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La contaminación de productos agrícolas y pecuarios con aflatoxinas (AF) está distribuida mundialmente. Las AF son tóxicas, inmunodepresoras y carcinogénicas, pero en México es escasa la información sobre Aspergillus flavus, principal hongo que las produce. El objetivo fue caracterizar morfológica, molecular y aflatoxigénicamente aislados de A. flavus y cuantificar AF en pienso y en leche de vacas Holstein en Aguascalientes (México). Se seleccionó por conveniencia una unidad de producción lechera (2,749 vacas) y se recolectaron muestras mensuales (24 meses) de ingredientes alimenticios y ración total mezclada (n= 267), leche cruda (n= 288) y suelo agrícola (n= 40), las cuales se cultivaron (PDA) mediante vaciado en placa con diluciones seriadas. Los hongos se caracterizaron mediante MEB, TLC y vapores de amonio en agar coco; se secuenciaron los genes de calmodulina y regulador de la ruta biosintética de AF, así como la región de los espaciadores internos de la transcripción. Se cuantificaron AF en pienso con HPLC y en leche con ELISA. Se caracterizaron molecularmente 283 aislados fúngicos; 88 resultaron ser Aspergillus spp, de los que 5 fueron A. flavus con capacidad aflatoxigénica y uno no aflatoxigénico. El 99.3 % de las muestras de alimento y 39.9 % de las muestras de leche presentaron niveles detectables de AF (14.8 y 0.021 µg/kg). Las vacas ingirieron diariamente 621 µg de AF y eliminaron el 0.09 % como aflatoxina M1 en leche. Lo anterior sugiere que la ocurrencia A. flavus aflatoxigénico en el alimento de vacas lecheras conduce a una amplia contaminación por AF de las dietas y de la cadena alimenticia.