antibodies to CD3 and CD28, we expanded IL-17A-positive CD4+ T cells in a serum-free cell culture medium supplemented with TGF-β1, IL-6 and IL-2. Populations of CD4+ T cells producing IL-17A or IFN-γ or both cytokines were obtained. Isolation of IL-17A-secreting CD4+ T cells was performed by labelling surface IL-17A, followed by flow cytometry cell sorting. The sorted Th17 cells were restimulated and could be expanded for several weeks. These cells were further characterized by cytokine profiling at transcriptomic and protein levels. They produced high amounts of IL-17A and IL-17F, and moderate amounts of IL-22 and IFN-γ. The techniques developed will be useful to characterize the phenotypic and functional properties of bovine Th17 cells.

VP22 is a major tegument protein of alphaherpesviruses encoded by the UL49 gene. Two properties of VP22 were discovered by studying Marek&rsquo, s disease virus (MDV), the Mardivirus prototype, it has a major role in virus cell-to-cell spread and in cell cycle modulation. This 249 AA-long protein contains three regions including a conserved central domain. To decipher the functional VP22 domains and their relationships, we generated three series of recombinant MDV genomes harboring a modified UL49 gene and assessed their effect on virus spread. Mutated VP22 were also tested for their ability to arrest the cell cycle, subcellular location and histones copurification after overexpression in cells. We demonstrated that the N-terminus of VP22 associated with its central domain is essential for virus spread and cell cycle modulation. Strikingly, we demonstrated that AAs 174-190 of MDV VP22 containing the end of a putative extended alpha-3 helix are essential for both functions and that AAs 159&ndash, 162 located in the putative beta-strand of the central domain are mandatory for cell cycle modulation. Despite being non-essential, the 59 C-terminal AAs play a role in virus spread efficiency. Interestingly, a positive correlation was observed between cell cycle modulation and VP22 histones association, but none with MDV spread.

International audience; Extracellular vesicles (EVs) are small, heterogeneous and difficult to measure. Flow cytometry (FC) is a key technology for the measurement of individual particles, but its application to the analysis of EVs and other submicron particles has presented many challenges and has produced a number of controversial results, in part due to limitations of instrument detection, lack of robust methods and ambiguities in how data should be interpreted. These complications are exacerbated by the field's lack of a robust reporting framework, and many EV-FC manuscripts include incomplete descriptions of methods and results, contain artefacts stemming from an insufficient instrument sensitivity and inappropriate experimental design and lack appropriate calibration and standardization. To address these issues, a working group (WG) of EV-FC researchers from ISEV, ISAC and ISTH, worked together as an EV-FC WG and developed a consensus framework for the minimum information that should be provided regarding EV-FC. This framework incorporates the existing Minimum Information for Studies of EVs (MISEV) guidelines and Minimum Information about a FC experiment (MIFlowCyt) standard in an EV-FC-specific reporting framework (MIFlowCyt-EV) that supports reporting of critical information related to sample staining, EV detection and measurement and experimental design in manuscripts that report EV-FC data. MIFlowCyt-EV provides a structure for sharing EV-FC results, but it does not prescribe specific protocols, as there will continue to be rapid evolution of instruments and methods for the foreseeable future. MIFlowCyt-EV accommodates this evolution, while providing information needed to evaluate and compare different approaches. Because MIFlowCyt-EV will ensure consistency in the manner of reporting of EV-FC studies, over time we expect that adoption of MIFlowCyt-EV as a standard for reporting EV- FC studies will improve the ability to quantitatively compare results from different laboratories and to support the development of new instruments and assays for improved measurement of EVs.

Milk production is highly dependent on the optimal development of the mammary epithelium. It is therefore essential to better understand mammary epithelial cell growth and maintenance from the related epithelial lineage during the animal life. Here, we characterized the epithelial lineage at puberty, lactation and dry-off in bovine using the cell surface markers CD49f, CD24, and CD10. The pubertal period was characterized by a high proportion of CD49fpos cells corresponding to various epithelial subpopulations, notably the CD24pos subpopulations. The proportion of CD49fpos cells was weaker during lactation and dry-off, and CD24pos cells were relatively few. Of note, the (sub)population profile at dry-off appeared close to that during lactation. Using a targeted gene approach, we associated specific genes with epithelial subpopulations, their expression level varying, or not, according to physiological stages. Caseins were only expressed in the CD49fmedCD24neg subpopulation. Basal marker genes (keratin(KRT)5, KRT14 and αSMA) were found in the CD49fhighCD24neg subpopulations. Luminal gene markers (KRT7, KRT8 and KRT19, CDH1 and the PRLR) were expressed in the CD49flowCD24neg subpopulation. The CD49flowCD24pos subpopulation, only abundant at puberty, expressed luminal gene markers and KI67 at high level. In contrast to others, the CD49fhighCD24pos cells accounted for a small proportion of total cells, decreasing from puberty to dry-off. They were characterized by expression of luminal and basal gene markers and low KI67 level. Interestingly, this subpopulation showed a remarkable stability of gene expression profile throughout physiological stages and bear the hallmark of quiescence that designate them as the potential bovine mammary stem cells.

Milk production is highly dependent on the extensive expansion of the mammary epithelium which largely occurs during puberty. Within the mammary epithelium, the Mammary Stem Cells (MaSC) and their progeny play a key role in driving the development of the future functional mammary gland. Later, these cells contribute to regenerate the secretory epithelium in order to ensure future lactations. To elucidate the epithelial cell lineage involved in the establishment of the functional gland, we investigated the MaSC/progenitors populations in the bovine mammary tissue at various physiological stages. We used flow cytometry to phenotype epithelial cells on the basis of CD49f and CD24 expression in animals at three contrasted physiologic stages: puberty (heifers of 17 months of age), lactation (multiparous cows producing 35 kg of milk) and drying off (cows at 6 years after drying off). Comparison of the cytometric profiles highlighted the presence of a distinct epithelial population of CD49flowCD24pos cells at puberty (23.7%±3.6) which substantially decreased in the others stages (4.1%±1 at lactation and 6%±1 at drying off). These CD49flowCD24pos cells had features of a dual lineage, with luminal and basal characteristics (CD10, ALDH1 and keratin 7 expression) and were considered to be early common progenitors. The MaSC fraction was recovered in the sub-population of CD49fhighCD24pos cells. When cultured in vitro (in a 3D culture system with matrigel), these cells formed mammospheres, a functional property of MaSC. At puberty, total mammary cells contained 2.8%±0.3 of MaSC. This proportion of MaSC was significantly reduced at lactation (1.1±0.3%) and at drying off (0.4±0.3%). Further phenotypic characterization of the CD49fhighCD24pos cells showed that they expressed CD10 and keratin 14 at any stages. This in-depth characterization of the epithelial sub-populations at various physiological stages provide new insights into the epithelial cell hierarchy in the bovine mammary gland from puberty to drying off.

To fertilize the oocyte, the sperm undergoes physiological and biochemical modifications known as “sperm capacitation”. The aim of this study was to analyze by flow cytometry and immunofluorescence analysis the changes induced by several molecules on stallion sperm viability, plasma membrane fluidity, cholesterol content, calcium influx and tyrosine phosphorylation. Moreover, the modifications induced on glycocalyx sperm sugars were studied by means of lectin-based cell microarray analysis. Frozen sperm samples were incubated with calcium ionophore, MβCD, α-L-fucosidase, neurotensin, HSPA8, cAMP and 4-AP. Flow cytometry analysis showed that membrane fluidity was affected by MβCD, cAMP, neurotensin, HSPA8 and 4-AP; cholesterol depletion was induced by MβCD; an increase of intracellular calcium was produced by calcium ionophore and cAMP; and sperm viability was affected by MβCD. Tyrosine phosphorylation increased when sperm was incubated with MβCD and cAMP. Sperm microarray analysis revealed that i) MβCD and cAMP treatment increased α2,3-linked sialic acid and T antigen, whereas decreased α1,3-linked fucose signals; ii) cAMP alone increased α1,6- and α1,2-linked fucoses; iii) MβCD alone reduced sialylated T antigen, lactosamine, αGal, GalNAc, terminating glycans as well as α 1,6fucose in high-mannose glycans. The combination of MβCD + cAMP treatment preserved the α2,3-linked sialic acid increasing, determined the GalNAc, GlcNAc, α 1,2-linked fucose enhancement, whereas reduced T antigen and high-mannose glycans. Our results determine the specific effect of each molecule in order to establish a combination of several agents to achieve an efficient in vitro capacitation technique for stallion sperm.

Milk production is highly dependent on the extensive development of the mammary epithelium, which occurs during puberty. It is therefore essential to distinguish the epithelial cells committed to development from the related epithelial hierarchy. Using cell phenotyping and sorting, we highlighted four cell sub-populations within the bovine mammary gland at puberty. The CD49fhighCD24neg cells expressing CD10, KRT14, vimentin and PROCR corresponded to cells committed to the basal lineage. The CD49flow sub-population contained two cell subsets (CD49flowCD24neg and CD49flowCD24pos). Both subsets expressed hormone receptors including ER, PR and PRLR, as well as ALDH1 activity but only the CD49flowCD24pos subset expressed ELF5. These data indicated that the CD49flow sub-population is mainly composed of cells displaying a luminal phenotype and that this population comprises two luminal cell subsets, namely the CD24neg and CD24pos cells, likely committed to ductal and alveolar lineage, respectively. The putative mammary stem cell (MaSC) fraction was recovered in the CD49fhighCD24pos sub-population which were shown to form mammospheres in vitro. These cells differentially expressed CD10, KRT14 and KRT7, suggesting the existence of several putative MaSC sub-fractions. In-depth characterization of these epithelial sub-populations provides new insights into the bovine mammary epithelial cell lineage and suggests a common developmental lineage in mammals.

Depuis quelques années, le rôle potentiel de biomarqueur des MP suscite un intérêt croissant mais leur petite taille, comprise entre 0.1µm et 1µm, rend difficile leur détection. La cytométrie de flux (CMF) offre une analyse multiparamétrique, rapide, de milliers d’évènements de façon spécifique et sensible, cependant une adaptation aux MP reste nécessaire afin de garantir une détection précise et standardisée.Les objectifs de ce travail ont été de montrer l’évolution et les spécificités de la CMF des MP et d'évaluer les performances d'un nouveau cytomètre fluo-sensible (le CytoFLEX, Beckman-Coulter) en condition physiopathologique sur des sujets sains et atteints de thrombopénie induite par l'héparine (TIH). Nous avons démontré une amélioration des performances du CytoFLEX associée à un gain de détection de MP chez des sujets sains en comparaison au Gallios. L’application à la cohorte clinique a mis en évidence une augmentation significative des concentrations de MP leucocytaires dans la TIH.Cependant nous avons observé que le gain en sensibilité de fluorescence s’accompagne de détection non spécifique de MP. En conclusion, notre étude montre une amélioration de détection des MP par CMF avec le CytoFLEX mais montre les difficultés liées à la détection de petites MP en raison de leur proximité avec le bruit de fond de fluorescence. Ceci montre la nécessité de développer des outils et stratégies permettant un dosage sensible, spécifique et reproductible assurant une meilleure définition de l'intérêt des MP comme biomarqueur clinique.

Récolte de sperme sur des poissons zèbres mutés pour analyse en cytométrie de flux. 2. Journées des Installations Expérimentales LPGP

Background Spore-forming bacteria are a major cause of food spoilage and food poisoning. Spores that resist physical and chemical treatments used in the food industry may germinate and multiply. Spore germination, outgrowth and growth constitute a complex and highly heterogeneous process. Scope and approach Various techniques and methods can be used to observe the germination, outgrowth and early multiplication process of spore-forming bacteria and/or to quantify the impact of environmental conditions on its progress over time within a spore population. These techniques can be classified by different criteria: (i) the scale of analysis, from populations or cells to molecules, and (ii) the number of analyzed objects (cells) and (iii) the potential of the method to describe and/or quantify the impact of lethal or sub-lethal treatments or environmental conditions. Such treatments are applied to a spore population or a single spore and take into account parameters at the cellular level (growth capacity, morphological properties) to molecular level (proteomics, transcriptomics, spore molecular composition). Key findings and conclusion A better understanding and quantification of the germination, outgrowth and growth process require the implementation of several complementary methods. Methods providing information at single and population levels, as well as at molecular and cellular levels, are essential to assess and control the fate of spore-forming bacteria development in food systems.

Congenital macrothrombocytopenia is a family of rare diseases, of which a significant fraction remains to be genetically characterized. To analyze cases of unexplained thrombocytopenia, 27 individuals from a patient cohort of the Bleeding and Thrombosis Exploration Center of the University Hospital of Marseille were recruited for a high-throughput gene sequencing study. This strategy led to the identification of two novel FLI1 variants (c. 1010G>A and c. 1033A>G) responsible for macrothrombocytopenia. The FLI1 variant carriers' platelets exhibited a defect in aggregation induced by low-dose adenosine diphosphate (ADP), collagen and thrombin receptor-activating peptide (TRAP), a defect in adenosine triphosphate (ATP) secretion, a reduced mepacrine uptake and release and a reduced CD63 expression upon TRAP stimulation. Precise ultrastructural analysis of platelet content was performed using transmission electron microscopy and focused ion beam scanning electron microscopy. Remarkably, dense granules were nearly absent in the carriers' platelets, presumably due to a biogenesis defect. Additionally, 25-29% of the platelets displayed giant a-granules, while a smaller proportion displayed vacuoles (7-9%) and autophagosome-like structures (0-3%). In vitro study of megakaryocytes derived from circulating CD34(+) cells of the carriers revealed a maturation defect and reduced proplatelet formation potential. The study of the FLI1 variants revealed a significant reduction in protein nuclear accumulation and transcriptional activity properties. Intraplatelet flow cytometry efficiently detected the biomarker MYH10 in FLI1 variant carriers. Overall, this study provides new insights into the phenotype, pathophysiology and diagnosis of FLI1 variant-associated thrombocytopenia.

L’objectif de l’étude était de déterminer la faisabilité d’un criblage haut-débit de spores fongiques issues de transformation, permettant l’insertion d’un transgène d’intérêt. Cette étape est aujourd’hui dépendante de marqueurs antibiotiques assurant la sélection des clones. Une alternative a été identifiée via des marqueurs fluorescents, présentant l’avantage de ne pas créer de souches potentiellement multi-résistantes, mais aussi d’être réutilisés successivement (recyclage possible). Cependant, leur mise en œuvre repose sur la capacité à détecter la fluorescence, si possible à haut-débit du fait du faible rendement de transformation (30 pour 1 million). C’est dans ce contexte qu’un protocole de cytométrie en flux (CMF) a été évalué pour sélectionner des spores fongiques. Pour cela, de nombreux paramètres ont dû être adaptés (vitesse, concentration, taille, intensité laser, débit…) pour parvenir à la détermination d’un fenêtrage dédié, permettant d’identifier les spores fluorescentes viables, des spores non fluorescentes et/ou sénescentes. Une fois l’outil mis en place, huit promoteurs constitutifs et quatre constructions contenant le promoteur de cellulases pCBHI ont été étudiés. Ce criblage a également permis de comparer deux variants de la Green Fluorescent Protein (GFP) : L et EGFP. Ce-dernier a été issu d’une optimisation de codons, afin d’obtenir un variant EGFP dédié à l’étude de T. reesei. Celui-ci a donné les meilleures expressions de fluorescence, en particulier lorsqu’il était placé sous le contrôle du promoteur pTEF, pPKI ou pCBHIC. Le suivi cinétique de l’intensité fluorescente de t0 à t+24h, combiné aux indicateurs de viabilité cellulaires ont également permis de suivre à la fois la croissance et l’expression de la protéine d’intérêt. De plus, la comparaison de 9 transformants pTEF-EGFP a permis de mettre exergue un effet transformant conséquent, soit une variation de l’expression de fluorescence de l’ordre de x 2,5. En conclusion, la présente étude a établi la faisabilité d’un passage des marqueurs de sélection de type antibiotique vers une alternative fluorescente. Pour cela, la CMF offre un fort potentiel pour la détection haut-débit qui sera nécessaire à l’analyse de millions de clones. Diverses perspectives ont été proposées, notamment en s’appuyant sur un trieur cellulaire afin d’isoler la population transformée par CMF.

MEMS and NEMS allow sensitive and precise mass detection consistent with micro- and bio- objects analysis. These systems are promising for biomedical research and particle metrology, and can be easily integrated in miniaturized multifunctional systems. Thererfore, characterization in liquid media remains tricky due to viscous dissipation consequent to the movement induced in the fluidic environment.In order to overcome this technological lock, our laboratory previously designed and fabricated specific MEMS devices for fluidic analysis; these thin plate resonators with and embedded microchannel are actuated in liquid media, with four capacitive electrodes providing both actuation and detection. The circulating fluid mass can be precisely measured by monitoring the device’s resonant frequency. The long-term objective is to be able to detect and weigh one single particle transported by the fluid.Two main objectives were fulfilled during these three years. First, the MEMS behaviour in presence of various liquids was evaluated, providing a fine-grained analysis of their performances as mass sensors. The measured resolution of our sensors is about a few g.L-1 with a sensitivity of 100 Hz.(g.m-3)-1.Meanwhile, a new generation of NEMS sensors with innovative features was designed; the objective is to decrease the effective mass and reduce the frequency noise, both for a better mass resolution.This thesis includes four chapters. The first one consists in a review of the existing techniques for particles characterization in fluid as well as MEMS and NEMS solutions for particles metrology described in the litterature. The second part of the manuscript presents the results of the experimental characterizations carried out on the first generation of sensors. The third chapter gathers the conclusions of these measurements and gives an outlook on possible improvements on both the design and the characterization of the sensors. At last, the fourth part describes the new generation of devices and discusses their characteristics in terms of expected resolution and applications., Les systèmes MEMS et NEMS permettent, par résonance mécanique, des mesures de masse avec une sensibilité et une résolution propices à la caractérisation d'objets de taille micro- et nanométrique. Ces dispositifs, adaptés à une intégration dans des systèmes d'analyse miniatures plus complexes, sont d'intérêt pour la recherche biomédicale et la détection de particules. Toutefois la caractérisation en milieu liquide reste à ce jour délicate, principalement à cause de phénomènes dissipatifs associés à la mise en mouvement du fluide environnant le dispositif vibrant.Afin de lever ce verrou, l’équipe au sein de laquelle s’est déroulée cette thèse a développé des MEMS fluidiques sous forme de plaques minces mises en vibration dans leur plan de manière à limiter l'excitation du fluide environnant. Chaque plaque comporte un canal microfluidique permettant la circulation d'un liquide dont la masse moyenne est précisément déterminée par la fréquence de résonance du système. A terme, l'ambition de ces systèmes est de parvenir à révéler, par un décalage en fréquence, le passage au sein de la plaque vibrante d’une particule unique transportée par le liquide.Deux objectifs ont été atteints dans le cadre de cette thèse. D'une part, le comportement de ces structures en présence de divers liquides a été finement caractérisé ce qui a permis d’évaluer leurs performances réelles en fonction des conditions d'excitation. La résolution mesurée pour ces capteurs est de l’ordre de quelques g.L-1, pour une sensibilité d’environ 100 Hz.(g.L-1)-1.D'autre part, une nouvelle génération de capteurs aux caractéristiques innovantes a été conçue en vue d’abaisser le seuil de détection en diminuant la masse des résonateurs et en améliorant le bruit en fréquence.Ce manuscrit sera articulé autour de quatre chapitres. Le premier propose un état de l’art des techniques existantes pour la caractérisation de particules en fluide, et détaille ensuite les solutions MEMS et NEMS développées à cette fin dans la littérature. Le second chapitre livre les résultats issus de la caractérisation d’une première génération de MEMS fluidiques. Le troisième décrit les observations et mesures réalises, et propose des perspectives d’amélioration de ces composants ainsi que de leur protocole de caractérisation. Enfin, on présente dans le dernier chapitre une nouvelle génération de NEMS conçue et fabriquée au cours de cette thèse ; pour finir sont discutés les choix réalisés et les perspectives d’évolution attendues pour ces composants.

OBJECTIF: Certains patients P-thalassémiques majeurs présentent des hyperlymphocytoses pouvant être importantes. Du fait de l'amélioration de la prise en charge de ces patients, certains atteignent des tranches d'âges où la question du développement d'une hémopathie maligne chronique peut se poser. Il semble doncimportant de caractériser qualitativement et quantitativement ces hyperlymphocytoses. MATÉRIELS ET MÉTHODES : L'étude porte sur une cohorte de 16 patients ?-thalassémiques majeurs, elle se décompose en deux phases. Une phase rétrospective sur 10 ans afin d'étudier l'évolution de la lymphocytose au cours du temps. Une phase prospective dont la finalité est l'étude précise de la composition lymphocytaire. Une analyse est alors réalisée par cytométrie en flux permettant de séparer les différentes sous populations : Lymphocytes TCD4, LymphocytesTCD8, Lymphocytes B et Lymphocytes NK. Une recherche de la clonalité des lymphocytes B est effectuée en parallèle. RÉSULTATS : la lymphocytose peut être très fluctuante au cours du temps chez un même patient. On décrit aussi des périodes d'augmentations progressives sur plus de 3 mois. L'étude prospective montre quant àelle une lymphocytose augmentée par rapport à la population générale, cette augmentation est par ailleurs plus importante chez les patients splénectomisés. Une corrélation inversement proportionnelle entre le ratio LyTCD4/LyTCD8 et la ferritinémie est aussi objectivée. DISCUSSION-CONCLUSION : Ces résultats confirment en partie ceux de la littérature. La splénectomie, les transfusions régulières, la surcharge martiale, la carence en zinc ou encore l'infection par le virus de l'hépatite C sont d'autant d'éléments pouvant concourir aux perturbations immunologiques décrites. Les périodes d'augmentations progressives sur 3 mois (suivies d'une période dedécroissance) sont relativement fréquentes chez ces patients, ainsi il parait raisonnable que la question du développement d'un syndrome lymphoprolifératif se pose que lorsque cette augmentation perdure sur 6 mois au moins. Pour aller plus loin, il pourrait être intéressant d'étudier les fonctions immunologiques plus en détailen évaluant la répartition des différentes formes mémoires et effectrices des lymphocytes B et T circulants. Par ailleurs, une étude comparative du répertoire V? du TCR serait également intéressante à réaliser.

Trois leviers ont été identifiés pour prévenir le développement de cette flore : les conditions de sporulation, l’intensité du traitement appliqué pour inactiver les spores et les conditions d’incubation. Ce travail de thèse a pour objectif (i) de quantifier l’impact des conditions de sporulation, de traitement et d’incubation sur la capacité des spores à former des colonies, (ii) de quantifier l’impact des conditions de sporulation, de traitement et d’incubation sur les cinétiques de germination et de reprise de croissance et (iii) de corréler les différences de comportements observées et le protéome de spores produites dans différentes conditions. Dans un premier temps, un modèle mathématique a été développé pour décrire et quantifier l’impact des conditions d’incubation sur la capacité des spores à former des colonies après un traitement thermique. Ce modèle intègre uniquement des paramètres physiologiques, les limites de croissance des souches étudiées. La germination et la reprise de croissance est un processus complexe au cours duquel les spores passent par plusieurs stades successifs : spores dormantes, spores germées et cellules végétatives. Afin de quantifier l’impact des conditions de sporulation, de traitement thermique et d’incubation sur chacun de ces stades, une méthode par cytométrie en flux a été développée. Elle a permis de suivre l’évolution de chaque stade au cours du temps et un modèle primaire a été proposé afin de décrire l’évolution de chacun de ces stades. A partir de ce modèle il a été possible de décrire l’impact des différentes conditions de sporulation, de traitement thermique et d’incubation sur cette évolution et un modèle secondaire a été développé pour quantifier l’impact de ces facteurs sur les cinétiques de germination et de reprise de croissance. Afin de corréler les différences de comportement avec la composition protéique des spores, une analyse protéomique a été réalisée sur des spores produites dans différentes conditions. Ces travaux permettent de mieux appréhender le comportement de germination et de reprise de croissance des spores bactériennes. De plus, les résultats apportés ainsi que les modèles mathématiques développés dans cette thèse pourront permettre de mieux contrôler la flore sporulées en industrie agro-alimentaire, connaissant l’impact des conditions de stockage et de formulation des produits, comme la température et le pH, sur le comportement des spores.

A new diagnostic marker of the chronic myelo-monocytic leukemia (CMML), based on the phenotype of circulating monocytes by flow cytometry, has been recently published by Selimoglu-Buet et al. Thus, a percentage of monocytes that do not express CD16 (MO1) greater than or equal to 94% of total monocytes has excellent specificity and sensitivity for diagnosis of CMML. In our laboratory, the results of the complete blood count are made by the analyzer couple DXH800 - flow cytometry with the solution Hématoflow (Beckman Coulter, Brea, CA). This strategy provides the percentage of MO1 on a routine blood count. The main objective of this work is to demonstrate the interest of the HematoFlow (HF) for the diagnosis of CMML, through a retrospective study conducted at the University Hospital of Rennes. Secondarily, on a prospective cohort we studied the correlation between HF and conventional flow cytometry for the quantification of MO1, actually implemented in our diagnostic work-up for chronic monocytosis. Finally, we evaluated the relevance of the association of two techniques for the diagnosis of CMML.; Un nouveau marqueur diagnostique de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC), basé sur l'immunophénotypage des monocytes sanguins par cytométrie en flux conventionnelle, a été récemment publié par Selimoglu-Buet et al. Ainsi, un pourcentage de monocytes CD16-négatifs (MO1) supérieur ou égal à 94% des monocytes totaux présente une excellente spécificité et sensibilité pour le diagnostic de LMMC. Dans notre laboratoire, la stratégie de rendu en routine des numérations formules sanguines, utilise le couple analyseur DXH800 – cytométrie en flux avec la solution HématoFlowTM (Beckman Coulter, Brea, CA). Cette stratégie permet d’obtenir sur une formule de routine le pourcentage de MO1. L’objectif principal de ce travail, grâce à une étude rétrospective menée au CHU de Rennes, est de démontrer l'intérêt de l’HematoFlow (HF) pour le diagnostic de LMMC. Secondairement, sur une cohorte prospective, nous avons étudié la corrélation entre la technique HF et la cytométrie en flux conventionnelle, technique de référence mise en place au laboratoire, pour la quantification des MO1. Enfin, nous avons évalué la pertinence de l’association des deux techniques pour le diagnostic de LMMC.

National audience; The aim of the present work was to investigate the features of satellite cells and other adult stem cells in skeletal muscle. Satellite cells are located between the basal membrane and the sarcolemma of each muscle fiber. First, we developed a mode! based on muscle satellite cell c ulture to investigate the regulation of adult Myosin Heavy Chain (MyHC) isoform expression in pig muscle. Satellite cells were harvested from the mostly fast-twitch glycolytic longissimus (LM) muscle collected at the fast rib leve!, and the predominantly slow-twitch oxidative rhomboideus (RM) muscle of 6-week-old piglets. Then, we investigated more extensively the features of ali adult stem cells in both muscles of growing and adult pigs using flow cytometry. The first study demonstrated that satellite cells from LM and RM only expressed the embryonic and fetal MyHC isoforms in ce li culture, without any of the adult MyHC isoforms expressed in vivo. The second study clearly indicated that adult stem cells from pig skeletal muscles expressed a panel of stem ce li markers exhibiting age-related changes.

International audience; LecA and LecB tetrameric lectins take part in oligosaccharide-mediated adhesion-processes of Pseudomonas aeruginosa. Glycomimetics have been designed to block these interactions. The great versatility of P. aeruginosa suggests that the range of application of these glycomimetics could be restricted to genotypes with particular lectin types. The likelihood of having genomic and genetic changes impacting LecA and LecB interactions with glycomimetics such as galactosylated and fucosylated calix[4]arene was investigated over a collection of strains from the main clades of P. aeruginosa. Lectin types were defined, and their ligand specificities were inferred. These analyses showed a loss of lecA among the PA7 clade. Genomic changes impacting lec loci were thus assessed using strains of this clade, and by making comparisons with the PAO1 genome. The lecA regions were found challenged by phage attacks and PAGI-2 (genomic island) integrations. A prophage was linked to the loss of lecA. The lecB regions were found less impacted by such rearrangements but greater lecB than lecA genetic divergences were recorded. Sixteen combinations of LecA and LecB types were observed. Amino acid variations were mapped on PAO1 crystal structures. Most significant changes were observed on LecBPA7, and found close to the fucose binding site. Glycan array analyses were performed with purified LecBPA7. LecBPA7 was found less specific for fucosylated oligosaccharides than LecBPAO1, with a preference for H type 2 rather than type 1, and Lewis(a) rather than Lewis(x). Comparison of the crystal structures of LecBPA7 and LecBPAO1 in complex with Lewis(a) showed these changes in specificity to have resulted from a modification of the water network between the lectin, galactose and GlcNAc residues. Incidence of these modifications on the interactions with calix[4]arene glycomimetics at the cell level was investigated. An aggregation test was used to establish the efficacy of these ligands. Great variations in the responses were observed. Glycomimetics directed against LecB yielded the highest numbers of aggregates for strains from all clades. The use of a PAO1ΔlecB strain confirmed a role of LecB in this aggregation phenotype. Fucosylated calix[4]arene showed the greatest potential for a use in the prevention of P. aeruginosa infections.

La sclérose latérale amyothrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative charactérisée par la perte des neurones moteurs menant à la paralysie et à la mort. Environ 20% des cas familiaux de la SLA sont causés par des mutations de la superoxyde dismutase 1 (SOD1), conduisant vers un mauvais repliement de la protéine SOD1, ce qui a comme conséquence un gain de fonction toxique. Plusieurs anticorps spécifiques pour la forme mal repliée de la protéine ont été générés et utilisés comme agent thérapeutique dans des modèles précliniques. Comment le mauvais repliement de SOD1 provoque la perte sélective des neurones moteurs demeure non résolu. La morphologie, le bilan énergétique et le transport mitochondrial sont tous documentés dans les modèles de la SLA basés sur SOD1, la détérioration des mitochondries joue un rôle clé dans la dégénération des neurones moteurs. De plus, la protéine SOD1 mal repliée s’associe sélectivement sur la surface des mitochondries de la moelle épinière chez les modèles de rongeurs de la SLA. Notre hypothèse est que l’accumulation de la protéine SOD1 mal repliée sur les mitochondries pourrait nuire aux fonctions mitochondriales. À cette fin, nous avons développé un nouvel essai par cytométrie de flux afin d’isoler les mitochondries immunomarquées avec des anticorps spécifiques à la forme malrepliée de SOD1 tout en évaluant des aspects de la fonction mitochondriale. Cette méthode permettra de comparer les mitochondries portant la protéine SOD1 mal repliée à celles qui ne la portent pas. Nous avons utilisé un anticorps à conformation spécifique de SOD1, B8H10, pour démontrer que la protéine mal repliée SOD1 s’associe avec les mitochondries de la moelle épinière des rat SOD1G93A d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries avec la protéine mal repliée SOD1 B8H10 associée à leur surface (B8H10+) ont un volume et une production excessive de superoxyde significativement plus grand, mais possèdent un potentiel transmembranaire comparable aux mitochondries B8H10-. En outre, la présence de la protéine mal repliée SOD1 reconnue par B8H10 coïncide avec des niveaux plus élevés de la forme pro-apoptotique de Bcl-2. L’immunofluorescence de sections de moelle épinière du niveau lombaire avec l’anticorps spécifique à la conformation B8H10 et AMF7-63, un autre anticorps conformationnel spécifique de SOD1, démontre des motifs de localisations distincts. B8H10 a été trouvé principalement dans les neurones moteurs et dans plusieurs points lacrymaux dans tout le neuropile. Inversement, AMF7-63 a marqué les neurones moteurs ainsi qu’un réseau fibrillaire distinctif concentré dans la corne antérieure. Au niveau subcellulaire, SOD1 possèdant la conformation reconnu par AMF7-63 est aussi localisée sur la surface des mitochondries de la moelle épinière d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries AMF7-63+ ont une augmentation du volume comparé aux mitochondries B8H10+ et à la sous-population non marquée. Cependant, elles produisent une quantité similaire de superoxyde. Ensemble, ces données suggèrent qu’il y a plusieurs types de protéines SOD1 mal repliées qui convergent vers les mitochondries et causent des dommages. De plus, différentes conformations de SOD1 apportent une toxicité variable vers les mitochondries. Les protéines SOD1 mal repliées réagissant à B8H10 et AMF7-63 sont présentes en agrégats dans les fractions mitochondriales, nous ne pouvons donc pas prendre en compte leurs différents effets sur le volume mitochondrial. Les anticorps conformationnels sont des outils précieux pour identifier et caractériser le continuum du mauvais repliement de SOD1 en ce qui concerne les caractéristiques biochimiques et la toxicité. Les informations présentes dans cette thèse seront utilisées pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces anticorps., Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder characterized by the loss of motor neurons resulting in paralysis and death. Approximately 20% of familial ALS cases are caused by mutations in superoxide dismutase (SOD1), which leads to misfolding of the SOD1 protein, resulting in a toxic gain of function. Several antibodies have been generated that are specific for the misfolded form of the protein, and have been used as therapeutics in pre-clinical models. How misfolded SOD1 provokes a selective loss of motor neurons remains unresolved. Mitochondrial morphology, bioenergetics and transport are all documented is SOD1-mediated ALS models, thus mitochondrial impairment plays a key role in motor neuron degeneration. Moreover, misfolded SOD1 selectively associates with the surface of spinal cord mitochondria in ALS rodent models. We hypothesize that the accumulation of misfolded SOD1 on mitochondria could impair mitochondrial function. To this end, we developed a novel flow cytometric assay to immunolabel isolated mitochondria with misfolded SOD1 antibodies while also evaluating aspects of mitochondrial function. This method will allow for a comparison of mitochondria bearing misfolded SOD1 to those without. We utilized the B8H10 conformation specific SOD1 antibody to demonstrate that misfolded SOD1 associates with SOD1G93A rat spinal cord mitochondria in a in a time dependent manner. Mitochondria with B8H10-reactive misfolded SOD1 associated with their surface (B8H10+) have a significantly larger volume and produce excessive amounts of superoxide, but have a similar transmembrane potential compared to B8H10- mitochondria. In addition, the presence of B8H10-reactive misfolded SOD1 coincides with higher levels of the pro-apoptotic form of Bcl-2. Staining of lumbar spinal cord sections with both B8H10 and another conformation specific SOD1 antibody, AMF7-63, yielded distinct localization patterns. B8H10 was found predominantly in motor neurons and numerous puncta throughout the neuropil. Conversely, AMF7-63 marked motor neurons as well as a distinctive fibrillar network that was concentrated in the anterior horn. At the subcellular level, AMF7-63-reactive misfolded SOD1 also localized to the mitochondrial surface of spinal cord mitochondria in a time-dependent manner. AMF7-63+ mitochondria have an increased volume compared to B8H10+ mitochondria and the unlabelled subpopulation. However, they produce similar amounts of superoxide. Together, these data suggest that there are multiple species of misfolded SOD1 that converge at the mitochondria to cause damage. Moreover, different SOD1 conformations may ellicit varying toxicities towards mitochondria. Both B8H10 and AMF7-63-reactive misfolded SOD1 are present in aggregates in mitochondrial fractions and can therefore not account for any different effects produced in terms of mitochondrial volume. Conformational antibodies are invaluable tools to identify and characterize the continuum of misfolded SOD1 species with regards to biochemical characteristics and toxicity. The information presented in this thesis will be used in determining the future therapeutic potential of these antibodies.

L'immunophénotypage lymphocytaire sanguin possède une place importante dans la démarche diagnostique deslymphomes en phase leucémique. Dans 20% des diagnostics, la classification de la pathologie n'est pasconfirmée soit par absence de marqueur spécifique, soit parce que l'examen anatomopathologique (« goldstandard ») est non disponible ou non discriminant. Le choix des marqueurs lymphoïdes, la recherche denouveaux marqueurs, et l?interprétation de l'immunophénotypage prennent alors une place importante dans ladémarche diagnostique. Nous avons donc évalué les différents marqueurs du panel lymphocytaire ainsi que denouveaux marqueurs : CD148, CD180 et CD200. Nous avons testé un logiciel de traitement de donnéescytométriques ainsi que quelques-unes de ses fonctionnalités. Dans un premier temps, nous avons déterminé lesintensités moyennes de fluorescence pour chaque marqueur dans la CLL, le MZL, et le MCL utile pour lavalidation quotidienne des immunophénotypages. Dans un second temps, l?étude du panel lymphocytaire amontré des marqueurs discriminants comme des expressions faibles dans la CLL des CD20, FMC7, CD79b, etCD81 ainsi qu'une expression faible des chaines légères ou un CD38 très fort dans le MCL. Les nouveauxmarqueurs apportent des arguments complémentaires dans l?interprétation : un CD200 fort dans la CLL, unCD180 fort dans le MZL et un CD148 fort associé à un CD200 faible dans le MCL. Le logiciel INFINICYTpermet de comparer graphiquement les différentes entités entre elles, et propose des représentations permettantde mettre en avant les marqueurs les plus discriminants comme l?APS. La fonction compas apporte une aidesupplémentaire dans la validation des immunophénotypages grâce à la création d?une base de données maisnécessite une standardisation des protocoles d?analyses. A l'avenir, ce type de logiciel pourra être utilisé dans lavalidation des immunophénotypages, et dans la recherche de nouveaux marqueurs pour la caractérisation dessyndromes lymphoprolifératifs B matures.

Mémoire de DES (Diplôme d'Etudes Spécialisées) tenant lieu de thèse d'exercice.; Bone marrow immunophenotyping by flow cytometry is an essential tool to screen, classify and monitor hematological malignancies. Our aim in the present work is to determine reference values for myeloid and lymphoid bone marrow subpopulations. A major issue for bone marrow cell subsets quantification is contamination by peripheral blood-derived cells which modify cell counts. Thus, in a first step, we validated a criterion for assessing cytometric bone marrow purity. It’s the ratio of immature granulocytes (IGRA) on neutrophils. In a cohort of 106 patients, we have shown that this parameter is highly correlated to the standard Holdrinet method. This first validated cytometric test is unique, easy to calculate, applicable for children and adults, for normal or pathological samples. Secondly we used this cytometric criterion to select 97 cytomorphologically normal, undiluted bone marrow samples, in an oligocentric study with Saint-Etienne and Lyon hospitals. We determined the reference values of 16 subpopulations in 5 age groups, from infants to over 70 years old adults. They are the only values available by flow cytometry for as many populations and for as many age classes. Finally, our study is the last step before testing the capacity of this 8-color tube to screen hematological disorders in bone marrow samples.; L'immunophénotypage de la moelle osseuse par cytométrie en flux est un outil indispensable au screening, classement et suivi des hémopathies malignes. Notre objectif dans ce travail est de déterminer des valeurs de référence pour les sous populations lymphoïdes et myéloïdes de la moelle. Un problème important est la fréquente hémodilution des moelles osseuses qui modifie les proportions des populations. Dans un premier temps, nous avons donc validé un critère cytométrique d'appréciation de la pureté médullaire : le rapport des granuleux immatures (GRIM) sur les PNN. Sur une cohorte de 106 patients, nous avons montré que ce paramètre était fortement corrélé à la méthode d'Holdrinet. Il s'agit ainsi du premier critère cytométrique validé. Il est unique, facile à calculer, utilisable chez l'enfant comme chez l'adulte, que la moelle soit normale ou pathologique. Nous avons dans un second temps utilisé ce critère cytométrique pour sélectionner 97 moelles osseuses cytologiquement normales, non diluées, dans une étude oligocentrique avec les CHU de Saint-Etienne et de Lyon et nous avons déterminé les valeurs de référence de 16 sous-populations pour 5 classes d'âge, du bébé à l'adulte de plus de 70 ans. A ce jour, il s'agit des seules valeurs disponibles en cytométrie pour autant de populations et pour tous les âges de la vie. Finalement, notre étude est l’étape ultime avant l’évaluation des capacités de screening des hémopathies de ce tube en 8 couleurs dans la moelle osseuse.

The objective of this study was to make a report of the management of fetomaternal hemorrhage with Kleihauer test above 40/10000 at the CHU of Caen, over five years. The study involved 27 patients. The main indications are bleeding, decreased fetal movements and abdominal trauma. The volume transfused highest average is 72,8mL/kg, that is before delivery of 16,2mL/kg. Measurements of MCA-PSV were in four cases above 1,5MoM. The average hemoglobin at birth was 14,1g/dL. Five children both had to be transfused in the neonatal period.; L’objectif de cette étude était de faire un état des lieux de la prise en charge des hémorragies fœto-maternelles avec un test de Kleihauer supérieures à 40/10000 au CHU de Caen, sur cinq ans. L’étude a concernée 27 patientes. Les principales indications sont les métrorragies, la diminution des mouvements actifs fœtaux et le traumatisme abdominal. Le volume transfusé moyen le plus élevé est de 72,8mL/kg, celui avant l’accouchement est de 16,2mL/kg. Les mesures des PSV-ACM étaient dans quatre cas supérieures à 1,5MoM. Le taux d’hémoglobine moyen à la naissance était de 14,1g/dL. Cinq enfants étaient en anémie et deux ont dû recevoir une transfusion en période néonatale.

Macrocyclic lactones (MLs) are widely used parasiticides against nematodes and arthropods, but resistance is frequently observed in parasitic nematodes of horses and livestock. Reports claiming resistance or decreased susceptibility in human nematodes are increasing. Since no target site directed ML resistance mechanisms have been identified, non-specific mechanisms were frequently implicated in ML resistance, including P-glycoproteins (Pgps, designated ABCB1 in vertebrates). Nematode genomes encode many different Pgps (e.g. 10 in the sheep parasite Haemonchus contortus). ML transport was shown for mammalian Pgps, Pgps on nematode egg shells, and very recently for Pgp-2 of H. contortus. Here, Pgp-9 from the equine parasite Cylicocyclus elongatus (Cyathostominae) was expressed in a Saccharomyces cerevisiae strain lacking seven endogenous efflux transporters. Pgp was detected on these yeasts by flow cytometry and chemiluminescence using the monoclonal antibody UIC2, which is specific for the active Pgp conformation. In a growth assay, Pgp-9 increased resistance to the fungicides ketoconazole, actinomycin D, valinomycin and daunorubicin, but not to the anthelmintic fungicide thiabendazole. Since no fungicidal activity has been described for MLs, their interaction with Pgp-9 was investigated in an assay involving two drugs: Yeasts were incubated with the highest ketoconazole concentration not affecting growth plus increasing concentrations of MLs to determine competition between or modulation of transport of both drugs. Already equimolar concentrations of ivermectin and eprinomectin inhibited growth, and at fourfold higher ML concentrations growth was virtually abolished. Selamectin and doramectin did not increase susceptibility to ketoconazole at all, although doramectin has been shown previously to strongly interact with human and canine Pgp. An intermediate interaction was observed for moxidectin. This was substantiated by increased binding of UIC2 antibodies in the presence of ivermectin, moxidectin, daunorubicin and ketoconazole but not selamectin. These results demonstrate direct effects of MLs on a recombinant nematode Pgp in an ML-specific manner., Author Summary Macrocyclic lactones (MLs) are widely used drugs against parasitic nematodes, but drug resistance is rapidly increasing in prevalence and spatial distribution in parasites of ruminants and horses, and is suspected in human nematodes after mass drug applications. Changes in expression levels or the amino acid sequences of P-glycoprotein (Pgp) transporters have frequently been implicated in ML resistance, but direct evidence for transport of MLs by nematode Pgps is still missing. Here, cloning of pgp-9 of the equine parasite Cylicocyclus elongatus and its functional recombinant expression in a Saccharomyces cerevisiae yeast strain deficient in seven endogenous ABC transporters is described. Expression decreased susceptibility to several fungicidal mammalian Pgp substrates including e.g. actinomycin D and ketoconazole, but had no influence on susceptibility to the benzimidazole thiabendazole, which is active against both, yeasts and nematodes. Addition of some MLs strongly increased ketoconazole susceptibility in yeasts expressing C. elongatus Pgp-9, while other MLs had no effect. These interactions are a strong hint that some MLs act as substrates or at least as inhibitors of Pgp-9 mediated drug transport.