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In dieser Arbeit wurden die Morpho-Physiologie und das Verhalten zweier Arten Afrikanischer schwach elektrischer Fische, Marcusenius victoriae und Petrocephalus degeni, im Labor und in einem ihrer natürlichen Habitate im Lwamunda Sumpf in Uganda untersucht. Die zwei Hauptziele dieser Arbeit waren (i) tageszeitabhängige Verhaltensrhythmen (Aktivität, Habitatnutzung) im Labor und im Freiland zu untersuchen und (ii) die Ausprägung und Plastizität der morpho-physiologischen Merkmale von P. degeni zu untersuchen, die ihnen erlauben bei natürlich vorkommender, geringer Sauerstoffverfügbarkeit (Hypoxie) zu überleben. Tageszeitabhängige Verhaltensrhythmen beider Arten wurden im Labor über 42 Stunden und im natürlichen Habitat dieser Fische für sechs Tage erfasst. In den Laborversuchen verbrachten beide Arten tagsüber annähernd 100% der Zeit in einem bereitgestellten Versteck und schwammen nachts heraus um aktiv ihre Umwelt zu erkunden. Im Habitat wurden die meisten Fische in strukturell komplexen Habitaten unter schwimmenden Pflanzen detektiert. Nachts schwammen die Fische aktiv in die offenen und ungeschützten Bereiche der Lagune, vermutlich um nach Futter zu suchen und zu interagieren. Die Begleitende in-situ Messung der Sauerstoffverfügbarkeit zeigte, dass beide Arten präsent und vermutlich sogar am aktivsten waren während Phasen extremer nächtlicher Hypoxie. Zur Untersuchung der respiratorischen Merkmale von P. degeni wurden Respirometrieversuche mit hypoxie-akklimatisierten Tieren durchgeführt, Hämoglobin- und Laktatkonzentration im Blut gemessen, und morphologische Parameter an den ersten beiden Kiemenbögen erfasst. Die Fische zeigten niedrige Sauerstoffverbrauchsraten, welche sie bis zu einem sehr niedrigem äußeren Sauerstoffpartialdruck aufrechterhielten. Zusätzlich zeigten sie hohe Hämoglobin- und Laktatkonzentrationen im Blut. Bis zu 75 Tage Normoxie-Akklimatisierung führte zu reduzierter Hämoglobinkonzentration und kürzeren Kiemenfilamenten., In this thesis, I investigated the morpho-physiology and behavior of two species of African mormyrid weakly electric fish, Marcusenius victoriae and Petrocephalus degeni, in the laboratory and in one of their natural habitats, the Lwamunda Swamp in Uganda. The two main objectives of this work were to (i) observe behavioral rhythms and habitat use patterns of both species under natural and laboratory conditions, and (ii) assess expression and plasticity of morpho-physiological traits that might enable P. degeni to survive naturally occurring low oxygen conditions (hypoxia). Behavioral rhythms were recorded in the laboratory over 42 hours and in the habitat on six sampling days. In the laboratory, both species spent close to 100% of the time in their shelter during the day and actively explore their environment at night. In the swamp lagoon, fish were most often encountered in structurally complex habitats under floating vegetation and ventured into open and unsheltered areas of the lagoon at night, presumably to forage and interact. Concomitant in-situ oxygen measurements revealed that these fish were present, and presumably most active during periods of extreme nocturnal hypoxia in their swamp habitat. To investigate respiratory traits of swamp-dwelling P. degeni, I conducted respirometry experiments and measured blood lactate and hemoglobin and gill morphometrics on the first two gill arches. Fish showed low routine oxygen consumption rates, which they maintained until a very low ambient oxygen partial pressure was reached. Additionally, they had high concentrations of hemoglobin and lactate in their blood. Up to 75 days of normoxia exposure reduced blood hemoglobin and gill filament length.

The obligate intracellular Gram-negative bacterium Coxiella burnetii replicates within phagocytes and is the causative agent of the zoonotic disease Q fever. Q fever occurs as acute self-limited respiratory infection that becomes chronic and develops into endocarditis in some patients. However, the molecular mechanisms that contribute to the development of chronic Q fever are poorly understood. In this work, we employed different mouse models and infection routes to study the course of the disease upon infection with the attenuated C. burnetii Nine Mile phase II strain (NMII). Since monocytes from patients suffering from chronic Q fever produce high amounts of the regulatory cytokine IL-10, macrophage deactivation by the IL-10-STAT3 pathway may cause inefficient control of NMII. In macIL-10tg mice that overexpress IL-10 in monocytes and macrophages, we observed significantly increased NMII loads in affected organs up to 42 days post intraperitoneal infection. In contrast, intratracheal NMII infections did not lead to a chronic phenotype in macIL-10tg mice. Further, we observed different effects of the two IL-10-induced genes, Dusp1 and Socs3, on the course of infection. Whereas a knockout of Dusp1 in mice did not have any impact on NMII control, a myeloid cell-specific deletion of Socs3 resulted in elevated NMII loads in lungs and spleens of mice after intratracheal infection. Besides IL-10-mediated macrophage deactivation, innate immune recognition of C. burnetii was hypothesized to be another checkpoint determining resolution versus chronicity of Q fever. In mice, recognition of C. burnetii by macrophages requires TLR2 and triggers production of pro- and anti-inflammatory cytokines. In humans, a single nucleotide polymorphism in the gene for the TLR adapter protein MyD88 is associated with the development of chronic Q fever. By employing MyD88-deficient mice, we observed a significantly higher NMII bacterial burden on day 5 and 20 in affected organs following intraperitoneal infection. In addition, intratracheal infection of mice resulted in a higher bacterial load in the lung and increased dissemination of NMII to other organs in MyD88-deficient mice. While wild-type mice essentially cleared NMII on day 27 after intratracheal infection, it was still readily detectable on day 42 in multiple organs in the absence of MyD88. Despite the elevated bacterial load, Myd88-/- mice had less granulomatous inflammation and expressed significantly lower levels of chemoattractants, inflammatory cytokines, and the IFNg-induced genes Nos2, Gbp1, Ido1 and Acod1 that are relevant for control of intracellular pathogens. These IFNg- V induced genes were validated in vitro using BMM generated from the corresponding knock out mice. Lack of Acod1, encoding the enzyme IRG1 which converts citrate to itaconate, most significantly impaired bacterial control in macrophages in vitro. In vivo, C. burnetii-infected IRG1-deficient mice showed significantly increased weight loss, increased expression of pro-inflammatory genes in spleen and lungs, and higher bacterial burden in lung tissue. These findings underpin the importance of MyD88- induced expression of IRG1 for a protective host response to C. burnetii and its role for the resolution of Q fever. Together, the establishment of different mouse models for Q fever allowed us to identify several disease-regulating host factors, which will serve as a basis for future research to determine the exact molecular mechanisms driving either chronicity or resolution of Q fever. Das obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii vermehrt sich in Phagozyten und ist der Erreger der Zoonose Q-Fieber. Q-Fieber tritt als akute selbstlimitierende, mitunter chronische Atemwegsinfektion auf. Zudem entwickelt sich bei einigen Patienten eine Endokarditis. Die molekularen Mechanismen, welche zur Entstehung von chronischem Q-Fieber beitragen, sind jedoch nur unzureichend verstanden. In dieser Arbeit verwendeten wir verschiedene Mausmodelle und Infektionswege, um die Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf bei Infektionen mit dem attenuierten C. burnetii Nine Mile Phase II-Stamm (NMII) zu untersuchen. Es wird vermutet, dass die Deaktivierung von Makrophagen durch den IL-10-STAT3- Signalweg zu einer ineffizienten Kontrolle von NMII führt, da hohe Mengen des regulatorischen Zytokins IL-10 im Blut von Patienten mit chronischem Q-Fieber gefunden wurden. In macIL-10tg-Mäusen, die IL-10 in Monozyten und Makrophagen überexprimieren, beobachteten wir bis Tag 42 nach intraperitonealen Infektion eine signifikant erhöhte NMII-Last in befallenen Organen. Im Gegensatz dazu führten intratracheale NMII-Infektionen bei der Mehrzahl der macIL-10tg-Mäuse nicht zu einem chronischen Phänotyp. Darüber hinaus beobachteten wir unterschiedliche Auswirkungen der beiden IL-10-Zielgene Dusp1 und Socs3 auf den Verlauf der Infektion. Während das Abschalten von Dusp1 bei Mäusen keinen Einfluss auf die NMII-Kontrolle hatte, führte eine myeloisch-zellspezifische Deletion von Socs3 zu erhöhten NMII-Lasten in Lunge und Milz bis zu 14 Tage nach intratrachealer Infektion. Neben der IL-10-vermittelten Makrophagen-Deaktivierung trägt auch die angeborene Immunerkennung von C. burnetii zur Entscheidung zwischen Beendigung der Infektion und Chronizität bei. So erfordert die Erkennung von C. burnetii durch Makrophagen TLR2 und löst die Produktion von pro- und anti-entzündlichen Zytokinen aus. Ein Einzelnukleotid-Polymorphismus im Gen für das TLR-Adapterprotein MyD88 ist mit der Entwicklung von chronischem Q-Fieber in Menschen assoziiert. In MyD88- defizienten Mäusen konnte 5 und 20 Tage nach intraperitonealer Infektion eine signifikant höhere NMII-Bakterienlast in betroffenen Organen gemessen werden. Im Gegensatz dazu führte eine intratracheale Infektion von Mäusen mit MyD88-Defizienz zu einer höheren Bakterienlast in der Lunge und zu einer vermehrten Ausbreitung von NMII zu anderen Organen. Während Wildtyp-Mäuse NMII im Wesentlichen am Tag 27 nach der intratrachealen Infektion eliminierten, waren die Bakterien bei Defizienz von VII MyD88 noch an Tag 42 in mehreren Organen nachweisbar. Trotz der erhöhten Bakterienlast wiesen Myd88-/- Mäuse weniger granulomatöse Entzündungen auf und exprimierten signifikant niedrigere Konzentrationen von Chemoattraktanten, von Entzündungsbotenstoffen und von den IFNg induzierten Genen Nos2, Gbp, Ido1 und Acod1, die für die Kontrolle intrazellulärer Pathogene relevant sind. Diese IFNg- induzierten Gene wurden in vitro mit aus Knochenmark generierten Makrophagen validiert, das aus entsprechenden Knock-out-Mäusen generiert wurde. Das Fehlen von Acod1, welches das Enzym IRG1 kodiert, welches wiederum Zitrat in Itakonat umwandelt, beeinträchtigte die Kontrolle der bakteriellen Infektion in Makrophagen in vitro am stärksten. In vivo zeigten C. burnetii-infizierte IRG1-defiziente Mäuse eine signifikant erhöhte Gewichtsabnahme, eine erhöhte Expression von entzündungs- fördernden Genen in Milz und Lunge und eine höhere Bakterienlast im Lungengewebe. Diese Befunde verdeutlichen die Bedeutung der MyD88-induzierten Expression von IRG1 für eine schützende Wirtsreaktion gegen C. burnetii und für die Auflösung des Q-Fiebers. Zusammenfassend ermöglichte uns die Etablierung verschiedener Maus- modelle für Q-Fieber die Identifizierung mehrerer krankheitsfördernder Wirtsfaktoren, die als Grundlage für zukünftige Forschung dienen werden, um die genauen molekularen Mechanismen zu bestimmen, die entweder zur Chronifizierung oder Auflösung von Q-Fiebers beitragen.

Depressive disorders represent one of the main sources for the loss of healthy years of life. One of the reasons for this circumstance is the recurrent course of these disorders, which can be interrupted by current therapeutic approaches, especially in the shortterm, but seem to be maintained at least in part in the long-term. Subsequently, on one hand, this thesis deals with methodological measurement issues in the longitudinal prediction of depressive courses. On the other hand, it addresses two currently discussed neuroscience-based treatment approaches, which are investigated experimentally in a basic-psychological manner and reviewed in the light of their potential to translate results to the application in patient care. These two approaches each address potential mechanisms that may negatively impact long-term disease trajectories: First, stable endophenotypes for vulnerability factors that could regain control over the organism and reactivate maladaptive experiences, or behaviors with increasing temporal distance from therapeutic methods are focused on. In the studies presented, these were influenced by a recently rediscovered method of neuromodulation (transcranial low-intensity focused ultrasound) which is discussed in light of its unique capability to address even deepest, subcortical regions at a high spatial resolution. Lastly, as a second approach, an experimental design for the use of reconsolidation interference is presented, which could provide a first insight into the applicability of corresponding protocols in the field of depressive disorders and thus contribute to the modification, instead of inhibition, of already mentioned endophenotypes. In sum, methodological considerations for monitoring and predicting long-term courses of depression are deducted before two approaches are discussed that could potentially exert positive influences on the recurrent nature of depressive symptoms on their own, in combination with each other, or as augmentation for existing therapeutic procedures., Depressive Erkrankungen stellen eine der Hauptquellen für das Einbußen gesunder Lebensjahre dar. Einer der Gründe für diesen Umstand liegt im rezidivierenden Verlauf dieser Erkrankungen, der auch durch bisherige Therapieansätze vor allem kurzfristig unterbrochen werden kann, jedoch langfristig zumindest in Teilen erhalten zu bleiben scheint. Daran anschließend befasst sich die hier vorgelegte Thesis zum einen mit der Messproblematik longitudinaler Vorhersagen depressiver Verläufe und zum anderen mit zwei aktuell diskutierten neurowissenschaftlich begründeten Behandlungsansätzen, die experimentellgrundlagenpsychologisch aufgearbeitet und im Lichte eines translationalen Ansatz hin zur Anwendung in realen Patientensituationen erörtert werden. Die beiden genannten Ansätze adressieren dabei jeweils Mechanismen, die sich negativ auf langfristige Krankheitsverläufe auswirken können: Zunächst werden hier stabile Endophänotypen für Vulnerabilitätsfaktoren, die mit zunehmendem zeitlichem Abstand zu Therapiemethoden erneut Kontrolle über den Organismus gewinnen und maladaptives Erleben und Verhalten reaktivieren könnten, in den Fokus gestellt. Diese wurden in den hier vorgestellten Studien mit einer vor wenigen Jahren wiederentdeckten Methode der Neuromodulation (transkranieller, niedrigintensiver, fokussierter Ultraschall) beeinflusst und vor dem Hintergrund der einzigartigen Möglichkeit dieser Technik, auch tiefste, subkortikale Regionen bei hoher räumlicher Auflösungsfähigkeit adressieren zu können, diskutiert. Zuletzt wird ergänzend, als zweiter Ansatz, ein experimentelles Design zur Nutzung der Rekonsolidierungsbeeinflussung vorgestellt, das erste Informationen über die Anwendbarkeit entsprechender Protokolle im Bereich der depressiven Erkrankungen liefern und somit zur Veränderung, Anstelle von Inhibition bereits genannter Endophänotypen beitragen könnte. Zusammengenommen ergeben sich hieraus zunächst allgemeine methodische Überlegungen für das Überwachen und Vorhersagen langfristiger Verläufe der Depressionen, aber auch zwei Ansätze, die für sich genommen, in Kombination miteinander oder auch als Augmentation für bestehende Therapieverfahren, potentiell positive Einflüsse auf die rezidivierende Natur dieser Diagnosegruppe haben könnten.

PURPOSE. Cone photoreceptors of the retina use a sophisticated ribbon-containing synapse to convert light-dependent changes in membrane potential into release of synaptic vesicles (SVs). We aimed to study the functional and structural maturation of mouse cone photoreceptor ribbon synapses during postnatal development and to investigate the role of the synaptic ribbon in SV release. METHODS. We performed patch-clamp recordings from cone photoreceptors and their postsynaptic partners, the horizontal cells during postnatal retinal development to reveal the functional parameters of the synapses. To investigate the occurring structural changes, we applied immunocytochemistry and electron microscopy. RESULTS. We found that immature cone photoreceptor terminals were smaller, they had fewer active zones (AZs) and AZ-anchored synaptic ribbons, and they produced a smaller Ca2+ current than mature photoreceptors. The number of postsynaptic horizontal cell contacts to synaptic terminals increased with age. However, tonic and spontaneous SV release at synaptic terminals stayed similar during postnatal development. Multiquantal SV release was present in all age groups, but mature synapses produced larger multiquantal events than immature ones. Remarkably, at single AZs, tonic SV release was attenuated during maturation and showed an inverse relationship with the appearance of anchored synaptic ribbons. CONCLUSIONS. Our developmental study suggests that the presence of synaptic ribbons at the AZs attenuates tonic SV release and amplifies multiquantal SV release. However, spontaneous SV release may not depend on the presence of synaptic ribbons or voltagesensitive Ca2+ channels at the AZs. Mammalian cone photoreceptors enable through their sophisticated synapse the high-fidelity transfer of visual information to second-order neurons in the retina. The synapse contains a proteinaceous organelle, called the synaptic ribbon, which tethers synaptic vesicles (SVs) at the active zone (AZ) close to voltage-gated Ca2+ channels. However, the exact contribution of the synaptic ribbon to neurotransmission is not fully understood, yet. In mice, precursors to synaptic ribbons appear within photoreceptor terminals shortly after birth as free-floating spherical structures, which progressively elongate and then attach to the AZ during the following days. Here, we took advantage of the process of synaptic ribbon maturation to study their contribution to SV release. We performed whole-cell patch-clamp recordings from cone photoreceptors at three postnatal (P) development stages (P8– 9, P12–13, >P30) and measured evoked SV release, SV replenishment rate, recovery from synaptic depression, domain organization of voltage-sensitive Ca2+ channels, and Ca2+-sensitivity of exocytosis. Additionally, we performed electron microscopy to determine the density of SVs at ribbon-free and ribbon-occupied AZs. Our results suggest that ribbon attachment does not organize the voltage-sensitive Ca2+ channels into nanodomains or control SV release probability. However, ribbon attachment increases SV density at the AZ, increases the pool size of readily releasable SVs available for evoked SV release, facilitates SV replenishment without changing the SV pool refilling time, and increases the Ca2+ sensitivity of glutamate release. It is a commonly accepted view that light stimulation of mammalian photoreceptors causes a graded change in membrane potential instead of developing a spike. The presynaptic Ca2+ channels serve as a crucial link for the coding of membrane potential variations into neurotransmitter release. Cav1.4 L-type Ca2+ channels are expressed in photoreceptor terminals, but the complete pool of Ca2+ channels in cone photoreceptors appears to be more diverse. Here, we discovered, employing whole-cell patch-clamp recording from cone photoreceptor terminals in both sexes of mice, that their Ca2+ currents are composed of low- (T-type Ca2+ channels) and high- (L-type Ca2+ channels) voltage-activated components. Furthermore, Ca2+ channels exerted self-generated spike behavior in dark membrane potentials, and spikes were generated in response to light/ dark transition. The application of fast and slow Ca2+ chelators revealed that T-type Ca2+ channels are located close to the release machinery. Furthermore, capacitance measurements indicated that they are involved in evoked vesicle release. Additionally, RT-PCR experiments showed the presence of Cav3.2 T-type Ca2+ channels in cone photoreceptors but not in rod photoreceptors. Altogether, we found several crucial functions of T-type Ca2+ channels, which increase the functional repertoire of cone photoreceptors. Namely, they extend cone photoreceptor light-responsive membrane potential range, amplify dark responses, generate spikes, increase intracellular Ca2+ levels, and boost synaptic transmission.

Vor- und Nachteile bestimmter Ernährungsbestandteile sind seit Jahrhunderten bekannt. Auch heute noch wird in der ganzheitlichen Medizin ein großer Wert auf die Ernährung gelegt. Alkohol ist wegen seiner angstlösenden Wirkung eine der am meisten konsumierten Substanzen weltweit. Gleichzeitig ist Alkohol aufgrund seines hohen Suchtpotentials eine der am häufigsten missbrauchten Substanzen. Die Folgen des Alkoholmissbrauchs sind erhöhte Risiken für Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems, der Leber und des Nervensystems. Außerdem wurde festgestellt, dass das Risiko für die Entwicklung von Krebserkrankungen in Mund, Rachen und Leber bei chronischem Alkoholkonsum erhöht ist. Alkoholkonsum wurde auch mit einer verminderten Funktion des Immunsystems in Verbindung gebracht. Dennoch ist Alkoholkonsum ein Schutzfaktor für die Entwicklung von Autoimmunkrankheiten wie Typ-1-Diabetes, Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis (RA) und systemischer Lupus erythematodes (SLE). Der zugrundeliegende Mechanismus für diesen toleranzinduzierenden Effekt von Alkohol ist jedoch unbekannt. Hier zeigen wir, dass der Hauptmetabolit von Alkohol, Acetat, vor Autoimmunkrankheiten wie RA schützt. Acetat ist eine natürlich vorkommende kurzkettige Fettsäure, die durch die Fermentation von Ballaststoffen durch kommensale Darmbakterien entsteht. Es wurde gezeigt, dass eine erhöhte Ballaststoffzufuhr den systemischen Acetatspiegel beim Menschen erhöhen kann. Daher war es interessant zu untersuchen, ob die schützende Wirkung von Alkohol durch Acetat hervorgerufen werden kann, wodurch der Alkoholkonsum durch eine ballaststoffreiche Ernährung ersetzt werden könnte. Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Daten eine Akkumulation von Acetat in sekundären lymphatischen Organen von mit Alkohol gefütterten Mäusen. Darüber hinaus verändern Alkohol sowie sein Metabolit Acetat den Funktionszustand von follikulären T-Helferzellen (TFH) in vitro und in vivo und üben dadurch immunregulatorische und toleranzinduzierende Eigenschaften aus. Neben einer reduzierten TFH-Zellpopulation sind auch deren Bcl6-, PD-1- und IL-21-Proteinsexpression vermindert. Es kommt zu einer reduzierten Bildung von TFH:B-Zell-Konjugaten an der T:B-Zell-Zonengrenze in den sekundären lymphatischen Organen (SLOs). Darüber hinaus deuten die Daten auf Veränderungen der intrazellulären Physiologie der T-Zellen hin, wie z. B. erhöhte Ca2+- und pH-Werte, reduziertes Aktin-Zytoskelett, erhöhte nukleäre NFAT-Persistenz und reduzierte CD62L Expression, ein wichtiges „Homing“-Molekül für die Migration zu SLOs. Die Daten deuten auch darauf hin, dass die Auswirkungen von Alkohol und Acetat nur auf T-Zell-abhängige humorale Antworten beschränkt sind. Demzufolge verursacht die Acetat-Exposition eine verringerte Autoantikörper-Antwort und schützt somit vor Autoimmunität, schwächt aber auch die humorale Antwort auf Impfungen. Benefits and harms of different components of human diet have been known for hundreds of years. Even today, holistic medical practice puts a great emphasis on diet. Alcohol is one the highest consumed substances worldwide for its anxiolytic effect. At the same time, alcohol is one of the most abused substances due to its’ addictive properties. Consequences of alcohol abuse are increased risks for diseases of cardiovascular system, liver, and nervous system. In addition, risks of developing cancers of mouth, throat and liver have been found to be increased in chronic alcohol consumers. Alcohol consumption has also been linked to reduced immune system function. Nevertheless, alcohol consumption is a consistent protective factor for the development of autoimmune diseases such as, type 1 diabetes, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE). The underlying mechanism for this tolerance-inducing effect of alcohol, however, is unknown. Here we show that the major metabolite of alcohol, acetate, protects against autoimmune diseases such as RA. Acetate is a naturally occurring short chain fatty acid, produced by the fermentation of dietary fiber by commensal bacteria of the gut. It has been shown that increased fiber intake can increase systemic acetate levels in humans. Therefore, it was interesting to investigate whether the protective effects of alcohol can be elicited by acetate, potentially replacing alcohol consumption with high fiber diet. In summary, data herein indicate an accumulation of acetate in secondary lymphoid organs of alcohol-fed mice. Additionally, alcohol, as well as its metabolite acetate, alter the functional state of T follicular helper (TFH) cells in vitro and in vivo, thereby exerting immune regulatory and tolerance-inducing properties. In addition to reduced TFH cell population, Bcl6, PD-1, and IL-21 protein levels are decreased. There is reduced formation of TFH:B cell conjugates at T:B cell zone border in the secondary lymphoid organs (SLOs). Furthermore, data indicate changes to T cell intracellular physiology, such as increased Ca2+ and pH, reduced actin cytoskeleton, increased nuclear NFAT persistence and reduced CD62L, a major homing molecule for migration to SLOs. Data also indicate the effects of alcohol and acetate to be limited only to T-cell dependent humoral responses. As a result, acetate exposure causes decreased autoantibody response hence protecting against autoimmunity but also weakens humoral response to vaccinations.

Micro-colonisation and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa (PA), an opportunistic gram-negative bacterium, is a major problem in immunocompromised patients. PA biofilm, which has a mushroom morphology in vitro, provides the bacteria with a structural persistence against antibiotic treatment. In vitro experiments have shown that constant exposure of PA biofilm with antibiotics is not an effective strategy to eliminate the bacteria. Biofilm morphologies are critical in optimising and enhancing the potential usage of individuals antibiotics in maximising the eradication of pathogens while at the same time reducing the effect of toxicity to the patients. We developed an agent-based model regarding biofilm formation, studying the effect of different treatment regimens of antibiotics, namely Tobramycin and Colistin. These antibiotics target different viable mechanisms of bacterial homeostasis. Using our antibiotics mode-of-action model embedded within our agent-based model, helped by a stochastic optimisation tool, namely Differential Evolution, we optimised the antibiotics treatment strategy concerning the duration and the amount of deployed antibiotic to reach a better PA clearance. Our model shows the efficiency of Colistin treatment, even in a very low dose, which targets the cell membrane irrespective of the bacterial metabolic state. In contrast, Tobramycin blocks protein synthesis and depends upon cellular nutrient uptake. Our results suggest that with a combined switching therapy in which at least two viable mechanisms of bacterial homeostasis are the targets, elimination of bacteria is more effective than using a single antibiotic. Our mathematical analyses, including our optimisation, suggest few schemes or patterns for antibiotics deployment that are suitable for Tobramycin and Colistin when biofilm treated with single antibiotic or with combinations. These schemes show an event where the biofilm is the most vulnerable, and we could simulate the best eradication. Our results suggest that our steady-state morphological behaviours indicate the persistence of biofilm stature and infections and could be brought forward to designing new antibiotics treatment regimens against lung biofilm infections., Die Mikrokolonisierung und Biofilmbildung von Pseudomonas aeruginosa (PA), einem opportunistischen gramnegativen Bakterium, ist ein Hauptproblem bei immungeschwächten Patienten. PA-Biofilm, der eine Pilzmorphologie in vitro aufweist, verleiht den Bakterien eine strukturelle Persistenz gegen die Behandlung mit Antibiotika. In-vitro -Experimente haben gezeigt, dass eine konstante Exposition von PA-Biofilm mit Antibiotika keine wirksame Strategie zur Beseitigung der Bakterien darstellt. Biofilm morphologien sind kritisch und entscheidend für die Optimierung und Verbesserung des potenziellen Einsatzes von Antibiotika bei Einzelpersonen, um die Verdrängung von Krankheitserregern von PA zu maximieren und gleichzeitig die Auswirkungen der Toxizität auf die Patienten zu verringern. Wir haben agentenbasiertes Modell zur Bildung von Biofilmen entwickelt, in dem die Wirkung verschiedener Behandlungsschemata von Antibiotika, nämlich Tobramycin und Colistin, untersucht wurde. Diese Antibiotika zielen auf verschiedene existenzfähige Mechanismen der bakteriellen Homöostase ab. Mithilfe unseres agentenbasiertes Modell, eingebetteten Wirkungsmodells für Antibiotika und Mithilfe eines stochastischen Optimierungstools, nämlich Differential Evolution Verfahren, haben wir die Strategie zur Behandlung von Antibiotika hinsichtlich der Dauer und der Menge des eingesetzten Antibiotikums optimiert, um eine bessere Therapie gegen PA Biofilm zu realisieren. Unser Modell zeigt die Effizienz der Colistin-Behandlung, selbst in einer sehr geringen Dosis, die unabhängig vom bakteriellen Stoffwechselzustand auf die Zellmembran abzielt. Im Gegensatz dazu, blockiert Tobramycin die Proteinsynthese und hängt von der Aufnahme von Zellnährstoffen ab. Diese Wirkungsmodelle für die einzelnen Anti-Infektiven und ihre Optimierungsregime werden mit den Versuchsaufbauten erneut validiert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass bei einer kombinierten Schalttherapie, bei den mindestens zwei existenzfähigen Mechanismen der bakteriellen Homöostase angestrebt werden, die Eliminierung von Bakterien wirksamer ist als die Verwendung eines einzelnen Antibiotikums. Unsere mathematischen Analysen, einschließlich unserer Optimierung, legen nahe, dass bestimmtes Schema der Flüssigkeitsdurchflüsse für den Einsatz von Antibiotika für Tobramycin und Colistin geeignet sind, wenn der Biofilm mit einem einzelnen Antibiotikum oder mit Kombinationen von Antibiotika behandelt wird. Diese Schemata zeigen ein Ereignis, bei dem der Biofilm am anfälligsten ist, und wir könnten eine Simulation der besten Verdrängung von PA Krankheitserregern erzielen. Unsere Ergeb- nisse deuten darauf hin, dass unser morphologisches Verhalten im Steady-State auf die Persistenz von Biofilmstatur und -infektionen hinweist und zur Entwicklung neuer Antibiotika-Behandlungsschemata gegen Lungenbiofilminfektionen beitragen könnte.

The disease Malaria, caused by parasites of the Plasmodium spp. is one of many neglected tropical diseases. With 241 million cases and 627,000 deaths (2020) it is one of the most dangerous infectious diseases. As currently available treatments and preventive measures are insufficient for battling Malaria, alternatives are needed. In this study, a broad number of fully human monoclonal antibodies were generated by utilizing antibody phage display technology. These antibodies bind to several different proteins that are involved in the invasion process of human erythrocytes by the malaria causing parasite Plasmodium falciparum. The target proteins supposedly play important roles in different invasion stages. While MSP1 is important for the initial interaction between parasite and erythrocyte, Rh5 is supposedly essential for initiating the actual invasion and ROPE is suggested to come into play afterwards. A variety of different panning strategies were utilized to adapt to prevailing circumstances in the invasion process. Conserved regions or regions that interact with proteins on the erythrocytes surface were ordered as peptides, as recombinant expression of proteins or their subdomains succeeded too late. Due to the fact, that the invasion is a very fast process a fast on-rate panning was established. The different pannings resulted in over 300 unique scFvs of which 174 were converted into the bivalent scFv-Fc format. All antibodies were characterized in titration-ELISAs and 149 antibodies were tested in growth inhibition assays. Binding ability of MSP1 antibodies was also characterized by immunofluorescence microscopy, whereas the ability of the respective antibodies binding to recombinant Rh5 was tested in ELISAs. In total, ten potentially inhibiting antibodies were identified in growth inhibition assays. The inhibitory potential still has to be validated, but these antibodies are a promising start for the development of novel therapeutics against malaria., Die Malaria, eine von Parasiten der Plasmodium spp. verursachte Krankheit, gehört zu den vielen vernachlässigten tropischen Krankheiten. Mit 241 Millionen Fällen und 627,000 Todesfällen pro Jahr (2020) gehört sie zu den gefährlichsten Infektionserkrankungen. Da die derzeit verfügbaren Behandlungen und präventiven Maßnahmen nicht ausreichen um Malaria zu bekämpfen, werden weiterhin Alternativen benötigt. Mittels Antikörper Phagen Display wurde im Rahmen dieser Arbeit eine große Anzahl humaner monoklonaler Antikörper generiert. Diese Antikörper sind gegen verschiedene Proteine gerichtet, die an der Invasion von Erythrozyten durch den Malaria Erreger Plasmodium falciparum beteiligt sind. Die ausgewählten Proteine spielen vermutlich in unterschiedlichen Stadien der Invasion eine Rolle. MSP1 ist für die erste Interaktion zwischen Erythrozyt und Parasit zuständig, während Rh5 die eigentliche Invasion initiiert, bei welcher ROPE dann vermutlich seine Rolle erfüllt. Unter Einbeziehen des sehr schnell ablaufenden Invasionsprozesses wurden verschiedene Panning Strategien verfolgt, unter anderem wurde ein Panning etabliert, welches Antikörper mit schneller Assoziationsgeschwindigkeit bevorteilt. Da es sich bei der Invasion um einen sehr schnell ablaufenden Prozess handelt, wurde ein Panning ausgewählt, welches Antikörper mit einer schnellen Assoziationsgeschwindigkeit bevorteilt. Aufgrund von Verzögerungen bei der Klonierung und Produktion der Zielproteine wurden konservierte Abschnitte und Bereiche, die mit der Oberfläche der Erythrozyten oder anderen Proteinen interagieren, als Peptide bestellt und fürs Panning verwendet. Über 300 einzigartige Antikörper wurden in den verschiedenen Pannings selektiert und 174 davon in das bivalente scFv-Fc Format umkloniert und produziert. Alle Antikörper wurden mittels Titrations-ELISAs charakterisiert und 149 Antikörper in Growth Inhibition Assays (GIAs) getestet. Die Bindungsfähigkeit einiger MSP1 Antikörper wurde mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie bestätigt, während die Bindung der Rh5 Antikörper auf rekombinant produziertem Rh5 bestätigt wurde. Es wurden insgesamt zehn potenziell inhibierende Antikörper mittels GIA identifiziert, deren Inhibierung bisher nicht in weiteren Tests bestätigt werden konnte. Die etablierte Kooperation könnte die Grundlage für die Entdeckung neuer therapeutischer Antikörper bilden.

Microtubules (MTs) are central components of the neuronal cytoskeleton and play a critical role in CNS integrity, function, and plasticity. Neuronal MTs are diverse due to extensive post-translational modifications (PTMs), particularly detyrosination/tyrosination, in which the C-terminal tyrosine of α-tubulin is cyclically removed by a carboxypeptidase and reattached by a tubulin-tyrosine ligase (TTL). The detyrosination/tyrosination cycle of MTs has been shown to be an important regulator of MT dynamics in neurons. TTL-null mice exhibit impaired neuronal organization and die immediately after birth, indicating TTL function is vital to the CNS. However, the detailed cellular role of TTL during development and in the adult brain remains elusive. Here, we demonstrate that conditional deletion of TTL in the neocortex and hippocampus during network development results in a pathophysiological phenotype defined by incomplete development of the corpus callosum and anterior commissures due to axonal growth arrest. TTL loss was also associated with a deficit in spatial learning, impaired synaptic plasticity, and reduced number of spines in hippocampal neurons, suggesting that TTL also plays a critical role in hippocampal network development. TTL deletion after postnatal development, specifically in the hippocampus and in cultured hippocampal neurons, led to a loss of spines and impaired spine structural plasticity. This indicates a novel and important function of TTL for synaptic plasticity in the adult brain. In conclusion, this study reveals the importance of α-tubulin tyrosination, which defines the dynamics of MTs, in controlling proper network formation and suggests TTL-mediated tyrosination as a new key determinant of synaptic plasticity in the adult brain.

Vaccines play a very crucial role in the control and prevention of several infectious diseases worldwide. However, there are many pathogens (such as HCV, HIV) against which a vaccine has not been developed and a preventive vaccine against such pathogens still evades researchers. Identifying neutralizing antibodies and new epitopes on the antigens are some of the ways that could improve our understanding of the immune response against these pathogens and subsequently help in developing new vaccines against them. Experimental methods for these tasks are expensive and time-consuming and this advocates for use of computational methods to accelerate research in these fields. In this thesis, I have developed two computational methods that would aid researchers in these tasks. Firstly, I analysed Hepatitis C neutralization data and then created a neutralization map for HCV using multidimensional scaling. This neutralization cartography allowed us to select a reduced reference panel for testing the breadth and potency of antibodies (and vaccines) against HCV. The panel also allowed us to select patients that develop the most potent antibodies, which are able to neutralize several HCV strains. I have created a pipeline for automating this method and it can potentially be utilized for other viruses as well. Secondly, I have created a new machine learning-based method called EpitopeVec for predicting linear B-cell epitopes on antigenic proteins. Although several methods for predicting linear B-cell epitopes have been published, their generalizability and accuracy in cross-testing is not satisfactory. Therefore, I also benchmarked many recently published methods on several datasets extensively for their generalizability and compared their performance with my method. The performance of the EpitopeVec method was better than the state-of-the-art methods in five-fold cross-validation as well as cross-testing. As the prediction performance of the methods depended on the type of antigens, I also created an EpitopeVec-viral method for predicting linear B-cell epitopes specifically for viral antigenic proteins. With these methods, this dissertation aims to aid researchers in immunology and furthering vaccine research., Impfstoffe spielen bei der Bekämpfung und Vorbeugung verschiedener Infektionskrankheiten weltweit eine sehr wichtige Rolle. Es gibt jedoch viele Krankheitserreger (z. B. HCV, HIV), gegen die noch kein Impfstoff entwickelt wurde, und ein präventiver Impfstoff gegen solche Krankheitserreger steht. Die Identifizierung neutralisierender Antikörper und neuer Epitope auf den Antigenen sind einige der Möglichkeiten, die unser Verständnis der Immunreaktion gegen diese Krankheitserreger verbessern und in der Folge zur Entwicklung neuer Impfstoffe gegen sie beitragen könnten. Experimentelle Methoden für diese Aufgaben sind teuer und zeitaufwendig, was für den Einsatz von Computermethoden spricht, um die Forschung auf diesen Gebieten zu beschleunigen. In dieser Arbeit habe ich zwei Berechnungsmethoden entwickelt, die den Forschern bei diesen Aufgaben helfen sollen. Zunächst analysierte ich Hepatitis-C-Neutralisierungsdaten und erstellte dann eine Neutralisierungskarte für HCV mithilfe der multidimensionalen Skalierung. Diese Neutralizationskarte ermöglichte es uns, ein reduziertes Referenzpanel auszuwählen, um die Breite und Wirksamkeit von Antikörpern (und Impfstoffen) gegen HCV zu testen. Das Panel ermöglichte es uns auch, Patienten auszuwählen, die die stärksten Antikörper entwickeln, die in der Lage sind, mehrere HCV-Stämme zu neutralisieren. Ich habe eine Pipeline zur Automatisierung dieser Methode entwickelt, die potenziell auch für andere Viren eingesetzt werden kann. Zweitens habe ich eine neue, auf maschinellem Lernen basierende Methode namens EpitopeVec zur Vorhersage von linearen B-Zell-Epitopen auf antigenen Proteinen entwickelt. Obwohl bereits mehrere Methoden zur Vorhersage linearer B-Zell-Epitope veröffentlicht wurden, ist ihre Verallgemeinerbarkeit und Genauigkeit bei Kreuztests fraglich. Daher habe ich auch viele kürzlich veröffentlichte Methoden anhand mehrerer Datensätze ausführlich auf ihre Verallgemeinerbarkeit geprüft und ihre Leistung mit meiner Methode verglichen. Die Leistung der EpitopeVec-Methode war sowohl bei fünffacher Kreuzvalidierung als auch bei Kreuztests besser als die modernsten Methoden. Da die Vorhersageleistung der Methoden von der Art der Antigene abhängt, habe ich auch eine EpitopeVec-viral-Methode zur Vorhersage linearer B-Zell-Epitope speziell für virale antigene Proteine entwickelt. Mit diesen Methoden soll diese Dissertation Forschern in der Immunologie helfen und die Impfstoffforschung fördern.

Host-associated microbiotas includes diverse microorganisms from different kingdoms of life. Protozoa are prevalent members of the intestinal microbiota in humans and other mammalian species. For instance, Tritrichomonads are common protozoa parasites that have been described in many species. While most attention has been focused on the pathogenic role of specific parasitic protozoa for mucosal disease, little is known about the symbiotic relationships of apathogenic or even commensal Tritrichomonas species with their hosts. In the present study, two commensal Tritrichomonas species inhibiting the murine gastrointestinal tract were identified in a laboratory mouse colony with a pro-colitogenic microbiota. Prior studies have started to study the immune modulatory role of some Tritrichomonas species, however, little is known about their role in interacting with bacterial microbiota. Since this extracellular protozoan is intimately associated with the mucosa and microbiota, key aspects of the complex interactions between the protozoan and the bacteria have thus remained elusive. Hence, we here investigated the effect of Tritrichomonas colonization on the microbiota composition, especially the interaction with mucus-associated bacteria. Moreover, we characterized their role in immune modulation with a multicolor staining flow cytometry. Finally, we also evaluated how Tritrichomonas colonization might affect the host disease susceptibility to inflammatory bowel disease. Specifically, two protozoan species, Tritrichomonas musculis (T. mu) and one novel uncharacterized species Tritrichomonas spp. (T. spp), were isolated and identified from one of our laboratory mouse lines. T. mu colonization induced a strong type 2 immune response characterized with higher percentage increase of type 2 innate lymphoid cells (ILC2s), T helper 2 (Th2) cells and eosinophils in the small intestine. After colonization of isogeneic mouse lines of SPF1 and SPF2 mice with T. mu, the microbiota composition of these two mouse lines from cecum and colon were heavily affected. Most interestingly, the abundance of mucus-associated bacteria like Mucispirillum schaedleri and Akkermansia muciniphila were modulated by the introduction of T. mu. This phenotype of A. muciniphila down-regulation is reproducible when we colonized SPF1 mice exogenously with A. muciniphila and confirmed it with fluorescence in situ hybridization. Metabolomics results showed T. mu colonization induced a higher level of succinate and significantly reduced the level of simple sugars such as galactose. In addition, when supplemented with galactose and N-acetyl-glucosamine in the minimum media for A. muciniphila, it favored the bacterial reproduction. However, these changes in the bacterial communities and the related metabolites changes were not associated with the alleviation of intestinal inflammation induced by T.mu colonization. In summary, we developed an effective and reproducible animal model that is required to compare the microbiome of Tritrichomonas-free animals before and after protozoa colonization. The results raised the awareness that a host-protozoan interaction shapes the murine intestinal microbial ecosystem and elucidated the mechanisms behind the observed shifts in gut microbiota diversity and composition., Die wirtsassoziierte Mikrobiota umfasst eine Vielzahl von Mikroorganismen aus verschiedenen Reichen des Lebens. Protozoen sind häufige Mitglieder der intestinalen Mikrobiota bei Menschen und anderen Säugetierarten. Zum Beispiel sind Tritrichomonaden häufige Protozoen-Parasiten, die in vielen Wirten beschrieben wurden. Während die meiste Aufmerksamkeit auf die pathogene Rolle einiger bestimmter parasitärer Protozoen für Schleimhauterkrankungen gerichtet wurde, ist wenig über die symbiotischen Beziehungen von apathogenen oder kommensalen Tritrichomonas-Arten mit ihren Wirten bekannt. Frühere Studien haben die immunmodulatorische Rolle einiger Tritrichomonas-Spezies untersucht. Es ist jedoch wenig über ihre Rolle bei der Interaktion mit der bakteriellen Mikrobiota bekannt. Da dieses extrazelluläre Protozoon eng mit der Schleimhaut und der Mikrobiota assoziiert ist, sind die Schlüsselaspekte der komplexen Interaktionen zwischen dem Protozoon und den Bakterien bisher nicht bekannt. Daher untersuchten wir hier den Effekt der Tritrichomonas-Besiedlung auf die Zusammensetzung der Mikrobiota, insbesondere die Interaktion mit schleimhautassoziierten Bakterien. Darüber hinaus charakterisierten wir ihre Rolle bei der Immunmodulation mithilfe von Multicolor-Färbe-Durchflusszytometrie. Schließlich untersuchten wir auch, wie die Tritrichomonas-Besiedlung die Krankheitsanfälligkeit des Wirts für entzündliche Darmerkrankungen beeinflussen könnte. Konkret wurden zwei Protozoen-Spezies, Tritrichomonas musculis (T. mu) und eine neue, nicht charakterisierte Spezies Tritrichomonas spp. (T. spp), aus einer unserer Labor-Mauslinien isoliert und identifiziert. Die Besiedlung mit T. mu induzierte eine starke Typ-2-Immunantwort, die durch eine prozentuale Zunahme von angeborenen lymphoiden Zellen (ILC2s), T-Helfer-2-Zellen (Th2) und Eosinophilen im Dünndarm gekennzeichnet war. Isogene Mauslinien von SPF1- und SPF2-Mäusen wurden mit T. mu kolonisiert, die Mikrobiota-Zusammensetzung dieser beiden Mäuse aus Zökum und Kolon wurde stark beeinflusst. Interessanterweise wurde die Abundanz von Mukus-assoziierten Bakterien wie Mucispirillum schaedleri und Akkermansia muciniphila durch die Besiedlung mit T. mu moduliert. Dieser Phänotyp der A. muciniphila-Down-Regulation ist reproduzierbar, wenn wir SPF1-Mäuse exogen mit A. muciniphila kolonisiert haben und bestätigte dies mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Metabolomics-Ergebnisse zeigten, dass die Besiedlung mit T. mu eine höhere Produktion von Succinat verursacht und den Gehalt an Einfachzuckern wie Galactose signifikant reduzierte. Die Zugabe von einfachen Zuckern wie Galaktose und N-Acetyl-Glucosamin in den Mindestmedien für A. muciniphila begünstigt die bakterielle Vermehrung. Diese Veränderungen in den bakteriellen Gemeinschaften und die damit verbundenen Veränderungen der Metaboliten waren jedoch nicht mit der Linderung der durch die T. mu-Besiedlung induzierten Darmentzündung verbunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Ergebnisse das Bewusstsein dafür schärften, dass eine Wirt-Protozoen-Interaktion das mikrobielle Ökosystem des Mäusedarms formt und die Mechanismen hinter den beobachteten Verschiebungen in der Diversität und Zusammensetzung der Darmmikrobiota aufklärte.

Bloodstream infections caused by Streptococcus pneumoniae induce strong inflammatory and procoagulant cellular responses and affect the endothelial barrier of the vascular system. Bacterial virulence determinants, such as the cytotoxic pore-forming pneumolysin, increase the endothelial barrier permeability by inducing cell apoptosis and cell damage. As life-threatening consequences, disseminated intravascular coagulation followed by consumption coagulopathy and low blood pressure is described. With the aim to decipher the role of pneumolysin in endothelial damage and leakage of the vascular barrier in more detail, we established a chamber-separation cell migration assay (CSMA) used to illustrate endothelial wound healing upon bacterial infections. We used chambered inlets for cell cultivation, which, after removal, provide a cell-free area of 500 μm in diameter as a defined gap in primary endothelial cell layers. During the process of wound healing, the size of the cell-free area is decreasing due to cell migration and proliferation, which we quantitatively determined by microscopic live cell monitoring. In addition, differential immunofluorescence staining combined with confocal microscopy was used to morphologically characterize the effect of bacterial attachment on cell migration and the velocity of gap closure. In all assays, the presence of wild-type pneumococci significantly inhibited endothelial gap closure. Remarkably, even in the presence of pneumolysin-deficient pneumococci, cell migration was significantly retarded. Moreover, the inhibitory effect of pneumococci on the proportion of cell proliferation versus cell migration within the process of endothelial gap closure was assessed by implementation of a fluorescence-conjugated nucleoside analogon. We further combined the endothelial CSMA with a microfluidic pump system, which for the first time enabled the microscopic visualization and monitoring of endothelial gap closure in the presence of circulating bacteria at defined vascular shear stress values for up to 48 h. In accordance with our CSMA results under static conditions, the gap remained cell free in the presence of circulating pneumococci in flow. Hence, our combined endothelial cultivation technique represents a complex in vitro system, which mimics the vascular physiology as close as possible by providing essential parameters of the blood flow to gain new insights into the effect of pneumococcal infection on endothelial barrier integrity in flow.

As a member of the transforming growth factor β (TGF-β) family, activin is an important regulator of multiple organ systems and tissues, including the brain. In addition to its established role in neurodevelopment and neuroprotection, activin is increasingly recognized as a crucial modulator of synaptic transmission in the adult hippocampus, a key brain region for learning and memory. Activin has been linked to the pathogenesis and even to the treatment of various neuropsychiatric diseases like anxiety and depression that partly involve the hippocampus. Functional differentiation along the longitudinal (dorsoventral) axis of the hippocampus has long been appreciated, in which the dorsal hippocampus (DH) is mainly concerned with spatial learning and other cognitive functions, whereas the ventral hippocampus (VH) is more related to emotions and affective behavior. Our lab has previously shown that activin modulates long-term potentiation (LTP) of glutamatergic synapses in the DH. Here, I extended this investigation towards the VH and systematically examined the impact of activin signaling on different forms of synaptic plasticity and network functions by combining in vitro electrophysiology, molecular biology, and fluorescence live-cell calcium imaging. Quantification of activin expression in the adult mouse hippocampus revealed that activin A, the most abundant activin isoform in the adult brain, is more prevalent in DH than VH, while expression of the activin receptor IB (ActRIB) remains constant along the dorsoventral axis. Field potential recordings of postsynaptic responses to Schaffer collateral (SC) stimulation from DH and VH slices of wild type (wt) mice clearly indicated that ventral CA1 synapses displayed stronger basic synaptic transmission, but less short-term facilitation and a narrower window of bidirectional long-term plasticity. To elucidate the role of activin in synaptic function and plasticity, I performed field potential recordings using brain slices from transgenic mice expressing a dominant-negative mutant of activin receptor IB (dnActRIB). This is an established and validated mouse line in the lab, in which activin receptor signaling is disrupted in a forebrain-specific fashion. Compared to their wt counterparts, basic synaptic transmission and various forms of LTP in DH were found to be attenuated in dnActRIB slices. As a result, the window of bidirectional long-term plasticity was shifted downwards, at the expense of LTP and in favor of long-term depression (LTD). Furthermore, depotentiation of LTP was no longer functional. Interestingly, short-term plasticity (STP) in the theta frequency range was significantly enhanced in dnActRIB dorsal slices, whereas cholinergically induced theta oscillations were mitigated in the mutant preparation. Consistent with the activin gradient along the dorsoventral axis, dnActRIB expression affected the aforementioned synaptic processes in ventral CA1 only modestly. It is worth noting that classical protocols for depotentiation and LTD failed in ventral CA1. As an intriguing side note, I discovered that, predominantly in DH, LTD is associated with a lasting and apparently Ca2+-dependent decrease in the axonal excitability of afferent fibers. This finding points to an unexpected presynaptic component of LTD. When the activin level in the hippocampus was physiologically elevated through overnight housing of mice in an enriched environment (EE), basic synaptic transmission was enhanced, and bidirectional long-term plasticity was shifted upwards in favor of LTP. In wt control slices, these facilitating effects in dorsal CA1 were all reproduced by recombinant activin, whereas they were, except for LTP, absent in EE-exposed dnActRIB mice. These findings strongly implicate activin in the electrophysiological consequences of this behavioral paradigm. Next, I interrogated the effects of activin on network dynamics and functional connectivity. Live cell calcium imaging served to record the activity in primary cultures of hippocampal neurons. Sophisticated post hoc image analysis demonstrated that activin treatment for two days significantly improved crucial network properties, manifested as reduced characteristic path length and increased network strength. In summary, my study suggests that the dorsoventral gradient of activin signaling in the hippocampus is essential to maintain dorsoventral differences in synaptic transmission and plasticity. This work further demonstrates that endogenous activin in the hippocampus, especially in its dorsal compartment, tunes synaptic transmission, plasticity, and overall network activity in a fashion that adapts and optimizes their performance under physiological conditions. Moreover, strong rises in activin levels such as observed during active exploration of a new and enriched environment appear as an essential molecular mechanism to translate behavioral stimulation into improved functioning of hippocampal circuits. Als Mitglied der TGF-β (transforming growth factor beta) Familie reguliert Activin eine Vielzahl von Organsystemen und Geweben, darunter auch das Gehirn. Zusätzlich zu seiner Rolle im Rahmen der neuronalen Entwicklung und der Neuroprotektion gilt Activin zunehmend als wichtiger Modulator der synaptischen Transmission im ausgereiften Hippocampus, einer Schlüsselstruktur für Lernprozesse und Gedächtnisbildung. Über die physiologischen Prozesse hinaus ist Activin auch im Rahmen neuropsychiatrischer Erkrankungen beteiligt, darunter bei Angststörungen und Depressionen, die sich teils auch im Hippocampus verorten lassen. Der Hippocampus weist entlang seiner Längsachse eine dorsoventrale (DV) Differenzierung auf, wobei der dorsale Hippocampus (DH) hauptsächlich für das räumliche Lernen sowie andere kognitive Funktionen, wohingegen der ventrale Hippocampus (VH) für Emotionen und affektives Verhalten zuständig ist. Aus früheren Arbeiten unseres Labors ist bekannt, dass Activin die Langzeitpotenzierung glutamaterger Synapsen im DH kontrolliert. In dieser Arbeit habe ich deshalb unter Verwendung in vitro elektrophysiologischer, molekularbiologischer und mikroskopischer Techniken den Einfluss von Activin auf verschiedene Formen der synaptischen Plastizität im dorsalen und ventralen Hippocampus, sowie die damit einhergehenden Konsequenzen auf Netzwerkebene untersucht. Eine Quantifizierung der Activin Expression im Hippocampus der erwachsenen Maus zeigte eine stärkere Expression von Activin A, der häufigsten Isoform im Gehirn, im DH im Vergleich zum VH, wohingegen die Expression des Activin-Rezeptors IB (ActRIB) entlang der DV-Achse konstant war. Durch Feldpotentialaufnahmen postsynaptischer Potentiale in Antwort auf eine Stimulation der Schaffer’schen Kollateralen (SC) in Hirnschnitten von Wildtyp (wt) Mäusen zeigte sich ventral eine stärkere basale synaptische Transmission, weniger Kurzzeit-Fazilitierung und ein engeres bidirektionales Langzeitplastizitäts-Fenster. Um die Rolle von Activin für die synaptischen Übertragung und Plastizität zu untersuchen, habe ich Feldpotentialaufnahmen von Hirnschnitten transgener Mäuse, die eine dominant-negative Activin Rezeptor IB (dnActRIB) Mutante exprimieren, durchgeführt. Dies ist eine etablierte und validierte Mauslinie im Labor, bei der die Activin Signaltransduktion in einer Vorderhirn-spezifischen Weise gestört ist. Im Vergleich zu Wildtypmäusen waren die basale synaptische Übertragung und verschiedene Formen der LTP im DH von dnActRIB Mäusen abgeschwächt. Infolgedessen wurde das Fenster der bidirektionalen Langzeitplastizität auf Kosten der LTP in Richtung der Langzeitdepression (LTD) verschoben. Eine Depotenzierung (DP) der LTP war nicht länger möglich. Interessanterweise war auch die Kurzzeitplastizität im Theta-Frequenzbereich bei dnActRIB Mäusen signifikant verstärkt, wohingegen cholinerg induzierte Theta-Oszillationen in dnActRIB Präparationen vermindert waren. Wie die Activin-Expression entlang der DV Achse vermuten ließ, führte die Expression des dnActRIB-Rezeptors in der ventralen CA1 Region (vCA1) nur zu leichten Änderungen der oben genannten synaptischen Prozesse. Überraschenderweise waren klassische Protokolle zur Induktion von DP und LTD in vCA1 nicht erfolgreich. Interessanterweise habe ich entdeckt, dass, vornehmlich im DH, die LTD-Induktion mit einer lang andauernden und scheinbar Ca2+-abhängigen Abnahme der axonalen Erregbarkeit afferenter Fasern einhergeht. Diese Ergebnisse deuten auf eine unerwartete präsynaptische Komponente der LTD hin. Als ich das Activin Level im Hippocampus physiologisch erhöhte, indem die Mäuse eine Nacht in einer angereicherten Umgebung (enriched environment, EE) verbrachten, waren die basale synaptische Transmission verstärkt und die bidirektionale Langzeitplastizität in Richtung LTP verschoben. In Wildtyp-Kontrollschnitten konnte ich diese fazilitierenden Effekte in der dorsalen CA1 Region reproduzieren, indem ich rekombinantes Activin applizierte, wohingegen die Effekte, bis auf die erhöhte LTP, in dnActRIB Mäusen nach EE nicht auftraten. Diese Ergebnisse deuten stark auf eine Rolle von Activin bei den elektrophysiologischen Konsequenzen dieses Verhaltensparadigmas hin. Als nächstes untersuchte ich die Effekte von Activin auf die Netzwerkdynamik und funktionelle Konnektivität der Neuronen. Mit Hilfe der Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie konnte ich die Aktivität kultivierter, primärer Hippocampusneuronen aufzeichnen. Durch eine sich daran anschließende detaillierte Bildanalyse konnte ich zeigen, dass eine Behandlung mit Activin über zwei Tage hinweg wichtige Netzwerkeigenschaften stark verbesserte: die charakteristische Pfadlänge im Netzwerk war reduziert und die Netzwerkstärke war erhöht. 5 Zusammenfassend deutet meine Studie darauf hin, dass der dorsoventrale Gradient der Activin Signaltransduktion im Hippocampus für die Aufrechterhaltung der dorsoventralen Unterschiede hinsichtlich synaptischer Transmission und Plastizität essentiell ist. Diese Arbeit zeigt zudem, dass das endogene Activin im Hippocampus, besonders im dorsalen Hippocampus, die synaptische Transmission und Plastizität sowie die insgesamte Netzwerkaktivität in einer Weise reguliert, die adaptierend wirkt und die Performance unter physiologischen Bedingungen optimiert. Ein starker Anstieg des Activin-Levels, wie man es während der aktiven Exploration neuer und stimulierender Umgebungen beobachtet, scheint ein essentieller molekularer Mechanismus zu sein, um eine Stimulation auf Verhaltensebene in verbesserte hippocampale Schaltkreise zu übertragen.

Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist unteranderem für die Stammzellproliferation im Darm essenziell. Die Aktivierung des Signalweges führt zur Akkumulation und Translokation des transkriptionellen Koaktivators β-Catenin in den Zellkern. Ohne ein extrazelluläres Wnt-Signal wird β-Catenin vom sogenannten Destruction Complex (DC) phosphoryliert und als Folge dessen im Proteasom abgebaut. Mutationen in Proteinen dieses Abbaukomplexes, wie APC, führen zur Deregulation der β-Catenin-abhängigen Zellproliferation und letzten Endes zur Bildung kolorektaler Karzinome. In über 90 % aller Darmkrebspatienten finden sich Mutationen in Teilen des Wnt/β-Catenin-Signalweges. Wichtig für die Assemblierung des DC sind außerdem die paralogen Gerüstproteine Axin und Conductin (Cdt), wobei letzteres ebenfalls ein Wnt/β-Catenin-Zielgen ist. In vorherigen Publikationen des Lehrstuhls konnte gezeigt werden, dass sich die Cdt-Aktivität über die interne RGS-Domäne regulieren lässt. Mutationen in dieser Proteindomäne, bzw. deren sterische Inhibition über ein Peptid, führten zur Polymerisation von Cdt, was wiederum den β-Catenin-Abbau steigerte. Dadurch ergab sich eine neue Möglichkeit den im Darmkrebs abnorm aktiven Signalweg herunterzuregulieren. Außerhalb des Wnt/β-Catenin-Signalweges konnte bereits gezeigt werden, dass G-Proteine direkt mit RGS-Domänen in anderen Proteinen interagieren können. Ein G-Protein-Kandidat für eine potenzielle Interaktion mit der Cdt-RGS� Domäne ist Gαi2. Dies ist ein inhibitorisches Signalprotein, das über α2-Adrenozeptoren reguliert wird. Ein Agonist dieses Rezeptors, das Bluthochdruckmedikament Guanabenz (Gbz), wurde aus diesem Grund hinsichtlich seines therapeutischen Effektes auf Darmkrebswachstum getestet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die orale Applikation von Gbz in zwei separaten Mauslinien zu einer signifikanten Reduktion des Tumorwachstums führt. Ebenfalls kam es zu einer Reduktion der mit der Tumorlast korrelierenden Splenomegalie in APCmin -Tieren. Auf vorherigen Versuchen aufbauend wurde dargestellt, dass die Koexpression von Gαi2 und Cdt den Abbau von β-Catenin steigern kann. Zusätzlich geht diese Arbeit der Frage nach, ob die downstream von Gαi2 befindliche Proteinkinase A, für die bereits gezeigt wurde, dass sie die Aktivität von β-Catenin steigern kann, ebenfalls über Gbz herunterreguliert werden kann. Die Ergebnisse veranschaulichen dabei, dass der inhibitorische Effekt von Gbz hauptsächlich über Cdt-Polymerisation abzulaufen scheint. Im finalen Teil dieser Arbeit wurde eine potenzielle Methode für das Tagging von Cdt mit GFP auf einem endogenen Level etabliert, was den Grundstein für zukünftige Cdt-Versuche legt. The Wnt/β-catenin signaling pathway is, among other things, essential for stem cell proliferation in the lower gastrointestinal tract. The activation of the pathway leads to accumulation and translocation of the coactivator β-catenin into the nucleus. Without an extracellular Wnt signal, β-catenin is phosphorylated by the so-called destruction complex (DC), which as a result leads to the degradation of β-catenin by the proteasome. Mutations in proteins of the DC, like APC, lead to deregulation of β-catenin dependent cell proliferation, which potentially results in formation of colorectal carcinoma. In over 90 % of all colon cancer cases components of the Wnt/β-catenin signaling pathway are mutated. The paralogous scaffold proteins axin and conductin (Cdt), the letter being a Wnt/β-catenin target gene, are vital for the formation of the DC. Previous publications by this group have shown, that the Cdt activity is regulated by an internal RGS domain. Mutations in this domain or its steric inhibition by a small peptide led to the polymerization of Cdt and thus an increase in β-catenin degradation. This opened the potential for downregulating the Wnt/β-catenin signaling pathway by a previously unknown mechanism. G-proteins have been shown to interact with RGS domains of other proteins. One G-protein to potentially interact with the Cdt RGS domain is Gαi2, an inhibitory protein which is regulated by α2-adrenoceptors. The therapeutic effect of the α2-adrenoceptor agonist guanabenz (Gbz), an antihypertensive drug, on colon cancer growth was therefore tested. This thesis shows that the oral application of Gbz led to significant reduction of tumor growth, in two separate mouse lines. Likewise, the reduction of the splenomegaly, which correlates with tumor burden, was reduced in APCmin mice. Concurrently it was demonstrated that the coexpression of Cdt and Gαi2, lead to a decrease in β-catenin concentration. Furthermore, this thesis pursues the question whether the downregulation of the β-catenin activating protein kinase A by Gbz through Gαi2 has any effect on Wnt signaling. The generated results illustrate that the inhibitory effect of Gbz mainly relies on the polymerization of Cdt. In the final part of this thesis a potential method for tagging endogenous Cdt with GFP was established, which lays the foundation for future Cdt experiments.

The intestinal tract is pivotal for our survival, as it is required for the digestion of food and the uptake of nutrients. Furthermore, it functions as a strong, but selective barrier, which defends the body against pathogens and an outgrowth of commensal microbiota. Cells of the innate and adaptive immune cell compartment, including innate lymphoid cells (ILCs) and T helper (TH) cells, are crucial mediators of immunity and intestinal epithelial cell (IEC) function. A vivid crosstalk between immune cells and IECs is of extraordinary importance for the defense, but also the homeostasis of the intestine. Overwhelming or unresolved inflammation as well as immune responses against harmless commensals or food particles can lead to severe tissue destruction, autoimmunity or chronic inflammation. Immune responses are guided by genetic programs mediated by transcription factors (TFs) such as the interferon regulatory factor 1 (IRF-1). IRF-1 is considered as a typical inducer of type I immune responses against intracellular pathogens. In the literature, IRF-1 has been shown to be involved in chronic and acute inflammatory processes in the intestine, which are influenced by the gut microbiome and pathogenic bacteria. Thus, the aim of this thesis was to discover the role of IRF-1 in the context of intestinal immune responses against extracellular bacterial pathogens. Murine infection experiments revealed that Irf1 expression is indispensable to mount efficient immune responses against the mouse pathogen Citrobacter rodentium, in order to prevent bacterial overgrowth and systemic dissemination. The generation of new mouse strains with a conditional deletion of Irf1 enabled the cell type-specific analysis of IRF-1 and revealed that its expression was essential in intestinal immune cells, while it was dispensable in IECs to counteract bacterial infections. Furthermore, it was determined that the expression of the IL-12Rβ1 chain, which is part of the IL-12 as well as the IL-23 receptor, is mediated by IRF-1. Thus, IL-12 and IL-23 receptor signaling were affected in Irf1-/- ILC and T helper cell populations. I also discovered that IRF-1 is not only an inducer of TH1 cells mediated by IL-12 signaling, as it was known before, but that it is also required for the type I programming of intestinal CCR6- ILC3s and ILC1s as well as the IL-23-dependent development of TH17 and TH22 cells. Further experiments revealed that IRF-1 is also essential for the IL-23-dependent production of the protective cytokine IL-22 by ILC3s. The secretion of IL-22 is required for epithelial regeneration, barrier function and antibacterial responses especially during early time points after C. rodentium infection. In accordance, decreased IL-22 levels in Irf1-/- mice caused pathogen overgrowth and systemic dissemination of C.rodentium. In summary, this work provides a better understanding of the regulation of intestinal immune responses against extracellular bacterial pathogens and offers a new view on IRF-1, which in future studies should not only be regarded as an inducer of type I responses, but should also be considered as a type III-related TF especially mediating the phenotype and function of ILC3s. Unser Intestinaltrakt ist lebensnotwendig, da er für den Verdau von Nahrungsmitteln und die Aufnahme von Nährstoffen benötigt wird. Des Weiteren schirmt er den Körper selektiv vor Pathogenen ab und verhindert die Ausbreitung von kommensalen Mikroorganismen. Zellen des angeborenen Immunsystems, wie zum Beispiel ILCs (engl. Innate lymphoid cells), sowie Zellen des adaptiven Immunsystems, zu denen T-Helfer (TH) Zellen gehören, sind zentral für die Regulation der Immunantwort und die Funktion der Epithelzellen im Darm. Ein reger Informationsaustausch zwischen diesen Zelltypen spielt eine wichtige Rolle für die Abwehr von Pathogenen, aber auch für die Homöostase im Darm. Überschießende oder andauernde intestinale Entzündung, sowie Immunantworten gegen harmlose Kommensalen oder Nahrungsmittelbestandteile, können zur massiven Zerstörung des Darmgewebes, Autoimmunität oder chronischer Entzündung führen. Zur Regulation werden Immunreaktionen durch bestimmte genetische Programme beeinflusst, die durch Transkriptionsfaktoren, wie den Interferon-regulierenden Faktor 1 (IRF-1), gesteuert werden. IRF-1 wird als typischer Aktivator von Typ I Immunreaktionen angesehen, welche speziell gegen intrazelluläre Krankheitserreger gerichtet sind. Es wurde außerdem publiziert, dass IRF-1 eine Rolle bei akuten und chronischen Entzündungsprozessen im Darm spielt, welche bekanntermaßen durch das intestinale Mikrobiom, sowie pathogene Bakterien beeinflusst werden. Ziel dieser Arbeit war es daher zu untersuchen, welche Rolle IRF-1 während intestinaler Immunreaktionen spielt, die gegen extrazelluläre bakterielle Pathogene gerichtet sind. Murine Infektionsexperimente zeigten, dass die Expression von IRF-1 für eine effektive Immunreaktion gegen das Mauspathogen Citrobacter rodentium notwendig ist, um das bakterielle Wachstum zu begrenzen und eine systemische Ausbreitung zu verhindern. Die Züchtung neuer Mausstämme, die eine konditionale Deletion des Irf1-Gens aufweisen, ermöglichte die zelltypspezifische Analyse von IRF-1. C. rodentium Infektionsexperimente mit diesen neuen Mausstämmen ergaben, dass die Expression von IRF-1 in Immunzellen essentiell ist um bakterielle Infektionen abzuwehren, während sie für intestinale Epithelzellen entbehrlich ist. Transkriptomanalysen zeigten, dass die Expression der IL-12Rβ1-Kette, die sowohl Teil des IL-12-Rezeptors, als auch des IL-23-Rezeptors ist, von IRF-1 reguliert wird. Die IL-12- sowie die IL-23-Signaltransduktion war demnach in Irf1-/- ILC und T-Helfer-Zellpopulationen beeinträchtigt. Durchflusszytometrische Analysen ergaben, dass IRF-1 nicht nur, wie bisher angenommen, die IL-12-vermittelte Differenzierung von TH1 Zellen induziert, sondern auch notwendig für die Typ I-Ausrichtung von intestinalen CCR6- ILC3s und ILC1s, sowie die IL-23-abhängige Entwicklung von TH17 und TH22 Zellen ist. Weitere Experimente ergaben, dass auch die IL-22 Produktion der ILC3s von IRF-1 reguliert wird, da diese ebenfalls von der IL-23 Signaltransduktion abhängt. Die Sekretion des protektiven Zytokins IL-22 ist speziell während der frühen Infektionsphase essentiell für die Einleitung von Regenerationsprozessen des Epithels, die Aufrechterhaltung der Barriere-Funktion, sowie die Produktion von antibakteriellen Mediatoren. Demnach führte die verminderte IL-22-Produktion in Irf1-/- Mäusen zu vermehrtem Bakterienwachstum und systemischer Translokation von C. rodentium. Zusammengefasst ermöglichen die Ergebnisse dieser Arbeit ein besseres Verständnis der Regulation intestinaler Immunreaktionen, die gegen extrazelluläre, bakterielle Pathogene gerichtet sind. Sie führen zu einer Neueinschätzung des Transkriptionsfaktors IRF-1, der in Zukunft nicht mehr nur als Aktivator von Typ I Immunreaktionen angesehen werden sollte, sondern viel mehr auch als Regulator von Typ III Antworten, welcher insbesondere den Phänotyp und die Funktion von ILC3s beeinflusst.

The epithelial layer of the gastrointestinal (GI) tract provides a barrier between the environment and the body. Dysfunction of the epithelium, including changes of the innate immune response facilitated by pattern recognition receptors (PRRs), plays a major role in the development of GI disorders. However, the organization of innate immune sensing, the expression and activity of PRRs and the factors contri¬buting to such possible organization along the GI tract are unclear. In recent years, stem cell-derived organoids gained increasing attention as promising tissue models. Here, a biobank of human and murine organoids comprising three lines from each GI segment; corpus, pylorus, duodenum, jejunum, ileum, colon was generated. RNA sequencing of 42 lines confirmed the preservation of tissue identity and revealed an extensive organization of innate immune signaling components along the cephalocaudal axis, giving each segment a specific innate immune profile. Comple-menting the region-specific expression analysis, several PRRs in human and murine organoids showed region- and species-specific function. To investigate the factors contributing to the patterning of innate immunity in the GI tract, the impact of microbial components was analyzed using murine embryo-derived, never colonized gastric and proximal intestinal organoids. Transcriptional profiling of embryo-derived organoids showed that while expression of some PRRs may depend on environmental cues as expected, an unexpectedly large part of segment-specific expression of PRR signaling components is independent of prior contact with microbial products. Further, analysis of published RNA-seq data as well as in vitro experiments using directed differentiation of organoids into specific cell types showed that expression of innate immune gene also depended on cellular differentiation along the crypt-villus axis. This underlined the importance of cellular differentiation rather than contact to microbial compounds for expression of PRRs. Lastly, analysis of published datasets of RNA-seq and ATAC-seq after knockout of the intestinal transcription factor Cdx2 demonstrated that Cdx2 is likely important for the expression of Nlrp6 and Naip1 in the murine intestine. Future experiments have to support these preliminary findings. Taken together, the expression of a large part of epithelial innate immunity is develop¬mentally defined and conserved in tissue-resident stem cells. The identification of mechanisms governing expression of genes related to immunity will provide further insights into the mechanisms that play a role in the progress of inflammatory diseases., Das Epithel des gastrointestinalen (GI) Traktes fungiert als Barriere zwischen der Umwelt und dem Körperinneren. Störungen des Epithels, darunter Veränderungen in der angeborenen Immunantwort, welche über „Pattern Recognition Receptors“(PRRs) ermöglicht wird, spielen eine bedeutende Rolle in der Entstehung gastrointestinaler Krankheiten. Auf welche Weise die angeborene Immunantwort im gastrointestinalen Trakt zwischen symbiotischen und schädlichen Mikroben unterscheidet, wie die Expression und Aktivität von PRRs organisiert sind, und die Faktoren die zu einer möglichen Organization beitragen sind bisher allerdings nicht bekannt. In den letzten Jahren haben aus Stammzellen gewonnene Organoide als vielversprechende Gewebemodelle steigende Aufmerksamkeit erregt. In dieser Arbeit wurde eine „Biobank“ humaner und muriner Organoide, jeweils bestehend aus 3 Linien jedes der gastrointestinalen Segmente Korpus, Pylorus, Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon generiert. Die RNA Sequenzierung von 42 Linien bestätigte den Erhalt der Gewebsidentität und zeigte eine umfangreiche Organization innerhalb der Signalkomponenten des angeborenen Immunsystems entlang der kraniokaudalen Achse, wodurch jedes Segment ein spezifisches Immunprofil erhält. Ergänzend zur regions-spezifischen Expressionsanalyse zeigten einige PRRs sowohl in humanen als auch in murinen Organoiden eine regions- und spezies-spezifische Funktion. Zur Untersuchung der Faktoren, die zur Strukturierung des angeborenen Immunsystems im GI-Trakt beitragen, wurde der Einfluss mikrobieller Komponenten untersucht. Hierfür wurden aus embryonalem Gewebe gewonnene Organoide des Magens und des proximalen Dünndarms verwendet, welche noch nicht mit dem Mikrobiom in Kontakt waren. Transkriptionsprofile embryonaler Organoide zeigten, dass die Expression einiger PRRs wie erwartet wahrscheinlich von Umweltfaktoren abhängt, dass ein unerwartet großer Anteil der segment-spezifischen Expression von Komponenten der PRR-induzierten Signalwege sich allerdings unabhängig vom Kontakt mit mikrobiellen Komponenten entwickelt. Des Weiteren zeigte die Analyse von bereits publizierten RNA Sequenzierungsdaten und in vitro Experimenten bei denen durch gezielte Differenzierung von Organoiden spezifische Zelltypen generiert wurden, dass die Expression von Genen des angeborenen Immunsystems auch von der zellulären Differenzierung entlang der Krypten-Zotten-Achse abhängt. Dies unterstreicht die Bedeutung von zellulärer Differenzierung für die Expression von PRRs, anstelle des Kontaktes zu mikrobiellen Komponenten. Auch konnte durch die Analyse bereits publizierter RNA- und ATAC-Sequenzierungsdaten nach knockout des im Dünndarm exprimierten Transkriptionsfaktors Cdx2 nachgewiesen werden, dass Cdx2 mit hoher Wahrscheinlichkeit wichtig für die Expression von Nlrp6 und Naip1 im murinen Dünndarm ist. Diese Erkenntnisse müssen in zukünftigen Experimenten validiert werden. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die Expression eines Großteils der angeborenen Immunität entwicklungsbiologisch festgelegt und in gewebe-spezifischen Stammzellen konserviert ist. Die zukünftige Identifikation von Mechanismen die die Expression von zur Immunität zugehörigen Genen steuern, wird weitere Erkenntnisse über die Mechanismen die eine Rolle in der Entwicklung entzündlicher Erkrankungen spielen bringen.

A reliable method for metabolite extraction is central to mass spectrometry-based metabolomics. However, existing methods are lengthy, mostly due to the step of scraping cells from cell culture vessels, which restricts metabolomics in broader application such as lower cell numbers and high-throughput studies. Here, we present a simplified metabolite extraction (SiMeEx) method, to efficiently and quickly extract metabolites from adherent mammalian cells. Our method excludes the cell scraping step and therefore allows for a more efficient extraction of polar metabolites in less than 30 min per 12-well plate. We demonstrate that SiMeEx achieves the same metabolite recovery as using a standard method containing a scraping step, in various immortalized and primary cells. Omitting cell scraping does not compromise the performance of non-targeted and targeted GC-MS analysis, but enables metabolome analysis of cell culture on smaller well sizes down to 96-well plates. Therefore, SiMeEx demonstrates advantages not only on time and resources, but also on the applicability in high-throughput studies.

Jahrbuch der Braunschweigischen Wissenschaftlichen Gesellschaft, vol. 2021Jahrbuch 2021 der Braunschweigischen Wissenschaftlichen Gesellschaft, vol. 2021, p. 178

Humoral immunity following an infection relies on Germinal centres (GCs), transient structures in the secondary lymphoid organs. B cells undergo affinity maturation in GCs, thus producing high affinity plasma and memory cells. Dysregulations in GC shutdown leads to various pathological conditions. As the mechanism and factors regulating GC shutdown are not well understood, the main aim of this study is to contribute to an improved understanding of GC shutdown with mathematical models. Antigen accessibility is a potential factor that regulates GC shutdown, and can be modulated by antibody feedback, a process where soluble antibodies mask the antigen on Follicular dendritic cells (FDCs). Simulations suggested a strong influence of soluble antibodies on GC shutdown and predicted that antibody feedback could also impair the affinity maturation of GC B cells by terminating GCs earlier. Similarly, changes in immune complex (IC) cycling kinetics impacted GC dynamics by regulating antigen protection from degradation. Blocking IC cycling terminated GCs suggesting a therapeutic opportunity to disrupt ectopic GCs. Analysis of published experimental data on GC kinetics suggested that lifetime of GCs in the same lymphoid organ might be highly variable potentially due to differences in antigen availability or founder cell composition among individual GCs. Simulations of GC-GC interactions by soluble antibodies predicted changes in GC kinetics and affinity maturation. Finally, simulations predicted that GCs could be terminated independently by antigen limitation, changes in Tfh signals, decreased B cell division capacity and faster terminal differentiation. These findings predict strategies for improving GC responses to vaccination, namely altering IC cycling dynamics by engineering IC particles and overcoming antibody mediated inhibition by persistent antigen delivery. These results also suggest ways to design future experiments to gain a more complete understanding of GC shutdown., Die humorale Immunität nach einer Infektion beruht auf Keimzentren (GCs), transienten Strukturen in den sekundären lymphatischen Organen. B-Zellen durchlaufen in GCs eine Affinitätsreifung, wodurch Plasma- und Gedächtniszellen mit hoher Affinität produziert werden. Fehlregulationen bei der GC-Abschaltung führen zu verschiedenen pathologischen Zuständen. Da der Mechanismus und die Faktoren, die die GC-Abschaltung regulieren, nicht gut verstanden sind, besteht das Hauptziel dieser Studie darin, mit mathematischen Modellen zu einem besseren Verständnis der GC-Abschaltung beizutragen. Die Zugänglichkeit von Antigenen ist ein potenzieller Faktor, der die GC-Abschaltung reguliert und durch Antikörper-Feedback moduliert werden kann, ein Prozess, bei dem lösliche Antikörper das Antigen auf follikulären dendritischen Zellen (FDCs) maskieren. Simulationen legten einen starken Einfluss löslicher Antikörper auf die GC-Abschaltung nahe und sagten voraus, dass Antikörper-Feedback auch die Affinitätsreifung von GC-B-Zellen beeinträchtigen könnte, indem GCs früher beendet werden. In ähnlicher Weise beeinflussten Veränderungen der Zyklenkinetik des Immunkomplexes (IC) die GC-Dynamik, indem sie den Antigenschutz vor Abbau regulieren. Blockieren von IC-Cycling-terminierten GCs, was auf eine therapeutische Möglichkeit hindeutet, ektopische GCs zu stören. Die Analyse veröffentlichter experimenteller Daten zur GC-Kinetik deutete darauf hin, dass die Lebensdauer von GCs in demselben lymphoiden Organ möglicherweise aufgrund von Unterschieden in der Antigenverfügbarkeit oder der Zusammensetzung der Gründerzellen zwischen einzelnen GCs sehr variabel sein könnte. Simulationen von GC-GC-Wechselwirkungen durch lösliche Antikörper sagten Veränderungen der GC-Kinetik und der Affinitätsreifung voraus. Schließlich sagten Simulationen voraus, dass GCs unabhängig voneinander durch Antigenlimitierung, Änderungen der Tfh-Signale, verringerte B-Zellteilungskapazität und schnellere terminale Differenzierung beendet werden könnten. Diese Ergebnisse sagen Strategien zur Verbesserung der GC-Reaktionen auf Impfungen voraus, nämlich die Veränderung der IC-Cycling-Dynamik durch die Entwicklung von IC-Partikeln und die Überwindung der antikörpervermittelten Hemmung durch anhaltende Antigenabgabe. Diese Ergebnisse schlagen auch Wege vor, um zukünftige Experimente zu entwerfen, um ein umfassenderes Verständnis der GC-Abschaltung zu erlangen.

Serotonin gilt als Hauptangriffsstelle gängiger Antidepressiva bei schweren Depressionen, wie bspw. selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI), und -Enhancer (SSRE). Es bleibt offen, ob SSRI / E ausschließlich über die Manipulation des Serotoninspiegels wirken, oder ob alternative Signalwege daran beteiligt sind. Ansatzpunkte hierfür sind beispielsweise die neurotrophen Signalwege (spez. Brain derived neurotophic factor, BDNF) oder die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren- (HPA) – Signalwege des Stressachsensystems. Ebenfalls wurde in Nagetiermodellen beobachtet, dass mit der Dysregulation des zentralen Serotoninsystems bei schweren Depressionen, ein Rückgang der Neurogenese im Gyrus dentatus des Hippocampus einhergeht. Ziel dieser Arbeit war, das Zusammenspiel von Serotonin, BDNF, adulter Neurogenese und der Stressachse zu untersuchen. Zentrum der Studien ist ein Mausmodell, mit einer genetischen Depletion des zentralen Serotonin-synthetisierenden Enzyms Tryptophanhydroxylase 2 (sog. Tph2-/- Mäuse). Es wurden die physiologische Reaktionen auf die Behandlung mit gängigen Antidepressiva abhängig von der Abwesenheit von Serotonin untersucht, um mögliche alternative Signalwege aufzeigen zu können. Die bekannte Zunahme der Neurogenese nach SSRI/SSRE-Behandlung wurde in Wildtyptieren beobachtet, während die Therapie in Tph2-/- Mäusen keine direkte kausale Wirkung zeigte. Im Gegensatz dazu waren die BDNF-Spiegel in depressionsrelevanten Hirnregionen in Tph2-/- Mäusen nach SSRI, signifikant verringert. Auch zeigen die Studien eine neurobiologische Relevanz von Serotonin im ZNS, bei den antidepressiven Mechanismen einer Elektrokonvulsiven Krampftherapie. Ebenfalls deuten erhöhte Neurogeneseraten bei lebenslanger Abwesenheit von Serotonin im ZNS, Therapiemethoden-unabhängig, möglicherweise auf eine modulierte Stressreaktion hin. Untersuchungen der Parameter des HPA-Stressachsensystems, wiesen auf einen grundlegend veränderten Stresshormonspiegel in Tph2-/- Mäusen hin. Serotonin, the "molecule of happiness" is an important target for antidepressants. The mainly prescribed drugs in major depression are selective serotonin re-uptake inhibitors (SSRI); but recently, SSR-enhancer (SSRE) have also attracted clinical attention. However, only a quarter of patients responds to treatment. It needs to be determined, whether SSRI/E act solely via manipulating serotonin levels or whether other pathways are involved, e.g. neurotrophic signaling (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) or the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA)-axis. Furthermore, in major depression, dysregulation of central serotonin signaling is accompanied with a decline in hippocampal neurogenesis, as has been observed in rodent models. At the center of this thesis is a mouse model deficient in the central serotonin-synthesizing enzyme, tryptophan hydroxylase 2 (Tph2-/- mice). I have investigated physiological responses to antidepressant treatment in the absence of brain serotonin, and the possible role of alternative pathways. I observed the typical increase in neurogenesis upon SSRI treatment in WT mice, while it had no effect in Tph2-/- mice. In contrast, BDNF levels were significantly decreased in Tph2-/- mice after treatment with no effect in WT control mice. Furthermore, my results show a critical role of brain serotonin in the neurobiological effects of electroconvulsive seizure. Surprisingly, in animals lacking central serotonin, increased neurogenesis was observed independently of the treatment. The gathered data indicated an altered stress response; therefore, parameters of the HPA-axis have been studied, indicating a downregulated HPA system in Tph2-/-animals in baseline state, but showed no difference in treatment or feedback control. This thesis gives insight into the mechanisms of antidepressant action and reveals ideas for novel pathways involved in the process that could be used as targets in therapeutic approaches and further research in major depression.

Das deklarative Gedächtnis beruht auf Wechselwirkungen zwischen dem medialen Temporallappens (MTL) und Neokortex. Aufgrund der verteilten Natur neokortikaler Netzwerke bleiben zelluläre Ziele und Mechanismen der Gedächtnisbildung im Neokortex jedoch schwer fassbar. Im sechsschichtigen Säugetier-Neokortex konvergieren die Top-Down-Inputs auf Schicht 1 (L1). Wir untersuchten, wie Top-Down-Inputs von MTL die neokortikale Aktivität während der Gedächtnisbildung modulieren. Wir haben zunächst ein Kortex- und Hippocampus-abhängiges Lernparadigma angepasst, in dem Tiere gelernt haben, direkte kortikale Mikrostimulation und Belohnung zu assoziieren. Neuronen in den tiefen Schichten des perirhinalen Kortex lieferten monosynaptische Eingaben in L1 des primären somatosensorischen Kortex (S1), wo die Mikrostimulation vorgestellt wurde. Die chemogenetische Unterdrückung der perirhinalen Inputs in L1 von S1 störte die Gedächtnisbildung, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Leistung der Tiere nach abgeschlossenem Lernen. Dem Lernen folgte das Auftreten einer klaren Subpopulation von Pyramidenneuronen der Schicht 5 (L5), die durch hochfrequentes Burst-Feuern gekennzeichnet war und durch Blockieren der perirhinalen Inputs zu L1 reduziert werden konnte. Interessanterweise zeigte ein ähnlicher Anteil an apikalen Dendriten von L5-Pyramidenneuronen ebenfalls eine signifikant erhöhte Ca2+-Aktivität während des Gedächtnisabrufs bei Expertentieren. Wichtig ist, dass die Störung der dendritischen Ca2+-Aktivität das Lernen beeinträchtigte, was darauf hindeutet, dass apikale Dendriten von L5-Pyramidenneuronen eine entscheidende Rolle bei der Bildung des neokortikalen Gedächtnisses spielen. Wir schließen daraus, dass MTL-Eingaben das Lernen über einen perirhinalen vermittelten Gating-Prozess in L1 steuern, der sich in einer erhöhten dendritischen Ca2+-Aktivität und einem Burst-Firing in pyramidalen L5-Neuronen manifestiert. Declarative memory relies on interactions between the medial temporal lobe (MTL) and neocortex. However, due the distributed nature of neocortical networks, cellular targets and mechanisms of memory formation in the neocortex remain elusive. In the six-layered mammalian neocortex, top-down inputs converge on its outermost layer, layer 1 (L1). We examined how layer-specific top-down inputs from MTL modulate neocortical activity during memory formation. We first adapted a cortical- and hippocampal-dependent learning paradigm, in which animals learned to associate direct cortical microstimulation and reward, and characterized the learning behavior of rats and mice. We next showed that neurons in the deep layers of the perirhinal cortex not only provide monosynaptic inputs to L1 of the primary somatosensory cortex (S1), where microstimulation was presented, but also actively reflect the behavioral outcome. Chemogenetic suppression of perirhinal inputs to L1 of S1 disrupted early memory formation but did not affect animals’ performance after learning. The learning was followed by an emergence of a distinct subpopulation of layer 5 (L5) pyramidal neurons characterized by high-frequency burst firing, which could be reduced by blocking perirhinal inputs to L1. Interestingly, a similar proportion of apical dendrites (~10%) of L5 pyramidal neurons also displayed significantly enhanced calcium (Ca2+) activity during memory retrieval in expert animals. Importantly, disrupting dendritic Ca2+ activity impaired learning, suggesting that apical dendrites of L5 pyramidal neurons have a critical role in neocortical memory formation. Taken together, these results suggest that MTL inputs control learning via a perirhinal-mediated gating process in L1, manifested by elevated dendritic Ca2+ activity and burst firing in L5 pyramidal neurons. The present study provides insights into cellular mechanisms of learning and memory representations in the neocortex.

This thesis focuses on unsolved questions regarding cellular signalling in different contexts, especially in diseases. Several problems concerning different pathologies are approached applying the widely used method of calcium imaging. Since calcium is an important messenger in cellular signalling, the increase of intracellular calcium levels indicate the reaction of the cell to an external stimulus. The large variety of stimuli, such as substances but also temperature or light, allow for a wide application in the investigation of cellular responses. Besides, with its high temporal resolution and wide field of view, calcium imaging allows the simultaneous observation of physiological phenomena in a high number of cells. This thesis consists of three parts. First, we investigate different questions regarding pruritus or itch, which is a common symptom in hepatobiliary disorders. The focus of the first publication is on signalling pathways activated by Lysophosphatidic Acid. Lysophosphatidic Acid is suspected to cause pruritus in patients with hepatobiliary diseases. The activated signalling pathway is therefore of great interest, as the options of pharmacological treatment are limited. We are able to show, that Lysophosphatidic Acid does not activate neuronal cells but the surrounding glia cells and also identify the corresponding receptor. In a second publication we further investigate possible targets for pharmaceutical treatment of pruritus: Ion-channels linked to the propagation of sensory signals. Thereby, we address the function of voltage-gated sodium channels by testing different known pruritogens in vitro and in vivo in mice. This allows us to conclude the involvement of several channels in pruritus. These findings could be an important step towards the development of a potential drug against itch. The second project explores the effect of cold atmospheric plasma (CAP) on melanoma cells. We are especially interested in intracellular effects and activated signalling mechanisms. Plasma already gained importance in medical application as it is used to sterilise and to support wound healing. The use of CAP in cancer therapy still needs to be further investigated. The cell damaging properties of CAP are highly selective towards cancer cells, though the underlying mechanisms remain to be elucidated. We use a device which produces plasma from the surrounding air. The temperature is only slightly above room temperature - hence the name ’cold atmospheric plasma’ - and does not damage cells unspecifically. We investigate the effects CAP on melanoma cells using calcium imaging in two different ways to for treatment of cells with CAP: Direct treatment with the CAP-devise and indirect treatment with CAP-treated solution applied onto the cells. In both cases, we measure a significant rise of cytosolic calcium, which stems from intracellular resources. The increase of intracellular calcium is of special interest in this context, as it is linked to senescence, the termination of cell division. Inducing senescence in melanoma cells could lead to further medical applications for CAP. A substantial fraction of the activating effect of CAP-treated solutions remains, when the application is delayed for one hour, showing the surprising chemical stability of the activating substances. This indicates a possible treatment of melanoma cells with CAP-treated solutions instead of direct CAP treatment. The third part focuses on details of the method of calcium imaging itself and on details when measuring without external calcium. Calcium-free measurements are needed when investigating only intracellular calcium stores. Without extracellular calcium, the main calcium sources are the endoplasmatic reticulum and the mito- chondria. To maintain a calcium-free environment, a calcium chelator in a sufficient concentration is needed in the solution surrounding the cells. We show, that a lower concentration can cause false positive results. Additionally, we describe a method to measure under nominally calcium-free conditions with the possibility to switch from calcium-containing to calcium-free within seconds. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit bisher ungelösten Fragestellungen zu intrazellulären Signalwegen in verschiedenen Zellen. Hierbei wird ein besonderer Fokus auf die zelluläre Signaltransduktion im Bezug auf verschiedene Krankheiten gelegt welche vorrangig mittels Calcium Imaging untersucht wird. Kalzium ist ein wichtiger Botenstoff in Zellen, weshalb seine Ausschüttung ein verlässliches Zeichen für die Reaktion einer Zelle auf einen externen Stimulus ist. Die Vielfalt der möglichen Stimuli, von applizierten Substanzen über Licht bis hin zu Hitze, erlaubt daher eine sehr breite Anwendung dieser Methode. Calcium Imaging ist wegen der hohen zeitlichen Auflösung und der großen Anzahl an gleichzeitig beobachtbaren Zellen gut geeignete Methode, um physiologische Vorgänge zu beobachten. Die vorliegende Arbeit ist in drei Teile gegliedert. Der erste Teil befasst sich der Erforschung von chronischem Juckreiz, einer häufigen Begleiterscheinung vieler hep- atobiliären Krankheiten. Hierbei liegt der Fokus auf den durch Lysophosphatidic Acid aktivierten Signalwegen. Lysophosphatidic Acid ist von besonderem Interesse, da es aufgrund vorheriger Studien im Verdacht steht, Juckreiz in cholestatischen Patienten auszulösen oder zu fördern. In einer ersten Publikation konnten wir zeigen, dass es nicht wie erwartet neuronale Zellen sondern die sie umgebenden Gliazellen aktiviert, sowie den dazugehörigen Rezeptor identifizieren. Um mögliche Ansatzpunkte für Juckreiz-hemmende Medikamente zu finden, wird außerdem die Rolle verschiedener Ionenkanäle untersucht. Diese sind von Interesse, da sie sich auf der Oberfläche von Zellen befinden, zelluläre Signale weiterleiten und intrazelluläre Signalkaskaden auslösen können. Wir untersuchen in diesem Kontext insbesondere die Funktion von spannungsabhängigen Natriumkanälen bei der Weiterleitung von Signalen. Neben der Untersuchung auf zellulärer Ebene werden bereits bekannte Puritugene auf ihren Effekt auf diese Kanäle in vitro und in vivo in Mäusen getestet. Hierdurch kann bestimmt werden, inwieweit diese Kanäle an Juckreiz beteiligt sind. Da im Gegensatz zu Schmerz die medikamentöse Linderung von Juckreiz bislang kaum möglich ist, ist dies ein wichtiger Schritt auf dem Weg zur pharmazeutischen Behandlung. Im zweiten Teil der Arbeit wird der Effekt von kaltem atmosphärischem Plasma (CAP - cold athmosphseric plasma) auf magligne Melanomzellen untersucht. Plasma ist in der Medizin bereits wegen seiner desinfizierenden und wundheilungsförn- dernden Eigenschaften im Einsatz. Eine mögliche Anwendung von Plasma in der Krebstherapie ist bislang noch nicht ausreichend erforscht. Die zellschädigenden Eigenschaften des Plasmas haben sich im Bezug auf Krebszellen in der Zellkul- tur in früheren Studien als hoch selektiv erwiesen. Allerdings sind die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen noch weitgehenden unverstanden. In unseren beiden Publikationen zu diesem Thema wird ein Gerät verwendet, welches aus der Umgebungsluft Plasma erzeugen kann. Die Temperature liegt dabei lediglich leicht über Raumtemperatur - daher auch die Bezeichnung ’kalt’ - und schädigt somit Zellen nicht unselektiv durch Erhitzen. Wir untersuchen den Effekt von CAP auf Melanomzellen mittels Calcium Imaging sowohl bei direkter Behandlung der Zellen, als auch nach Applikation einer mit CAP behandelten Lösung. Beide Methoden führen zu einem deutlichen Anstieg des intrazellulären Kalziums welches aus intrazellulären Quellen stammt. Der Anstieg des zytosolischen Kalziums ist von besonderem Interesse, da ein erhöhtes Kalziumlevel in den Zellen auch mit Seneszenz, also ein Ende der Zellteilung, verknüpft ist. Gezielt Melanomzellen zur Seneszenz zu bringen während gesunde Zellen unverändert bleiben, wäre ein großer Schritt in Richtung einer breiteren medizinischen Anwendung von Plasma. Wir zeigen zudem die hohe Stabilität der an der Aktivierung der Zellen beteiligten Sub- stanzen, da eine Lösung eine Stunde nach Behandlung mit CAP noch einen großen Teil der Kalzium-Antwort in Zellen hervorruft. Dies eröffnet die Möglichkeit der Behandlung der Zellen mit CAP-bestrahlter Lösung. Im dritten Teil wird die Methode des Calcium Imaging auf die Feinheiten der Kalzium-freien Messung zur Betrachtung von intrazellulären Kalziumfreisetzungen hin analysiert. Kalzium-freie Messungen sind von Interesse, wenn, wie in vorheri- gen Abschnitten durchgeführt, der Ursprung des Kalziumeinstroms in das Cyto- plasma der Zelle untersucht werden soll. Ohne extrazelluäres Kalzium können in der Zelle Kalziumionen vor allem aus dem Mitochondrium oder dem Endoplasma- tischen Retikulum freigesetzt werden. Da jedoch ein kalziumfreie Umgebung der Zelle nicht ohne weiteres gewährleiset ist, muss diese durch die ausreichende Zu- gabe eines Kalziumgelators in das Zellmedium erzeugt werden. Wir können zeigen, dass eine unzureichende Konzentration dabei zu falsch positiven Ergebnissen führt. Daneben beschreiben wir eine Methode, um innerhalb von Sekunden von einer kalzium-haltigen auf eine kalzium-freie Umgebung zu wechseln.

Chronic heart failure (HF) is a progressive cardiac disease with a 5-year mortality rate of over 50%. Especially in industrial societies, the prevalence of heart failure is rising with currently over two million affected people in Germany and over 60 million people worldwide. However, therapeutic options are still limited and most patients eventually require heart transplantation to survive. For the development of new therapies, a better understanding of the processes underlying contractile dysfunction in HF is essential. In chronically failing hearts, the transverse tubular system (t-system), a complex network of membrane invaginations of cardiomyocytes, was shown to be severely compromised. Normally, the t-system is very dense and ensures a close apposition of L-type Ca2+ channels (LTCC), located in the cell membrane, with ryanodine receptors (RyR) in the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. The formation of RyR-LTCC junctions promotes a rapid and synchronous rise of cytoplasmic Ca2+, necessary for contraction (excitation-contraction coupling). It is still unclear to which extent loss and remodeling of the t-system contribute to reduced contractility of the heart and vice versa. So far, t system remodeling in human HF was only described in chronically ill patients. However, if t system remodeling may also occur and contribute to dysfunction in acute HF is unknown. Furthermore, despite extensive research, the mechanisms of t-system remodeling are still elusive. Initial experiments showed that glucocorticoid (GC) treatment of animal cardiomyocytes in vitro can prevent t-system loss otherwise observed under control conditions. Therefore, the present study aimed to investigate the t system in human hearts after acute HF. Subsequently, the effects of GC treatment on the t system and EC coupling were studied in model of t-system loss in adult rat cardiomyocytes, and in mouse hearts with cardiomyocyte-specific knockout of the glucocorticoid receptor (GR). It was further investigated if known t system associated scaffolding proteins and metabolic pathways are involved in t system regulation. Finally, an efficient protocol for the isolation of human cardiomyocytes was developed, to test if effects of GC on the t-system can be transferred to human cardiomyocytes. Confocal microscopy analyses showed that t-system loss and remodeling may also occur in acute human HF, resembling the changes typically observed in chronic HF. Cultivation of adult rat cardiomyocytes showed preservation of the t system by GCs. Analysis of intracellular Ca2+ signaling by confocal microscopy further revealed an improved Ca2+ release synchrony in GC-treated cardiomyocytes. Cardiomyocytes of GR knockout mice exhibited a substantial reduction of the t-system and increased RyR-LTCC distances, which was shown by confocal microscopy and STED super-resolution microscopy. This result confirmed the importance of GC signaling in maintaining the t-system and cardiac EC coupling structures, also in vivo. To identify specific pathways, immunofluorescent staining of t-system-associated proteins and RNA sequencing were performed in isolated rat cardiomyocytes. Although reported to be involved in t-system organization and development, the expression and localization of the scaffolding proteins BIN1, JPH2 and CAV3 were not affected by GC treatment. However, the expression of proteins involved in autophagy, a conserved cellular recycling pathway, was strikingly elevated. Autophagy assays in isolated rat cardiomyocytes indicated enhanced autophagic turnover after GC treatment. Intriguingly, stimulating autophagy preserved the t-system independently of GCs, while inhibiting autophagy accelerated t system loss, even in the presence of GCs. To verify if GCs stabilize the t-system also in human cardiomyocytes, an improved isolation technique was developed. It was found that using vibratome-cut myocardial slices of 300µm thickness improved cardiomyocytes isolation strikingly. The new method yielded up to 200 cells per milligram tissue, which enabled the cultivation of human cardiomyocyte culture. Subsequent experiments showed that GCs preserved the t-system in human cardiomyocytes. The results of this study indicate that t-system remodeling is not exclusive to chronic HF but also occurs in acute human HF. Furthermore, this work shows that GC signaling is crucial for maintaining the t-system and EC coupling in rodent cardiomyocytes in vitro and in vivo. Importantly, stabilization of t-system by GCs could also be demonstrated in human cardiomyocytes. Increased autophagy was identified as a major mechanism of t-system preservation, in consistence with the eminent role of autophagy in cardiac physiology. These results may contribute to the identification of novel therapeutic targets for heart failure. Moreover, the newly developed approach for human cardiomyocyte isolation may facilitate translational cardiac research.

Hintergrund und Ziele: Regionale Unterschiede von Ionenkanalaktivität im Herzen steuern die geordnete Abfolge der Repolarisation und können entsprechend zu Unterschieden bei der Kontraktion führen. In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, inwieweit der kardiale Mineralokortikoidrezeptor (MR) einen Einfluss auf die Regulation der intrazellulären Ca2+- Konzentration und der Kontraktilität in linksventrikulären Kardiomyozyten der Ratte hat. Hierbei wurden insbesondere MR-induzierte Effekte auf Aktionspotentiale, Ionenkanäle, Ca2+- Haushalt und Kontraktilität analysiert, welche regionalen Unterschiede es dabei zwischen subepikardialen und subendokardialen Zellen gibt, und mögliche Erklärungen diskutiert. Methoden: Linksventrikuläre Kardiomyozyten wurden isoliert und für 24 Stunden in einer Kulturlösung, die Dexamethason und Insulin (D+I) enthielt, bzw. Kontrolllösung inkubiert. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden die Ionenströme ICaL, Ito, und IK untersucht. Ca2+-Transienten und Kontraktilität der Kardiomyozyten wurden mittels Epifluoreszenzmessung (Fura2-AM) sowie Sarkomerlängenbestimmung untersucht. In Western-Blot-Analysen wurde die Expression zweier wesentlicher am Ca2+-Transport beteiligter Proteine (Sarkoplasmatische- Retikulum-ATPase (SERCA) und Phospholamban) analysiert. Ergebnisse: Eine Inkubation in D+I-Kulturlösung führte zu einem ähnlichen Anstieg des ICaL in subendo- und subepikardialen Myozyten, während die K+-Ströme IK und Ito im Vergleich zur Kontrolle unverändert waren. Nach Zugabe von Spironolacton zur Kulturlösung waren keine Veränderungen des ICaL im Vergleich zu Kontrolllösung mehr detektierbar, sodass der Mineralokortikoidrezeptor als am Signalweg wesentlich beteiligt identifiziert werden konnte. Die Aktionspotentialdauer (APD) und der aktionspotentialinduzierte Ca2+-Einstrom (QCa) waren ausschließlich in subepikardialen Myozyten signifikant gesteigert. In Dexamethason/Insulin-inkubierten Zellen war ein deutlicher Anstieg in Ca2+-Transienten und Kontraktilität messbar (subepikardial +43%, subendokardial +70%), wohingegen die Füllung des sarkoplasmatischen Retikulums unverändert blieb. Eine Inhibition der SERCA durch Thapsigargin bewirkte in D+I-Zellen einen deutlich größeren Rückgang des Ca2+- Transienten, wobei der Effekt subepikardial leicht größer war. Im Western Blot zeigte sich bei Dexamethason/Insulin-inkubierten Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe eine nur leicht verringerte Menge an SERCA-Protein, jedoch signifikant weniger Phospholamban (PLB). Die Analyse von phosphoryliertem Phospholamban in den jeweiligen Gruppen ergab ähnliche Mengen von PLBpSer16 sowie deutlich mehr PLBpThr17. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse zeigen, dass Kortikosteroide sowohl in subepi- als auch in subendokardialen Myozyten starke Modulatoren von ICaL, Ca2+-Transienten und Kontraktilität sind, während die Aktionspotentialdauer und der aktionspotentialinduzierte Ca2+-Einstrom nur in subepikardialen Myozyten gesteigert sind. Dies weist darauf hin, dass die kortikosteroidinduzierte positive Inotropie hauptsächlich durch den ICaL und die Aktivität der SERCA mediiert wird. Regional differences in ion channel activity in the heart control the sequence of repolarization and may contribute to differences in contraction. Corticosteroids such as aldosterone or corticosterone increase the L-type Ca2+ current ( ICaL) in the heart via the mineralocorticoid receptor (MR). Here, we investigate the differential impact of corticosteroid-mediated increase in ICaL on action potentials (AP), ion currents, intracellular Ca2+ handling and contractility in endo- and epicardial myocytes of the rat left ventricle. Dexamethasone led to a similar increase in ICaL in endocardial and epicardial myocytes, while the K+ currents Ito and IK were unaffected. However, AP duration (APD) and AP-induced Ca2+ influx ( QCa) significantly increased exclusively in epicardial myocytes, thus abrogating the normal differences between the groups. Dexamethasone increased Ca2+ transients, contractility and SERCA activity in both regions, the latter possibly due to a decrease in total phospholamban (PLB) and an increase PLBpThr17. These results suggest that corticosteroids are powerful modulators of ICaL, Ca2+ transients and contractility in both endo- and epicardial myocytes, while APD and QCa are increased in epicardial myocytes only. This indicates that increased ICaL and SERCA activity rather than QCa are the primary drivers of contractility by adrenocorticoids.

Profilins are actin-binding proteins and influence actin dynamics via their binding. In the central nervous system, neuronal transmission depends on cell morphology. Therefore, profilins are of high importance in neurons. The two isoforms of profilin are relevant for cellular functions and are therefore closely related to synaptic plasticity and processes such as learning and memory formatiozn. However, the exact influence of the two isoforms of profilin on various cellular functions has not yet been conclusively investigated. It is known that profilins can have isoform-specific and also overlapping functions. In the mouse hippocampus, profilins modulate the actin network, resulting in changes in the morphology of dendrite and spine processes. Although the function and regulation of profilins is critical for neuronal morphology, the resulting physiological consequences have not been studied in detail. To be able to study the role of both isoforms in neuronal systems, the CRISPR Cas9 genome editing system was used. Thus, cell type- and isoform specific knockout of profilins can be achieved. In this context, simultaneous knockout of both profilin isoforms precluded mutual compensation. Analyses of neuronal morphology in primary hippocampal cultures indicate an essential role for profilin2a in dendritic complexity, confirming previous studies from this laboratory. Combining the Cas9 genome editing system with the adeno-associated viruses allowed the study of mouse behavior in learning and memory. This work shows for the first time cognitive impairments related to memory retrieval. Moreover, this study reports physiological deficits in amplitude and frequency of excitatory postsynaptic currents (EPSCs) as a consequence of the loss of the profilin. Intriguingly, this phenomenon did not occur in the case of a double knockout. In summary, this work demonstrated the relevance of profilins for cellular morphology in hippocampal neurons, the necessity of both profilins in the hippocampus for learning and memory behavior, and finally an essential role of profilins in neuronal transmission., Profiline sind Aktin-bindende Proteine und beeinflussen über ihre Bindung die Aktindynamik. Im zentralen Nervensystem hängt die neuronale Transmission von der Morphologie der Zellen ab. Daher sind Profilin in Nervenzellen von einer hohen Bedeutung. Die beiden Isoformen des Profilins sind für zellulären Funktionen relevant und hängen daher eng mit der synaptischen Plastizität und Prozessen wie Lernen und Gedächtnisbildung zusammen. Der genaue Einfluss der zwei Isoformen von Profilin auf die verschiedenen zellulären Funktionen ist allerding noch nicht abschließend erforscht. Es ist bekannt, dass Profiline isoformspezifische und auch überlappende Funktionen haben können. Im Hippocampus der Maus modulieren die Profiline das Aktinnetzwerk, was zu einer Veränderung der Morphologie von Dendriten- und Dornenfortsätzen führt. Obwohl die Funktion und Regulation der Profiline für die neuronale Morphologie von entscheidender Bedeutung ist, sind die daraus resultierenden physiologischen Konsequenzen noch nicht genauer untersucht worden. Um die Rolle beider Isoformen in neuronalen Systemen untersuchen zu können, wurde das CRISPR Cas9 Genome Editing System eingesetzt. So kann ein Neuronen- und isoformspezifischer Knockout von Profilinen erzielt werden. Dabei konnte durch den simultanen Knockout beider Profilin-Isoformen eine gegenseitige Kompensation ausgeschlossen werden. Analysen der neuronalen Morphologie in primären hippokampalen Kulturen weisen auf eine essentielle Rolle von Profilin2a für die dendritische Komplexität hin, was frühere Studien aus diesem Labor bestätigen. Durch die Kombination des Cas9-Genome-Editing-Systems zur mit den Adeno-assoziierten Viren war die Untersuchung des Verhaltens von Mäusen in Bezug auf Lernen und Gedächtnis möglich. Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal kognitive Beeinträchtigungen in Bezug auf Gedächtnisabrufens. Darüber hinaus berichtet diese Studie über physiologische Defizite in Amplitude und Frequenz exzitatorischer postsynaptischer Ströme (EPSCs) in Folge des Verlusts von Profilin. Erstaunlicherweise ist dieses Phänomen im Falle eines Doppel-Knockout nicht aufgetreten. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit die Relevanz der Profiline- für die zellulären Morphologie in pyramidalen Neuronen des Hippocampus‘, die Notwendigkeit beider Profiline im Hippocampus für das Lern- und Gedächtnisverhalten und schließlich eine essentielle Rolle der Profiline in der neuronalen Transmission gezeigt werden.

These days, treatment of melanoma patients relies on targeted therapy with BRAF/MEK inhibitors and on immunotherapy. About half of all patients initially respond to existing therapies. Nevertheless, the identification of alternative therapies for melanoma patients with intrinsic or acquired resistance is of great importance. In melanoma, antioxidants play an essential role in the maintenance of the redox homeostasis. Therefore, disruption of the redox homeostasis is regarded as highly therapeutically relevant and is the focus of the present work. An adequate supply of cysteine is essential for the production of the most important intracellular antioxidants, such as glutathione. In the present work, it was investigated whether the depletion of cysteine and glutathione is therapeutically useful. Depletion of glutathione in melanoma cells could be achieved by blocking cysteine supply, glutathione synthesis, and NADPH regeneration. As expected, this led to an increased level of reactive oxygen species (ROS). Surprisingly, however, these changes did not impair the proliferation and survival of the melanoma cells. In contrast, glutathione depletion led to cellular reprogramming which was characterized by the induction of mesenchymal genes and the repression of differentiation markers (phenotypic switch). This was accompanied by an increased migration and invasion potential which was favored by the induction of the transcription factor FOSL1. To study in vivo reprogramming, Gclc, the first and rate-limiting enzyme in glutathione synthesis, was knocked out by CRISPR/Cas9 in murine melanoma cells. The cells were devoid of glutathione, but were fully viable and showed a phenotypic switch, the latter only in MITF-expressing B16F1 cells and not in MITF-deficient D4M3A.781 cells. Following subcutaneous injection into immunocompetent C57BL/6 mice, Gclc knockout B16F1 cells grew more aggressively and resulted in an earlier tumor onset than B16F1 control cells. In summary, this work demonstrates that inhibition of cysteine supply and thus, glutathione synthesis leads to cellular reprogramming in melanoma. In this context, melanoma cells show metastatic capabilities, promoting a more aggressive form of the disease., Die Behandlung von Melanompatienten beruht heutzutage auf der gerichteten Therapie mit BRAF/MEK Inhibitoren und auf der Immuntherapie. Circa die Hälfte aller Patienten spricht zunächst auf die vorhandenen Therapien an. Dennoch ist die Identifizierung alternativer Therapieansätze für Melanompatienten mit intrinsischer oder erworbener Resistenz von großer Wichtigkeit. Im Melanom spielen Antioxidanzien eine essenzielle Rolle zur Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase. Eine Störung der Redox-Homöostase wird daher als therapeutisch hochrelevant betrachtet und steht im Fokus der vorliegenden Arbeit. Eine ausreichende Versorgung mit Cystein ist essenziell zur Produktion der wichtigsten intrazellulären Antioxidanzien wie dem Glutathion. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Depletion von Cystein und Glutathion therapeutisch nützlich ist. Eine Depletion von Glutathion in Melanomzellen konnte durch eine Blockierung der Cysteinversorgung, der Glutathionsynthese und der NADPH-Regeneration erreicht werden. Dies führte wie erwartet zu einem erhöhten Level von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Überraschenderweise beeinträchtigten diese Veränderungen jedoch nicht die Proliferation und das Überleben der Melanomzellen. Im Gegenteil führte die Glutathion-Depletion zu einer zellulären Reprogrammierung, die durch die Induktion mesenchymaler Gene und der Repression von Differenzierungsmarkern gekennzeichnet war (phenotypic switch). Dies ging mit einem erhöhten Migrations- und Invasionspotential einher, welches durch die Induktion des Transkriptionsfaktors FOSL1 begünstigt wurde. Für die Untersuchung der Reprogrammierung in vivo wurde Gclc, das erste und geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Glutathionsynthese, mittels CRISPR/Cas9 in murinen Melanomzellen ausgeknockt. Die Zellen waren voll lebensfähig und zeigten erwartungsgemäß reduzierte Glutathionlevel und einen phenotypic switch. Letzterer zeigte sich jedoch nur in MITF-exprimierenden B16F1 Zellen und nicht in MITF-defizienten D4M3A.781 Zellen. Nach subkutaner Injektion in immunkompetente C57BL/6 Mäuse wuchsen die Gclc-knockout B16F1 Zellen aggressiver und führten zu einer früheren Tumorentstehung als B16F1 Kontrollzellen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Hemmung der Cysteinversorgung und somit der Glutathionmenge im Melanom zu einer Reprogrammierung führt, bei der Melanomzellen metastasierende Fähigkeiten aufweisen und somit zu einer aggressiveren Form der Erkrankung führen.

Significant advances in fluorescence imaging techniques enable life scientists today to gain insights into biological systems at an unprecedented scale. The interpretation of image features in such bioimage datasets and their subsequent quantitative analysis is referred to as bioimage analysis. A substantial proportion of bioimage analyses is still performed manually by a human expert - a tedious process that is long known to be subjective. Particularly in tasks that require the annotation of image features with a low signal-to-noise ratio, like in fluorescence images of tissue samples, the inter-rater agreement drops. However, like any other scientific analysis, also bioimage analysis has to meet the general quality criteria of quantitative research, which are objectivity, reliability, and validity. Thus, the automation of bioimage analysis with computer-aided approaches is highly desirable. Albeit conventional hard-coded algorithms are fully unbiased, a human user has to set its respective feature extraction parameters. Thus, also these approaches can be considered subjective. Recently, deep learning (DL) has enabled impressive advances in computer vision research. The predominant difference between DL and conventional algorithms is the capability of DL models to learn the respective task on base of an annotated training dataset, instead of following user-defined rules for feature extraction. This thesis hypothesized that DL can be used to increase the objectivity, reliability, and validity of bioimage analyses, thus going beyond mere automation. However, in absence of ground truth annotations, DL models have to be trained on manual and thus subjective annotations, which could cause the model to incorporate such a bias. Moreover, model training is stochastic and even training on the same data could result in models with divergent outputs. Consequently, both the training on subjective annotations and the model-to-model variability could impair the quality of DL-based bioimage analyses. This thesis systematically assessed the impacts of these two limitations experimentally by analyzing fluorescence signals of a protein called cFOS in mouse brain sections. Since the abundance of cFOS correlates with mouse behavior, behavioral analyses could be used for cross-validation of the bioimage analysis results. Furthermore, this thesis showed that pooling the input of multiple human experts during model training and integration of multiple trained models in a model ensemble can mitigate the impact of these limitations. In summary, the present study establishes guidelines for how DL can be used to increase the general quality of bioimage analyses., Fortschritte in den Methoden der fluoreszenz-basierten Bildgebung ermöglichen Biowissenschaftlern heutzutage noch nie dagewesene Einblicke in biologische Systeme. Die Interpretation sowie die anschließende quantitative Analyse von Bildelementen in biologischen Bilddatensätzen wird in der Wissenschaft als bioimage analysis bezeichnet. Ein wesentlicher Anteil der bioimage analysis wird noch immer von Experten per Hand durchgeführt - ein mühsamer Prozess, von dem man seit langem weiß, dass er subjektiv ist. Besonders bei Aufgabestellungen, welche die Annotierung von Bildelementen mit einem geringen Signal-Rausch-Verhältnis erfordern, wie es beispielsweise bei Fluoreszenzbildern von Gewebeproben der Fall ist, sinkt die Übereinstimmung zwischen den Bewertungen mehrerer Experten. Genauso wie jede andere wissenschaftliche Analyse, muss jedoch auch die bioimage analysis den generellen Qualitätskriterien quantitativer Forschung gerecht werden. Dies sind Objektivität, Zuverlässigkeit und Validität. Die Automatisierung der bioimage analysis mit Hilfe von computer-basierten Ansätzen ist somit erstrebenswert. Konventionelle, hartkodierte Algorithmen sind zwar vollkommen unvoreingenommen, jedoch legt ein menschlicher Benutzer jene Parameter fest, die der Algorithmus für die Extraktion der relevanten Bildelemente nutzt. Aus diesem Grund sind auch diese Ansätze zumindest partiell subjektiv. In den letzten Jahren hat Deep learning (DL) zu beeindruckenden Fortschritten auf dem Forschungsgebiet der computer vision beigetragen. Der vorherrschende Unterschied zwischen DL und konventionellen Algorithmen besteht darin, dass DL Modelle in der Lage sind die jeweilige Aufgabe auf Grundlage eines annotierten Trainingsdatensatzes zu lernen, anstatt starr den Parametern zu folgen, die der Benutzer für die Extraktion der relevanten Bildelemente vorgegeben hat. In dieser Dissertation wurde die Hypothese untersucht, ob DL, neben der Möglichkeit der automatischen Bildanalyse, auch dazu genutzt werden kann die Objektivität, die Zuverlässigkeit und die Validität der Bildanalyse zu verbessern. Ohne eine objektive Referenzannotierung muss das Training der DL Modelle jedoch auf händisch erstellten und somit also subjektiven Annotierungen durchgeführt werden. Theoretisch könnte dies dazu führen, dass das DL-Modell diese Vorgeingenommenheit übernimmt. Außerdem unterliegt das Training der Modelle stochastischen Prozessen und selbst Modelle, die auf den gleichen Trainingsdaten trainiert wurden, könnten sich danach in ihren ausgegeben Analysen unterscheiden. Demzufolge könnten also sowohl das Training auf subjektiven Annotierungen als auch die Variabilität von Modell zu Modell die Qualität der DL-basierten Analyse von biologischen Bilddaten beeinträchtigen. In dieser Dissertation werden die Einflüsse von diesen beiden Limitierungen auf Grundlage von experimentellen Daten untersucht. In den experimentellen Bilddaten werden Fluoreszenzsignale des Proteins cFOS in Hirnschnitten von Mäusen dargestellt und hier repräsentativ untersucht. Da das Vorkommen von cFOS mit dem Verhalten der Mäuse korreliert, kann die Analyse des Verhaltens der Mäuse zur Kreuzvalidierung der Analyse der biologischen Bilddaten herangezogen werden. Die Daten dieser Dissertation zeigen, dass die Integration mehrerer Experten in das Training eines Modells sowie die Integration mehrerer trainierter Modelle in ein Modell-Ensemble das Risiko einer subjektiven oder nicht reproduzierbaren Bildanalyse abschwächen können. Diese Arbeit etabliert Richtlinien dafür, wie DL verwendet werden kann, um die generelle Qualität der Analyse biologischer Bilddaten zu erhöhen.

The liver plays a pivotal role in maintaining energy homeostasis. Hepatic carbohydrate and lipid metabolism are tightly regulated in order to adapt quickly to changes in nutrient availability. Postprandially, the liver lowers the blood glucose levels and stores nutrients in form of glycogen and triglycerides (TG). In contrast, upon fasting, the liver provides glucose, TG, and ketone bodies. However, obesity resulting from a discrepancy in food intake and energy expenditure leads to abnormal fat accumulation in the liver, which is associated with the development of hepatic insulin resistance, non-alcoholic fatty liver disease, and diabetes. In this context, hepatic insulin resistance is directly linked to the accumulation of diacylglycerol (DAG) in the liver. Besides being an intermediate product of TG synthesis, DAG serves as second messenger in response to G-protein coupled receptor signaling. Protein kinase D (PKD) family members are DAG effectors that integrate multiple metabolic inputs. However, the impact of PKD signaling on liver physiology has not been studied so far. In this thesis, PKD3 was identified as the predominantly expressed isoform in liver. Stimulation of primary hepatocytes with DAG as well as high-fat diet (HFD) feeding of mice led to an activation of PKD3, indicating its relevance during obesity. HFD-fed mice lacking PKD3 specifically in hepatocytes displayed significantly improved glucose tolerance and insulin sensitivity. However, at the same time, hepatic deletion of PKD3 in mice resulted in elevated liver weight as a consequence of increased hepatic lipid accumulation. Lack of PKD3 in hepatocytes promoted sterol regulatory element-binding protein (SREBP)-mediated de novo lipogenesis in vitro and in vivo, and thus increased hepatic triglyceride and cholesterol content. Furthermore, PKD3 suppressed the activation of SREBP by impairing the activity of the insulin effectors protein kinase B (AKT) and mechanistic target of rapamycin complexes (mTORC) 1 and 2. In contrast, liver-specific overexpression of constitutive active PKD3 promoted glucose intolerance and insulin resistance. Taken together, lack of PKD3 improves hepatic insulin sensitivity but promotes hepatic lipid accumulation. For this reason, manipulating PKD3 signaling might be a valid strategy to improve hepatic lipid content or insulin sensitivity. However, the exact molecular mechanism by which PKD3 regulates hepatocytes metabolism remains unclear. Unbiased proteomic approaches were performed in order to identify PKD3 phosphorylation targets. In this process, numerous potential targets of PKD3 were detected, which are implicated in different aspects of cellular metabolism. Among other hits, phenylalanine hydroxylase (PAH) was identified as a target of PKD3 in hepatocytes. PAH is the enzyme that is responsible for the conversion of phenylalanine to tyrosine. In fact, manipulation of PKD3 activity using genetic tools confirmed that PKD3 promotes PAH-dependent conversion of phenylalanine to tyrosine. Therefore, the data in this thesis suggests that PKD3 coordinates lipid and amino acid metabolism in the liver and contributes to the development of hepatic dysfunction., Die Leber spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Energiehomöostase. Der hepatische Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel ist stark reguliert, um sich schnell an Veränderungen in der Nährstoffverfügbarkeit anzupassen. Die Leber senkt postprandial den Blutzuckerspiegel und speichert Nährstoffe in Form von Glykogen und Triglyzeriden (TG). Im Gegensatz dazu stellt die Leber beim Fasten Glukose, TG und Ketonkörper bereit. Fettleibigkeit, welche aus einer Diskrepanz zwischen Nahrungsaufnahme und Energieaufwand resultiert, führt allerdings zu einer abnormalen Fettansammlung in der Leber, die mit der Entwicklung von Leberinsulinresistenz, nicht-alkoholischen Fettlebererkrankungen und Diabetes einhergeht. Hepatische Insulinresistenz steht dabei in direktem Zusammenhang mit der Akkumulation von Diacylglycerol (DAG) in der Leber. DAG ist nicht nur ein Zwischenprodukt der TG-Synthese, sondern dient auch als sekundärer Messenger im G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signalweg. Die Mitglieder der Proteinkinase D (PKD)-Familie sind DAG-Effektoren, die vielfache metabolische Inputs integrieren. Jedoch wurden die Auswirkungen der PKD-Signalwirkung auf die Leberphysiologie bisher nicht untersucht. Im Rahmen dieser Thesis wurde PKD3 als die in der Leber überwiegend exprimierte Isoform identifiziert. Die Stimulation von primären Hepatozyten mit DAG sowie die Fütterung von Mäusen mit fettreicher Nahrung (HFD) führte zu einer Aktivierung von PKD3, was auf eine Relevanz von PKD3 bei Fettleibigkeit hinweist. Mäusen, welchen PKD3 spezifisch in Hepatozyten fehlte und mit HFD gefüttert wurden, zeigten eine deutlich verbesserte Glukosetoleranz und Insulinsensitivität. Gleichzeitig führte jedoch die hepatische Deletion von PKD3 bei Mäusen zu einem erhöhten Lebergewicht in Folge einer erhöhten Lipidakkumulation in der Leber. Das Fehlen von PKD3 in Hepatozyten förderte die Sterol Regulatory Element-Binding Protein (SREBP)-vermittelte de novo Lipogenese in vitro und in vivo und erhöhte damit den Gehalt an Triglyceriden und Cholesterol in der Leber. Darüber hinaus supprimierte PKD3 die Aktivierung von SREBP, indem es die Aktivität der Insulin-Effektoren Proteinkinase B (AKT) und mechanistisches Ziel von Rapamycin- Komplexen (mTORC) 1 und 2 verminderte. Im Gegensatz dazu förderte die leberspezifische Überexpression von konstitutiv aktiver PKD3 die Glukoseintoleranz und Insulinresistenz. Zusammenfassend verbessert der Mangel an PKD3 die hepatische Insulinempfindlichkeit, aber fördert gleichzeitig die Akkumulation von Lipiden in der Leber. Aus diesem Grund könnte das Eingreifen in den PKD3-Signalweg eine gute Strategie zur Verbesserung des hepatischen Lipidgehalts oder der Insulinempfindlichkeit sein. Allerdings bleibt der genaue molekulare Mechanismus, mit dem PKD3 den Stoffwechsel von Hepatozyten reguliert, unklar. Es wurden unvoreingenommene proteomische Ansätze durchgeführt, um PKD3- Phosphorylierungsziele zu identifizieren. In diesem Prozess wurden zahlreiche potenzielle Ziele von PKD3 entdeckt, welche in den verschiedensten Aspekten des Zellstoffwechsels involviert sind. Unter anderem wurde Phenylalaninhydroxylase (PAH) als Ziel von PKD3 in Hepatozyten identifiziert. PAH ist das Enzym, welches für die Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin verantwortlich ist. Tatsächlich bestätigte die Manipulation der PKD3-Aktivität mit Hilfe von genetischen Werkzeugen, dass PKD3 die PAH-abhängige Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin fördert. Deswegen legen die Daten in dieser Arbeit nahe, dass PKD3 den Lipid- und Aminosäurestoffwechsel in der Leber koordiniert und zur Entwicklung von Leber- Dysfunktion beiträgt.

Die Ergebnisse, welche in dieser Arbeit erzielt wurden, zeigen, dass es möglich ist, durch gezielte Glucoselimitierung und die Zufütterung der alternativen Kohlenstoffquelle Galactose das Wachstum als auch die Produktbildung deutlich zu verbessern. Ausschlaggebend für das Maß der Verbesserung war u.a. die verwendete Zelllinie. Je nach Präferenz zur Lactatbildung oder zum Lactatkonsum im späteren Verlauf der Kultivierung wirkte sich die Glucoselimitierung unterschiedlich auf die Kulturen aus., The results, gained in this work, show the potential to increase growth and productivity by implementing a well-directed glucose limitation and the additional feeding with the alternative carbon source galactose. One of the decisive parameters in the whole process was the used cell line itself. The preference of the cells either to form lactate or to consume it in the later stage of the cultivation determined the influence of the glucose limitation on the cell culture.

Ionizing radiation is commonly used in radiotherapy (RT) for the local treatment of solid tumors to kill cancer cells and to stop tumor progression. Meanwhile, RT is also known to have immune-stimulatory properties by causing immunogenic tumor cell death turning tumors into in situ cancer vaccines eventually leading to anti-tumor immune responses. However, due to the immunosuppressive tumor microenvironment, after RT alone the immune system often fails to completely eradicate residual tumor masses of locally irradiated lesions or distant metastases. Although therapies are continuously improving, these systemic immune responses after RT that also target distant metastases outside of the radiation field, the so called abscopal effects, are still rarely seen in the clinic. Thus, immunotherapies are needed to break immunosuppression or to amplify RT-induced anti-tumor immune responses. The latter can be addressed by autologous whole tumor cell-based vaccines which comprise tumor-associated or -specific antigens of a particular patient. Since their approval for the treatment of several tumor entities, immune checkpoint inhibitors, counteracting tolerance induction and repressed tumor cell killing by immune cells, have achieved great success. The combined treatment with RT is currently under investigation in many clinical trials but is by far not standard yet. Here we aimed to generate inactivated whole tumor cell vaccines with high hydrostatic pressure (HHP) which are safe but still immunogenic to boost RT-induced immune responses. We hypothesized that RT and such HHP-vaccines synergize to generate a tumor microenvironment fostering tumor growth retardation in locally irradiated tumors and that systemic anti-tumor immune reactions can also be triggered when anti-PD-1 immune checkpoint inhibitors are applied in addition. In pre-clinical model systems we subcutaneously (s.c.) injected mice with syngeneic B16 melanoma or CT26 colon carcinoma cells, respectively. To evaluate the efficiency of RT in combination with HHP vaccines, established tumors were locally irradiated with a hypofractionated schedule and mice were injected next to the tumor with HHP-vaccines generated with 200 MPa. In an abscopal tumor model with local irradiation of only one of two B16 tumors (one on each flank) using two differently hypofractionated schedules with 2x8 Gy or 3x8 Gy, HHP-vaccines were injected s.c. in the neck. Additionally, mice concurrently received anti-PD-1 antibodies. Tumor growth and survival of the mice was monitored and the immunological tumor microenvironment was analyzed via multi-color flow cytometry, qPCR and ELISA. Tumor cells treated with a pressure of 200 MPa were completely inactivated and lost the potential to form colonies in vitro or tumors in vivo. Combined treatment of local irradiation and therapeutic HHP-vaccination resulted in retarded tumor growth and prolonged survival of the mice in both tumor models. The number of cells per gram of tumor across several immune cell subtypes was only significantly increased in B16 tumors that were treated with both, RT and HHP-vaccines. Irradiated tumors showed higher expression of suppressive immune checkpoint ligands and most of the tumor-infiltrating T cells were positive for PD-1 expression, providing a rationale for the combination with anti-PD-1 checkpoint inhibition. Although injected distantly in the abscopal setting, HHP-vaccines also further retarded the growth of locally irradiated tumors even though in all radioimmunotherapy combinations the total number of immune cells was decreased in primary tumors and the peripheral blood. However, HHP-vaccination combined with RT failed to significantly induce abscopal anti-tumor immune responses and even partly abrogated those which were induced with RT plus anti-PD-1. In this group, the abscopal effects were accompanied by an elevated infiltration of CD8+ T cells. Adding another fraction of 8 Gy completely abrogated abscopal effects and in vitro data revealed that multiple immunosuppressive and oncogenic pathways including cell death, cytokine release, and checkpoint expression were differently modulated with 3x8 Gy when compared to 2x8 Gy. We further found that high intratumoral concentrations of IGFBP-6 correlated with abscopal responses. Surprisingly, knockdown of IGFBP-6 inhibited tumor growth in vitro and in vivo. We conclude that autologous whole tumor cell-based vaccines generated with HHP are safe and suitable to be combined with RT and work irrespective of the injection site of the vaccine if the tumor was previously irradiated. However, HHP-vaccines without any additional adjuvant do not increase abscopal anti-tumor immune responses induced with RT plus anti-PD-1 and thus need further optimization in the future. Ionisierende Strahlung wird üblicherweise in der Strahlentherapie (RT) zur lokalen Behandlung von soliden Tumoren verwendet, um Krebszellen abzutöten und das Fortschreiten des Tumors zu stoppen. Mittlerweile ist auch bekannt, dass RT immunstimulierende Eigenschaften hat, indem es immunogenen Tumorzelltod verursacht und Tumore in in-situ-Krebsimpfstoffe verwandelt, die schließlich zu anti-Tumor-Immunantworten führen. Aufgrund der immunsuppressiven Tumormikroumgebung kann das Immunsystem jedoch die verbleibenden Tumormassen lokal bestrahlter Läsionen oder Fernmetastasen außerhalb des Bestrahlungsfeldes nach RT allein oft nicht vollständig eliminieren. Obwohl sich die Therapien kontinuierlich verbessern, werden diese systemischen Immunantworten nach RT, welche auch unter dem Begriff abskopaler Effekt bekannt sind, in der Klinik immer noch selten beobachtet. Daher sind Immuntherapien erforderlich, um die Immunsuppression zu unterbrechen oder RT-induzierte anti-Tumor-Immunantworten zu verstärken. Letzteres kann durch autologe Impfstoffe auf der Basis ganzer Tumorzellen realisiert werden, die tumorassoziierte oder -spezifische Antigene eines bestimmten Patienten beinhalten. Seit ihrer Zulassung für die Behandlung mehrerer Tumorentitäten haben Immun-Checkpoint-Inhibitoren, die der Toleranzinduktion und der unterdrückten Abtötung von Tumorzellen durch Immunzellen entgegenwirken, große Erfolge erzielt. Die Behandlung in Kombination mit RT wird derzeit in vielen klinischen Studien untersucht, ist jedoch bei weitem noch nicht Standard. In dieser Arbeit war es unser Ziel inaktivierte Ganzzell-Tumorimpfstoffe mit hohem hydrostatischem Druck (HHP) zu erzeugen, die sicher und immunogen sind, um RT-induzierte Immunantworten zu verstärken. Wir stellten die Hypothese auf, dass RT und solche HHP-Impfstoffe zusammenwirken, um eine Tumormikroumgebung zu erzeugen, die die Verzögerung des Tumorwachstums bei lokal bestrahlten Tumoren fördert, und dass darüber hinaus systemische anti-Tumor-Immunreaktionen ausgelöst werden können, wenn zusätzlich anti-PD-1-Immun-Checkpoint-Inhibitoren angewendet werden. In präklinischen Modellsystemen injizierten wir Mäusen subkutan (s.c.) syngene B16-Melanom- oder CT26-Kolonkarzinomzellen. Um die Effizienz von RT in Kombination mit HHP-Impfstoffen zu untersuchen, wurden etablierte Tumoren lokal mit einem hypofraktionierten Schema bestrahlt und Mäusen wurden neben dem Tumor HHP-Impfstoffe injiziert, die mit 200 MPa erzeugt wurden. In einem abskopalen Tumormodell mit lokaler Bestrahlung von nur einem von zwei B16-Tumoren (einer an jeder Flanke) unter Verwendung von zwei unterschiedlich hypofraktionierten Zeitplänen mit 2×8 Gy oder 3×8 Gy wurden HHP-Impfstoffe s.c. im Nacken injiziert. Zusätzlich erhielten Mäuse gleichzeitig anti-PD-1-Antikörper. Das Tumorwachstum und das Überleben der Mäuse wurden überwacht und die immunologische Tumormikroumgebung wurde mittels Mehrfarben-Durchflusszytometrie, qPCR und ELISA analysiert. Mit einem Druck von 200 MPa behandelte Tumorzellen wurden vollständig inaktiviert und verloren das Potenzial zur Bildung von Kolonien in vitro oder von Tumoren in vivo. Die kombinierte Behandlung mit lokaler Bestrahlung und therapeutischer HHP-Impfung führte in beiden Tumormodellen zu einem verzögerten Tumorwachstum und einem verlängerten Überleben der Mäuse. Die Menge an Zellen pro Gramm Tumor über mehrere Immunzell-Subtypen hinweg war nur bei B16-Tumoren, die sowohl mit RT als auch mit HHP-Impfstoffen behandelt wurden, signifikant erhöht. Bestrahlte Tumoren zeigten eine höhere Expression von supprimierenden Immun-Checkpoint-Liganden und die meisten Tumor-infiltrierenden T-Zellen waren PD-1 positiv, was eine Begründung für die Kombination mit anti-PD-1-Checkpoint-Inhibition liefert. Obwohl HHP-Impfstoffe entfernt von den Tumoren verabreicht wurden, verzögerten sie trotzdem das Wachstum lokal bestrahlter Tumoren weiter, obwohl in allen Radioimmuntherapiekombinationen die Gesamtzahl der Immunzellen in Primärtumoren und im peripheren Blut verringert war. Eine mit RT kombinierte HHP-Impfung induzierte jedoch keine signifikanten abskopalen anti-Tumor-Immunantworten und hob sogar diejenigen, die mit RT plus Anti-PD-1 induziert wurden, teilweise auf. In dieser Gruppe gingen die abskopalen Effekte mit einer erhöhten Infiltration von CD8+ T-Zellen einher. Eine zusätzliche Fraktion von 8 Gy hob die abskopalen Effekte vollständig auf und in-vitro-Daten zeigten, dass mit 3×8 Gy im Vergleich zu 2x8 Gy eher immunsuppressive und onkogene Signalwege, einschließlich Zelltod, Zytokinfreisetzung und Checkpoint-Expression, moduliert wurden. Außerdem fanden wir heraus, dass hohe intratumorale Konzentrationen von IGFBP-6 mit abskopalen Reaktionen korrelierten. Überraschenderweise hemmte ein IGFBP-6 knockdown allerdings das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Wir schließen daraus, dass mit HHP erzeugte autologe Impfstoffe auf der Basis ganzer Tumorzellen sicher und geeignet sind, mit RT kombiniert zu werden und unabhängig von der Injektionsstelle des Impfstoffs wirken, wenn der Tumor zuvor bestrahlt wurde. HHP-Impfstoffe ohne zusätzliches Adjuvans erhöhen jedoch nicht die mit RT plus Anti-PD-1 induzierten abskopalen Antitumor-Immunantworten und müssen daher in Zukunft weiter optimiert werden.

Touch sensation is the ability to perceive mechanical cues which is required for essential behaviors. These encompass the avoidance of tissue damage, environmental perception, and social interaction but also proprioception and hearing. Therefore research on receptors that convert mechanical stimuli into electrical signals in sensory neurons remains a topical research focus. However, the underlying molecular mechanisms for mechano-metabotropic signal transduction are largely unknown, despite the vital role of mechanosensation in all corners of physiology. Being a large family with over 30 mammalian members, adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs) operate in a vast range of physiological processes. Correspondingly, diverse human diseases, such as developmental disorders, defects of the nervous system, allergies and cancer are associated with these receptor family. Several aGPCRs have recently been linked to mechanosensitive functions suggesting, that processing of mechanical stimuli may be a common feature of this receptor family – not only in classical mechanosensory structures. This project employed Drosophila melanogaster as the candidate to analyze the aGPCR Latrophilin/dCIRL function in mechanical nociception in vivo. To this end, we focused on larval sensory neurons and investigated molecular mechanisms of dCIRL activity using noxious mechanical stimuli in combination with optogenetic tools to manipulate second messenger pathways. In addition, we made use of a neuropathy model to test for an involvement of aGPCR signaling in the malfunctioning peripheral nervous system. To do so, this study investigated and characterized nocifensive behavior in dCirl null mutants (dCirlKO) and employed genetically targeted RNA-interference (RNAi) to cell-specifically manipulate nociceptive function. The results revealed that dCirl is transcribed in type II class IV peripheral sensory neurons – a cell type that is structurally similar to mammalian nociceptors and detects different nociceptive sensory modalities. Furthermore, dCirlKO larvae showed increased nocifensive behavior which can be rescued in cell specific reexpression experiments. Expression of bPAC (bacterial photoactivatable adenylate cyclase) in these nociceptive neurons enabled us to investigate an intracellular signaling cascade of dCIRL function provoked by light-induced elevation of cAMP. Here, the findings demonstrated that dCIRL operates as a down-regulator of nocifensive behavior by modulating nociceptive neurons. Given the clinical relevance of this results, dCirl function was tested in a chemically induced neuropathy model where it was shown that cell specific overexpression of dCirl rescued nocifensive behavior but not nociceptor morphology., Der Tastsinn ist die Fähigkeit, mechanische Reize wahrzunehmen, die für essentielle Verhaltensweisen notwendig sind. Dazu gehören die Vermeidung von Gewebsschädigungen, die Wahrnehmung der Umwelt und soziale Interaktion, aber auch die Propriozeption und das Hören. Daher bleibt die Forschung an Rezeptoren, die mechanische Reize in sensorischen Neuronen in elektrische Signale umwandeln, ein aktueller Forschungsschwerpunk. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen für die mechanometabotrope Signalübertragung sind trotz der wesentlichen Rolle des Tastsinns in allen Bereichen der Physiologie weitgehend unbekannt. Adhäsions G-Protein gekoppelte Rezeptoren (aGPCRs), eine große Molekülfamilie mit über 30 Vertretern im Menschen, sind an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Demzufolge wird ein Zusammenhang zwischen diesen Rezeptoren und verschiedenen Erkrankungen des Menschen, wie z. B. Entwicklungsstörungen, Defekte des Nervensystems, Allergien und Krebs, angenommen. Mehrere aGPCRs wurden kürzlich mit mechanosensitiven Funktionen in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass die Verarbeitung mechanischer Reize ein gemeinsames Merkmal dieser Rezeptorfamilie ist – nicht nur in klassischen mechanosensorischen Strukturen. In diesem Projekt wurde Drosophila melanogaster verwendet, um die Funktion des aGPCR-Latrophilin/dCIRL in der mechanischen Nozizeption in vivo zu analysieren. Zu diesem Zweck konzentriert sich diese Arbeit auf mechano-sensorische Neurone (Typ II Klasse IV) der Fruchtfliegenlarve, um die molekularen Mechanismen der dCIRL-Aktivität zu untersuchen. Hierzu wurden noxische mechanische Reize in Kombination mit optogenetischen Werkzeugen, zur Manipulation der Second-Messenger-Signalübertragung, herangezogen. Zusätzlich wurde ein Neuropathie-Modell etabliert, um eine Beteiligung des aGPCRs dCIRL am beeinträchtigten peripheren Nervensystem zu testen. Zu diesem Zweck untersucht und charakterisiert diese Studie das nozizeptive Verhalten in dCirl-Nullmutanten (dCirlKO) und die RNA-Interferenz (RNAi) Methode, um zellspezifische Manipulationen auszuführen. Die Ergebnisse zeigen, dass dCirl in spezifischen peripheren sensorischen Neuronen (C4da) transkribiert wird - ein Zelltyp, der Nozizeptoren in Säugern strukturell ähnlich ist und verschiedene nozizeptive sensorische Modalitäten vermittelt. Darüber hinaus zeigen dCirlKO-Larven ein erhöhtes nozizeptives Verhalten, welches mittels zellspezifischer Reexpression gerettet werden kann. Die Expression von bPAC (bakterielle photoaktivierbare Adenylatcyclase) in diesen nozizeptiven Neuronen ermöglichte es, intrazelluläre Signalkaskaden von CIRL zu untersuchen, welche durch lichtinduzierte Erhöhung von cAMP angeregt werden. Dieser Versuch zeigt, dass dCIRL durch die Modulation nozizeptiver Neuronen eine Herabregulation des nozizeptiven Verhaltens bewirkt. Angesichts der klinischen Relevanz dieses Ergebnisses wurde die dCirl-Funktion in einem chemisch induzierten Neuropathie-Modell getestet. Dabei stellte sich heraus, dass zellspezifische Überexpression von dCirl eine ausgeprägte Hyperalgesie reduziert, morphologische Schädigungen hingegen nicht gerettet werden konnten.

The transition metal molybdenum (Mo) is present in all kingdoms of life, bound to vitally crucial enzymes. Mo itself is biologically inactive and needs a scaffold to serve as part of the active site of its user enzymes. This scaffold is a pyranopterin compound called molybdopterin (MPT). The four steps of MPT synthesis and Mo insertion, leading to the final pathway product molybdenum cofactor (Moco), are highly conserved. Moco plays an essential role in nitrate assimilation by binding to the active site of nitrate reductase (NR), the first and rate-limiting enzyme of this pathway. While the literature describes the regulatory mechanisms of nitrogen catabolism in detail, the knowledge about eukaryotic Moco biosynthesis regulation is limited. The focus of this work was to give first insights into the mechanisms leading to optimal Moco biosynthesis activity under Moco demanding conditions. For this, I used the fungal model organism Neurospora crassa and revealed a tight connection between enhanced NR expression and the Moco biosynthesis rate. The transcript quantification of genes involved in Moco biosynthesis showed that nit-7, encoding for the first step of Moco biosynthesis, is the critical point of regulation. While Moco demand caused the up-regulation of non-spliced nit-7 expression (encoding for NIT-7A), I saw no regulation of the splice variant encoding for NIT-7AB. The mRNA analysis identified a third, yet unknown splice variant, also encoding for NIT-7A. Following these findings, I examined the interplay of these variants, their encoded enzymes, and potential new protein products in different in vivo experiments. Mutagenesis and rescue studies showed that the NIT-7 A- and B-domain together catalyze the conversion of guanosine-5’-triphosphate to cyclic pyranopterin monophosphate (cPMP). NIT-7A harbors the sole mitochondrial targeting signal, and thus, NIT-7B requires the fusion to an inactive A-domain for its translocation. After import, the mitochondria separate the domains of NIT-7AB and degrade the A-domain. Not only fungi but also animals exhibit the fusion of A- and B-domain of NIT-7 orthologs. The precise analysis of the NIT-7 import identified that the opisthokont-branch developed at least two different strategies to orchestrate the cytoplasmic export of fused cPMP-synthase enzymes., Das Übergangsmetall Molybdän (Mo) ist in allen Reichen des Lebens, gebunden an essentielle Enzyme, vorhanden. Mo selbst ist biologisch inaktiv und benötigt daher ein Rückgrat um im aktiven Zentrum dieser Enzyme zu dienen. Dieses Rückgrat ist ein Pyranopterin Ringsystem, das Molybdopterin (MPT) genannt wird. Die vier Schritte der MPT Synthese und Mo Bindung, welche zum finalem Produkt Molybdän Cofaktor (Moco) führen, sind hochkonserviert. Moco spielt durch die Bindung an die Nitrat Reduktase (NR), dem ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Enzym dieses Stoffwechselweges, eine essentielle Rolle in der Nitrat-Assimilation. Während die regulatorischen Mechanismen des Stickstoff-Katabolismus detailliert beschrieben wurden, ist das Wissen über die Regulation der eukaryotische Moco Biosynthese beschränkt. Diese Arbeit zeigt erste Einblicke in die Mechanismen, die zur optimalen Moco Biosynthese Aktivität unter Moco erfordernden Bedingungen führen. Hierfür verwendete ich den Pilz Neurospora crassa als Modellorganismus und deckte eine enge Verknüpfung zwischen erhöhter NR Expression und Moco Biosynthese auf. Die Quantifizierung der Gen-Transkripte der Moco Biosynthese zeigte, dass nit-7, welches für den ersten Schritt der Moco Biosynthese kodiert, ein kritischer Punkt der Regulation ist. Während Moco Bedarf zur Hochregulierung der Expression von nicht-gespleißtem nit-7 (kodierend für NIT-7A) führt, ist keine Regulation der NIT-7AB kodierenden Spleißvariante zu beobachten. Durch eine mRNA Analyse identifizierte ich eine dritte, bisher unbekannte Spleißvariante, die auch für NIT-7A kodiert. Daran anknüpfend untersuchte ich die Wechselwirkungen aller Varianten, ihrer kodierenden Enzyme und potentiell neuer Proteinprodukte in verschiedenen in vivo Experimenten. Mutagenese- und „rescue“-Untersuchungen zeigten, dass die NIT-7 A- und B-Domäne zusammen die Umwandlung von Guanosintriphosphat zu zyklisches Pyranopterinmonophosphat (cPMP) katalysieren. NIT-7A beinhaltet das einzige mitochondrielle Lokalisierungssignal und daher benötigt NIT-7B für die Translokalisierung die Fusion an die inaktive A-Domäne. Nach dem mitochondriellem Import werden die Domänen von NIT-7AB getrennt und die A-Domäne abgebaut. Auch Tiere weisen eine Fusion der A- und B-Domänen der NIT-7 orthologen Proteine auf. Die genaue Analyse des NIT-7 Imports zeigte, dass Opistokontha mindestens zwei verschiedene Strategien für den zytoplasmatischen Export der fusionierten cPMP-Synthase Enzyme entwickelt haben.

Learning and memory processes shape the function and structure in the brain. The precise temporal modulation of the synaptic connections in the neuronal network is important to regulate their function. While it is necessary that synapses are plastic in order to enable the acquisition and implementation of new information, the stabilization of synapses is crucial to allow long-term storage and recall of these data. A set of molecules has been described to modify this delicate balance between plastic changes and stabilization. In this study, the role of one of these molecules, namely Nogo-A, in regulating the interplay between plasticity and stability was investigated. Nogo-A has been shown to limit functional and structural recovery after an injury in the adult central nervous system (CNS) and has recently been implicated as a suppressor of activity-dependent synaptic plasticity as well as learning and memory processes. However, the underlying mechanisms of how Nogo-A modulates synaptic function and especially its acute actions on synaptic transmission remained unknown. This work shows via patch clamp electrophysiology that Nogo-A bidirectionally regulates neuronal transmission on a fast time scale. While Nogo-A loss-of-function resulted in an increase in excitatory synaptic transmission within few minutes, inhibitory synaptic transmission was decreased simultaneously. Moreover, quantum dot-based single particle tracking paired with calcium imaging revealed that the lateral diffusion of GABAA receptors at synaptic and extrasynaptic sites as well as the concentration of intracellular calcium in dendrites was simultaneously increased within few minutes of Nogo-A loss-of-function. Furthermore, Nogo-A was found to limit the number and length of dendritic spines of CA3 hippocampal neurons in an activity-dependent manner as demonstrated via live cell imaging. Finally, spatial learning of mice in the Morris water maze and paired immunohistochemistry showed that Nogo-A seems not to control the activity of parvalbumin-positive inhibitory neuron networks to control spatial learning. Taken together, this study reveals a new mechanism by which Nogo-A modulates neuronal transmission on a fast time scale and contributes to the understanding of how Nogo-A stabilizes neuronal circuits, which has its price, it limits plasticity in the mature brain., Lernen und Gedächtnisvorgänge beruhen auf der Funktion und Struktur neuronaler Verschaltungen im Gehirn. Die präzise zeitliche Modulation von synaptischen Verbindungen im neuronalen Netzwerk ist essentiell, um ihre Funktion zu regulieren. Während es notwendig ist, dass Synapsen plastisch sind, um die Aufnahme neuer Informationen zu ermöglichen, ist die Stabilisierung vonnöten, um ihre Langzeitspeicherung und Wiederabrufbarkeit zu gewährleisten. Es wurden verschiedene Moleküle identifiziert, die das Gleichgewicht zwischen plastischen Veränderungen und Stabilisierung regulieren. In dieser Dissertation wurde die Rolle eines dieser Moleküle namens Nogo-A in der Regulierung dieser Balance zwischen Veränderbarkeit und Stabilisierung untersucht. Es wurde bereits in vorherigen Arbeiten gezeigt, dass Nogo-A funktionelle und strukturelle Genesung nach einer Verletzung im zentralen Nervensystem (ZNS) einschränkt und konnte als Inhibitor von aktivitätsabhängiger synaptischer Plastizität und der Gedächtnisbildung identifiziert werden. Die zugrundeliegenden Mechanismen der Regulierung von synaptischer Funktion und speziell die akute Wirkung auf neuronale Transmission von Nogo-A sind jedoch nur wenig bekannt. Diese Arbeit zeigt anhand von Patch clamp Elektrophysiologie, dass Nogo-A die neuronale Transmission auf schnelle und bidirektionale Weise moduliert. Anhand von Quantum Dot basiertem Single particle tracking und simultanem Calcium Imaging konnte festgestellt werden, dass die synaptische und extrasynaptische laterale Diffusion von GABAA Rezeptoren sowie die intrazelluläre Calciumkonzentration in Dendriten durch Inhibierung von Nogo-A erhöht wurden. Des Weiteren wurde mittels Live-Imaging festgestellt, dass Nogo-A die Anzahl und Länge von dendritischen Spines an CA3 Neuronen aktivitätsanhängig begrenzt. Zudem konnte anhand von Morris water maze Tests und Immunohistochemie gezeigt werden, dass Nogo-A räumliches Lernen nicht reguliert, indem es die Aktivität von Parvalbumin-positiven inhibitorischen Netzwerken kontrolliert. Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit ein neuer Mechanismus aufgedeckt werden, mit dem Nogo-A neuronale Transmission moduliert, was somit zum weiteren Verständnis der Regulierung neuronaler Netzwerke durch Nogo-A im adulten Gehirn beiträgt.

Das globale Phänomen Übergewicht erhöht das Risiko für die Entwicklung von Diabetes, Atherosklerose und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Diese sind assoziiert mit der Expression des Transmembranproteins Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b (Gpnmb), das von Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert wird. Wir haben die Rolle von Gpnmb in genetisch- und diät-induzierter Atherosklerose sowie in diät-induzierter Adipositas in Gpnmb-Knockout- und Wildtyp-Mäusen untersucht. Körpergewicht und Blutfette wurden in beiden Erkrankungen nicht von Gpnmb beeinflusst. Gpnmb wurde in Makrophagen von atherosklerotischen Läsionen stark exprimiert, jedoch hatte das Fehlen von Gpnmb keinen Einfluss auf die Größe der Aortenläsion. In Übergewicht konnten wir dagegen einen größeren Effekt von Gpnmb detektieren. Gpnmb hatte einen positiven Einfluss auf den Insulin- und Glukoseplasmaspiegel sowie auf die Leberfibrose bei adipösen Mäusen. Gpnmb-Knockout-Tiere besaßen mehr Makrophagen im epididymalen Fettgewebe. Da Gpnmb in den entsprechenden Makrophagen von Wildtyp-Mäusen stark exprimiert wurde, könnte Gpnmb eine abschwächende Rolle auf Entzündungen des Fettgewebes haben. Dies wird durch in-vitro-Daten bestätigt, wo Gpnmb hauptsächlich in reparativen, TGFβ-stimulierten Makrophagen exprimiert wurde. Diese Expression führte jedoch nur zu einer leichten entzündungshemmenden Wirkung. Eine weitere Aufgabe von Makrophagen, die Autophagie, wurde durch Gpnmb nicht beeinflusst. Dies ist überraschend, da die Expression, die Freisetzung und der Abbau von Gpnmb durch Bafilomycin, einem Inhibitor des letzten Schritts der Autophagie, auf einzigartige Weise erhöht wurde. Zusammenfassend ist die Gpnmb-Expression in voll ausgereiften Makrophagen stark induziert und kann durch lysosomale Hemmung weiter gesteigert werden. Bei Adipositas verhindert Gpnmb die Entwicklung einer Insulinresistenz, möglicherweise durch Dämpfung der Entzündung des Fettgewebes., Obesity, an emerging global phenomenon, increases the risk for the development of diabetes, atherosclerosis and cardiovascular diseases. Those metabolic diseases have been associated with the expression of glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b (Gpnmb), a transmembrane protein that is expressed by macrophages and dendritic cells. We studied the role of Gpnmb in genetically- and diet-induced atherosclerosis as well as diet-induced obesity in Gpnmb-knockout and respective wildtype control mice. The absence of Gpnmb did not affect body weight and blood lipid parameters in both diseases. Whereas Gpnmb was strongly expressed in atherosclerotic lesion-associated macrophages, the absence of Gpnmb did not influence the development of aortic lesion size. On the other hand, the absence of Gpnmb elicited stronger effects in obesity. We observed a positive influence of Gpnmb on insulin and glucose plasma levels as well as liver fibrosis in obese mice. Moreover, Gpnmb-knockout animals contained more macrophages in epididymal adipose tissue. Gpnmb was strongly expressed in adipose tissue macrophages in wildtype mice, suggesting an alleviating role of Gpnmb on adipose tissue inflammation. This was corroborated by in vitro data where Gpnmb was mostly expressed in reparative macrophages stimulated with transforming growth factor β (TGFβ). However, this expression resulted only in a mild anti-inflammatory effect. Another important macrophage feature, autophagy, was not influenced by Gpnmb. This is surprising as Gpnmb expression, shedding and degradation was uniquely increased by bafilomycin, an inhibitor of the last step of autophagy. Taken together, Gpnmb expression is strongly induced in fully mature macrophages and can be further increased due to lysosomal inhibition. In obesity, Gpnmb prevents the development of insulin resistance possibly by dampening adipose tissue inflammation.

Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet. In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind., Progressing chronic kidney disease results in the accumulation of uremic toxins and, if left untreated in end-stage kidney disease, death due to the developing uremic syndrome. The most common renal replacement therapy is hemodialysis. It is a life-prolonging therapy but only delivering inadequate blood purification, which is associated with excess morbidity and mortality of the patients. In hemodialysis, only uremic toxins with a molecular size of up to 20 kDa are removed by diffusion or convection. Solutes are eliminated by semi-selective size exclusion across a hollow fiber dialysis membrane in a dialyzer. Binding of certain uremic toxins to carrier proteins, such as albumin, results in an increased effective size, which excludes them from passing through dialysis membranes. In the native kidney, these protein-bound uremic toxins are eliminated from blood by secretory transport in the proximal tubule, a specific part of the tubular filtration apparatus of the nephron. The present doctoral thesis evaluated the first steps towards a so-called bio-artificial tubule. The intended biohybrid filter was supposed to consist of a co-culture of functional human proximal tubule cells and human endothelial cells on synthetic hollow fiber membranes. In its final form, it would be implemented during hemodialysis as an additional purification step to more efficiently remove protein-bound uremic toxins from the patients’ blood by active transport. The proximal tubule cells were differentiated from adipose-derived mesenchymal stem cells, which facilitates a later autologous treatment. The co-culture with endothelial cells should further promote the expression of transporters for organic anions and, thereby, potentially increase the secretion of protein-bound uremic toxins. In the present study, the differentiation from ASCs to a CK18-expression lineage, which confirmed successful epithelial differentiation, was induced by a combination of the soluble differentiation factors all-trans-retinoic acid, activin A and BMP-7. The expression of functional proteins, i.e., of aquaporin 1, which is relevant for water transport, and Na+-/K+-ATPase, was shown already before differentiation. Additionally, the present work demon-strated a high-quality co-culture of ASCs and HUVECs on the inner- and outer membrane surfaces of synthetic polypropylene- or polyethersulfone-based hollow fiber membranes, which initially were surface-modified with the extracellular matrix protein fibronectin. The viability of both cell types was thereby ensured by the application of a specific co-culture medium, which further increased the proliferation of ASCs intensely while maintaining their stem-cell character. The results of the present approach represent a promising basis for a bio-artificial renal tubule. The further development requires the differentiation of ASCs into proximal tubule cells on the 3D-bioreactor membrane and their characterization by verifying tubulusepithel-specific transporters. Finally, subsequent functional experiments have to precede an upscaling to clinically applicable modules.

In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht. In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie. Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen., Here we investigated cardiac effects of c-type natriuretic peptide (CNP) in wildtype mice (study 1) and in a newly generated mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of the guanylyl cyclase B (GC-B) receptor (study 2). In study 1 the effects of exogenous, synthetic CNP were investigated in wildtype mice (C57Bl6 background) after heart failure induced by pressure overload. Therefore, additionally to transverse aortic constriction (TAC) CNP (50 ng/kg/min) was administered via osmotic minipumps for 14 days. TAC provoked progressive heart hypertrophy. The TAC-induced hypertrophy was accompanied by enlarged cardiomyocyte areas and increased left ventricular mRNA levels of BNP. CNP significantly reduced cardiomyocyte areas and mRNA levels of BNP. Also, the TAC-induced left ventricular dilatation was almost prevented through synthetic CNP. These cardiac protective effects of CNP were accompanied by increased phosphorylation of the sarcomeric protein titin. Titin plays a critical role in maintaining the sarcomere structure and elasticity and thereby influences myocyte contraction and especially relaxation. The left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were significantly increased after TAC. The increased left-ventricular (end-diastolic and end-systolic) volumes after TAC are maybe provoked by an increased cardiomyocyte stiffness. The acute rise in IL-6 mRNA levels after TAC may favour these change, since Kruger et al postulate a relationship between passive cardiomyocyte stiffness and IL-6 expression. These changes were prevented by exogeneous CNP. Presumably, the CNP induced phosphorylation of titin on Serin 4080 within its elastic domain improves the cardiomyocyte relaxation and therefore the left-ventricular diastolic function. Because of these observations, we investigated in study 2, whether endogenous CNP as a paracrine hormone can affect TAC-induced hypertrophy and contractile function of cardiomyocytes. Therefore, we generated a new genetic mouse model with a cardiomyocyte specific deletion of the GC-B receptor (CM GC-B KO). Since previous studies in our group demonstrated that cardiac baseline expression levels of CNP are very low, but they markedly increased 3 days after TAC and decline to baseline levels 14 days after TAC, CM GC-B KO mice and control littermates were investigated at both timepoints after TAC. TAC resulted in increased cardiac afterload after 3 days, and more after 2 weeks, which was similar in both genotypes. Pressure overload provoked a progressive and significant cardiac hypertrophy, shown by the increased heart weight/body weight ratios, and were confirmed by histology. More severe myocyte hypertrophy was shown 3 days after TAC in CM GC-B KO mice, compared with control mice. Left ventricular contractile functions were also investigated by invasive catheterization in anesthetized mice. Notably, while in control mice subjected to TAC the LV ejection fraction was only mildly decreased, the KO mice reacted with a very marked and early decrease of the ejection fraction at three days after TAC, which tend to improve later on. Even more, the left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were markedly increased in the KO mice 3 days after TAC, indicating left ventricular dilatation. Again, this acute dilatation seems to reverse or improve at later stages. Such changes were not observed in control mice. To clarify possible downstream signalling pathways mediating these protective effects of CNP, we investigated titin-phosphorylation and IL-6 expression after 3 days of TAC. The acute increased IL-6 mRNA expression correlates well with the diminished phosphorylation of titin (serin 4080) in CM GC-B KO mice. Also, the increased NOX4 expression 3 days after TAC, could be one of the reasons of the early dilatation in KO mice. The diminished phosphorylation of STAT3 in CM GC-B KO mice may induce apoptosis by transcription of Bcl or Bax genes. Also, the increased mRNA expression of Cxcl-1 and IL-6 after 3 days of TAC can lead to more inflammation the hearts of the KO mice. In summary, these results show, that the CNP/GC-B/cGMP pathway can prevent cardiac dilatation in early stages. The phosphorylation of titin and the inhibition of the pro-inflammatory cytokines can contribute to this protective effects of CNP in the heart.

“Woher wissen die Zellen, in welche Richtung sie sich teilen sollen?“ Zellschicksals-induktionen hängen von Zell-Zell-Kontakten im frühen Caenorhabditis elegans Embryo ab. Die stereotype Orientierung der Zellteilungsrichtungen garantiert eine korrekte Nachbarschaft der Zellen. Seit 1988 stehen die par-Gene für die Spezifizierung der anterior-posterior Asymmetrie der Zygote und für ihre erste Teilung. Nun wird hier gezeigt, dass PAR-3 und PAR-6 die links-rechts Richtung der frühen Teilung spezifizieren. 1997 wurde berichtet, dass der Wnt-Signalweg die ABar Spindel steuert, um den Kontakt zwischen ABara und MS zu garantieren. 2009 wurde LAT-1 identifiziert, das die ABal Teilung orientiert. 1987 und 2006 wurde ein autonomer Grundzustand für die Spindelausrichtung vorgeschlagen. Allerdings führt eine Inaktivierung von GPB-1, einem Gbeta-protein, zu zufälligen Teilungsrichtungen. Eine epistatische Analyse zeigt, dass GPB-1 downstream von MOM-5 (frizzled, ein Rezeptor für Wnt) und LAT-1 wirkt. Theoretisch sind zwei Kräfte ausreichend, um die Spindelausrichtung auf einer Zelle/Kugel zu definieren. Jedoch könnten diese vermutlich kein robustes System bilden, da die beiden Kräfte den nicht-linearen Sinus/Kosinus-Funktionen unterliegen, wenn sie die Teilungsrichtung in 3D präzise steuern müssen. Nicht nur deswegen sind mehr beteiligte Kräfte zu erwarten, sondern auch, weil LAT-1 und MOM-5 bisher nur die ABal oder ABar, aber nicht die ABpl und ABpr Teilungen beeinflussten. Mit einer systematischen Analyse wurden zwei Rezeptoren für die Spindelausrichtung identifiziert. Der erste ist EGL-15, ein Fibroblast-Growth-Factor-Rezeptor. Nach einer EGL-15 Inaktivierung teilen sich ABal und ABar nicht schräg zur a-p Achse wie im WT sondern parallel. Dies indiziert, dass EGL-15 die laterale Richtung spezifiziert. Der zweite ist GLP-1, ein Notch-Rezeptor, der bisher für die Induktion der ABp, ABalp und ABara Schicksale bekannt ist. Eine GLP-1 Inaktivierung verändert die Spindelausrichtung von ABar und ABpr nur schwach. Allerdings führt die Doppelinaktivierung von GLP-1 und LAT-1 zu einem starken Phänotyp in ABpl und ABpr. Umfängliche statistische und bioinformatische Analysen indizieren, dass jeder Signalweg die Spindelausrichtung spezifisch und abhängig von der Blastomer-Identität reguliert. Letzlich biete ich ein Modell an, das die zuvor mysteriöse, an die Blastomer-Identitäten gebundene Spezifizierung der Spindelausrichtungen mit Hilfe von vier kombinatorischen Codes erklärt., “How do cells know in which orientation to divide?” The inductions of cell fates in the early embryo of Caenorhabditis elegans depend on cell-cell contacts. Therefore, stereotyped cleavage directions are essential to create the appropriate neighborhoods of cells. Starting 1988 it was reported that the par-genes organize the anterior-posterior axis of the zygote and its first cleavage. Suprisingly, this work shows that PAR-3 and PAR-6 specify the left-right cleavage direction in the early embryo. 1997 it was reported that the Wnt-pathway is essential to turn the ABar spindle to guarantee that ABara touches MS and in 2009 that LAT-1 is necessary to prevent ABala touching MS. In 1987 and 2006 an autonomous schedule of cell division orientations was proposed. However, reducing GPB-1, a Gbeta-protein required non-autonomously, causes cells to divide randomly. An epistatic analysis shows that GPB-1 functions downstream of MOM-5 (frizzled, a receptor for Wnt) and LAT-1, which excludes the existance of an autonomous schedule. Theoretically, two forces are sufficient to specify a cleavage axis on a cell/sphere. However, these forces are subjected to the sine or cosine, which require a very fine tuning of forces, which appears incompatible with a robust control of spindle directions. Therefore, more forces may be involved, a conjecture corroborated by the fact that for MOM-5 nor LAT-1 division defects in ABpl or ABpr were reported before. A systematic search uncovered two additional receptors involved in aligning of spindle directions. The first is EGL-15, a Fibroblast Growth Factor Receptor. After a reduction of EGL-15 activity, ABal and ABar divide nearly parallel into the a-p direction compared to wildtype, which indicates that it specifies the lateral direction. The second is GLP-1, a Notch receptor, so far described to induce the ABp, the ABalp and ABara fates. Reducing GLP-1 alters the ABar and ABpr spindle directions only slightly. However, a double inactivation of LAT-1 and GLP-1 causes a strong phenotype in ABpl and ABpr. Both receptors were previously not linked with the coordination of cell cleavage directions. Extensive statistical and bioinformatic analyses are compatible with the notion that the four pathways regulate spindle orientations independently in the four blastomeres. The blastomeres may aquire their initially mysterious individuality/identity coupled to their specific spindle directions via four combinatorial codes assigned by the pathways.

Inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic inflammatory disorders consisting of the two major forms Crohn`s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Although IBD are of rising incidence, their pathogenesis is not fully understood yet. Even though IBD are characterized by an extensive intestinal vascularization, the pathogenic impact of the vasculature in IBD and its underlying regulatory mechanisms remain largely unknown. One of the most highly upregulated cytokines during IBD is Interferon-gamma (IFN-g). As yet, its role in IBD pathogenesis has been attributed to its immune modulatory and epithelial cell-directed effects. Interestingly, IFN-g has been shown to exert potent functions on endothelial cells as well. Therefore, we analyzed endothelial-directed effects of IFN-g in the context of IBD. Using a mouse model based on the endothelial-specific knockout of the IFN-g-receptor 2 (Ifngr2EndoC), we showed that loss of the vascular IFN-g response ameliorates the course of dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice, while increasing angiogenesis, as confirmed in vitro and ex vivo. However, blockade of VEGF, and thereby inhibition of angiogenesis, also resulted in a milder course of DSS-colitis in mice, suggesting that the angiogenic activity is not the most crucial vascular factor for IBD pathogenesis. On the contrary, the breakdown of the endothelial barrier function by IFN-g was shown to be of pathogenic relevance in murine colitis. Both Ifngr2EndoC and anti-VEGF-A-treated mice had a reduced intestinal vascular permeability as shown by intra-vital imaging in comparison to control mice during DSS-colitis, accompanied by a milder intestinal inflammation. In addition, IFN-g reduced vessel coverage with mural cells in DSS-colitis, which is commonly associated with a reduced stability of the endothelial barrier. A disrupted vascular barrier integrity was confirmed by confocal laser endomicroscopy in human IBD patients. We demonstrated that IFN-g disrupts membranous VE-cadherin integrity causing increased endothelial permeability in vitro. Impairment of VE-cadherin junctions by IFN-g was confirmed in vivo by two-photon microscopy in mice with DSS-colitis. Furthermore, we showed that human IBD patients were characterized by a loss of VE-cadherin junction integrity in inflamed intestinal areas. Additionally, we found that imatinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor recently shown to block vascular permeability, restored VE-cadherin junctions leading to a reduction of IFN-g-induced endothelial permeability in vitro and in vivo and a milder course of DSS-colitis in mice. In summary, this work identified a new pathogenic function of IFN-g in IBD, comprising the breakdown of the intestinal vascular barrier function by impairment of VE-cadherin mediated junctions. The results may be of high clinical relevance for new vascular-directed therapy approaches in IBD. Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED) beschreiben chronische, inflammatorische Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts, deren häufigste Vertreter der Morbus Crohn (MC) und die Colitis Ulcerosa (UC) sind. Zwar ist die Anzahl der Neuerkrankungen von CED steigend, die Pathogenese der CED ist jedoch nicht vollständig geklärt. Eine vermehrte intestinale Vaskularisation ist charakteristisch für die CED, doch der Einfluss der Blutgefäße auf die Pathogenese der CED sowie der zugrundeliegende Mechanismus sind noch weitestgehend unbekannt. Das Zytokin Inteferon-gamma (IFN-g) ist eines der am stärksten hochregulierten Zytokine bei CED. Bisher wird sein pathogener Effekt seinen immunmodulatorischen und epithelial-gerichteten Eigenschaften zugeschrieben. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass IFN-g ebenfalls starke Effekte auf endotheliale Zellen aufweist. Daher haben wir die endothelial-gerichteten Effekte von IFN-g im Kontext der CED untersucht. Anhand eines Mausmodells mit einem endothelzell-spezifischen Knockout des IFN-g-Rezeptors 2 (Ifngr2EndoC) konnten wir zeigen, dass der Verlust der vaskulären IFN-g-Reaktion den Krankheitsverlauf einer DSS-induzierten Colitis in Mäusen verbessert und eine erhöhte Angiogenese induziert. Letzteres wurde sowohl in vitro als auch ex vivo bestätigt. Dennoch resultierte eine Inhibierung von VEGF und somit der Angiogenese ebenfalls in einem verbesserten Krankheitsverlauf der DSS-Colitis in Mäusen, was suggerierte, dass die angiogene Aktivität nicht der entscheidende vaskuläre Faktor bei der Pathogenese von CED ist. Dahingegen konnten wir zeigen, dass der IFN-g-induzierte Verlust der endothelialen Barrierefunktion zu der Pathogenese von Colitis im Mausmodell beiträgt. Anhand von intravitaler Mikroskopie konnten wir verdeutlichen, dass sowohl die Ifngr2EndoC Mäuse, als auch anti-VEGF-A-behandelte Mäuse, eine reduzierte intestinale Gefäßpermeabilität während der DSS-induzierten Colitis im Vergleich zu Kontrollmäusen aufweisen, was mit einer verminderten intestinalen Entzündung verbunden ist. Hinzukommend demonstrierten wir, dass IFN-g die Anlagerung von muralen Zellen an den Blutgefäßen in der DSS-Colitis herabsetzt. Es wird angenommen, dass dies mit einer Destabilisierung der endothelialen Barriere assoziiert ist. Mithilfe von konfokaler Laserendomikroskopie haben wir bestätigt, dass Patienten mit CED eine verminderte vaskuläre Barrierefunktion aufweisen. Wir konnten in vitro zeigen, dass IFN-g die membranständige VE-Cadherin-Integrität stört, wodurch die endotheliale Permeabilität erhöht wird. Eine Destabilisierung der VE-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Kontakte durch IFN-g wurde ebenfalls in vivo in Mäusen mit DSS-induzierter Colitis mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie bestätigt. Darüber hinaus demonstrierten wir, dass auch die entzündeten intestinalen Bereiche in CED Patienten durch einen Verlust der VE-Cadherin-assoziierten Zell-Zell-Adhäsion charakterisiert sind. Wir konnten zudem zeigen, dass der Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib, für den erst kürzlich eine inhibierende Wirkung auf die Gefäßpermeabilität bestätigt wurde, auch zu einer Stabilisierung der VE-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Kontakte führt. Letzteres war sowohl in vitro als auch in vivo mit einer reduzierten IFN-g-induzierten endothelialen Permeabilität verbunden und bewirkte einen milderen Verlauf der DSS-Colitis in Mäusen. Zusammenfassend haben wir durch diese Arbeit eine neue pathogene Funktion von IFN-g in den CED identifiziert, welche auf einer Störung der vaskulären Barrierefunktion im Darm durch eine Destabilisierung der VE-Cadherin-assoziierten Zell-Zell-Adhäsion beruht. Diese Ergebnisse sind von hoher klinischer Relevanz, um neue gefäßbasierte Therapieansätze für die Behandlung von CED zu entwickeln.

Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor (Ror) proteins are a conserved family of tyrosine-kinase receptors that function in various developmental processes. Ror proteins are type I single-transmembrane domain proteins and act as Wnt co-receptors. Ror2 predominantly activates β-catenin independent Wnt pathways. The ability of Ror2 to activate β-catenin independent Wnt signaling occurs after Clathrin-mediated endocytosis, but Ror2 also interacts with Caveolin at the plasma membrane. Membrane microdomains, including cholesterol-rich membrane microdomains (CRMMs) and sphingolipid-enriched domains serve as platforms for signaling pathways. Therefore, we hypothesize that Ror2 associates with different membrane microdomains, which affects Ror2 signaling. Furthermore, the length and amino acid sequence of the Transmembrane domain (TM) and its membrane proximal regions are crucial for the interaction of membrane proteins with lipid microdomains. Based on colocalization analysis, the Transmembrane domain (TM-mCherry) of Ror2 does not show a strong preference for any membrane microdomains, such as Caveolae (Caveolin-1 (Cav1)-positive), Flotillin-2 (Flo2)-positive lipid rafts or Clathrin-complexes. Rather, this protein was rapidly endocytosed again and was trapped in Rab7 positive vesicles, i.e. late endosomes or lysosomes. The same was true for a protein that contained the transmembrane domain and the adjacent intracellular domain, i.e. TM+JM-mCherry. The longest protein KR+TM+JM-mCherry and the KR+TM-mCherry showed considerable stability in the plasma membrane, which was further confirmed by a cell surface biotinylation assay that labels only proteins facing the extracellular space. Interestingly, KR+TM+JM-mCherry equally colocalized with Cav1, Flo2 and µ2A. By contrast the full-length Ror2 protein showed a preference for raft-like microdomains (Cav1- or Flo2- positive), which was shifted towards Clathrin-coated pits and vesicles by stimulation with its ligand Wnt5a. Overall, these findings suggest that the TM-domain itself is not sufficient to mediate stable integration into the plasma membrane or association with specific microdomains. The presence of both membrane proximal domains appears to be necessary to mediate stable integration into the plasma membrane but was not sufficient to determine the localization of the protein. Moreover, we have characterized the response of HEK 293-T and XTC cells to exogenous Wnt5a stimuli to detect the activity of known Ror2 downstream effectors such as AKT or c-jun N-terminal kinase (JNK) and found that Wnt5a induces these effectors differently in both cell lines. Furthermore, we depleted plasma membrane cholesterol using Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) in HEK 293-T and XTC cells. Lipidome analyses showed that treatment of HEK 293-T and XTC cells with 2.5 mM MβCD reduced free cholesterol by 25% and 51% respectively. In addition, qualitative lipidome analyses of lipid classes such as Glycerophospholipids including Phosphatidylinositol, Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine, Cardiolipin, non-polar triacylglycerols and Sphingolipids of HEK 293-T and XTC cells were carried out. Ror (receptor-tyrosine kinase-like orphan receptor)-Proteine sind eine konservierte Familie von Rezeptoren-Tyrosinkinasen, die in verschiedenen Entwicklungsprozessen eine Rolle spielen. Ror-Proteine sind Typ I Einfach-Transmembran-Domänen-Proteine und fungieren als Wnt-Co-Rezeptoren. Ror2 aktiviert überwiegend β-catenin unabhängige Wnt-Signalwege. Die Fähigkeit von Ror2, β-catenin unabhängige Wnt-Signalwege zu aktivieren, tritt nach Clathrin-vermittelter Endozytose auf, allerdings interagiert Ror2 auch mit Caveolin an der Plasmamembran. Membran-Mikrodomänen, darunter cholesterinreiche Membran-Mikrodomänen (CRMMs) und Sphingolipid-angereicherte Domänen, dienen als Plattform für Signalwege. Daher gehen wir davon aus, dass Ror2 mit verschiedenen Membran-Mikrodomänen assoziieren kann, was die Ror2-Signalisierung beeinflusst. Darüber hinaus sind die Länge und Aminosäuresequenz der Transmembran-Domäne (TM) und ihrer proximalen Membranbereiche entscheidend für die Interaktion von Membranproteinen mit Lipid-Mikrodomänen. Basierend auf der Kolokalisations-Analyse zeigt die Transmembran-Domäne (TM-mCherry) von Ror2 keine starke Präferenz für Membran-Mikrodomänen wie Caveolae (Caveolin-1 (Cav1)-positiv), Flotillin-2 (Flo2)-positive Lipid Rafts oder Clathrin-Komplexe. Vielmehr wurde dieses Protein schnell wieder endozytiert und in Rab7-positiven Vesikeln, d.h. späte Endosomen oder Lysosomen, eingeschlossen. Dasselbe galt für ein Protein, das die Transmembran-Domäne und die benachbarte intrazelluläre Domäne, d.h. TM+JM-mCherry, enthielt. Das längste Protein, welches zusätzlich die extrazelluläre Membran-nahe Kringle-Domäne enthält (KR+TM+JM-mCherry) sowie KR+TM-mCherry zeigten eine deutlich bessere Stabilität in der Plasmamembran, was ferner durch einen Biotinylierungstest an der Zelloberfläche bestätigt wurde, der nur Proteine markiert, die dem extrazellulären Raum zugewandt sind. Interessanterweise hat KR+TM+JM-mCherry gleichmäßig mit Cav1, Flo2 und Clathrin-Komplexen kolokalisiert. Im Gegensatz dazu zeigte das Ror2-Protein in voller Länge eine Präferenz für raftartige Mikrodomänen (Cav1- oder Flo2-positiv), die durch Stimulation mit seinem Liganden Wnt5a in Richtung Clathrin-abhängiger Endozytose verschoben wurden. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die TM-Domäne selbst nicht ausreicht, um eine stabile Integration in die Plasmamembran oder die Assoziation mit spezifischen Mikrodomänen zu vermitteln. Das Vorhandensein beider proximaler Membranbereiche scheint notwendig zu sein, um eine stabile Integration in die Plasmamembran zu vermitteln, war aber nicht ausreichend, um die Lokalisation des Proteins zu bestimmen. Darüber hinaus haben wir die Reaktion von HEK 293-T- und XTC-Zellen auf exogene Wnt5a-Stimuli charakterisiert, um die Aktivität bekannter Ror2 Effektoren wie AKT oder c-jun N-terminale Kinase (JNK) zu erkennen, und festgestellt, dass Wnt5a diese Effektoren in beiden Zelllinien unterschiedlich induziert. Darüber hinaus reduzierten wir den Cholesterinspiegel der Plasmamembran mit Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) in HEK 293-T-und XTC-Zellen. Lipidomanalysen zeigten, dass die Behandlung von HEK 293-T- und XTC-Zellen mit 2,5 mM MβCD den freien Cholesterinspiegel um 25% bzw. 51% reduziert. Desweiteren wurden qualitative Lipidomanalysen von Lipidklassen wie Glycerophospholipiden einschließlich Phosphatidyl-Inositole, Phosphatidyl-Choline, Phosphatidyl-Ethanolamine und Cardiolipine, unpolare Triacylglycerine, sowie Sphingolipide von HEK 293-T- und XTC-Zellen durchgeführt

L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated. Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy., Durch die Regulation des Calciumeintritts in die Zellen kontrollieren L-Typ-Calciumkanäle (LTCCs) wichtige physiologische Prozesse wie die Dauer und Amplitude von Aktionspotentialen, die elektromechanische Kopplung und die Genexpression in Kardiomyozyten. Kardiale LTCCs bestehen aus einer porenformenden α1 Untereinheit und Hilfsuntereinheiten wie Cavβ, Cavα2δ und Cavγ. Von diesen Hilfsuntereinheiten ist Cavβ der wichtigste Regulator der Kanalfunktion, wobei Cavβ auch LTCC-unabhängige zelluläre und regulatorische Funktionen haben kann. Veränderungen in der Expression dieses Proteins können daher zu einer Fehlregulation der LTCC-Aktivität führen, jedoch auch zu Veränderungen von anderen zellulären Funktionen. Einer der häufigsten Risikofaktoren für kongestive Herzinsuffizienz ist die kardiale Hypertrophie, welche abhängig ist von der Aktivierung von Calcium-abhängigen prohypertrophen Signalwegen. Die Rolle von LTCCs und insbesondere von Cavβ in dieser Erkrankung ist jedoch kontrovers und muss noch weiter erforscht werden. Von den vier Cavβ Splicevarianten ist Cavβ2 die dominierende Form in Kardiomyozyten. Darüber hinaus existieren fünf verschiedene Splicevarianten von Cavβ2 (Cavβ2a-e), die sich jeweils nur in der N-terminalen Region unterscheiden. Wir konnten demonstrieren, dass von diesen Splicevarianten überwiegend Cavβ2b im Herzen exprimiert wird. Außerdem konnten wir zeigen, dass ein Teil von Cavβ2 im Nukleus von Kardiomyozyten zu finden ist. Die Expression von nuklearem Cavβ2 verringert sich während der in vitro und in vivo induzierten kardialen Hypertrophie und außerdem verhindert die Überexpression von im Kern lokalisiertem Cavβ2 die in vitro induzierte Hypertrophie komplett. Zusätzlich konnten wir demonstrieren, dass die Reduktion von Cavβ2 mittels shRNA zu einer Steigerung der Hypertrophie induziert durch die Stimulation mit dem α1-adrenergen Agonisten Phenylephrin (PE) führt, ohne dass die LTCC-Aktivität beteiligt ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cavβ2 die Entstehung von Hypertrophie durch LTCC-unabhängige Signalwege beeinflussen kann. Um die Rolle von nuklearem Cavβ2 zu bekräftigen, haben wir quantitative Proteomanalysen von Cavβ2 defizienten neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCs) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reduktion von Cavβ2 die Expression verschiedener Proteine beeinflusst, zum Beispiel wird Calpastatin, ein Inhibitor der calciumabhängigen Cysteinproteasen Calpain, herunterreguliert. Außerdem wird durch die Cavβ2 Reduktion während der Hypertrophie von Kardiomyozyten die Calpainaktivität verglichen mit den Kontrollen signifikant erhöht. Letztendlich konnten wir zeigen, dass die Inhibierung von Calpain durch Calpeptin die gesteigerte PE-induzierte Hypertrophie in Cavβ2-defizienten Zellen verhindert. Diese Ergebnisse lassen eine Calcium- und LTCC-unabhängige Funktion von nuklearem Cavβ2 während der Entwicklung von Hypertrophie, annehmen. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse auf eine neue Rolle von Cavβ2 in den antihypertrophen Signalwegen in der kardialen Hypertrophie hin.

Gonadal sex differentiation and reproduction are the keys to the perpetuation of favorable gene combinations and positively selected traits. In vertebrates, several gonad development features that differentiate tetrapods and fishes are likely to be, at least in part, related to the water-to-land transition. The collection of information from basal sarcopterygians, coelacanths, and lungfishes, is crucial to improve our understanding of the molecular evolution of pathways involved in reproductive functions, since these organisms are generally regarded as “living fossils” and as the direct ancestors of tetrapods. Here, we report for the first time the characterization of >50 genes related to sex differentiation and gametogenesis in Latimeria menadoensis and Protopterus annectens. Although the expression profiles of most genes is consistent with the intermediate position of basal sarcopterygians between actinopterygian fish and tetrapods, their phylogenetic placement and presence/absence patterns often reveal a closer affinity to the tetrapod orthologs. On the other hand, particular genes, for example, the male gonad factor gsdf (Gonadal Soma-Derived Factor), provide examples of ancestral traits shared with actinopterygians, which disappeared in the tetrapod lineage.

A tight regulation of the balance between inhibitory and excitatory synaptic transmission is a prerequisite for synaptic plasticity in neuronal networks. In this context, the neurite growth inhibitor membrane protein Nogo-A modulates synaptic plasticity, strength, and neurotransmitter receptor dynamics. However, the molecular mechanisms underlying these actions are unknown. We show that Nogo-A loss-of-function in primary mouse hippocampal cultures by application of a function-blocking antibody leads to higher excitation following a decrease in GABAARs at inhibitory and an increase in the GluA1, but not GluA2 AMPAR subunit at excitatory synapses. This unbalanced regulation of AMPAR subunits results in the incorporation of Ca2+-permeable GluA2-lacking AMPARs and increased intracellular Ca2+ levels due to a higher Ca2+ influx without affecting its release from the internal stores. Increased neuronal activation upon Nogo-A loss-of-function prompts the phosphorylation of the transcription factor CREB and the expression of c-Fos. These results contribute to the understanding of the molecular mechanisms underlying the regulation of the excitation/inhibition balance and thereby of plasticity in the brain.

A compelling question in biology is how form arises in development and is inherited throughout generations. It was the conventional wisdom that the consecutive superposition of tissues, together with inductions, establishes the body plan. However, it was recently shown that cellular organoids even form spontaneously in tissue culture, suggesting an intrinsic order and a capacity of self-organisation of cells. I propose that the C. elegans embryo is suited to unravel the nature of this intrinsic order and self-organisation. The embryo is patterned by extensive migrations that are guided by cell focussing. These migrations are based on constant, independent and short-term random movements – the dance of cells – resembling Brownian motion. This dance of cells is also observed in diverse other bilateral animals and thus defines a new widespread biological phenomenon. The migratory system is highly inert. Only mutants of ced-10, an orthologue to human Rac1, other genes in the Rac signalling pathway, and tag-335, involved in the production of GDP-mannose, cause significant reductions of effective migrations but do not affect the dance of cells. Downstream of CED-10, the SCAR/WAVE complex known to facilitate actin branching is responsible for normal effective migrations. In mutants of this complex only 40 % of cells migrate more than their own radius and leave the position they have been placed at by the mitoses – however, it can be shown that this is just pure chance. This reduction of effective migration is most prominent during the 64- and 128-AB stages, where the ordering migrations guided by cell focussing are occurring in the WT. The loss of ced-10 mediated SCAR/WAVE activity is highly deleterious for pattern formation. To potentially explain the aberrant patterning, an agent-based in silico model was devised, where all cell displacements are based solely on random cell movements and the also random displacements by mitoses. This model reproduces both, the reduced effective migrations and the observed patterning defects in SCAR/WAVE mutants. The guidance of migrations is, thus, independently regulated from the dance itself. SAX-3/ROBO was established as a cell focussing receptor potentially regulating lateral movements. I propose a new principle of pattern formation based on the cell focussing model. The embryo is patterned by translating a random dance of cells into directed effective migrations via RAC signalling to the SCAR/WAVE complex., Eine herausfordernde Fragestellung der Biologie ist, wie Form im Laufe der Entwicklung entsteht und über Generationen hinweg vererbt wird. In Zellkulturen können sich spontan Organoide bilden, was eine intrinsische Ordnung und Fähigkeit der Zellen zur Selbstorganisation anzeigt. Ich nutze C. elegans als Modell zur Ergründung der Natur dieser intrinsischen Ordnung und Selbstorganisation. In Embryonen von C. elegans organisieren sich die Zellen mittels extensiver, über die Zellfokussierung gesteuerter Migrationen. Diese Migrationen basieren auf konstanten, voneinander unabhängigen und auf kurzer zeitlicher Ebene zufälligen Bewegungen, dem Tanz der Zellen, der der brownschen Bewegung ähnelt. Dieser Tanz kann außerdem in weiteren Tieren beobachtet werden und zeigt so ein neues und weit in den Bilateria verbreitetes biologisches Phänomen an. Das Migrationssystem in C. elegans Embryonen ist ausgesprochen inert. Nur bei Mutanten von ced-10, einem Ortholog des humanen Rac1, anderen Genen des Rac Signalweges, und tag-335, welches an der Produktion von GDP-Mannose beteiligt ist, zeigen sich signifikante Reduktionen der Effektivmigrationen, ohne dabei den Tanz der Zellen zu beeinflussen. Downstream von CED-10 befindet sich der SCAR/WAVE Komplex, welcher an der Regulation von verzweigtem Aktin beteiligt ist. In Mutanten dieses Komplexes migrieren nur noch 40 % der Zellen weiter als ihren eigenen Radius und verlassen den Ort, an dem sie von der Mitose platziert wurden, was allerdings dem Zufall zuzuschreiben ist. Die Reduktionen der Effektivmigrationen sind im 64- und 128-AB Stadium – der Entwicklungsphase, in der im WT die ordnenden Migrationen der Zellfokussierung beobachtet werden – besonders auffällig. Der Verlust der SCAR/WAVE Aktivität führt zu einer drastischen Veränderung der normalen Musterbildung. Um diese zu erklären wurde ein agentenbasiertes Modell entwickelt, bei dem die Positionsveränderung von Zellen nur noch auf zufälligen Bewegungen und Platzierungen durch Mitosen basiert. Dieses Modell reproduziert die reduzierten Effektivmigrationen und die aberrante Musterbildung der SCAR/WAVE-Mutanten. Die Steuerung der Migrationen ist demnach unabhängig vom Tanz. Die Zellfokussierung steuert die Musterbildung, indem sie den zufälligen Tanz der Zellen über den Rac-Signalweg in gerichtete Bewegungen übersetzt. SAX-3/ROBO konnte als potentieller Zellfokussierungsrezeptor und Kandidat zur Regulation von lateralen Bewegungen identifiziert werden.