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Fluorescence microscopy makes it possible to rely on mathematical modeling for the study of complex cellular mechanisms, but preexisting models do not yield information on both global trends and local behaviors, and are not fit for the study of the complex interactions between the molecular actors involved. In this thesis, we propose a mixed approach designed with these limitations in mind, and use this approach to study two cellular mechanisms. We propose a first model for the estimation of local diffusion in TIRF imaging, which addresses the challenging issues caused by membrane heterogeneity by allowing to evaluate the diffusion for several diffusing spots in a region of interest. A second model is introduced for the study of centrosome behavior during cell division, that allows to better understand the factors and interactions that contribute to the oscillations of centrosomes during anaphase, thus providing means of prediction for phenotypes related to misguided asymmetric division. Both models are put into operation thanks to a novel parameter estimation framework, that relies on sensitivity analysis and Approximate Bayesian Computation. This versatile framework is easily adaptable to studies beyond the context of the ones presented in this thesis.; La microscopie de fluorescence permet de s'appuyer sur la modélisation mathématique pour l'étude de mécanismes cellulaires complexes, mais les modèles préexistants ne permettent pas d'obtenir des informations à la fois sur les tendances globales et les comportements locaux, et ne sont pas adaptés à l'étude des interactions complexes entre les différents acteurs moléculaires. Dans cette thèse, nous proposons une approche mixte conçue pour pallier ces limitations, et l'appliquons à l'étude de deux mécanismes cellulaires. Nous proposons un premier modèle pour l'estimation de la diffusion locale en imagerie TIRF ; ce modèle permet l'évaluation de la diffusion en plusieurs spots de diffusion dans une région d'intérêt, répondant ainsi aux problèmes complexes causés par l'hétérogénéité de la membrane. Un deuxième modèle est introduit pour l'étude du comportement des centrosomes durant la division cellulaire, qui permet une meilleure compréhension des facteurs, et des interactions de ces facteurs, qui contribuent aux oscillations des centrosomes durant l'anaphase; ce modèle fournit des moyens de prédiction pour des phénotypes liés à des divisions asymétriques erronées. Ces deux modèles sont utilisés grâce à un nouveau cadre d'estimation de paramètres, qui s'appuie sur l'analyse de sensibilité et les méthodes bayésiennes ABC. Ce framework est polyvalent et facilement adaptable à d'autres contextes que celui des études présentées dans cette thèse.

La protéine de liaison à l’ARN double-brin Staufen1 (STAU1) est exprimée dans les cellules de mammifères de manière ubiquitaire. STAU1 est impliqué dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique grâce à sa capacité de lier les ARN et moduler leur épissage, leur transport et localisation, leur traduction ainsi que leur dégradation. Des études récentes de notre laboratoire indiquent que l’expression de STAU1 est régulée durant le cycle cellulaire, ayant une abondance maximale au début de la mitose. En prométaphase, STAU1 est lié à des ARNm codant pour des facteurs impliqués dans la régulation de la prolifération, la croissance et la différenciation cellulaires. De plus, des analyses protéomiques menées sur des cellules humaines ont permis d’identifier STAU1 comme un composant de l’appareil mitotique. Cependant, l’importance de cette association n’a pas été investiguée. Par ailleurs, il a été montré qu’une défaillance dans l’expression ou les fonctions de STAU1 pourrait contribuer au développement et l’accélération de plusieurs maladies débilitantes, dont le cancer. Dans cette thèse, nous avons montré la localisation de STAU155 sur le fuseau mitotique dans les cellules de cancer colorectal HCT116 et les cellules non transformées hTERT-RPE1. Nous avons également caractérisé le déterminant moléculaire impliqué dans l’interaction entre STAU155 et les microtubules mitotiques, soit la séquence située dans les 88 premiers acides aminés N-terminaux de RBD2, un domaine qui n’est pas requis pour l’activité de liaison à l’ARN de STAU1. Nous avons ainsi montré que la fraction de STAU1 enrichie sur le fuseau colocalise avec des ribosomes dans des sites actifs de traduction. De plus, notre analyse transcriptomique du fuseau mitotique montre que 1054 transcrits (ARNm, pré-ARNr, lncRNA et snoRNA) sont enrichis sur l’appareil mitotique. De façon intéressante, le knockout de STAU1 entraine la délocalisation des pré-ARNr et de 154 ARNm codants pour des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette d'actine et la croissance 4 cellulaire. Bien que STAU1 n’est pas essentiel pour la survie et la prolifération des cellules cancéreuses HCT116, nos résultats mettent clairement en évidence l’implication de STAU1 dans la régulation des ARN spécifiques en mitose et suggèrent un nouveau rôle de cette protéine dans la progression mitotique et la cytokinèse par la régulation de la maintenance des pré-ARNr, la ribogenèse et/ou la reconstitution de l’enveloppe nucléaire., Staufen1 (STAU1) is a double-stranded RNA-binding protein that is ubiquitously expressed in mammals and known for its involvement in the post-transcriptional regulation of gene expression such as splicing, transport and localization, translation, and decay. It has been demonstrated that STAU1 protein expression level is modulated through the cell cycle with peak abundance by the onset of the mitotic phase after which it is degraded. Genome-wide analysis revealed that in prometaphase, STAU1 bound with mRNAs code for factors implicated in cell differentiation, cell growth as well as for cell proliferation. Interestingly, previous large-scale proteomic studies identified STAU1 as a component of the human mitotic spindle apparatus. Altering STAU1 expression patterns or functions may lead to several debilitating human diseases including cancer. In this thesis, we further elucidated the localization of STAU1 at the mitotic spindle of the colorectal cancer HCT116 and the non-transformed hTERT-RPE1 cells. Next, we characterized the molecular determinant required for STAU1/spindle association within the first 88 N-terminal amino acids, a domain that is not required for the RNA binding activity. RNA-Seq analysis of purified mitotic spindles reveals that 1054 mRNAs as well as the precursor ribosomal RNA, lncRNAs and snoRNAs are enriched on spindles compared to cell extracts. Spindle-associated STAU1 partly co-localizes with ribosomes and active sites of translation. Interestingly, the knockout of STAU1 delocalizes pre-rRNA and 154 mRNAs coding for proteins involved in actin cytoskeleton organization and cell growth. Our results highlighting a role for STAU1 in mRNA trafficking to the spindle. These data demonstrate that STAU1 controls the localization of sub-populations of RNA during cell division and suggests a novel role of STAU1 protein in mitotic progression and cytokinesis by regulating pre-rRNA maintenance, ribogenesis and/or nucleoli reassembly.

La plupart des espèces bactériennes possèdent un chromosome circulaire qui est répliqué de façon bidirectionnelle au cours du cycle cellulaire. Bien que la réplication et la ségrégation du chromosome bactérien se développent simultanément, la ségrégation du chromosome s’accomplit après la fin de la réplication et avant la fermeture du septum. La circularité du chromosome bactérien et le grand nombre d’événements de recombinaison homologue donnent lieu à la création des dimères de chromosome dans une fraction de la population cellulaire. Chez Escherichia coli et Bacillus subtilis, la dimérisation des chromosomes se produit respectivement dans 15% et 25% des cas. Un chromosome dimérique doit être résolu avant la fermeture du septum. Chez les espèces bactériennes les plus étudiées, les chromosomes dimériques sont résolus par un système de recombinaison site spécifique hautement réservé incluant deux recombinases à tyrosine, XerC et XerD, et un site génomique dans la région terminus du génome bactérien, appelé le site dif (deletion induced filamentation). L’organisation spatio-temporelle du système de recombinaison site spécifique Xer/dif et l’activation de ce dernier sont réglementées par la protéine transmembranaire impliquée dans la division cellulaire, FtsK. D’autre part, des études récentes ont mis en évidence l’existence de plusieurs éléments mobiles appelés IMEXs (Integrative Mobile Elements Exploiting Xer), capables d’exploiter le système Xer/dif pour leur intégration dans le génome bactérien. Chez E. coli, des déficiences dans la résolution des dimères de chromosome se terminent par le guillotinage du chromosome dimérique au cours de la division cellulaire, ce qui entraîne l’induction de la réponse SOS chez les cellules filles et la mort de ces dernières. Dans cette thèse, le site dif a été identifié et caractérisé chez Caulobacter par une combinaison d’approches in vivo et in vitro. Fait intéressant, il a été démontré que chez Caulobacter, contrairement à E. coli, la perturbation du système Xer/dif ne mène pas au guillotinage du chromosome, et les cellules portant un système Xer/dif défectueux contourne cette déficience en adoptant un nouveau mode de cycle cellulaire. De plus, notre analyse comparative entre les terminus des souches sauvages de C. crescentus a également permis de révéler la présence d’un IMEX putatif de 71 kb dans le terminus de C. crescentus NA1000., Most bacteria possess a single circular chromosome which is replicated bidirectionally during the cell cycle. Although replication and segregation of the chromosome in bacteria develops simultaneously, the segregation of the chromosome occurs after the completion of replication and before the closure of the septum. The circularity of the bacterial chromosome and the high number of homologous recombination events that occur during replication result in the creation of chromosome dimers in a fraction of the cell population. In Escherichia coli and Bacillus subtilis, chromosome dimer formation occurs, respectively, in 15% and 25% of the cell population during replication, which needs to be resolved before the closure of division septum. In most of the well-studied bacterial species, chromosome dimers are resolved by a highly conserved site-specific recombination system which employs two tyrosine recombinases, XerC and XerD, and a recombination genomic site located in the terminus region of the bacterial chromosome called dif (deletion induced filamentation). The temporo-spatial organization of the Xer/dif site-specific recombination system, along with its activation, is regulated by a cell division transmembrane protein, FtsK. In E. coli, deficiencies in the resolution of chromosome dimers result in the guillotining of the dimeric chromosome during the cell division leading to the continuous induction of SOS response in the daughter cells and the death of the latter ones. In my thesis, the dif site in Caulobacter is identified and characterized by a combination of in vitro and in vivo approaches. Interestingly, it was observed that, unlike E. coli, in Caulobacter perturbations in the chromosome dimer resolution system do not result in the guillotining of the chromosome dimers. Instead, Caulobacter cells bearing deficiencies in the resolution of dimeric chromosomes adopt a new mode of cell cycle to bypass this deficiency.

During cytokinesis, the intercellular bridge (ICB) connecting the daughter cells experiences pulling forces, which delay abscission by preventing the assembly of the ESCRT scission machinery. Abscission is thus triggered by tension release, but how ICB tension is controlled is unknown. Here, we report that caveolae, which are known to control membrane tension upon mechanical stress in interphase cells, are located at the midbody, at the abscission site and at the ICB/cell interface in dividing cells. Functionally, the loss of caveolae delays ESCRT-III recruitment during cytokinesis and impairs abscission. This is the consequence of a 2-fold increase of ICB tension measured by laser ablation, associated with a local increase in myosin II activity at the ICB/cell interface. We thus propose that caveolae buffer membrane tension and limit contractibility at the ICB to promote ESCRT-III assembly and cytokinetic abscission.; Pendant la cytocinèse, le pont intercellulaire qui relie les cellules filles subit des forces de traction qui retardent l'abscission en empêchant l'assemblage de la machinerie de scission ESCRT. L'abscission est donc déclenchée par la libération de la tension, mais la façon dont la tension du pont intercellulaire est contrôlée est inconnue. Nous rapportons ici que les cavéoles, connues pour contrôler la tension membranaire lors d'un stress mécanique dans les cellules en interphase, sont situées au niveau du midbody, du site d'abscission et à l'interface du pont intercellulaire/cellule dans les cellules en division. Fonctionnellement, la perte des cavéoles retarde le recrutement de l'ESCRT-III pendant la cytocinèse et retarde l'abscission. Ceci est la conséquence d'une multiplication par 2 de la tension du pont intercellulaire mesurée par ablation laser, associée à une augmentation locale de l'activité de la myosine II à l'interface du pont intercellulaire/cellule. Nous proposons donc que les cavéoles tamponnent la tension membranaire et limitent la contractilité au niveau du pont intercellulaire pour favoriser l'assemblage de l'ESCRT-III et l'abscission.

Le développement d’un organisme multicellulaire requière la coordination de la croissance, détermination tissulaire et différenciation cellulaire. Cependant, alors que les bases de la génétique de la morphogenèse ont été rigoureusement étudiées, le processus permettant la conversion de l’activité génétique en des structures biologiques complexes est bien moins compris. Chez Arabidopsis thaliana, les feuilles et fleurs initiés à partir du Méristème Apical Primaire (MAP) ont une expression génétique casi similaire. Toutefois, leur forme est considérablement différente dès les premières étapes de leur développement. Une compréhension de ce paradoxe requière avant tout de précisément quantifier la croissance dans toutes les dimensions de ces organes. Dans cet article, je présente une méthode de quantification spatio-temporelle complète de la croissance et de la prolifération des feuilles et des fleurs chez A. thaliana. En analysant des séries d’images confocales, j’en ai conclu que la différence morphologique observée entre feuilles et fleurs émerge principalement d’une asymétrie de la distribution de la croissance entre leurs côtés abaxial et adaxial, tôt dans leur développement. Je montre que le tissue contribuant principalement au développement des primordia est la couche 2 (L2) chez les feuilles et la couche 3 (L3) chez les fleurs. Mes résultats préliminaires démontrent que les premiers signes de l’initiation d’organes est un changement de distribution de la croissance, et non de la prolifération. Dans le futur, en appliquant, par exemple, cette méthodologie à l’étude de gènes de développement, il sera possible de finalement réconcilier la morphogenèse et la génétique de l’initiation des plantes., The development of a multicellular organism requires the proper coordination of growth, pattern determination and cell differentiation. Still, while the genetic basis of morphogenesis has been extensively studied, the process converting gene activity into intricate biological shapes is less understood. In Arabidopsis thaliana, flowers and leaves, both initiated from the shoot apical meristem (SAM), have a very similar genetic expression profile. Yet, their shape differs considerably from early developmental stages. A full comprehension of this paradox requires an accurate quantification of cellular growth in those organs. In this paper, I am presenting a methodology for the complete spatio-temporal quantitative analysis of growth and proliferation of initiating leaves and flowers in wild type Arabidopsis thaliana. By analyzing time series of leaf and flower confocal images, I conclude that the morphological differences observed between flowers and leaves mainly arises from asymmetrical distributions of growth between their adaxial and abaxial sides during their initiation. I show that the tissue that mainly contributes to the development of early primordium is the layer 2 (L2) in leaves, and the layer 3 (L3) in flowers. My preliminary results also demonstrate that the first signs of organ initiation are a change in growth distribution, not cell proliferation. In the future, by applying this methodology, for example, to study morphogen reporter lines, it could finally bridge the gap between the morphogenesis and the genetics of plant initiation.

The kinetochore is a multiprotein complex that assembles on centromeric DNA and enables chromosome segregation during cell division. Essential for kinetochore assembly in most species is the histone variant CenH3 that initiates complex formation. Unexpected to this essential role, it was previously shown that CenH3 was lost in multiple insect orders including the Lepidoptera (butterflies, moths). Despite this loss, recent studies from my host lab revealed that other kinetochore homologs are present in Lepidoptera and must therefore be recruited in a different way. For my PhD I aimed to characterize the assembly of these CenH3-deficientt kinetochores in Bombyx mori cells. In order to address my aim, during the 1st and 2nd year of my PhD, I established tools and protocols in these cells with sparse experimental history. Those include the optimization of RNAI-mediated depletion, characterization of mitotic phenotypes, verification of antibodies and the generation of cell lines containing lacO arrays to able to study kinetochore assembly at ectopic sites. My studies focused on one particular kinetochore component, CENP-T that in other organisms makes important contributions to connect the kinetochore to DNA and to the spindle microtubules. Using the tools that I have generated, I could show that the B. mori CENP-T is essential for mitotic progression and both necessary and sufficient to recruit components to interact with the spindle.; Le kinétochore est un complexe multiprotéique qui s'assemble sur l'ADN centromérique et permet la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Le variant d'histone CenH3 est essentiel pour l'assemblage des kinétochores dans la plupart des espèces où il initie leurs formation. De façon inattendue, compte tenu de leur rôle essentiel, il a été précédemment montré que CenH3 avait été perdu dans plusieurs ordres d'insectes dont les lépidoptères. Malgré cette perte, des études récentes au laboratoire ont révélé que d'autres composants du kinétochore ont des homologues chez les lépidoptères et doivent donc être recrutés de manière différente. Ma thèse a eu pour objectif de comprendre l'assemblage des kinétochores en absence de CenH3 dans des cellules de Bombyx mori. Pour cela, j'ai mis en place des outils dans ces cellules à l'histoire expérimentale sporadique. Par exemple: la déplétion d'un gène par ARNi et la validation des anticorps et la génération de lignées cellulaires contenant des répétitions lacO pour pouvoir étudier l'assemblage des kinétochores sur des sites ectopiques. Mes études se sont concentrées sur un composant particulier du kinétochore, CENP-T, qui dans d'autres organismes, contribue à la liaison du kinétochore à I'ADN et aux microtubules du fuseau. En utilisant les outils que j'ai générés, j'ai pu montrer que B. mori CENP-T est essentiel à la progression mitotique et à la fois nécessaire et suffisant pour recruter les composants interagissants avec le fuseau. Pris ensemble, les résultats de mon projet de doctorat généreront un nouveau système modèle pour l'étude de l'assemblage des kinétochores indépendants de CenH3.

The kinetochore is a multiprotein complex that assembles on centromeric DNA and enables chromosome segregation during cell division. Essential for kinetochore assembly in most species is the histone variant CenH3 that initiates complex formation. Unexpected to this essential role, it was previously shown that CenH3 was lost in multiple insect orders including the Lepidoptera (butterflies, moths). Despite this loss, recent studies from my host lab revealed that other kinetochore homologs are present in Lepidoptera and must therefore be recruited in a different way. For my PhD I aimed to characterize the assembly of these CenH3-deficientt kinetochores in Bombyx mori cells. In order to address my aim, during the 1st and 2nd year of my PhD, I established tools and protocols in these cells with sparse experimental history. Those include the optimization of RNAI-mediated depletion, characterization of mitotic phenotypes, verification of antibodies and the generation of cell lines containing lacO arrays to able to study kinetochore assembly at ectopic sites. My studies focused on one particular kinetochore component, CENP-T that in other organisms makes important contributions to connect the kinetochore to DNA and to the spindle microtubules. Using the tools that I have generated, I could show that the B. mori CENP-T is essential for mitotic progression and both necessary and sufficient to recruit components to interact with the spindle., Le kinétochore est un complexe multiprotéique qui s'assemble sur l'ADN centromérique et permet la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Le variant d'histone CenH3 est essentiel pour l'assemblage des kinétochores dans la plupart des espèces où il initie leurs formation. De façon inattendue, compte tenu de leur rôle essentiel, il a été précédemment montré que CenH3 avait été perdu dans plusieurs ordres d'insectes dont les lépidoptères. Malgré cette perte, des études récentes au laboratoire ont révélé que d'autres composants du kinétochore ont des homologues chez les lépidoptères et doivent donc être recrutés de manière différente. Ma thèse a eu pour objectif de comprendre l'assemblage des kinétochores en absence de CenH3 dans des cellules de Bombyx mori. Pour cela, j'ai mis en place des outils dans ces cellules à l'histoire expérimentale sporadique. Par exemple: la déplétion d'un gène par ARNi et la validation des anticorps et la génération de lignées cellulaires contenant des répétitions lacO pour pouvoir étudier l'assemblage des kinétochores sur des sites ectopiques. Mes études se sont concentrées sur un composant particulier du kinétochore, CENP-T, qui dans d'autres organismes, contribue à la liaison du kinétochore à I'ADN et aux microtubules du fuseau. En utilisant les outils que j'ai générés, j'ai pu montrer que B. mori CENP-T est essentiel à la progression mitotique et à la fois nécessaire et suffisant pour recruter les composants interagissants avec le fuseau. Pris ensemble, les résultats de mon projet de doctorat généreront un nouveau système modèle pour l'étude de l'assemblage des kinétochores indépendants de CenH3.

Ostreopsis cf. ovata is a cosmopolitan toxic dinoflagellate that produces seasonal blooms. It is currently unknown how this organism divides or how its cell cycle is controlled. The aim of this thesis was to provide a cellular and molecular characterization of the mitotic cell cycle, which underlies cell proliferation during vegetative growth, for the dinoflagellate O. cf. ovata. Morphological classification of cells collected at different phases of the bloom, allowed to identify different phases of the O. cf. ovata vegetative cycle, including cells undergoing division. Using this classification, I showed that during blooming, O. cf. ovata divides exclusively at night. Using immuno-fluorescence and confocal microscopy, I then characterized the major changes in cytoskeletal organization associated with the O. cf. ovata cell cycle. To characterize O. cf. ovata cell cycle at the molecular level, I searched for O. cf. ovata homologues of conserved cell cycle regulators identified in model organisms, using a de novo transcriptome that I generated from cultured cells. This analysis revealed the presence of major components of the O. cf. ovata cell cycle. A differential expression analysis using meta-trascriptomic datasets corresponding to bloom samples enriched in interphase cells, pre-dividing cells and dividing, which I generated during the 2019 bloom, showed an active transcriptional control during cell division. By integrating the results obtained from the transcriptomic analysis with the cytological characterization I propose a first model of O. cf. ovata cell cycle, in which cyclins and CDK activities dictate the transition from interphase to mitosis., Ostreopsis cf. ovata est un dinoflagellé cosmopolite toxique qui produit des blooms saisonniers dont la fréquence et la distribution ont augmenté à travers le globe. Cependant, la manière dont cet organisme se divise et comment sont contrôlés ses cycles cellulaires reste inconnue. Le but de mon travail de thèse a été de caractériser au niveau cellulaire et moléculaire le cycle cellulaire mitotique qui est à la base de la prolifération de O. cf. ovata. La morphologie des cellules collectées pendant les différentes phases du bloom permet d’identifier les différentes phases du cycle cellulaire de O. cf. ovata. En utilisant cette classification, j’ai montré que pendant le bloom O. cf. ovata se divise exclusivement la nuit. En utilisant l'immunofluorescence, j'ai ensuite caractérisé les changements d'organisation cytosquelettique associés au cycle cellulaire d’O. cf. ovata. Pour caractériser le cycle cellulaire de O. cf. ovata au niveau moléculaire, J’ai utilisé le transcriptome de référence que j’ai généré à partir de culture cellulaire pour chercher les homologues des protéines connues pour être impliquées dans le cycle mitotique. Une analyse d'expression différentielle utilisant des ensembles de données méta-trascriptomiques correspondant à des échantillons enrichis en cellules interphase, cellules pré-divisant et divisant, que j'ai générées pendant le bloom 2019, a montré un contrôle transcriptionnel actif pendant la division cellulaire. J’ai intégré l’ensemble de ces résultats dans un schéma global récapitulant les étapes du cycle cellulaire d’O. cf. ovata dans lequel l’activité des cyclines et des CDKs dicte la transition entre l’interphase et la mitose.

The pathogenic bacterium Streptococcus pneumoniae possesses two protein-kinases CpsD and StkP involved in polysaccharide capsule synthesis and cellular division respectively. Recently, a new bacterial protein-kinase family was identified, named UbK (Ubiquitous bacterial Kinase). My thesis work was to study the cellular role of UbK in the pneumococcus. I have demonstrated that Ubk is phosphorylated on a unique Tyrosine in vivo. A Δubk mutant, as well as catalytic (non ATPasic) or a permanently phosphorylated mutant shows growth and morphological defects. The deletion of ubk generates a suppressive mutation in the essential protein AsnS, whose role is assimilated to Asparaginyl-tRNA synthetase. Thus, I explored in details the link between UbK and AsnS. ubk is found in an operon induced in competence. I have evidenced that late competence and transformation are to a certain extent controlled by UbK. Morphological defects in absence of ubk appear to be typical of a cell-cycle impairment. We determined the cell wall composition was impaired, and that the UbK’s partners, FtsZ and FtsA that are implicated in cell division, are not correctly localized the Δubk mutant. Therefore, UbK is a major actor of cellular division and competence., La bactérie pathogène Streptococcus pneumoniae possède deux protéines-kinases CpsD et StkP impliquées respectivement dans la synthèse de la capsule polysaccharidique et de la division cellulaire. Récemment, une nouvelle famille de protéines-kinases exclusivement bactériennes a été identifiée, nommée UbK (Ubiquitous bacterial Kinase). Mes travaux de thèse ont consisté en l’étude du rôle cellulaire d’UbK chez le pneumocoque. J’ai montré qu’UbK s’autophosphoryle sur une unique Tyrosine in vivo. Un mutant Δubk présente des défauts de croissance et de morphologie. Nous avons mis en évidence que l’absence d’activité d’hydrolyse de l’ATP ou une phosphorylation permanente sont également délétères pour la croissance et la morphologie cellulaires. La délétion d’ubk sélectionne une mutation suppressive dans la protéine essentielle AsnS, dont le rôle est assimilé à une Asparaginyl-ARNt synthétase. J’ai exploré le lien entre UbK et AsnS, ubk étant présent dans un opéron de gènes induits lors de la compétence. J’ai mis en évidence que la compétence tardive et la transformation étaient en partie contrôlées par UbK. Les défauts de morphologie en absence d’ubk traduisent une altération du cycle cellulaire. Nous avons déterminé que la composition de la paroi était modifiée, et que les protéines de la division FtsZ et FtsA, des partenaires d’UbK, ne sont pas localisées correctement dans le mutant Δubk. UbK est donc un acteur majeur de la division cellulaire et de la compétence.

The Midbody Remnant (MBR) is a structure that arises once cytokinetic abscission, the last step in cell division, is completed. Then, the MBR interacts with the cell surface and can play various roles in development, polarisation or cell proliferation. I first characterized a new MBR purification method. This study revealed that BST2, a protein known to anchor enveloped viruses to the cell surface, is enriched at the MBR. I thus focused on BST2 and its role at the MBR, especially in the interaction with the recipient cell plasma membrane. I fist confirmed by microscopy the enrichment of BST2 t the MBR. Similarly to viruses, the absence of BST2 increases the detachment of MBRs from the cell surface. They are thus released in the extracellular medium, increasing their transfer to neighbouring cells. Mechanistically, in parallel with virion restriction, BST2 dimerization and GPI anchor are both required for proper localization and functions of BST2 at the MBR. Using purified MBRs, we showed that BST2 at the midbody membrane -but not at the plasma membrane of the cell- is important for MBR retention to the cell surface. Altogether, these results show that BST2 localizes at the midbody remnant to promote its retention at the cell surface of non-infected cells. I propose that, in a way analogous to enveloped virions, BST2 tethers midbody remnants and participates in promoting their proper interaction with recipient cells.; Le Midbody (MB) post-cytokinétique est une structure créée suite à la séparation physique des cellules filles après la dernière étape de la division cellulaire, la cytokinèse. Le MB interagit ensuite avec la surface cellulaire afin de jouer des rôles variés dans le développement, la polarisation ou la prolifération cellulaire. J’ai d’abord caractérisé une nouvelle méthode de purification de MB post-cytokinétiques. Cette étude a révélé que BST2, une protéine connue pour ancrer les virus enveloppés à la surface cellulaire, est enrichie au MB. Je me suis donc concentré sur BST2 et son rôle au MB, notamment dans l’interaction avec la membrane plasmique de la cellule réceptrice. J’ai d’abord confirmé par microscopie l’enrichissement de BST2 au MB. De manière similaire aux virus, l’absence de BST2 augmente le détachement des MB de la surface cellulaire. Ils sont ainsi relâchés dans le milieu extracellulaire, augmentant leur transfert aux cellules avoisinantes. Mécaniquement, le domaine de dimérisation et l’ancre GPI de BST2 sont requis pour la localisation et la fonction au MB. En utilisant des MB purifiés, j’ai montré que BST2 à la membrane du MB -mais pas à la membrane plasmique- est important pour la rétention de ceux-ci à la surface cellulaire. En conclusion, ces résultats montrent une nouvelle fonction cellulaire de BST2. En effet, 1/ BST2 localise au MB et 2/BST2 permet de mieux retenir le MB à la surface cellulaire. Je propose donc que BST2 ancre les MB et participe à promouvoir leur étroite interaction avec la surface cellulaire, de manière analogue à son activité de restriction virale dans les cellules infectées.

International audience; Cell fate maintenance is an integral part of plant cell differentiation and the production of functional cells, tissues, and organs. Fleshy fruit development is characterized by the accumulation of water and solutes in the enlarging cells of parenchymatous tissues. In tomato (Solanum lycopersicum), this process is associated with endoreduplication in mesocarp cells. The mechanisms that preserve this developmental program, once initiated, remain unknown. We show here that analysis of a previously identified tomato ethyl methanesulfonate-induced mutant that exhibits abnormal mesocarp cell differentiation could help elucidate determinants of fruit cell fate maintenance. We identified and validated the causal locus through mapping-by-sequencing and gene editing, respectively, and performed metabolic, cellular, and transcriptomic analyses of the mutant phenotype. The data indicate that disruption of the SlGBP1 gene, encoding GUANYLATE BINDING PROTEIN1, induces early termination of endoreduplication followed by late divisions of polyploid mesocarp cells, which consequently acquire the characteristics of young proliferative cells. This study reveals a crucial role of plant GBPs in the control of cell cycle genes, and thus, in cell fate maintenance. We propose that SlGBP1 acts as an inhibitor of cell division, a function conserved with the human hGBP-1 protein.

The phylum Apicomplexa encompasses parasitic protists with a complex life cycle that alternates between sexual and asexual replication in different hosts. Apicomplexa are obligate intracellular parasites that display a peculiar organisation of their cell cycle. It consists of a nuclear phase (DNA replication) and a budding phase (daughter cells assembly) that can be uncoupled or coordinated differently, resulting in four distinctive modes of division in the phylum. The simplest of them, endodyogeny, is characteristic for the rapidly proliferating tachyzoite asexual stage of Toxoplasma gondii and comprises a single round of DNA replication and subsequent formation of two daughter cells within the mother cell. The regulatory system of endodyogeny is suggested to be physically linked to the parasite’s unusual bipartite centrosome, but remains largely unexplored. During this research project I characterized a novel T. gondii zinc finger protein named TgZFP2, whose knockdown led to a striking arrest of the parasite cell cycle. While DNA replication proceeded as normally, the budding was affected, resulting in appearance of immature daughters that failed to emerge from the mother cell and often failed to incorporate nuclear material. We have shown that, at the onset of daughter cells assembly, TgZFP2 re-localises from cytoplasmic puncta to the peri-centrosomal region where it persists until the completion of division. TgZFP2 also behaves as a cytoskeleton-associated protein. Though we were unable to identify TgZFP2 molecular partners to decipher the precise molecular mechanisms it is involved in, our data show TgZFP2 is an important regulator of the cell cycle that may have a pleotropic function.; Le phylum des Apicomplexes regroupe des parasites protozoaires avec un cycle de vie complexe alternant des réplications sexuée et asexuée chez différents hôtes. Ce sont des parasites intracellulaires obligatoires qui ont une l’organisation particulière de leur cycle cellulaire. Celui-ci consiste en une phase nucléaire (la réplication de l’ADN) et en une phase de bourgeonnement (l’assemblage des cellules filles) qui peuvent être découplées ou coordonnées différemment, générant quatre modes de division distincts au sein du phylum. Le plus simple d’entre eux, l’endodyogénie, est caractéristique de la forme tachyzoite de Toxoplasma gondii, un stade asexué et fortement prolifératif. Lors de ce type de division, il y a un seul tour de réplication de l'ADN avec une formation ultérieure de deux cellules filles dans la cellule mère. Le système de régulation de l’endodyogénie est physiquement lié à un centrosome atypique biparti, cependant il reste largement inexploré. Lors de ce projet de recherche, j’ai caractérisé chez T. gondii une nouvelle protéine à motif en doigt de zinc appelée TgZFP2. Interférer avec sa fonction résulte en l’arrêt du cycle cellulaire du parasite. Bien que la réplication de l'ADN se déroule normalement, le bourgeonnement des cellules filles est impacté, donnant naissance à des cellules filles immatures qui ne peuvent pas émerger de la cellule mère et ne parviennent souvent pas à incorporer le matériel nucléaire. Nous avons montré qu’au début de l’assemblage des cellules filles, la protéine TgZFP2 se re-localise depuis des puncta cytoplasmiques vers la région péri-centrosomale, où elle persiste jusqu’à l’achèvement de la division et l’émergence des cellules filles. TgZFP2 présente également des propriétés de protéine associée au cytosquelette. Bien que nous n’ayons pas été en mesure d’identifier les partenaires moléculaires de TgZFP2 pour identifier les mécanismes moléculaires dans lesquels elle est impliquée, nos données montrent que TgZFP2 est un régulateur important de la division cellulaire, potentiellement avec des fonctions multiples.

The phylum Apicomplexa encompasses parasitic protists with a complex life cycle that alternates between sexual and asexual replication in different hosts. Apicomplexa are obligate intracellular parasites that display a peculiar organisation of their cell cycle. It consists of a nuclear phase (DNA replication) and a budding phase (daughter cells assembly) that can be uncoupled or coordinated differently, resulting in four distinctive modes of division in the phylum. The simplest of them, endodyogeny, is characteristic for the rapidly proliferating tachyzoite asexual stage of Toxoplasma gondii and comprises a single round of DNA replication and subsequent formation of two daughter cells within the mother cell. The regulatory system of endodyogeny is suggested to be physically linked to the parasite’s unusual bipartite centrosome, but remains largely unexplored. During this research project I characterized a novel T. gondii zinc finger protein named TgZFP2, whose knockdown led to a striking arrest of the parasite cell cycle. While DNA replication proceeded as normally, the budding was affected, resulting in appearance of immature daughters that failed to emerge from the mother cell and often failed to incorporate nuclear material. We have shown that, at the onset of daughter cells assembly, TgZFP2 re-localises from cytoplasmic puncta to the peri-centrosomal region where it persists until the completion of division. TgZFP2 also behaves as a cytoskeleton-associated protein. Though we were unable to identify TgZFP2 molecular partners to decipher the precise molecular mechanisms it is involved in, our data show TgZFP2 is an important regulator of the cell cycle that may have a pleotropic function.; Le phylum des Apicomplexes regroupe des parasites protozoaires avec un cycle de vie complexe alternant des réplications sexuée et asexuée chez différents hôtes. Ce sont des parasites intracellulaires obligatoires qui ont une l’organisation particulière de leur cycle cellulaire. Celui-ci consiste en une phase nucléaire (la réplication de l’ADN) et en une phase de bourgeonnement (l’assemblage des cellules filles) qui peuvent être découplées ou coordonnées différemment, générant quatre modes de division distincts au sein du phylum. Le plus simple d’entre eux, l’endodyogénie, est caractéristique de la forme tachyzoite de Toxoplasma gondii, un stade asexué et fortement prolifératif. Lors de ce type de division, il y a un seul tour de réplication de l'ADN avec une formation ultérieure de deux cellules filles dans la cellule mère. Le système de régulation de l’endodyogénie est physiquement lié à un centrosome atypique biparti, cependant il reste largement inexploré. Lors de ce projet de recherche, j’ai caractérisé chez T. gondii une nouvelle protéine à motif en doigt de zinc appelée TgZFP2. Interférer avec sa fonction résulte en l’arrêt du cycle cellulaire du parasite. Bien que la réplication de l'ADN se déroule normalement, le bourgeonnement des cellules filles est impacté, donnant naissance à des cellules filles immatures qui ne peuvent pas émerger de la cellule mère et ne parviennent souvent pas à incorporer le matériel nucléaire. Nous avons montré qu’au début de l’assemblage des cellules filles, la protéine TgZFP2 se re-localise depuis des puncta cytoplasmiques vers la région péri-centrosomale, où elle persiste jusqu’à l’achèvement de la division et l’émergence des cellules filles. TgZFP2 présente également des propriétés de protéine associée au cytosquelette. Bien que nous n’ayons pas été en mesure d’identifier les partenaires moléculaires de TgZFP2 pour identifier les mécanismes moléculaires dans lesquels elle est impliquée, nos données montrent que TgZFP2 est un régulateur important de la division cellulaire, potentiellement avec des fonctions multiples.

Cell division is an essential process required for the proliferation of unicellular organisms, for the development of multicellular organisms, as well as for cell renewal within tissues and organs. Defective control of cell division can either lead to cell death, or to cell hyper-proliferation and contribute to cancer progression. Cell division is therefore under the control of very tight regulatory mechanisms. In animals and fungi, its final step, cytokinesis, requires an acto-myosin-based contractile ring that constricts to promote sister cell cleavage. Modifications in the lipid composition of the plasma membrane take place during cell division, with functional impact on cytokinesis.Fission yeast is a simple single cell eukaryotic organism which has been extensively used to study cell division because of its stereotyped rode shape, easy genetics and short generation time. In particular, this model system has proved very powerful for the molecular dissection of contractile ring assembly. However remarkably little is known on how membrane lipids regulate contractile ring assembly. In the first part of my PhD, my objective was to study how lipids could regulate contractile ring positioning in fission yeast. I have combined fission yeast genetics with live-cell imaging of contractile ring assembly from precursor nodes to understand how ergosterol levels affect division plane positioning. I have found that increased ergosterol levels prevent F-actin assembly from cytokinetic precursor nodes by the formin Cdc12, avoiding their compaction into a medially placed contractile ring. Since the stability of F-actin cables was not altered altogether and the phenotype could be partially rescued by inhibition of the Arp2/3 complex which competes with formins, we propose that increasing ergosterol levels in the plasma membrane may inhibit the activity of the formin Cdc12.In addition to the contractile ring, cytokinesis involves an additional component of the cytoskeleton, the septins, which form filaments at the division site. Septins are a family of conserved GTP binding proteins whose deletion leads to cytokinetic defects. They also serve as scaffolds for protein-protein interactions and/or as diffusion barriers for protein compartmentalization in cytokinesis and beyond. In fission yeast, in contrast to budding yeast, septins are late at the division site and are only involved in late stages of cytokinesis, to promote sister cell separation. In the second part of my PhD, I decided to explore the dynamic behavior of septins and decipher how they are regulated. Using live cell imaging and precise cell cycle timers, I have identified a new step in the recruitment of septin to the cell cortex in the proximity of the contractile acto-myosin ring, in a broad meshwork that then compacts into a tight ring. I have also found evidence that the anillin-like protein Mid2 is necessary to promote this compaction and may act as a bundler for septin filaments. However, analysis of mutants blocked in mitosis shows that this protein is not sufficient to accomplish this task. Moreover, I have determined that high Cdk activity allows septins and Mid2 initial recruitment and assembly, but the SIN pathway also plays a role in promoting their recruitment at the cell middle and is then required to drive their compactio. Additionally, I have found that PIP2 levels influence not only the amount of septins and Mid2 filaments associated at the medial cortex together with their compaction but also the timing of septin recruitment to the division site. This demonstrates that septin assembly relies on complex regulations coordinated by the cell cycle machinery., La division cellulaire est un processus essentiel requis pour la prolifération des organismes unicellulaires, pour le développement des organismes multicellulaires, ainsi que pour le renouvellement cellulaire dans les tissus et organes. Un contrôle défectueux de la division cellulaire peut conduire à la mort cellulaire ou à une hyper-prolifération cellulaire et contribuer à la progression du cancer. La division cellulaire est donc sous le contrôle de mécanismes de régulation très stricts. Sa dernière étape, la cytocinèse, nécessite un anneau contractile acto-myosique qui se contracte pour permettre le clivage en deux cellules filles. Parallèlement à l'assemblage de l’anneau contractile, des modifications de la composition lipidique de la membrane plasmatique ont lieu avec un impact fonctionnel sur la cytokinèse. S. pombe a été utilisé comme modèle pour disséquer l’impact des lipides dans d`assemblage de l’anneau contractile. Dans la première partie de ma thèse, mon objectif était d’étudier comment les lipides pourraient réguler le positionnement de l’anneau contractile chez la levure S. pombe. J’ai combiné une approche génétique à de l’imagerie sur cellules vivantes de l'assemblage de l’anneau contractile à partir des nœuds précurseurs de l’anneau pour comprendre comment le niveau d'ergostérol affecte le positionnement du plan de division. J'ai constaté que l'augmentation du niveau d'ergostérol empêchait l'assemblage d’actine-F par la formine Cdc12 à partir de nœuds précurseurs, bloquant leur compaction en anneau fin. Comme la stabilité des câbles d’actine n’est pas perturbée globalement et que le phénotype peut être partiellement compensé par inhibition du complexe Arp2/3, en compétition avec les formines, nous proposons que l'augmentation du niveau d'ergostérol dans la membrane plasmique pourrait inhiber l'activité de la formine Cdc12. En plus de l’anneau contractile acto-myosique, la cytocinèse implique un réseau supplémentaire de cytosquelette, les septines, qui forment des filaments au niveau du site de division. Les septines constituent une famille conservée de protéines liant le GTP dont la suppression conduit à des défauts de cytocinèse. Elles servent également d’échafaudages pour les interactions protéine-protéine et/ou de barrières de diffusion pour la compartimentation des protéines pendant la cytocinèse et au-delà. Chez S. pombe, contrairement à S. cerevisiae, les septines arrivent tardivement au site de division et sont seulement impliquées dans les étapes tardives de la cytocinèse, pour promouvoir la séparation des deux cellules filles. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai décidé d’explorer le comportement dynamique des septines au cours de la progression de la cytocinèse et leurs mécanismes de régulation. En utilisant l’imagerie sur cellules vivantes et des déterminants temporels précis de progression du cycle cellulaire, j’ai identifié une nouvelle étape de recrutement des septines sur le cortex cellulaire à proximité de l’anneau contractile acto-myosique, en un large réseau qui se compacte ensuite en anneau fin. J'ai également trouvé des preuves que Mid2, une protéine de la famille de l'anilline, favorise la compaction des septines et peut agir comme un « bundler » de septines. Cependant, l’analyse de mutants bloqués en mitose indique que cette protéine n’est pas suffisante pour accomplir cette tâche. De plus, j'ai déterminé qu’une activité de Cdk1 élevée permet le recrutement et l’assemblage des septines mais que la voie du SIN est aussi nécessaire pour promouvoir leur recrutement au milieu de la cellule et favoriser leur compaction. Enfin, j’ai trouvé que les niveaux de PIP2 influaient non seulement sur la quantité de septines et de Mid2 associés au cortex médian et leur compaction mais aussi sur le « timing » du recrutement des septines sur le site de division. Ceci démontre que l’organisation des septines dépend d’une série de régulations complexes coordonnées par la machinerie du cycle cellulaire.

Cytokinesis is the final step that mediates the separation of the two daughter cells after mitosis. It begins with the formation of a cleavage furrow, generated by an actomyosin ring, which leads to the formation of an intercellular bridge whose center is called the "midbody". The mechanisms that lead to abscission are not fully understood, but the commonly accepted model involves the polymerization of ESCRT-III filaments. In particular, these proteins are localized at the abscission sites and are required for the severing the intercellular bridge. It is not known whether these ESCRT-III proteins interact with a membrane protein in the context of cytokinesis, as it has been shown in other topologically equivalent events in which ESCRT-III are involved, such as HIV budding or biogenesis of exosomes. In the latter case, Syntenin is known to act as an adapter between the transmembrane proteins Syndecans and the ALIX / ESCRT-III proteins, and this is required for the proper release of exosomes within the multivesicular bodies. Before my arrival, the laboratory had purified and analyzed by mass spectrometry "midbody remnants" of HeLa cells, a midbody released after abscission. This analysis revealed the enrichment of approximately 500 proteins in the "midbody remnants", a large part of which had never been shown to be required for cytokinesis, in particular Syntenin and Syndecan-4. The aim of my thesis was to determine the role of the Syntenin / Syndecan-4 couple in the last stages of cytokinesis, especially because no transmembrane protein has yet been studied in the context of cytokinetic abscission. Immunofluorescence experiments on intercellular bridges of HeLa cells showed that the endogenous proteins Syndecan-4, Syntenin, ALIX and CHMP4B (a protein of the ESCRT-III complex) colocalize at the midbody and on its side, at the site of abscission. In videomicroscopy, mScarlet-Syntenin and GFP-Syndecan-4 are first recruited to the midbody, and then, in a second step, are enriched at the abscission site, as it has already been shown for ESCRT-III proteins. From a mechanistic point of view, ALIX is required for the recruitment of Syntenin at the intercellular bridge, and Syntenin is itself required for the proper recruitment of Syndecan-4. From a functional point of view, the depletion of ALIX, Syntenin or Syndecan-4 strongly delays abscission and prevents the stable recruitment of ESCRT-III proteins at the abscission site. All these results show that ALIX, Syntenin and Syndecan-4 interact together in the context of cytokinesis and that they allow the proper localization of ESCRT-III proteins at the abscission site. Syndecan-4 is the first transmembrane protein directly involved in abscission; I propose that this protein couples the forces generated by the ALIX / ESCRT-III filaments to the plasma membrane, and therefore promotes the scission of the intercellular bridge.; La cytocinèse est l’étape finale de séparation des deux cellules filles, après la mitose. Elle commence avec la formation d’un sillon de clivage, généré par un anneau d’actomyosine, menant à la formation d’un pont intercellulaire dont le centre est dénommé « midbody ». Les mécanismes qui mènent à l’abscission sont encore largement incompris, mais le modèle actuellement retenu fait intervenir la polymérisation de filaments d’ESCRT-III. Ces protéines sont en particulier localisées au niveau des sites d’abscission et sont nécessaires à la coupure du pont intercellulaire. On ne sait pas si ces protéines ESCRT-III interagissent avec une protéine membranaire dans le cadre de la cytocinèse, comme c’est le cas dans d’autres événements topologiquement équivalents où les ESCRT-III sont impliquées, comme par exemple le bourgeonnement du VIH ou la formation des exosomes. Dans ce dernier cas, Synténine est connue pour agir comme un adaptateur entre les protéines transmembranaires Syndécans et les protéines ALIX/ESCRT-III, ce qui est nécessaire pour la scission des exosomes à l’intérieur des corps multivésiculaires. Avant mon arrivée, le laboratoire TMDC a purifié et analysé par spectrométrie de masse des « midbody remnants » de cellules HeLa, une structure résiduelle générée après l’abscission. Cette analyse a mis en évidence l’enrichissement d’environ 500 protéines dans ces « midbody remnants », dont une grande partie n’avaient jamais été décrites comme requises pour la cytocinèse, en particulier Synténine et Syndécan-4. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du couple Synténine/Syndécan-4 dans les dernières étapes de la cytocinèse, d’autant plus qu’aucune protéine transmembranaire n’a pour le moment été étudiée dans le cadre de l’abscission. Des expériences d’immunofluorescence sur des ponts intercellulaires de cellules HeLa ont montré que les protéines endogènes Syndécan-4, Synténine, ALIX et CHMP4B (une protéine du complexe ESCRT-III) colocalisent au niveau du midbody et sur son côté, au site d’abscission. En vidéomicroscopie, mScarlet-Synténine et GFP-Syndécan-4 sont d’abord recrutées au midbody, puis dans un deuxième temps, sont enrichies au site d’abscission, comme ce qui a déjà été montré pour les protéines ESCRT-III. Au niveau mécanistique, ALIX est nécessaire au recrutement de Synténine au pont intercellulaire, et Synténine est elle-même nécessaire au bon recrutement de Syndécan-4. D’un point de vue fonctionnel, la déplétion d’ALIX, de Synténine ou de Syndécan-4 retarde fortement l’abscission et empêche le recrutement stable des protéines ESCRT-III au site d’abscission. L’ensemble de ces résultats montre qu’ALIX, Synténine et Syndécan-4 interagissent dans le cadre de la cytocinèse et qu’ils permettent la bonne localisation des protéines ESCRT-III au niveau du site d’abscission. Syndecan-4 est la première protéine transmembranaire directement impliquée dans l’abscission ; je propose que cette protéine couple les forces générées par les filaments d’ALIX/ESCRT-III et la membrane, ce qui permet la scission effective du pont intercellulaire.

National audience; Le BPAF (substituant potentiel au BPA) est un bisphénol fluoré, principalement utilisé dans la synthèse des fluoroélastomères. Même si son utilisation est pour le moment, restreinte à certains matériaux utilisés en électronique, robotique et en aéronautique, sa présence dans notre environnement n’est pas négligeable ; il est régulièrement détecté dans l’eau, les poussières domestiques, les sédiments et les boues des stations d’épuration. Peu d’études ont été réalisées pour évaluer la toxicité du BPAF. Mais, son analogie structurale au BPA, sa persistance dans l’environnement et sa faible biodégradation justifient l’importance d’une étude sur la toxicité éventuelle du BPAF sur les cellules germinales femelles, déjà connues pour être extrêmement sensibles au BPA.

International audience; The crossovers (COs) that occur during meiotic recombination lead to genetic diversity upon which natural and artificial selection can act. The potential of tinkering with the mechanisms of meiotic recombination to increase the amount of genetic diversity accessible for breeders has been under the research spotlight for years. A wide variety of approaches have been proposed to increase CO frequency, alter CO distribution and induce COs between non-homologous chromosomal regions. For most of these approaches, translational biology will be crucial for demonstrating how these strategies can be of practical use in plant breeding. In this review, we describe how tinkering with meiotic recombination could benefit plant breeding and give concrete examples of how these strategies could be implemented into breeding programs.

Nuclear transfer consists in injecting a somatic nucleus carrying valuable genetic information into a recipient oocyte to sire a diploid offspring which bears the genome of interest. It requires that the oocyte (maternal) DNA is removed. In fish, because enucleation is difficult to achieve, non-enucleated oocytes are often used and disappearance of the maternal DNA was reported in some clones. The present work explores which cellular events explain spontaneous erasure of maternal DNA, as mastering this phenomenon would circumvent the painstaking procedure of fish oocyte enucleation. The fate of the somatic and maternal DNA during oocyte activation and first cell cycle was studied using DNA labeling and immunofluorescence in goldfish clones. Maternal DNA was always found as an intact metaphase within the oocyte, and polar body extrusion was minimally affected after oocyte activation. During the first cell cycle, only 40% of the clones displayed symmetric cleavage, and these symmetric clones contributed to 80% of those surviving at hatching. Maternal DNA was often fragmented and located under the cleavage furrow. The somatic DNA was organized either into a normal mitotic spindle or abnormal multinuclear spindle. Scenarios matching the DNA behavior and the embryo fate are proposed.

Le BPAF (substituant potentiel au BPA) est un bisphénol fluoré, principalement utilisé dans la synthèse des fluoroélastomères. Même si son utilisation est pour le moment, restreinte à certains matériaux utilisés en électronique, robotique et en aéronautique, sa présence dans notre environnement n’est pas négligeable ; il est régulièrement détecté dans l’eau, les poussières domestiques, les sédiments et les boues des stations d’épuration. Peu d’études ont été réalisées pour évaluer la toxicité du BPAF. Mais, son analogie structurale au BPA, sa persistance dans l’environnement et sa faible biodégradation justifient l’importance d’une étude sur la toxicité éventuelle du BPAF sur les cellules germinales femelles, déjà connues pour être extrêmement sensibles au BPA.

Fruit size and morphology are key characters defining the final fruit quality. Among the large fruit diversity observed in the nature, human domestication and selection has induced changes in fruit size and tissue morphology. Only a few genetic regulators have been identified so far, thus cellular and molecular mechanisms by which fruit tissue morphology is defined remain incomplete. In this context, the aim of my thesis is to identify and characterize new regulators of fruit tissue morphology. For this purpose, I used a collection of tomato EMS mutants as a source of genetic and phenotypic diversity. I selected two mutants presenting opposite trends of pericarp thickness. Through a mapping-by-sequencing strategy, I identified a genetic region on chromosome 10, associated with an extreme thick pericarp phenotype. I also investigated the role of the Guanylate Binding Protein (GBP) at the origin of a thin pericarp phenotype. The GBP is a large GTP binding protein that was never characterized in plants so far. In order to go deeper into its functional characterization in plants, I studied in parallel the role of the protein in tomato and Arabidopsis "thaliana" models. I showed that both homolog proteins are localized at the nucleus. Mutation of GBP in tomato induced strong alterations in cell division and cell expansion inside the pericarp and altered lateral root growth in tomato and Arabidopsis, a classical feature for mutants impaired in mitosis. This study suggests a role for the GBP in the fine control of cell division in the tomato pericarp.; La taille du fruit et la morphologie des tissus du fruit sont des caractères clés définissant la qualité finale du fruit. Parmi la grande diversité de fruits observée dans la nature, la domestication et la sélection ont entrainé d’importantes modifications de la taille et de la morphologie des tissus du fruit. Jusqu'à présent, seuls quelques régulateurs génétiques ont été identifiés, et les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels la morphologie des tissus du fruit est définie restent imprécis. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse est d'identifier et de caractériser de nouveaux régulateurs impliqués dans la morphologie des tissus du fruit. Pour cela, j'ai utilisé une collection de mutants EMS de tomate comme source de diversité génétique et phénotypique et j'ai sélectionné deux mutants présentant des tendances opposées et extrêmes d'épaisseur du péricarpe. Grace à une stratégie de cartographie par séquençage, j’ai identifié une région génétique du chromosome 10, associée au phénotype péricarpe épais. J'ai également étudié le rôle de la Guanylate Binding Protein (GBP) à l’origine du phénotype péricarpe fin chez la tomate. La GBP est une grosse GTP binding protein qui n’a jamais été caractérisée chez les plantes. Afin d'approfondir l’étude de cette protéine, j'ai étudié en parallèle son rôle dans les modèles tomate et Arabidopsis" thaliana. J'ai démontré que les deux protéines homologues sont localisées dans le noyau. La mutation de la GBP chez la tomate induit de fortes altérations de la division et de l'expansion cellulaire à l'intérieur du péricarpe ainsi qu'une altération de la croissance des racines latérales chez la tomate et Arabidopsis, une caractéristique classiquement retrouvée chez les mutants altérés dans la mitose. Cette étude suggère que le GBP joue un rôle dans le contrôle précis des divisions cellulaires dans le péricarpe de tomate.

The bacterial cell cycle is a very well studied process but current models don't reflect the complexity and diversity of involved molecular machineries and associated regulation mechanisms. In fact, our knowledge of cell cycle is based on study of a few model organisms. Yet, comparative analyses showed that some described systems and mechanisms are not conserved and not transposable from a taxon to another. Evolutionary approach such as phylogenomic can be used for functional studies of such systems at the bacterial scale. Those approaches allow to determine the key evolutionary events that lead to a such diversity but also to identify potential functional links between proteins. Furthermore, the development of high throughput sequencing methods leads to a big amount of genomic data, particularly for prokaryotes. In this context, I realized a very large scale phylogenomic analysis of proteins involved in cell cycle and its regulation in Firmicutes. My goal was to search some coevolution patterns between protein families reflecting potentially functional links. The application of methods that I developed during my PhD to cell cycle proteins allowed to reconstruct the evolutionary history of this cell process in Firmicutes. Notably, I highlighted some hot-spots corresponding for example to the emergence of Bacilli or Streptococcaceae. The emergence of such taxa has been accompanied by many acquisitions/losses of cell cycle genes but also many genomic rearrangements in gene clusters suggesting that major changes have occurred at the level of the cell cycle and its regulation. I also highlighted some potential functional links between genes involved in different machineries of cell cycle that have never been described. The application of these approaches to the entire proteomes of Firmicutes allowed to identify proteins presenting same evolution patterns than cell cycle proteins suggesting potential functional links that have to be experimentally tested, Le cycle cellulaire chez les bactéries est un processus très étudié mais il apparait que les modèles actuels ne rendent pas compte de la complexité et surtout de la diversité des machineries et des mécanismes de régulation impliqués. En fait, notre connaissance du cycle cellulaire repose sur l'étude de quelques organismes modèles. Or les analyses comparatives ont montré que certains systèmes et mécanismes décrits sont peu conservés et donc difficilement transposables d'un taxon à l'autre. Des approches évolutives telles que la phylogénomique peuvent être utilisées pour l'étude fonctionnelle de tels systèmes biologiques à l'échelle des bactéries. Ces approches permettent notamment de déterminer les évènements évolutifs clés qui ont conduit à une telle diversité mais également d'identifier des liens fonctionnels potentiels entre protéines. De plus, le développement des méthodes de séquençage à très haut débit a conduit à une accumulation de données génomiques sans précèdent, notamment chez les procaryotes. Dans ce contexte, j'ai réalisé une analyse phylogénomique à très large échelle des protéines impliquées dans le cycle cellulaire et sa régulation chez les Firmicutes. Mon objectif était de rechercher des patrons de coévolution entre familles protéiques pouvant refléter des liens fonctionnels. L'application des méthodes développées dans le cadre cette thèse aux protéines impliquées dans le cycle cellulaire chez les Firmicutes a permis de reconstruire l'histoire évolutive de ce processus cellulaire fondamental à l'échelle de ce phylum bactérien majeur. En particulier, j'ai pu mettre en évidence l'existence de quelques points chauds correspondant par exemple à l émergence des Bacilli ou des Streptococcaceae. L'émergence de ces taxa s'est accompagnée de nombreuses acquisitions et/ou de pertes de gènes ainsi que de nombreux réarrangements dans l'organisation des clusters de gènes codant pour ces protéines, suggérant que des changements majeurs se sont produits au niveau du cycle cellulaire et de sa régulation. J'ai également pu mettre en évidence de possibles liens fonctionnels qui n'ont jamais été décrits jusqu'à présent entre des gènes impliqués dans différentes machineries du cycle cellulaire. L'application de ces approches à l'ensemble des protéomes de Firmicutes a également permis d'identifier des protéines présentant des patrons de coévolution communs avec les protéines impliquées dans la division cellulaire et sa régulation, suggérant de possibles liens fonctionnels qu'il serait nécessaire de tester expérimentalement

A developing plant organ exhibits complex spatiotemporal patterns of growth, cell division, cell size, cell shape, and organ shape. Explaining these patterns presents a challenge because of their dynamics and cross-correlations, which can make it difficult to disentangle causes from effects. To address these problems, we used live imaging to determine the spatiotemporal patterns of leaf growth and division in different genetic and tissue contexts. In the simplifying background of the speechless (spch) mutant, which lacks stomatal lineages, the epidermal cell layer exhibits defined patterns of division, cell size, cell shape, and growth along the proximodistal and mediolateral axes. The patterns and correlations are distinctive from those observed in the connected subepidermal layer and also different from the epidermal layer of wild type. Through computational modelling we show that the results can be accounted for by a dual control model in which spatiotemporal control operates on both growth and cell division, with cross-connections between them. The interactions between resulting growth and division patterns lead to a dynamic distributions of cell sizes and shapes within a deforming leaf. By modulating parameters of the model, we illustrate how phenotypes with correlated changes in cell size, cell number, and organ size may be generated. The model thus provides an integrated view of growth and division that can act as a framework for further experimental study., Organ morphogenesis involves two coordinated processes: growth of tissue and increase in cell number through cell division. Both processes have been analysed individually in many systems and shown to exhibit complex patterns in space and time. However, it is unclear how these patterns of growth and cell division are coordinated in a growing leaf that is undergoing shape changes. We have addressed this problem using live imaging to track growth and cell division in the developing leaf of the mustard plant Arabidopsis thaliana. Using subsequent computational modelling, we propose an integrated model of leaf growth and cell division, which generates dynamic distributions of cell size and shape in different tissue layers, closely matching those observed experimentally. A key aspect of the model is dual control of spatiotemporal patterns of growth and cell division parameters. By modulating parameters in the model, we illustrate how phenotypes may correlate with changes in cell size, cell number, and organ size.

The family of forkhead box (Fox) transcription factors regulate gonadogenesis and embryogenesis, but the role of foxr1/foxn5 in reproduction is unknown. Evolution of foxr1 in vertebrates was examined and the gene found to exist in most vertebrates, including mammals, ray-finned fish, amphibians, and sauropsids. By quantitative PCR and RNA-seq, we found that foxr1 had an ovarian-specific expression in zebrafish, a common feature of maternal-effect genes. In addition, it was demonstrated using in situ hybridization that foxr1 was a maternally-inherited transcript that was highly expressed even in early-stage oocytes and accumulated in the developing eggs during oogenesis. We also analyzed the function of foxr1 in female reproduction using a zebrafish CRISPR/Cas9 knockout model. It was observed that embryos from the foxr1-deficient females had a significantly lower survival rate whereby they either failed to undergo cell division or underwent abnormal division that culminated in growth arrest at around the mid-blastula transition and early death. These mutant-derived eggs contained a dramatically increased level of p21, a cell cycle inhibitor, and reduced rictor, a component of mTOR and regulator of cell survival, which were in line with the observed growth arrest phenotype. Our study shows for the first time that foxr1 is an essential maternal-effect gene and is required for proper cell division and survival via the p21 and mTOR pathways. These novel findings will broaden our knowledge on the functions of specific maternal factors stored in the developing egg and the underlying mechanisms that contribute to reproductive fitness.

Lactococcus lactis is an ovoid bacterium that forms filaments during planktonic and biofilm lifestyles by uncoupling cell division from cell elongation. In this work, we investigate the role of the leading peptidoglycan synthase PBP2b that is dedicated to cell elongation in ovococci. We show that the localization of a fluorescent derivative of PBP2b remains associated to the septal region and superimposed with structural changes of FtsZ during both vegetative growth and filamentation indicating that PBP2b remains intimately associated to the division machinery during the whole cell cycle. In addition, we show that PBP2b-negative cells of L. lactis are not only defective in peripheral growth; they are also affected in septum positioning. This septation defect does not simply result from the absence of the protein in the cell growth machinery since it is also observed when PBP2b-deficient cells are complemented by a catalytically inactive variant of PBP2b. Finally, we show that round cells resulting from β-lactam treatment are not altered in septation, suggesting that shape elongation as such is not a major determinant for selection of the division site. Altogether, we propose that the specific PBP2b transpeptidase activity at the septum plays an important role for tagging future division sites during L. lactis cell cycle.

CEP55 (Centrosomal protein 55 KDa) critically regulates the final step of cell division termed cytokinesis. In the first part, using bioinformatical, structure-function and cell biology approaches, we showed that CEP55 contains two new NEMO-like ubiquitin binding domains, NOACEP55 and ZFCEP55, which differentially regulate CEP55 function during cytokinesis. Structural modeling, mutagenesis and biophysical studies of both domains pointed out that NOACEP55 adopts a dimeric coiled-coil structure and selectively interacts with linear ubiquitin chains (M1). However, ZFCEP55 presents a zinc-finger scaffold – or UBZ – and preferentially binds to K63 and M1 ubiquitin chains. Moreover, our results highlight that ZFCEP55 functions as a cargo receptor to the midbody in an ubiquitin dependent manner whilst NOACEP55 plays a crucial role in cytokinesis but acts downstream of CEP55 recruitment to the midbody. In the second part, we showed that NOACEP55 and ZFCEP55 separated by a proline rich linker cooperatively interact with long K63 poly-ubiquitin chains and this interaction can be modulated by phosphorylation and isomerization via CEP55 physiological partners. Finally, these results allowed us to identify E3-ligases and deubiquitinases involved in cytokinesis, which permit to discuss the role of ubiquitin signaling in this cellular process.; La protéine CEP55 pour Centrosomal protein 55 kDa est un régulateur essentiel de la dernière étape de la division cellulaire appelée cytocinèse. En utilisant des approches de bioinformatique, structure-fonction et de biologie cellulaire, nous montrons que CEP55 comporte deux nouveaux domaines d'interaction à l'ubiquitine, qui sont similaires à ceux de la protéine NEMO, NOACEP55 et ZFCEP55 et qui régulent différemment la fonction de CEP55 durant la cytocinèse. Des études de modélisation structurale, mutagénèse dirigée et de biophysique de ces domaines ont permis de mettre en évidence que NOACEP55 adopte une structure dimérique de type " coiled-coil " et interagit préférentiellement avec des chaines d'ubiquitine linéaires (M1). Néanmoins, ZFCEP55 présente une architecture de type zinc finger ou UBZ et se lie préférentiellement avec des chaines d'ubiquitine K63 et M1. De plus, nous mettons en évidence que ZFCEP55 est indispensable au recrutement de CEP55 au midbody de façon dépendante de son interaction avec l'ubiquitine. A contrario, NOACEP55 joue un rôle déterminant en aval du recrutement de CEP55 au midbody. Dans un second volet, nous montrons que NOACEP55 et ZFCEP55 qui sont séparés par un domaine charnière riche en proline, interagissent in vitro de manière coopérative avec de longues chaines d'ubiquitine K63 et que cette interaction est modulée par phosphorylation et isomérisation d'acteurs physiologiques associés à CEP55. Enfin, ces résultats ont permis d'identifier par criblage de siRNA des ubiquitine ligases et déubiquitinases impliquées dans la cytocinèse, qui permettent de discuter du rôle de la signalisation de l'ubiquitine dans ce processus cellulaire.

CEP55 (Centrosomal protein 55 KDa) critically regulates the final step of cell division termed cytokinesis. In the first part, using bioinformatical, structure-function and cell biology approaches, we showed that CEP55 contains two new NEMO-like ubiquitin binding domains, NOACEP55 and ZFCEP55, which differentially regulate CEP55 function during cytokinesis. Structural modeling, mutagenesis and biophysical studies of both domains pointed out that NOACEP55 adopts a dimeric coiled-coil structure and selectively interacts with linear ubiquitin chains (M1). However, ZFCEP55 presents a zinc-finger scaffold – or UBZ – and preferentially binds to K63 and M1 ubiquitin chains. Moreover, our results highlight that ZFCEP55 functions as a cargo receptor to the midbody in an ubiquitin dependent manner whilst NOACEP55 plays a crucial role in cytokinesis but acts downstream of CEP55 recruitment to the midbody. In the second part, we showed that NOACEP55 and ZFCEP55 separated by a proline rich linker cooperatively interact with long K63 poly-ubiquitin chains and this interaction can be modulated by phosphorylation and isomerization via CEP55 physiological partners. Finally, these results allowed us to identify E3-ligases and deubiquitinases involved in cytokinesis, which permit to discuss the role of ubiquitin signaling in this cellular process.; La protéine CEP55 pour Centrosomal protein 55 kDa est un régulateur essentiel de la dernière étape de la division cellulaire appelée cytocinèse. En utilisant des approches de bioinformatique, structure-fonction et de biologie cellulaire, nous montrons que CEP55 comporte deux nouveaux domaines d'interaction à l'ubiquitine, qui sont similaires à ceux de la protéine NEMO, NOACEP55 et ZFCEP55 et qui régulent différemment la fonction de CEP55 durant la cytocinèse. Des études de modélisation structurale, mutagénèse dirigée et de biophysique de ces domaines ont permis de mettre en évidence que NOACEP55 adopte une structure dimérique de type " coiled-coil " et interagit préférentiellement avec des chaines d'ubiquitine linéaires (M1). Néanmoins, ZFCEP55 présente une architecture de type zinc finger ou UBZ et se lie préférentiellement avec des chaines d'ubiquitine K63 et M1. De plus, nous mettons en évidence que ZFCEP55 est indispensable au recrutement de CEP55 au midbody de façon dépendante de son interaction avec l'ubiquitine. A contrario, NOACEP55 joue un rôle déterminant en aval du recrutement de CEP55 au midbody. Dans un second volet, nous montrons que NOACEP55 et ZFCEP55 qui sont séparés par un domaine charnière riche en proline, interagissent in vitro de manière coopérative avec de longues chaines d'ubiquitine K63 et que cette interaction est modulée par phosphorylation et isomérisation d'acteurs physiologiques associés à CEP55. Enfin, ces résultats ont permis d'identifier par criblage de siRNA des ubiquitine ligases et déubiquitinases impliquées dans la cytocinèse, qui permettent de discuter du rôle de la signalisation de l'ubiquitine dans ce processus cellulaire.

The centrosome is the main microtubule organizing center. It nucleates and organizes interphase microtubule and contributes to the assembly of the bipolar mitotic spindle. To do so, the centrosome, present in one copy at the beginning of the cell cycle, duplicates to produce a second copy. The duplication process is tightly controlled and regulated since centrosome over-duplication can lead to multipolar mitotic spindles and promote genome instability and tumorigenesis. The duplication of the yeast centrosome, the SPB (Spindle pole body), begins with the duplication of the half bridge. This appendage is composed of Sfi1/Cdc31 complex organized in a parallel array attached to the core SPB. SPB duplication relies on the assembly of a second array of Sfi1/Cdc31, anti-parallel to the first one, creating thereby an assembly site for the new SPB. Therefore Sfi1 is essential for SPB duplication and our work defined the timing of half-bridge duplication and some of the regulatory mechanisms that favor bridge splitting to release duplicated centrosomes and allow spindle assembly at mitotic onset. Sfi1 and Cdc31/Centrins are conserved in human cells where the centrosome is composed of two centrioles surrounded by the pericentriolar material. Centrins are concentrated in the distal end of centrioles. Sfi1 has also been localized to centrioles, but its function remained unknown. Thus, we started investigating Sfi1 function in human cells. We found that Sfi1 depletion leads to a decrease in Centrin recruitment to the centrioles. It also leads to a cell cycle arrest in G1 in RPE1 cells, an event previously observed in presence of defects in centriole biogenesis. In HeLa cells where the cell cycle is not affected, Sfi1 depletion leads to a mitotic delay. Moreover, Sfi1 depletion leads to cilium assembly. To conclude, these results altogether point towards a role of human Sfi1 in centriole biogenesis., Le centrosome est le centre organisateur des microtubules dans les cellules animales, il nucléé les microtubules interphasiques ainsi que le fuseau mitotique. Les centrosomes sont produits par duplication, mécanisme rigoureusement régulé au cours du cycle cellulaire. En effet, un centrosome comporte deux centrioles qui se dupliquent une fois par cycle cellulaire. Des erreurs de duplication conduisant à plus de deux centrosomes induisent la formation de fuseaux multipolaires et provoquent des défauts de ségrégation des chromosomes. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, un organisme modèle pour l’étude de la division cellulaire, les homologues des centrosomes sont les SPBs (pour Spindle Pole Body). Une structure annexe spécifique liée aux SPBs est appelée demi-pont (quand les SPBs ne sont pas dupliqués) puis pont (quand elle relie les deux SPBs dupliqués). Les deux principaux composants du pont chez la levure S. pombe sont Cdc31 et Sfi1. Sfi1 est une protéine linéaire formée de répétitions en hélice α formant des sites de liaison pour la Centrine/Cdc31. Sfi1 s’assemble en réseau de molécules parallèles interagissant avec le SPB via leur domaine N-terminal. Lors de la première partie de ma thèse, j’ai démontré que Sfi1 est requis pour la duplication et la séparation des deux SPBs. Dans la première partie de ma thèse, je me suis intéressée aux fonctions de Sfi1 chez la levure. Cette étude a permis de démontrer que Sfi1 est un composant du demi-pont et qu’il est essentiel pour la duplication des SPBs et l’assemblage d’un fuseau bipolaire. De plus, nous avons déterminé que le pont est dupliqué en fin de mitose. Enfin, nous avons aussi montré que la déstabilisation du pont menant à sa rupture en mitose, dépend de la phosphorylation de Cdc31 par la kinase mitotique Cdk1. Lors de la seconde partie de ma thèse, je me suis intéressée au complexe Sfi1/Centrine dans les cellules humaines. J’ai confirmé que Sfi1 est localisée aux centrioles. De plus, j’ai montré que la déplétion de Sfi1 dans les cellules RPE1, conduit à une perte de localisation de la Centrine, suggérant soit un défaut de recrutement, soit une déstabilisation. De plus, en absence de Sfi1, les cellules RPE1 ne sont plus capables de former de cil primaire. Ce résultat suggère que Sfi1 et la Centrine sont requis pour la ciliogénèse. Enfin, j’ai aussi démontré que la déplétion deSfi1 induit un arrêt de cycle cellulaire dans les cellules non tumorales RPE1. Dans les cellules cancéreuses, HeLa, le cycle n’est pas arrêté mais j’ai pu observer une prolongation du temps de mitose. En conclusion mes travaux montrent que bien que la fonction de Sfi1/Centrin ne soit pas conservée, le complexe reste essentiel pour l’intégrité structurale et fonctionnelle du centrosome.

We study structured populations without interactions from a probabilistic and a statistical point of view. The underlying motivation of this work is the understanding of cell division mechanisms and of cell aging. We use the formalism of branching measure-valued Markov processes. In our model, each individual is characterized by a trait (age, size, etc...) which moves according to a Markov process. The rate of division of each individual is a function of its trait and when a branching event occurs, the trait of the descendants at birth depends on the trait of the mother and on the number of descendants. First, we study the trait of a uniformly sampled individual in the population. We explicitly describe the penalized Markov process, named auxiliary process, corresponding to the dynamic of the trait of a "typical" individual by giving its associated infinitesimal generator. Then, we study the asymptotic behavior of the empirical measure associated with the branching process. Under assumptions assuring the ergodicity of the auxiliary process, we prove that the auxiliary process asymptotically corresponds to the trait along its ancestral lineage of a uniformly sampled individual in the population. Finally, we address the problem of parameter estimation in the case of a branching process structured by a diffusion. We consider data composed of the trait at birth of all individuals in the population until a given generation. We give kernel estimators for the transition density and the invariant measure of the chain corresponding to the trait of an individual along a lineage. Moreover, in the case of a reflected diffusion on a compact set, we use maximum likelihood estimation to reconstruct the division rate. We prove consistency and asymptotic normality for this estimator. We also carry out the numerical implementation of the estimator., Cette thèse porte sur l'étude probabiliste et statistique de populations sans interactions structurées par un trait. Elle est motivée par la compréhension des mécanismes de division et de vieillissement cellulaire. On modélise la dynamique de ces populations à l'aide d'un processus de Markov branchant à valeurs mesures. Chaque individu dans la population est caractérisé par un trait (l'âge, la taille, etc...) dont la dynamique au cours du temps suit un processus de Markov. Ce trait détermine le cycle de vie de chaque individu : sa durée de vie, son nombre de descendants et le trait à la naissance de ses descendants. Dans un premier temps, on s'intéresse à la question de l'échantillonnage uniforme dans la population. Nous décrivons le processus pénalisé, appelé processus auxiliaire, qui correspond au trait d'un individu "typique" dans la population en donnant son générateur infinitésimal. Dans un second temps, nous nous intéressons au comportement asymptotique de la mesure empirique associée au processus de branchement. Sous des hypothèses assurant l'ergodicité du processus auxiliaire, nous montrons que le processus auxiliaire correspond asymptotiquement au trait le long de sa lignée ancestrale d'un individu échantillonné uniformément dans la population. Enfin, à partir de données composées des traits à la naissance des individus dans l'arbre jusqu'à une génération donnée, nous proposons des estimateurs à noyau de la densité de transition de la chaine correspondant au trait le long d'une lignée ainsi que de sa mesure invariante. De plus, dans le cas d'une diffusion réfléchie sur un compact, nous estimons par maximum de vraisemblance le taux de division du processus. Nous montrons la consistance de cet estimateur ainsi que sa normalité asymptotique. L'implémentation numérique de l'estimateur est par ailleurs réalisée.

International audience; The identification of the limits between the cell division, elongation and mature zones in the root apex is still a matter of controversy when methods based on cellular features, molecular markers or kinematics are compared while methods based on cell length profiles have been comparatively underexplored. Segmentation models were developed to identify developmental zones within a root apex on the basis of epidermal cell length profiles. Heteroscedastic piecewise linear models were estimated for maize lateral roots of various lengths of both wild type and two mutants affected in auxin signaling (rtcs and rum-1). The outputs of these individual root analyses combined with morphological features (first root hair position and root diameter) were then globally analyzed using principal component analysis. Three zones corresponding to the division zone, the elongation zone and the mature zone were identified in most lateral roots while division zone and sometimes elongation zone were missing in arrested roots. Our results are consistent with an auxin-dependent coordination between cell flux, cell elongation and cell differentiation. The proposed segmentation models could extend our knowledge of developmental regulations in longitudinally organized plant organs such as roots, monocot leaves or internodes.

Cells position their cleavage plane in a precise and predictable way. In particular, during the early embryogenesis, the cleavage pattern of the egg cell is extremely reproducible, yet sensitive to perturbation (shape manipulation,…), which suggests an intrinsic plasticity of the system. My PhD project is about the signals that determine the positions of the cleavage planes in the embryo, and their competition. First, I developed a model to predict division plane positioning from cell shape and possible additional cortical maternal polarity or inhomogeneous yolk/organelles distribution within the cytoplasm. This model is based on pulling forces exerted by interphase astral microtubules on the mitotic spindle/nucleus. Under the hypothesis that these forces depend on microtubule lengths (dynein in the cytoplasm), and are modulated by cortical polarity, it is then possible to find the equilibrium position of the spindle, that sets the future division plane. In addition, I reproduced the shapes and rearrangement of cells (blastomeres) within the embryo, with a program (The Surface Evolver) that minimizes surface energy under various constraints : here cell volumes, surface tensions and possible confinements. The modeling framework I used consisted in a loop between cell shape generation and division plane prediction (cell shape allows to predict cell division, that gives the daughter cells volumes and positions to generate the next cell shapes, and so on…). I could quantitatively reproduce four representative cleavage patterns (zebrafish, xenopus, sea urchin, ascidian), up to the 8 to 16-cell stage, in silico. I also tested the model on classic perturbation experiments in these four systems (Hertwig, Hörstadius, polarity ablation,…), and reproduced the observations of the literature. This first part suggests an auto-organization of these systems, and that the determination of the cleavage plane mainly depends on a limited number of signals. Second, I aimed at characterizing the competition between shape and maternal polarity cues, in a quantitative manner. This project comprises 3D imaging (positions of the centrosomes and division planes, polarity, blastomere shape), as well as experiments assessing the roles of blastomere shape/size and of polarity (blastomere separation, microchambers of different shapes, polarity inhibition,…). The results are compared to the predictions of the model, that now inputs the imaged blastomere shapes. These experimental results confirm the hypotheses of the in silico study, and allow assessing the robustness of the biological system to refine the model., Les cellules positionnent leur plan de division de manière précise et prévisible. En particulier au tout début de l’embryogenèse, la cellule-œuf suit un patron de clivage extrêmement reproductible, mais néanmoins sensible aux perturbations (manipulation de la forme de la cellule,…), ce qui suggère une plasticité intrinsèque du système. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux signaux qui déterminent la position des plans de division embryonnaires, et à leur compétition. Dans un premier temps, j’ai développé un modèle pour prédire le positionnement du plan de division à partir de la forme de la cellule, et de la présence éventuelle de polarité maternelle à la membrane ou d’une distribution inhomogène de yolk/organelles dans le cytoplasme. Ce modèle est basé sur les forces de traction exercées par les microtubules des astres interphasiques sur le fuseau mitotique/noyau. Sous l’hypothèse que ces forces dépendent de la longueur des microtubules (dynéine dans le cytoplasme) et sont modulées par la polarité membranaire, il est alors possible de trouver la position d’équilibre du fuseau, qui détermine le futur plan de division. J’ai également reproduit les formes et réarrangements des cellules (blastomères) dans l’embryon après la division, à l’aide d’un programme (The Surface Evolver) qui minimise l’énergie de surface sous différentes contraintes : ici les volumes, tensions de surface et éventuels confinements. En bouclant la génération des formes des blastomères avec la prédiction de leurs divisions (les formes permettent de prédire la division, qui permet de générer les formes des cellules filles, etc…), j’ai pu reproduire de manière quantitative quatre patrons de clivage représentatifs (poisson-zèbre, xenope, oursin, ascidie), jusqu’au stade 8 à 16 cellules, in silico. J’ai également testé le modèle sur des expériences classiques de perturbation dans ces quatre systèmes (Hertwig, Hörstadius, ablation de la polarité,…), et reproduit les observations de la littérature. Cette première partie suggère que ces systèmes sont auto-organisés et que la détermination du plan de division dépend principalement d’un nombre restreint de signaux. Dans un second temps, j’ai cherché à caractériser la compétition entre les signaux de forme et de polarité maternelle chez l’embryon d’oursin, de manière quantitative. Ce projet comprend une part importante d’imagerie 3D (position des centrosomes et division, polarité, forme des blastomères), ainsi que des expériences visant à tester le rôle de la forme/taille des blastomères et de la polarité (séparation des blastomères, microchambres de différentes formes, inhibition de la polarité,…). Les résultats obtenus sont comparés aux prédictions du modèle, cette fois basées sur la forme imagée des blastomères. Ces résultats expérimentaux confirment les hypothèses de l’étude in silico, et permettent d’évaluer la robustesse du système biologique pour affiner le modèle.

Alternatives to fossil fuel are one of the biggest challenges of the 21st century. Plants and microalgae are able to produce oil which is easily convertible in biodiesel. In order to optimise the biofuel production it is necessary to know the cellular mechanisms leading to the setting up of these storage lipids or TAG (Triacylglycerides). In its physiological condition, the lipid flux is naturally orientated towards the membrane lipid synthesis, which allows the creation of new membranes which occurs during the cell division. Nitrogen deficiency, a condition often encountered by plants and algae, is known to induce cell growth to slow down and an accumulation of TAG in microalgae models. Is the lipid flux, which is conventionally orientated towards new membrane synthesis, tipped over the storage lipid synthesis? To check this hypothesis, a range of compounds known to stop the cell growth was tested on the higher plant model Arabidopsis thaliana, according to a chemical genetic strategy. All treatments showed a rise of the TAG content associated to a cell growth inhibition. Among them, the methotrexate inhibit the dihydrofolate reductase enzyme involved in the C1 metabolism and induced a TAG accumulation up to 15 times the control. This treatment was compared to a nitrogen starvation condition, which in our experiments slowed down the cell growth and induced an increase of 60 times to the TAG content. The lipid profile analysis revealed that the nitrogen deficiency led to a decrease of membrane lipids -phospholipids and galactolipids, in favour to TAG, whereas the methotrexate treatment was not associated to any membrane remodelling. Nevertheless, both conditions shared similarities, as the modifications of the fatty acid insaturation profile and the expression of desaturase genes. The strong gene expression of Non Specific phospholipases C (NPC4/5) and pulse-chase experiments performed with a labelled phosphatidylcholine (PC), highlighted the predominant involvement of this phospholipid in the TAG production which occurs during the two treatments. In order to evaluate the NPC role in the storage lipid metabolism more closely, A. thaliana mutant lines for NPC4 and NPC5 (over-expressers and knock-out) were initiated. Microalgae are powerful models for the third generation of biofuels. For this reason we tested the impact of a nutrient deficiency as well as the effect of different growth inhibitors on the TAG accumulation in the marine microalgae Phaeodactylum tricornutum. Preliminary results suggested that the inhibitor sensibility can be different between diatoms and higher plants., Trouver des solutions aux carburants fossiles est un des grands challenges du XXIème siècle. Les plantes et les microalgues sont capables de produire de l’huile, facilement convertible en biodiésel. Afin d’optimiser la production de biocarburant, il est essentiel de connaitre les mécanismes cellulaires menant à la formation de ces lipides de réserve aussi appelés TAG (Triacylglycérides). En condition physiologique, le flux de lipide est naturellement orienté vers la synthèse de lipides membranaires qui permettent de créer de nouvelles membranes lors de la division cellulaire. Le manque de nutriments disponibles est une condition souvent rencontrée par les végétaux terrestres et les microalgues. Chez ces dernières, lors d’une en carence d’azote, la croissance cellulaire est ralentie et les TAG s’accumulent. Le flux de lipides, normalement orienté vers la synthèse de nouvelles membranes, est-il alors basculé vers la synthèse des lipides de réserve ? Pour vérifier cette hypothèse, une gamme de composés connus pour arrêter la croissance cellulaire a été testée sur la plante supérieure Arabidopsis thaliana selon une stratégie de génétique chimique. Quel que soit le traitement, l’inhibition de la croissance est toujours accompagnée par une augmentation de la teneur en TAG. Parmi les inhibiteurs, le méthotrexate, qui réprime l’enzyme dihydrofolate réductase impliquée dans le métabolisme C1, induit une augmentation des lipides de réserve jusqu’à 15 fois la valeur du contrôle. Ce traitement a été comparé à une carence en azote, qui dans nos conditions expérimentales, ralentie la croissance cellulaire et augmente d’un facteur 60 la teneur en TAG. L’analyse des profils lipidiques révèle que la déficience en azote engendre une diminution des classes de lipides membranaires -phospholipides et galactolipides, au profit des TAG, tandis que le traitement méthotrexate n’est pas associé à un remaniement membranaire. Néanmoins, les deux conditions partagent des similitudes, comme le taux d’insaturation des acides gras et l’expression des gènes des désaturases qui sont modifiés. La forte expression des gènes codant pour les Non Spécific Phospholipases C (NPC4/5), ainsi que des expériences de pulse-chase avec de la phosphatidylcholine (PC) marquée, ont mis en évidence que ce phospholipide est plus utilisé pour produire des TAG dans les deux traitements, qu’en condition contrôle. Afin d’évaluer plus finement l’importance des enzymes NPC4 et 5 dans le métabolisme d’accumulation des lipides de réserve, la construction de lignées mutantes d’A. thaliana (surexpresseur ou knock-out) a été amorcée. Les microalgues sont des modèles puissants pour les biocarburants de 3ème génération. Pour cette raison nous avons testé l’effet d’une déficience minérale et l’impact de différents inhibiteurs de croissance sur l’accumulation de TAG chez la microalgue Phaeodactylum tricornutum. Les résultats préliminaires suggèrent que la sensibilité aux inhibiteurs peut être différente chez les diatomées et les plantes supérieures.

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer., Polo-like kinases (PLK) play a crucial role during the cell cycle, especially in promoting essential processes such as M phase entry and mitotic exit. They are also involved in many cancers and are highly tumorigenic. Recently, our laboratory showed that Cdc5 (i.e., the Polo-kinase of Saccharomyces cerevisiae) was required for the adaptation response to DNA damage, and that the target of Cdc5 during this process would localize to the yeast centrosomes and might be a less conventional substrate. In order to identify it, an in vivo analysis of the whole phosphoproteome of PLK/Cdc5 by mass spectrometry has to be to done. Accordingly, a thermosensitive allele of CDC5, i.e. a mutant version that can be inactivated at high temperature, has to be used. This allele has to be thermosensitive at 30°C, in order to make sure that only cdc5 will be inactivated and that only its substrates will be identified. For this purpose, we created two cdc5 alleles that were thermosensitive at 30°C: cdc5-17 and cdc5-18, and then we analyzed their cell cycle at 32°C. The results of this analysis showed that cells exposure to 32°C resulted in their arrest at the end of the cell cycle as large-budded cells, which points towards a defect in the promotion of mitosis exit. This defect is due to the mutation of CDC5 whose protein allows the exit from mitosis via two pathways: the MEN pathway (Mitotic Exit Network) and the FEAR pathway (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 and cdc5-18 represent precious biological tools that will allow us to analyze PLK/Cdc5 phosphoproteome and to identify Cdc5 targets during the adaptation response to DNA damage. Since the adaptation to DNA damage caused by chemotherapeutic agents is considered one of the factors promoting cancer tumors proliferation, this discovery will be a huge step in the fight against cancer.

Escherichia coli, as the majority of bacteria, has a unique circular chromosome. Faithfull cell proliferation requires that a least one copy of the chromosome is transmitted to sister cells prior to cell division. A strict temporal and spatial coupling of chromosome segregation with cell division is thus required to ensure the accurate separation of the two fully replicated chromosomes. The terminal region of the chromosome (ter) is the last one to be replicated and segregated, and moves from the pole to the middle of the cell where the division septum is formed, at the end of the cell cycle. Loci of the ter region display an extended cohesion period. This extended cohesion is controlled by the MatP protein, which binds specific matS sites restricted to the ter region. MatP binds DNA as a dimer and forms tetramers via its N-terminal and C-terminal domains respectively. Tetramerisation is stimulated by binding to DNA and pairs remote matS sites. MatP also interacts with ZapB, a component of the divisome, the protein machinery that contributes to septum formation. While tetramerisation of MatP appears important for compacting the ter region, its interaction with ZapB, which is localized at the septum via ZapA and FtsZ, is involved in the positioning and the extended cohesion of this region. The linkage of the ter region with the divisome is required for the success of many later events of the cell cycle : (i) the active, ordered and progressive segregation of the ter region by FtsK, a component of the divisome, (ii) resolution of chromosome dimers via the site-specifique recombination XerCD/dif, activated by FtsK, (iii) the resolution of intercatenation links by TopoIV and (iv) the positive regulation of divisome assembly in the absence of the negative regulators MinCDE and SlmA. During my thesis, I first studied the role of MatP in the chromosome management. By using pairs of loci tagged with parSp1 and parSpMT1 sites recognized by cognate ParB-XFP proteins, we directly analysed chromosome positioning and orientation in the cell. We show that MatP is required for normal positioning and orientation of the whole chromosome at the end of the cell cycle. The localisation of SlmA in wt and Delta matP strains proves that inactivation of MatP leads to inaccuracy of nucleoid positioning accompanied by defects in SlmA localisation, and thus induces division inhibition. Take together, these results show that MatP, SlmA and their interplay are important for chromosome management and control of cell division in E. coli. In collaboration with O. Espeli's team, we have used genomic and molecular biology methods to characterize TopoIV regulation during the E. coli cell cycle. We show that at the dif site, TopoIV binging and cleavage are enhanced by the presence of the XerCD recombinases and MatP. This enhancement of TopoIV activity at dif promotes decatenation of fully replicated chromosomes and ensure, through interaction with other processes, accurate separation of sister chromosomes. These results provide insight into the protein network dedicated to the final step of chromosome management during the cell cycle, and how the chromosome management is linked to cell division.; Escherichia coli, comme la majorité des bactéries, possède un unique chromosome circulaire. Au moins une copie du chromosome doit être transmise à chacune des cellules filles avant la division cellulaire afin d'assurer une prolifération cellulaire correcte. Une couplage spatio-temporel précis de la ségrégation avec la division cellulaire est donc nécessaire pour assurer la bonne répartition des deux chromosomes après réplication. La région terminale du chromosome (ter) est la dernière à être répliquée et ségrégée, et migre du pôle vers le centre de la cellule au moment de la mise en place du septum de division, à la fin du cycle cellulaire. Les loci de la région ter présentent une période de cohésion post-réplicative étendue. Cette cohésion étendue est contrôlée par la protéine MatP, qui se fixe spécifiquement au niveau des sites matS, présents uniquement dans ter. MatP se fixe à l'ADN sous forme de dimère, via son domaine N-terminal, et tétramérise via son domaine C-terminal. La tétramérisation est stimulée par la liaison à l'ADN et permet le pontage de deux sites matS distants. MatP interagit aussi avec ZapB, un composant du divisome, la machinerie protéique participant à la formation du septum. Alors que la tétramérisation de MatP semble importante pour la compaction de la région ter, son interaction avec ZapB, qui est localisée au septum via ZapA et FtsZ, participe au positionnement et à la cohésion étendue de cette région. Le couplage de la région ter avec le divisome est essentiel pour le bon déroulement de nombreux évènements tardifs du cycle cellulaire : (i) la ségrégation active, ordonnée et progressive de la région ter par FtsK, un composant du divisome, (ii) la résolution des dimères de chromosomes via la recombinaison spécifique de site XerCD/dif, activée par FtsK, (iii) la résolution des liens d'intercaténation par la TopoIV et (iv) la régulation positive de l'assemblage du divisome en absence des régulateurs négatifs MinCDE et SlmA. Pendant ma thèse, je me suis tout d'abord intéressée au rôle de MatP dans la structuration globale du chromosome. En utilisant un système permettant de visualiser deux loci marqués avec un site parSp1 et un site parSpMT1, reconnu par ParBp1 et ParBpMT1 spécifiquement, nous avons analysé le positionnement et l'orientation du chromosome dans la cellule. Nous avons montré que MatP est nécessaire au positionnement et à l'orientation de tout le chromosome à la fin du cycle cellulaire. La localisation de SlmA dans des souches wt et DeltamatP prouve que l'inactivation de MatP, induisant une mauvais positionnement du chromosome, s'accompagne d'une défaut de localisation de SlmA, et induit donc une inhibition de la division. Ces résultats pris ensemble montre que MatP, SlmA et leur communication à travers la structuration globale du chromosome sont importants pour le management du chromosome et le contrôle de la division cellulaire. En collaboration avec l'équipe d'Olivier Espeli, nous avons utilisé des méthodes de génomiques et de biologie moléculaire pour caractériser la régulation de la TopoIV au cours du cycle cellulaire d'E. coli. Nous avons montré qu'au site dif, les activités de fixation et de clivage de la TopoIV sont améliorées par la présence des recombinases XerCD et de MatP. L'amélioration de l'activité de la TopoIV favorise la décaténation des chromosomes nouvellement répliqués et assure, en lien avec d'autres processus, la séparation précise des chromosomes frères. Ces résultats permettent de mieux comprendre le réseau d'interactions dédiées au management du chromosome à la fin du cycle cellulaire, et l'influence du management du chromosome sur le contrôle de la division cellulaire.

During epithelial cytokinesis, the remodelling of adhesive cell-cell contacts between the dividing cell and its neighbours has profound roles in the integrity, the arrangement and morphogenesis of proliferative tissues. In both vertebrates and invertebrates, this remodelling requires the activity of non-muscle Myosin II (MyoII) in the interphasic cells neighbouring the dividing cells. However, the mechanisms coordinating cytokinesis and MyoII activity in the neighbours are unknown. Here, we found that, in the Drosophila notum epithelium, each cell division is associated with a mechano-sensing and transmission event controlling MyoII dynamics in the neighbours. We established that the ring pulling forces promote local junction elongation, resulting in a decrease of E-Cadherin (E-Cad) concentration at the ingressing adherens junction (AJ). In turn, the local reduction of E-Cad concentration and the contractility of the neighbouring cells promote self-organized actomyosin flows, ultimately leading to MyoII accumulation at the base of the ingressing AJ. While mechano-sensing has been extensively studied in the context of AJ reinforcement to stabilize the adhesive cell-cell contacts, we propose an alternative mechano-sensing mechanism able to coordinate actomyosin dynamics between epithelial cells and to sustain AJ remodelling in response to mechanical forces.; Au sein d'un tissu épithélial la division cellulaire doit être couplée à la formation de nouvelles jonctions intercellulaires entre les futures cellules-filles, afin de préserver l'intégrité du tissu et maintenir son adhésion et polarité. Chez les vertébrés et les invertébrés, lors de la constriction de l'anneau contractile les jonctions assemblées entre la cellule en division et ses voisines est remodelé. Concomitamment, la myosine non-musculaire II (MyoII) s'accumule dans les cellules voisines y produit la force nécessaire pour juxtaposer les membranes de la cellule en division, définissant ainsi la longueur de la future jonction formée entre les cellules-filles. Dans le cadre de mes travaux de doctorat, j'ai cherché à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au dialogue entre les cellules épithéliales pendant la division. J'ai montré que chaque division cellulaire est associée à un processus de mécano-transduction qui contrôle la dynamique de la MyoII dans les cellules voisines. Les forces produites par l'anneau contractile allongent localement la membrane des voisines diluant ainsi la concentration d'E-Cadhérine (E-Cad). En retour, cette réduction locale d'E-Cad, couplée à la contractilité intrinsèque des cellules voisines, génère des flux auto-organisés d'actine et myosine, qui conduisent à l'accumulation de MyoII dans les cellules voisines. En montrant que la cytocinèse épithéliale est une source endogène de contraintes mécaniques, mon travail définit un nouveau mécanisme de mécano-transduction qui coordonne les dynamiques d'actine et myosine dans les cellules en division et leurs voisines, et qui est permet de plus le remodelage des jonctions adhérentes.

Regeneration of a tissue damaged by injury represents a physiological response for organ recovery(1-3). Although this regeneration process is conserved across multicellular taxa, plants appear to display extremely high regenerative capacities, a feature widely used in tissue culture for clonal propagation and grafting(4,5). Regenerated cells arise predominantly from preexisting populations of division-competent cells(6,7); however, the mechanisms by which these cells are triggered to divide in response to injury remain largely elusive(8). Here, we demonstrate that the heterodimeric transcription factor complex ETHYLENE RESPONSE FACTOR115 (ERF115)-PHYTOCHROME A SIGNAL TRANSDUCTION1 (PAT1) sustains meristem function by promoting cell renewal after stem cell loss. High-resolution time-lapse imaging revealed that cell death promotes ERF115 activity in cells that are in direct contact with damaged cells, triggering divisions that replenish the collapsed stem cells. Correspondingly, the ERF115-PAT1 complex plays an important role in full stem cell niche recovery upon root tip excision, whereas its ectopic expression triggers neoplastic growth, correlated with activation of the putative target gene WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION1 (WIND1)(9). We conclude that the ERF115-PAT1 complex accounts for the high regenerative potential of plants, granting them the ability to efficiently replace damaged cells with new ones.

The fruit is a specialized organ which results from the development of the ovary after successful flower pollination and fertilization and provides a suitable environment for seed maturation and seed dispersal mechanisms. Due to their importance in human nutrition and their economic inference, fleshy fruit species have been the subject of developmental studies, especially using tomato (Solanum lycopersicum Mill.) as a model species due to its favourable biological cycle and all the available genetic and molecular resources. Tomato fruit growth results from the interplay between cell division and cell expansion. These two developmental processes are under the control of complex interactions between internal signals (due to hormones) and external factors (carbon partitioning, environmental influences), which altogether contribute to the establishment of crucial determinants for fruit quality such as the final size, weight and shape of fruits as well as the organoleptic and nutritional traits of the ripe fruit. This chapter aims at describing recent advances in the knowledge of molecular breeding applied to modify tomato fruit growth.

The coordinated pattern of cell division and cell expansion during fruit set and fruit growth in tomato pericarp. Fruit Structure 2015

Key message Hypocotyl semi-dwarfism in BP was only due to less cell number. Daylight was required to inhibit cell division in the mutant. ABA, IAA and cytokinins would be involved. Abstract Coffea arabica 'Laurina' is a natural mutant of Coffea arabica 'Bourbon' (B) and is known under the trade name 'Bourbon Pointu' (BP). Under daylight, the laurina mutation leads to pleiotropic effects, including semi-dwarf hypocotyls. At the opposite, semi-dwarfism of BP seedlings disappeared under darkness conditions. The first step was to describe the morphological impact of the mutation in seedlings growing under daylight by comparison with seedlings growing under darkness. As the hypocotyl length was mainly affected, the second step was to investigate histological modifications in the organ comparing B and BP seedlings growing under daylight. Result of this investigation indicated that the mutation does not impact on cell length. Moreover, cytometry analyses showed absence of endoreduplication. Actually, the mutation influenced the cell number and this effect appeared before the 40th day after sowing. The length difference of hypocotyls between B and BP was due to lower cell number in BP, indicating possible involvement of phytohormones. Investigations showed the decrease of cytokinin and auxin levels in BP compared to B, while the cytokinin/auxin ratio remained constant in both varieties. By contrast, abscisic acid content increased in BP. Concurrently these results indicate the lowering of cell division, due to the mutation.

Cells within an organism successfully divide to ensure growth, differentiation and homeostasie. Recent work suggests that dividing cells actively communicate with neighbours thus spatially and temporally coordinating cell division while maintaining tissue cohesiveness. We hypothesized that Eph-ephrin signalling, a local cell-cell signalling pathway, could participate in coordinating cell division within a tissue. Using vertebrate and invertebrate cell culture models I showed that Eph-signalling controls cell division and induces delay in the abscission of nascent daughter cells as well as polyploidy. Using time-lapse imaging I proved that the Eph-mediated abscission failure depends on the catalytic activity of the receptor via the non receptor tyrosine kinase relay molecule c-Src. Downstream of Eph signalling c-Src phosphorylates the protein citron kinase (CitK) a well known regulator of intercellular bridge stability. I also observed that CitK was abnormally localized during cytokinesis when Eph signalling was active. Further, using in vitro kinase assays, I demonstrated that Eph does not directly phosphorylate CitK but that c-Src could do so. In addition, using Mass Spectrometry I mapped all tyrosine residues directly phosphorylated by c-Src. I mutated two of them located in the Rho binding domain of CitK and demonstrated that phosphorylation of those residues are necessary and sufficient to induce cytokinesis failure. I validated in vivo this novel role of Eph-ephrin signalling in a physiological context in the developing mouse neocortex. Members of the Eph/ephrin family are expressed in neural progenitors that give rise to neurons of the cortex upon neurogenic division. Importantly, CitK has been shown by others to control cytokinesis of these progenitor cells. Using the Cre-lox system, I specifically turned off Eph forward signalling in neural progenitor cells and observed an alteration of neuronal ploidy in these mutant animals. Further, I also observed that CitK which adopts a particular apical localisation in neural progenitors physiologically co-localized with phosphorylated tyrosine residues. Altogether, these results suggest that Eph-ephrin signalling controls abscission of neural progenitors by promoting phosphorylation of CitK. The textbook view of cytokinesis is that it is a cell autonomous event orchestrated by the intracellular machinery. Data obtained during my PhD suggest that cytokinesis is also regulated by local environment, here Eph/ephrin signalling, and that phosphorylation of CitK may represent a molecular switch in the normal progression of cell division and in the control of neuronal ploidy.; Au sein d'un organisme les cellules se divisent et assurent la croissance, la différentiation et l'homéostasie des tissus. Des travaux récents proposent qu'elles communiquent activement entre voisines au sein des organes solides pour coordonner leur propre division et la préservation de l'intégrité tissulaire. Nous proposons que la signalisation Eph-éphrine, acteur de la communication cellulaire locale, participe à cette coordination entre division cellulaire et cohésion du tissu. Au cours de ma thèse, j'ai démontré dans plusieurs modèles cellulaires que la signalisation Eph-éphrine contrôle la division cellulaire et peut induire des retards dans l'abscission et de la polyploïdie. J'ai prouvé par vidéomicrosocpie que ces défauts d'abscission dépendent du domaine catalytique du récepteur EphB2 et de l'activation de la protéine tyrosine kinase relais c-Src. En cascade, c-Src phosphoryle un régulateur clé de la stabilité du pont intercellulaire, la protéine citron kinase (CitK). J'ai également observé que CitK était anormalement localisé durant la cytocinése en aval de la voie Eph. Par des essais kinase in vitro, j'ai exclu une phosphorylation directe de CitK par le récepteur Eph et identifié c-Src comme capable de phosphoryler directement CitK. J'ai identifié les résidus tyrosines de CitK phosphorylés par c-Src, mutés deux d'entre eux et à l'aide d'analyses de sauvetage phénotypique, démontré que ces résidus étaient nécessaires et suffisants pour induire des défauts d'abscission. J'ai ensuite validé in vivo ce rôle original de la voie Eph-éphrine, dans le contexte du développement neuronal chez la souris. Plusieurs membres de la famille des Eph-éphrines sont exprimés dans les progéniteurs neuraux à l'origine des neurones corticaux et des auteurs ont montrés que CitK contrôle la cytocinèse de ces cellules. En utilisant un système Cre-lox, j'ai spécifiquement éteint la signalisation Eph dans ces progéniteurs et observé une modification de la ploïdie neuronale dans ces animaux. J'ai également observé dans les progéniteurs neuraux une co-localisation physiologique de résidus tyrosines phosphorylés et de la protéine CitK, qui adopte un enrichissement apical caractéristique. Ces résultats suggèrent notamment que la signalisation Eph-éphrine pourrait contrôler l'abscission des progéniteurs neuraux via la phosphorylation de CitK. La cytocinèse est aujourd'hui décrite comme un processus cellulaire autonome orchestré par la machinerie intracellulaire. Les résultats obtenus durant mon doctorat suggèrent que la cytocinèse est également régulée par l'environnement local de la cellule comme j'en ai fait la démonstration avec la signalisation Eph-éphrine. D'autre part, mes travaux suggèrent que la phosphorylation de CitK sert d'interrupteur moléculaire durant la progression à travers la division cellulaire et le contrôle de la ploïdie des neurones.

A multi-scale pipeline for reproducible analyses of tomato leaf expansion and its plasticity in response to drought. 10. International Symposium on Modelling in Fruit Research and Orchard Management

La division cellulaire est un processus fondamental des êtres vivants. À chaque division cellulaire, le matériel génétique d'une cellule mère est dupliqué et ségrégé pour produire deux cellules filles identiques; un processus nommé la mitose. Tout d'abord, la cellule doit condenser le matériel génétique pour être en mesure de séparer mécaniquement et également le matériel génétique. Une erreur dans le niveau de compaction ou dans la dynamique de la mitose occasionne une transmission inégale du matériel génétique. Il est suggéré dans la littérature que ces phénomènes pourraient causé la transformation des cellules cancéreuses. Par contre, le mécanisme moléculaire générant la coordination des changements de haut niveau de la condensation des chromosomes est encore incompris. Dans les dernières décennies, plusieurs approches expérimentales ont identifié quelques protéines conservées dans ce processus. Pour déterminer le rôle de ces facteurs dans la compaction des chromosomes, j'ai effectué un criblage par ARNi couplé à de l'imagerie à haute-résolution en temps réel chez l'embryon de C. elegans. Grâce à cette technique, j'ai découvert sept nouvelles protéines requises pour l'assemblage des chromosomes mitotiques, incluant la Ribonucléotide réductase (RNR) et Topoisomérase II (topo-II). Dans cette thèse, je décrirai le rôle structural de topo-II dans l'assemblage des chromosomes mitotiques et ces mécanismes moléculaires. Lors de la condensation des chromosomes, topo-II agit indépendamment comme un facteur d'assemblage local menant par la suite à la formation d'un axe de condensation tout au long du chromosome. Cette localisation est à l'opposé de la position des autres facteurs connus qui sont impliqués dans la condensation des chromosomes. Ceci représente un nouveau mécanisme pour l'assemblage des chromosomes chez C. elegans. De plus, j'ai découvert un rôle non-enzymatique à la protéine RNR lors de l'assemblage des chromosomes. Lors de ce processus, RNR est impliqué dans la stabilité des nucléosomes et alors, permet la compaction de haut niveau de la chromatine. Dans cette thèse, je rapporte également des résultats préliminaires concernant d'autres nouveaux facteurs découverts lors du criblage ARNi. Le plus important est que mon analyse révèle que la déplétion des nouvelles protéines montre des phénotypes distincts, indiquant la fonction de celles-ci lors de l'assemblage des chromosomes. Somme toute, je conclus que les chromosomes en métaphase sont assemblés par trois protéines ayant des activités différentes d'échafaudage: topoisomérase II, les complexes condensines et les protéines centromériques. En conclusion, ces études prouvent le mécanisme moléculaire de certaines protéines qui contribuent à la formation des chromosomes mitotiques., Cell division is a fundamental process that continuously happens in all living organisms. In each cell division, genetic material of the parent cell duplicates and segregates to produce genetically identical daughter cells in a process called mitosis. Cells need to condense their genetic material to be able to partition them equally. Any subtle defects, either timing or compaction level, could lead to the unequal inheritance of genetic material, a phenomenon that is believed to be the leading cause of cancerous transformation. However, the precise molecular mechanisms underlying the coordinated changes of higher-order chromosome structure are poorly understood. In the last two decades, various approaches have identified several conserved factors required for chromosome condensation. To define the roles of known and novel factors in this process, I performed an RNAi based screen using high-resolution live imaging of the C. elegans one-cell embryo. Importantly, using an in vivo approach, I discovered seven novel factors required for mitotic chromosome assembly, including Ribonulceotide reducatase (RNR) and DNA topoisomerase II (topo-II). In this thesis, I report a structural role for topo-II in mitotic chromosome assembly and underlying molecular mechanisms. During chromosome condensation process, topo-II acts independently as a local assembly factor leading to global chromosome axis formation, contradicting models that chromosomes organize around preassembled scaffolds, thus representing a novel pathway for chromosome assembly in C. elegans. Furthermore, I also discovered a non-enzymatic role of RNR in the mitotic chromosome assembly process. During this process, RNR is involved in nucleosome stability, and thereby, it allows higher-order chromatin assembly. In this thesis, I also report preliminary data for other novel factors that I discovered in the RNAi based screen for factors involved in chromosome condensation. Importantly, my analyses revealed that the depletion of several proteins results in distinct chromosome condensation phenotypes, indicating that they function in discrete events during mitotic chromosome assembly. In sum, I conclude that metaphase chromosomes are built by the distinct scaffolding activities of three proteins: DNA topoisomerase II, condensin complexes and centromere proteins. Taken together, these studies provide underlying molecular mechanisms contributing to the mitotic chromosome formation.