Search

Optički čisti spojevi su vrijedni prekursori u farmaceutskoj industriji. Fluorirani spojevi su aktivne tvari u mnogim lijekovima, stoga su nove mogućnosti sinteze fluoriranih kiralnih graĎevnih blokova posebno zanimljive i vrijedne. U ovom radu sintetizirana su tri racemična derivata 1-fluorpropan-2-ola koji su supstituirani u položaju 3 azido (1a), cijano (2a) skupinom i klorom (3a) te su korišteni kao supstrati za kinetičku rezoluciju kataliziranu lipazama. Pripravljeni su i odgovarajući racemični acetati alkohola (1b-3b) kao standardi. U ovim reakcijama ispitano je pet različitih lipaza. Najaktivnije i najselektivnije lipaze za pojedini alkohol testirane su u različitim organskim otapalima. Lipaze su pokazale nisku do srednje visoku enantioselektivnost prema ispitanim supstratima (E = 1 – 44). U preparativnim reakcijama kataliziranim lipazama najviše enantioselektivnosti, pripravljeni su enantiomerno obogaćeni produkti: (R)-1a (ev = 65 – 85 %), (S)-1b (ev = 92 %), (R)-2a (ev = 84 %), (S)-2b (ev = 68 %) te smjesa (S)-3a (ev = 30 %) i (R)-3b (ev = 69 %). Optically pure compunds are valuable precursors in pharmaceutical industry. Active ingridients in many drugs are fluorinated compounds, therefore the new possibilities in synthesis of fluorinated chiral building blocks are especially interesting and valuable. In this thesis three racemic derivatives of 1-fluoropropan-2-ol were synthesized, substituated at position 3 with azide (1a), cyanide (2a) and chloride (3a) and used as substrates in lipasecatalyzed kinetic resolution. Corresponding racemic acetates were prepared (1b-3b) as standards. Five different lipases were tested. Lipase with highest activity and selectivity with each alcohol was tested in different organic solvents. Lipases have shown low to high enantioselectivity toward supstrates (E = 1 – 44). In preparative-scale reactions catalysed by lipases with highest enantioselectivity, enantiomerically enriched products were prepared: (R)-1a (ee = 65 – 85 %), (S)-1b (ee = 92 %), (R)-2a (ee = 84 %), (S)-2b (ee = 68 %), and mixture of (S)-3a (ee = 30 %) and (R)-3b (ee = 69 %).

Optički čiste tvari su vrijedni prekursori u farmaceutskoj industriji i industriji finih kemikalija, stoga pretvorba racemičnih smjesa u enantiomerno čiste produkte predstavlja izazov. Jedna od metoda deracemizacije je dinamička kinetička rezolucija (DKR) koja se zasniva na kinetičkoj rezoluciji u kombinaciji s in situ racemizacijom sporije reagirajućeg enantiomera supstrata. Halogenhidrin dehalogenaze (HHDH) u metaboličkim putovima kataliziraju reverzibilnu dehalogenaciju vicinalnih halogenhidrina do epoksida. U radu je razvijen matematički model DKR rac-2-bromometil-2-metil-oksirana i dobivanja (S)-5-bromometil-5-metiloksazolidin-2-ona uz enzim HheC iz Agrobacterium radiobacter AD1. Ispitivana DKR se sastoji od tri reakcijska stupnja: i. favorizirano nastajanje (S)-oksazolidinona reakcijom (S)-epoksida i cijanatnih iona, ii. nastajanje 1,3-dibromo-2-metil-2-propanola iz (R)-epoksida i bromidnih iona, te iii. nastajanje rac-epoksida iz dibromoalkohola. Matematički model sastoji se od kinetičkog modela i bilanci tvari u reaktoru. Određivanjem kinetike reakcije DKR utvrđen je različit afinitet enzima prema enantiomerima. U i. stupnju reakcije za (S)-epoksid utvrđeno je da supstrati prate Michaelis-Menteničinu kinetiku uz inhibicijski učinak (S)-epoksida na enzim pri višim koncentracijama. Za (R)-epoksid utvrđeno je da prati kinetiku 1. reda, a cijanatni ioni Michaelis-Menteničinu kinetiku. Bromidni ioni te suprotni enantiomeri epoksida u oba slučaja imaju inhibicijski učinak na enzim. U ii. stupnju DKR oba epoksida prate kinetiku 1. reda, a bromidni ioni Michaelis-Menteničinu kinetiku uz inhibiciju u slučaju (S)-epoksida. U slučaju (S)-epoksida također postoji inhibicijski učinak suprotnim enantiomerom i cijanatnim ionima. Otkriveno je da je reakcija zatvaranja dibromoalkohola odnosno iii. stupanj DKR spontan kemijski proces pri kojem rac-epoksid nastaje prema kinetici 1. reda. Optički čisti (S)-5-bromometil-5-metiloksazolidin-2-on može se dobiti uz pažljivo odabrane reakcijske uvjete. DKR je potrebno provoditi pri niskim koncentracijama rac-epoksida, radi inhibicije supstratom (S)-epoksidom u i. stupnju, te niskim koncentracijama bromidnih iona, koje su dovoljne za provođenje ii. stupnja i ne inhibiraju enzim u i. stupnju. Optically pure compounds are valuable precursors in pharmaceutical and fine chemicals industry, so the conversion of racemic mixtures to enantiomerically pure products represents a challenge. One of the deracemization methods is the dynamic kinetic resolution (DKR) which couples a kinetic resolution with in situ racemization of the slower reacting substrate enantiomer. Halohydrin dehalogenases (HHDH) in metabolic pathways catalyze the reversible dehalogenation of vicinal halohydrin to epoxide. In this paper, a mathematical model of rac-2-bromomethyl-2-methyl-oxirane DKR has been developed to obtain (S)-5-bromomethyl-5-methyloxazolidin-2-one with the HheC enzyme from Agrobacterium radiobacter AD1. The examined DKR consists of three reaction steps: i. favored formation of (S)-oxazolidinone in (S)-epoxide and cyanate ions reaction; ii. the formation of 1,3-dibromo-2-methyl-2-propanol in (R)-epoxide and bromide ions reaction; and iii. the formation of rac-epoxide from dibromo-alcohol. The mathematical model consists of the kinetic model and the mole balance in the reactor. By determining the DKR reaction kinetics, different affinity of the enzyme towards the enantiomers has been observed. In the i. reaction step for (S)-epoxide, it has been determined that both substrates follow Michaelis-Menten kinetics with the inhibitory effect on the enzyme at higher concentrations of the (S)-epoxide. The (R)-epoxide follows the first-order kinetics and the cyanate ion Michaelis-Menten kinetics. Bromide ions and the opposite epoxide enantiomers in both cases have an inhibitory effect on the enzyme. In the ii. reaction step both epoxides follow first-order kinetics and the bromide ions follow Michaelis-Menten kinetics with the inhibitory effect in the case of (S)-epoxide. In the case of (S)-epoxide enzyme inhibition with another enantiomer and cyanate ion is present as well. It has been found that the reaction of dibromo-alcohol closure, i.e. iii. reaction step, is a spontaneous chemical process in which rac-epoxide is formed by first-order kinetics. Optically pure (S)-oxazolidinone can be obtained with carefully selected reaction conditions. DKR should be carried out at low concentrations of the rac-epoxide, because of the (S)-epoxide substrate inhibition in the i. reaction step, and low concentrations of bromide ions, which should be sufficient enough to perform the ii. reaction step and which do not inhibit the enzyme in the i. step.

Dinamička kinetička rezolucija (DKR) jedna je od metoda koje se mogu primijeniti za deracemizaciju racemata. Zasniva se na kombinaciji kinetičke rezolucije (KR) uz in situ racemizaciju sporije reagirajućeg enantiomera. Enzimski katalizirana racemizacija je vrlo pogodna metoda za DKR jer se izvodi pri sobnoj temperaturi, neutralnom pH, atmosferskom tlaku i visoke je kemoselektivnosti. Halogenhidrin dehalogenaze su jedinstveni enzimi koji istovremeno kataliziraju racemizaciju i kinetičku rezoluciju određenih supstrata. [1] U reakciji 2-metil epibromhidrina (rac-1a) s natrijevim cijanatom, kataliziranoj s halogenhidrin dehalogenazom iz Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC), kao produkt nastaje 2- oksazolidinon (S)-2a u iskorištenju od 47 % i 98 % ev. [2] Primijetili smo da kada je u reakcijskoj smjesi prisutna mala količina bromida, dolazi do brze racemizacije sporije reagirajućeg enantiomera epoksida te istovremeno do 100 %-tne konverzije u 2-oksazolidinon. Kao rezultat DKR spoj (S)-2a izoliran je u iskorištenju od 87 % i 99, 5 % ev. Po prvi put je na preparativnoj skali pripravljen i 2-oksazolidinon (S)-2b u reakciji epibromhidrina s natrijevim cijanatom kataliziranoj halogenhidrin dehalogenazom HheC. Spoj (S)-2b je izoliran u iskorištenju od 97 % i 89, 5 % ev. [1] J. H. Lutje Spelberg, L. Tang, R. Kellogg, D. B. Janssen, Tetrahedron: Asymmetry. 15 (2004) 1095-1102. [2] M. Majerić Elenkov, L. Tang, A. Meetsma, B. Hauer, D. B. Janssen, Org. Lett. 10 (2008) 2417- 2420.

Kvantitativna transformacija smjese enantiomera u produkt koji sadrži samo jedan enantiomer predstavlja velik izazov u asimetričnoj sintezi. Dinamička kinetička rezolucija (DKR) je metoda koja se može koristiti za deracemizaciju racemata, a bazira se na kinetičkoj rezoluciji (KR) u kombinaciji s in situ racemizacijom sporije reagirajućeg enantiomera. Enzimski katalizirana racemizacija je dobar izbor za dinamičku kinetičku rezoluciju jer se izvodi pri sobnoj temperaturi, neutralnom pH, atmosferskom tlaku i visoke je kemoselektivnosti. Halogenhidrin dehalogenaze su jedinstveni enzimi koji simultano kataliziraju racemizaciju i kinetičku rezoluciju određenih supstrata, derivata epihalogenhidrina poput epibromhidrina i epiklorhidrina. [1] U reakciji 2-metil epibromhidrina (1) s cijanatom, kataliziranoj s halogenhidrin dehalogenazom iz Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC), kao produkt nastaje 2-oksazolidinon (S-2) u iskorištenju od 47 % i visoke enantiomerne čistoće, 98% ev. [2] Kada je u reakcijskoj smjesi prisutna mala količina natrijevog bromida, dolazi do brze racemizacije sporije reagirajućeg enantiomera supstrata te istovremeno do 100%-tne konverzije epoksida u 2- oksazolidinon. Kao rezultat dinamičke kinetičke rezolucije S-2 je izoliran u iskorištenju od 90% i 99, 5% ev.

Halogenhidrin dehalogenaze su enzimi koji kataliziraju otvaranje epoksida malim nukleofilima kao što su azid, nitrit ili cijanid. Također sudjeluju u reakcijama zatvaranja halogenalkohola u epoksid. U ovom radu ispitan je mutant halogenhidrin dehalogenaze HheC2360 kao biokatalizator za sintezu β-azidoalkohola iz aromatskih epoksida uz azid kao nukleofil. Standardnim kemijskim metodama pripravljen je niz racemičnih aromatskih epoksida i bromoalkohola kao supstrata te azidoalkohola kao očekivanih produkata enzimskih reakcija. Provedene su reakcije otvaranja epoksida enzimski i neenzimski. Pokazalo se da HheC2360 katalizira azidolizu 2-(4- nitrofenil)oksirana, 4-(oksiran-2-il)benzonitrila te 2-(oksiran-2-il)piridina potpuno regioselektivno uz nastanak sekundarnog azidoalkohola. Reakcije sa stiren-oksidom, 2-(4- bromfenil)oksiranom i 2-(4-klorfenil)oksiranom idu uz regioselektivnost od 95%, dok je kod 2-(4- metilfenil)oksirana, omjer regioizomera 37:63 u prilog nastajanja primarnog azidoalkohola. Neenzimsko nastajanje azidoalkohola provedeno je pri pH 4, 2 i 9, 5 te je u oba slučaja dobiven pretežno primarni azidoalkohol. HheC2360 ispitan je i kao katalizator uzastopnih reakcija zatvaranja aromatskih bromoalkohola u azidoalkohole preko epoksida kao međuprodukta. Utvrđeno je da ove reakcije daju produkte u istom regioizomernom omjeru kao i enzimske azidolize iz epoksida te da traju duže zbog kompeticije bromida i azida za aktivno mjesto mutanta.

Biokatalitička svojstva halogenhidrin dehalogenaze HheA iz Arthrobacter sp. AD2 te njegove nove varijante HheA-N178A ispitana su u reakcijama nukleofilnog otvaranja šest različito supstituiranih terminalnih epoksida (supstituenti s alifatskim, aromatskim, eterskim i esterskim skupinama) u prisustvu azida kao nukleofila. Biokatalitička istraživanja uključivala su transformacije monosupstituiranih epoksida katalizirane divljim tipom HheA te modificiranim enzimom HheA-N178A s ciljem utvrđivanja odnosa strukture supstrata i enantioselektivnosti enzimske reakcije. Enantioselektivnost reakcija kataliziranih enzimom HheA pokazala se niska do osrednja (E = 1-17). Višestruko povećanje enantioselektivnosti kod supstrata alil- glicidil-etera, fenil-glicidil-etera i stiren- oksida postignuto je mutantom HheA-N178A. Utvrđeno je da promjena samo jedne aminokiseline u aktivnom mjestu HheA, zamjena asparagina u alanin na položaju 178, znatno utječe na povećanje enantioselektivnost enzima prema stiren-oksidu i derivatima glicidola.

Halogenhidrin dehalogenaze su enzimi koji kataliziraju nehidrolitičko otvaranje epoksida, a kao nukleofile koriste male anione kao što su azid, cijanid i nitrit, te halogenide. Kao biokatalizatori oni su posebno zanimljivi stoga što pokazuju enantioselektivnost u reakcijama koje kataliziraju. Nedavno smo otkrili da enzim halogenhidrin dehalogenaza iz Agrobacterium radiobacter (HheC) pokazuje aktivnost u reakciji otvaranja epoksida s cijanatom kao nukleofilom pri čemu kao produkti nastaju 5-supstituirani oksazolidinoni. Koristeći HheC, pripravljeni su enantiomerno obogaćeni oksazolidinoni (e.v.= 68 – 98 %) u visokom iskorištenju što je ujedno i prvi primjer ovakve biokatalitičke transformacije opisane u literaturi. Ovi produkti predstavljaju interesantne građevne blokove za pripravu farmaceutskih intermedijara te imaju široku primjenu kao kiralni ligandi i kiralna pomoćna sredstva.

Sinteziran je racemični epoksid, metil-3, 4- epoksibutanoat, koji je poslužio kao supstrat za ispitivanje biokatalitičkog potencijala novih varijanti halogenhidrin dehalogenaza. Biokatalitička istraživanja uključivala su transformacije epoksida koristeći azid i cijanid kao nukleofile. U ovim reakcijama ispitana su tri enzima: divlji tip iz Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC) te mutanti HheC-W249F i HheC-T134A. Reakcijom metil-3-hidroksi-4-klorobutanoata s NaCN kataliziranom HheC-W249F dobivena su dva korisna građevna bloka, metil-4-cijano-3-hidroksibutanoat (97% e.v., 38% iskorištenje) i (S)-metil-3- hidroksi-4-klorobutanoat (97% e.v., 43% iskorištenje). Sve biotransformacije su provedene na sobnoj temperaturi u vodenom mediju neutralnog pH.