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Phytomonas spp. are members of the family Trypanosomatidae that parasitize plants and may cause lethal diseases in crops such as Coffee Phloem necrosis, Hartrot in coconut, and Marchitez sorpresiva in oil palm. In this study, the molecular karyotype of 6 isolates from latex plants has been entirely elucidated by pulsed-field gel electrophoresis and DNA hybridization. Twenty-one chromosomal linkage groups constituting heterologous chromosomes and sizing between 0.3 and 3 Mb could be physically defined by the use of 75 DNA markers (sequence-tagged sites and genes). From these data, the genome size can be estimated at 25.5 (±2) Mb. The physical linkage groups were consistently conserved in all strains examined. Moreover, the finding of several pairs of different-sized homologous chromosomes strongly suggest diploidy for this organism. The definition of the complete molecular karyotype of Phytomonas represents an essential primary step toward sequencing the genome of this parasite of economical importance.

As part of our search for tissue-specific promoters in coffee (Coffea arabica), we used 2-D gel electrophoresis to detect proteins highly and specifically expressed in coffee leaves. Among the proteins identified by N-terminal sequencing, the small subunit (SSU) of the coffee ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (EC.4.1.1.39) was one of the most abundant. Using the protein sequence information available in databases, degenerate primers were used to screen a coffee leaf cDNA library, leading to the cloning of a full-length cDNA and a genomic clone for the coffee RBCS1 gene. The promoter region of this gene was also isolated. Sequence analysis of this promoter revealed the presence of several putative DNA boxes with similarities to well-characterized light responsive elements (LRE) that have previously been shown to be critical components for transcriptional control of gene expression by light. Using a RBCS1 promoter-uidA translational fusion, we demonstrated that this coffee promoter could function as a leaf-specific and light-regulated promoter in transgenic tobacco plants. These data suggest that the 1-kb coffee RBCS1 promoter sequence contained all the cis-elements required for developmental and light-mediated control of gene expression and that trans-acting factors implicated in this mechanism are probably highly conserved between coffee and tobacco. © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS

pFL1 is a pUC9 derivative that contains a 572-bp EcoRI insert cloned from plasmid DNA of Xanthomonas campestris pv. citri XC62. The nucleotide sequence of pFL1 was determined, and the sequence information was used to design primers for application of the polymerase chain reaction (PCR) to the detection of X. campestris pv. citri, the causal agent of citrus bacterial canker disease. Seven 18-bp oligonucleotide primers were designed and tested with DNA from X. campestris pv. citri strains and other strains of X. campestris associated with Citrus spp. as templates in the PCR. Four primer pairs directed the amplification of target DNA from X. campestris pv. citri strains but not from strains of X. campestris associated with a different disease, citrus bacterial spot. Primer pair 2-3 directed the specific amplification of target DNA from pathotype A but not other pathotypes of X. campestris pv. citri. A pH 9.0 buffer that contained 1% Triton X-100 and 0.1% gelatin was absolutely required for the successful amplification of the target DNA, which was 61% G+C. Limits of detection after amplification and gel electrophoresis were 25 pg of purified target DNA and about 10 cells when Southern blots were made after gel electrophoresis and probed with biotinylated pFL1. This level of detection represents an increase in sensitivity of about 100-fold over that of dot blotting with the same hybridization probe. PCR products of the expected sizes were amplified from DNA extracted from 7-month-old lesions from which viable bacteria could not be isolated. These products were confirmed to be specific for X. campestris pv. citri by Southern blotting. This PCR-based detection protocol will be a useful addition to current methods of detection of this pathogen, which is currently the target of international quarantine measures.

National audience; The term “chromosome painting” widely implies painting of differential chromosome segments with sequence specific probes based on the technique of in situ molecular hybridization. Development of fluorescence in situ hybridization (FISH), further enhanced sensitivity and versatility of in situ hybridization procedures. Despite recent development and application of FISH in plant genome analysis, this technology remains unfamiliar to most coffee scientists. Here we report through of different examples, the potential of FISH technique as a tool for genome analysis in coffee. We investigated the presence of alien chromatin in interspecific hybrids between C. arabica x C. canephora as well as in one C. arabica line introgressed from C. liberica. Further, we demonstrated that it is possible to identify one specific chromosome on the whole genome, despite the morphological similarity between coffee chromosomes. Overall, our results illustrate how molecular cytogenetics approach would provide complementary information for genetic mapping studies based on molecular markers

Une nouvelle technique de transformation génétique mise au point très récemment sur Hevea brasiliensis, haut producteur de caoutchouc naturel, permet l'insertion de transgène via Agrobacterium tumefaciens. L'étude présentée vise la caractérisation du promoteur H4 du gène hev2.1 à l'aide du gène rapporteur gusA. Cette caractérisation précoce au niveau du cal et de plantules in vitro a nécessité une mise au point des tests histo-cytochimique et fluorimétrique de l'activité GUS. Au final, 10 des 16 lignées H4::GUS correspondant à un événement de transformation indépendant ont permis d'obtenir une cinquantaine de plantules dont une trentaine ont été acclimatées en serre. La caractérisation du promoteur a permis de mettre en évidence une influence des stress éthyléniques, lumineux et osmotiques sur le fonctionnement du promoteur. Toutefois, ces résultats restent à confirmer sur des tissus ex vitro ainsi que sur un nombre d'échantillons plus important pour gagner en significativité. Par ailleurs, une hybridation in situ sur messagers a été réalisée avec une sonde ARN antisens gusA sur des échantillons de plantules transgéniques H4::GUS. Cela a permis de mettre en évidence une expression du gène gusA localisée strictement au niveau des lactifères dans la tige et la racine d'une part, et sans spécificité au niveau des feuilles d'autre part.

International audience; A total of 26 strains, including 15 strains isolated from garlic plants with the typical symptoms of 'Café au lait' disease and 11 strains isolated from diseased or healthy rice seeds and sheaths infested by Pseudomonas fuscovaginae, were compared with 70 type or reference strains of oxidase-positive pathogenic or non-pathogenic fluorescent pseudomonads. The strains were characterized by using a polyphasic taxonomic approach. Numerical taxonomy of phenotypic characteristics showed that the garlic and rice strains were related to each other. However, they clustered into separate phenons, distinct from those of the other strains tested, and were different in several nutritional tests. On the basis of DNA-DNA hybridization, the garlic and rice strains constituted two distinct DNA hybridization groups, indicating that they belonged to separate species. The two groups of strains were also well differentiated by siderotyping. Garlic strains were pathogenic to garlic plants and either weakly pathogenic or non-pathogenic on rice; rice strains were either weakly pathogenic or non-pathogenic on rice and non-pathogenic on garlic. A phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences confirmed that the two groups of strains belonged to the y-Proteobacteria and to the genus Pseudomonas. The names Pseudomonas salomonii sp. nov. and Pseudomonas palleroniana sp. nov. are respectively proposed for the garlic strains and the rice strains. The type strains are P. salomonii CFBP 2022(T) ( = ICMP 14252(T) = NCPPB 4277(T)) and P. palleroniana CFBP 4389(T) (= ICMP 14253(T) = NCPPB 4278(T))

Chantier qualité spécifique "Auteurs Externes" département de Génétique animale : uniquement liaison auteur au référentiel HR-Access; National audience; Les cartes géniques des espèces domestiques sont restées très rudimentaires, voire inexistantes, jusqu’au début des années 1990. La situation a évolué à cette période avec la mise en place de vastes programmes de cartographie du génome, aussi bien au plan national (programmes de cartographie de l’INRA, programmes Génome Français) qu’européen (programmes Bridge) pour quelques espèces majeures dont les espèces bovine et porcine. Il est en effet apparu clairement que la connaissance du génome, indispensable pour l’isolement et le clonage des gènes d’intérêt agronomique, passait par la construction des cartes génétique (mise en place d’un réseau de marqueurs polymorphes par analyse de liaison sur des familles de référence) et cytogénétique (localisation de marqueurs et de gènes sur les chromosomes). Les principales méthodes mises au point pour établir, dans un premier temps, la carte cytogénétique puis, dans un deuxième temps, la carte physique à haute résolution sont présentées.

Introduction. Les productions tropicales, primordiales pour les pays en voie de développement, peuvent cependant être considérées comme le parent pauvre des marqueurs moléculaires. L'utilisation de microsatellites a de nombreux avantages par rapport à d'autres techniques moléculaires comme les analyses d'isozymes, de RFLP ou de RADP. Notre objectif a donc été de développer une méthode permettant de constituer des banques enrichies en microsatellites en utilisant, comme matériel de départ, du DNA de plantes tropicales. Une construction simple et rapide de banque enrichie en séquences microsatellites (GA)n du palmier à huile est décrite ici. Procédure de construction de banques enrichies en microsatellites. L'hybridation avec une sonde microsatellite biotinylée puis la capture des séquences ciblées grâce à des particules magnétiques recouvertes de streptavidine sont les deux principes de la technique utilisée. Les différentes étapes de la méthode sont discutées et un protocole optimisé est proposé. Caractérisation des banques enrichies. Les banques de plusieurs milliers de clones ont une proportion de clones positifs, contenant un microsatellite, supérieure à 70 %. Le taux de redondance des clones positifs dépend du mode de préparation de l'ADN, avec, respectivement, 20 % et 60 % pour des fragments obtenus par restriction par PstI ou par sonication. Conclusion. L'étude présentée donne une technique pour développer facilement des banques de marqueurs satellites spécifiques des productions tropicales en attendant que la communauté internationale entreprenne des projets moléculaires appliqués à l'amélioration génétique de ces cultures traditionnellement oubliées.

Nine phylogenetic oligonucleotide probes were used to describe at the genus level the microbial community responsible for the spontaneous fermentation of maize, leading to the reproduction of Mexican pozol. Ribosomal RNAs of specific groupds and genera, in particular, lactic acid bacteria, were quantified using a culture-independent approach. In the early stage of the fermentation, #Lactococcus$ and #Leuconostoc$ appeared to be the dominant genera. A contrario, these represented minor genera at the end of the fermentation when #Lactobacillus$ dominated the process. In addition, eukaryotes seemed to play a significant role throughout the fermentation and enterobacteria could be detected by this method. (Résumé d'auteur)

The use of microsatellite markers for diversity studies and mapping has been undertaken for several tropical species including sugarcane, rubber tree, cocoa, oil palm, and coconut palm. Three different small insert microsatellite enriched libraries have been constructed for each of the above species. These libraries include one for each of the tetra nucleotide repeats GA and GT and a mixed library enriched for the tri and tetra repeats CAA, ATT, ACC, GCC, GAA, CATA and GATA. Initial screening of the libraries was performed by PCR amplification of the cloned inserts followed by Southern blot hybridization. The degree of enrichment for the libraries varied by the type of microsatellite as well as by species. The percentage of enrichment ranged from 15% to >65%. Representative clones from each of the libraries was sequenced to confirm the presence and determine the average size of the microsatellite sequences. The type and size of microsatellites found varied among the species particularly those from the mixed library. Unique primers have been designed from the regions flanking the microsatellite sequences and then used for PCR amplification. The results of each amplification were analyzed first by agarose gel electrophoresis to confirm that a product of the expected size was produced. Successful primer pairs were then used on progeny populations for mapping and on cultivars for diversity studies. Amplification products were then analyzed by ethidium bromide staining of 4% agarose gels or on acrylamide gels followed by autoradiography. A project sponsored by the Genoscope, Evry, France is producing sequence data for 250 additional clones for each of the above species enabling us to increase the number of potential markers for each species. (Texte intégral)

Le cocotier est affecté par de nombreux ravageurs et microbes particulièrement en Amérique latine et dans les Caraïbes. Pour identifier les maladies, l'observation des symptômes est la première étape, l'étape suivante étant d'isoler le pathogène suspecté par culture #in vitro# ou purification, de le caractériser et de prouver sa pathogénicité. L'approche conventionnelle, peu coûteuse en général, est l'étape logique après la symptomatologie. Si l'on suspecte une origine bactérienne ou fongique, l'isolement et la culture #in vitro# peuvent être complétés par des tests sérologiques ou une observation au microscope. Dans le cas de virus ou phytoplasmes, la microscopie électronique doit être utilisée, mais on peut également identifier un virus donné par des techniques sérologiques. Ces méthodes conventionnelles, satisfaisantes pour le diagnostic, ne sont pas assez spécifiques pour les études épidémiologiques ou les études de la variabilité au niveau des espèces ou des souches. L'avantage de l'approche moléculaire est d'utiliser toute l'information génétique concernant le pathogène. Il y a plusieurs techniques pour cette approche : l'hybridation moléculaire, l'amplification en chaîne par polymérase(ACP), l'ACP couplée avec l'immunocapture. Ces techniques plus sensibles sont généralement plus coûteuses et plus longues pour l'obtention des résultats

Ce rapport donne l'état d'avancement des recherches sur les molécules de type viroïdes du cocotier ("viroid-like molecules" ou VLM). Les objectifs des travaux scientifiques portent sur la rechercher des VLM associés aux cocotiers en utilisant diverses techniques et le développement d'une méthode de diagnostic moléculaire spécifique au cadang-cadang du cocotier. Les résultats et leurs analyses ont clairement mis en doute les conclusions antérieures avancées par d'autres équipes sur la détection des VLM. Il faudrait identifier et standardiser les paramètres utilisés dans différents protocoles. Les résultats n'ont pas permis de dire si l'indexation systématique des échanges de matériel végétal comme recommandé par le guide publié par la FAO pour les VLM est nécessaire

Les différents outils sérologiques et moléculaires que nous avions développés nous avaient principalement servi à démontrer l'extrême hétérogénéité du genre créé arbitrairement pour décrire les trypanosomes de plantes : "Phytomonas". Ces outils nous avaient permis d'aborder l'épidémiologie moléculaire et nous avions pu ainsi démontrer que les trypanosomes des diverses Euphorbes et Asclepiades poussant dans les palmeraies et cocoteraies étaient différents de ceux associés aux dépérissements du cocotier et du palmier à huile en Amérique du Sud ("Hartrot" et "Marchitez sorpresiva"). Les études qui ont suivi ont été principalement orientées sur les trypanosomes intraphloémiques associés à ces dépérissements, ainsi que sur les trypanosomes intraphloémiques associés à un dépérissement de l'Alpinia purpurata dans les Caraibes

The kinetoplast DNA of 27 plant trypanosomatid stocks (22 intraphloemic Phytomonas associated with coconut Hartrot, oil palm Marchitez, or decay of Alpinia purpurata, 3 Phytomonas isolates from latex, and 2 fruit trypanosomatids) was studied. Four classes of minicircle sizes were obtained: 1.6 and 1.8 kb for isolates originating from coconut palms, oil palms, Alpinia purpurata, and fruits; 850 bp and 2.8 kb for isolates from latex. Restriction endonuclease analysis showed that for almost all of the isolates minicircles were heterogeneous in base sequence. Cross-hybridization experiments were performed by Southern blot. A high sequence similarity only occurred between isolates of the same class of minicircle sizes, except for the 1.6-kb class, in which isolates from fruits and isolates originating from diseased coconut belonged to two hybridization groups. Moreover, the intraphloemic isolates that belonged to two classes, 1.6 and 1.8 kb, showed sequence similarity. These data confirm the existence of at least two groups of intraphloemic trypanosomatids associated with wilts, several groups of latex trypanosomatids, and one group of fruit trypanosomatids and could help in the classification of the lower trypanosomatids.

La maladie de dépérissement foliaire du cocotier est économiquement importante au Vanuatu et influence donc les programmes de sélection et d'amélioration du cocotier dans ce pays. L'identification des agents pathogènes de cette maladie et des moyens de transmission permettra de déterminer les risques de transfert des noix dans d'autres pays. Des études restent à faire sur les sites de reproduction des insectes vecteurs et sur quelles parties de l'insecte le virus s'accumule ou se réplique. L'éradication des plantes hôtes de cet insecte n'est pas encore prouvée comme étant nécessaire

Erwinia carotovora subsp. atroseptica is a pathogen of potatoes in Europe because of its ability to induce blackleg symptoms early in the growing season. However, E. carotovora subsp. carotovora is not able to produce such severe symptoms under the same conditions. On the basis of the technique described by Straus and Ausubel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1889-1893, 1990), we isolated DNA sequences of E. carotovora subsp. atroseptica 86.20 that were absent from the genomic DNA of E. carotovora subsp. carotovora CH26. Six DNA fragments ranging from ca. 180 to 400 bp were isolated, cloned, and sequenced. Each fragment was further hybridized with 130 microorganisms including 87 E. carotovora strains. One probe was specific for typical E. carotovora subsp. atroseptica strains, two probes hybridized with all E. carotovora subsp. atroseptica strains and with a few E. carotovora subsp. carotovora strains, and two probes recognized only a subset of E. carotovora subsp. atroseptica strains. The last probe was absent from the genomic DNA of E. carotovora subsp. carotovora CH26 but was present in the genomes of many strains, including those of other species and genera. This probe is homologous to the putP gene of Escherichia coli, which encodes a proline carrier. Further use of the probes is discussed.

Les travaux sur l'étiologie de la pourriture du coeur du palmier à huile en Equateur n'ayant rien donné, tant sur le plan agronomique, mycologique, bactériologique, nématologique et entomologique, ils ont été orientés vers une hypothèse de virus (virus ou viroïde ou MLO), mais aucune particule virale ou MLO n'ont pu être observés sous microscope électronique. Une stratégie de recherche mettant en cause les acides nucléiques a donc été mise en place par comparaison de l'ensemble des acides nucléiques chez les plantes saines et les plantes malades. Aucune différence n'a été observée, les travaux se sont alors tournés sur la recherche d'un viroïde. Les résultats, décrits dans cette communication, suspectent des molécules de type viroïdes

Une méthode d'hybridation moléculaire de l'ADN en dot-blots a été réalisée pour la caractérisation des espèces animales dans les produits carnés. La présence de porc est détectable grâce à cette technique dans des pâtes fines crues, pasteurisées ou stérilisées. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'identifier sans ambiguïté des espèces animales même dans des produits stérilisés

Not available, Trois types de gènes codent pour les chaines lourdes(IGH) et les chaines légères kappa(IGK) et lambda(IGL) des immunoglobulines. Le réarrangement de ces gènes est obligatoire pour qu'ils puissent s'exprimer. La chronologie de ce réarrangement au cours de la différenciation des lymphocytes b implique d'abord les gènes IGH, et ensuite, selon la littérature, une séquence d'essais successifs dans l'ordre IGK-IGK-IGL-IGL. A la suite de l'observation d'une inversion de la ration des chaines kappa: lambda dans les lymphocytes associes aux tissus muqueux et dans les liquides sécrétoires chez l'homme, nous avons entrepris d'analyser le réarrangement des gènes des chaines légères humaines dans les leucémies, les lymphocytes b amygdaliens et les lymphocytes b du sang périphérique. Les résultats obtenus, présentés dans ce mémoire, nous conduisent à proposer un modèle alternatif pour la chronologie de réarrangement des gènes codant pour les chaines légères, selon lequel le réarrangement de ces gènes peut commencer soit par IGK soit par IGL. Le deuxième gène qui réarrangerait serait également au choix IGK ou IGL. Cette hypothèse diffère des modèles traditionnels en ce qu'une cellule b peut réarranger ce gène IGL sans avoir nécessairement réarrangé les deux allèles IGK. Nos résultats indiquent enfin que la prédominance de cellules produisant des chaines légères lambda dans le malt peut résulter de l'utilisation préférentielle de ce réarrangement alternatif

Not available, Trois types de gènes codent pour les chaines lourdes(IGH) et les chaines légères kappa(IGK) et lambda(IGL) des immunoglobulines. Le réarrangement de ces gènes est obligatoire pour qu'ils puissent s'exprimer. La chronologie de ce réarrangement au cours de la différenciation des lymphocytes b implique d'abord les gènes IGH, et ensuite, selon la littérature, une séquence d'essais successifs dans l'ordre IGK-IGK-IGL-IGL. A la suite de l'observation d'une inversion de la ration des chaines kappa: lambda dans les lymphocytes associes aux tissus muqueux et dans les liquides sécrétoires chez l'homme, nous avons entrepris d'analyser le réarrangement des gènes des chaines légères humaines dans les leucémies, les lymphocytes b amygdaliens et les lymphocytes b du sang périphérique. Les résultats obtenus, présentés dans ce mémoire, nous conduisent à proposer un modèle alternatif pour la chronologie de réarrangement des gènes codant pour les chaines légères, selon lequel le réarrangement de ces gènes peut commencer soit par IGK soit par IGL. Le deuxième gène qui réarrangerait serait également au choix IGK ou IGL. Cette hypothèse diffère des modèles traditionnels en ce qu'une cellule b peut réarranger ce gène IGL sans avoir nécessairement réarrangé les deux allèles IGK. Nos résultats indiquent enfin que la prédominance de cellules produisant des chaines légères lambda dans le malt peut résulter de l'utilisation préférentielle de ce réarrangement alternatif

Afin de déterminer l'étiologie de la maladie de la pourriture du coeur chez le palmier à huile, des études en virologie ont été réalisées à partir d'une mission menée sur la plantation de Shushufundi en Equateur. Elles se sont déroulées en 2 phases : la première a permis de mettre en évidence de nombreuses bactéries après culture in vitro et examen au microscope électronique, mais les tests d'inoculation sur palmiers sains par ces bactéries se sont révélés négatifs. La deuxième phase n'a pas clairement révélé la présence de viroides dans les plantes infectées malgré l'utilisation des techniques d'électrophorèse bidimentionnelle et d'hybridation moléculaire à l'aide de sondes à ADN, chimiques ou radioactives. Par contre, elle a mis en évidence la présence de nombreux ARN bicaténaires en relation avec cette maladie. Les recherches nécessitent d'être appronfondies afin de savoir si ces ARN sont la conséquence ou l'origine de la maladie. En ce qui concerne les tentatives de transmission de la pourriture du coeur, aucune ne s'est avérée positive

La maladie des raies noires causée par M. fijiensis est considérée comme l'une des principale menaces des bananiers. Cette maladie s'étend inexorablement aux principales régions bananières et supplante la Cercosporiose jaune causée par M. musicola. Une étude de population de ces Mycosphaerella spp, pathogènes des bananiers et plantains, par RFLP (polymorphisme de longueur de fragments de restriction), a été initiée. Une méthode d'extraction d'ADN total adaptée à ces espèces a été mise au point. Des hybridations avec une sonde hétérologue correspondant à l'ADNr de Sordaria macrospora nous ont permis de détecter un polymorphisme interspécifique et entre isolats de M. fijiensis d'origine géographique différente. L'espèce M. musicola semble plus homogène. Ces observations seraient en accord avec l'activité pathogène supérieure de l'espèce M. fijiensis.

Plasmid DNA was isolated from 54 strains of Xanthomonas campestris pv. citri, associated with different forms of citrus bacterial canker disease (CBCD). The number of plasmids per strain varied from one to five. A total of 24 plasmid bands with sizes from 7 to 100 kilobases (kb) were identified. Strains that had identical plasmid profiles were generally associated with the same form of CBCD. After digesting the plasmid DNA with each of three restriction endonucleases, 87 fragments with different sizes from about 1 to 30 kb were visualized (...)

Les effets du PSTV ont été étudiés sur plusieurs cultivars de pomme de terre infectés artificiellement et maintenus en serre isolée. Dans ces conditions de culture, l’infection a peu d’effet sur les organes aériens ; en revanche, on observe un effet très marqué sur la taille et les facultés germinatives des tubercules de certaines variétés, notamment « Belle de Fontenay ». L’évolution de l’infection dans la plante a été suivie tout au long du cycle végétatif, dans les feuilles, puis dans les tubercules. Le PSTV a été recherché par la technique d’hybridation moléculaire utilisant une sonde constituée d’un plasmide contenant une copie complète de PSTV et marquée au 3P2 par « nick translation ». La présence du PSTV peut être mise en évidence très précocement après l’inoculation et il existe une parfaite corrélation entre les résultats des tests effectués sur les parties aériennes et sur les tubercules. Cependant, une certaine hétérogénéité de la distribution du PSTV pose le problème de l’échantillonnage. L’intérêt et la sensibilité de la technique d’hybridation moléculaire (qui permet de détecter régulièrement 15 à 30 pg de viroïde) ont été confirmés. Cette méthode apparaît particulièrement adaptée à une détection précoce du viroïde aussi bien dans les organes aériens que dans les tubercules., Several potato cultivars were artificially inoculated. Under our culture conditions in an isolated greenhouse, PSTV appeared to have little effect on the above-ground part of the plant ; by contrast, it has marked effect on tuber production and quality : the size and germination of tubers of some cultivars were particularly affected (Belle de Fontenay). Spread of PSTV in the plant from the inoculation point was followed by sampling of leaves during the vegetation period, and subsequently of tubers. PSTV was detected by a molecular hybridization technique using a 32P-labelled probe consisting of a plasmid containing a full-length copy of PSTV. Presence of PSTV was detected as early as 9 days after inoculation and the results point to a good correlation between the results of the tests carried out on leaves and on tubers. Nevertheless uneven distribution of the viroid in leaves and tubers was observed, which poses the problem of sampling. The reliability and sensitivity of the molecular hybridization technique (which detects as low as 15-30 pg viroid) were confirmed : this technique appears to be perfectly adapted to early detection of PSTV in leaves and tubers of infected potato plants.

Double-stranded RNAs were isolated from plants infected with five different isolates of apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV). Analysis by PAGE and by Northern blot hybridization showed that six major species of viral dsRNA of approximately 7.5, 6.4, 5.4, 2.2, 1.1 and 1.0 kbp can be detected in infected plants, irrespective of the ACLSV isolate used. In addition to the dsRNA of 7.5 kbp corresponding to the full-length genome, the size and position on the genome of the 2.2 and 1.1 kbp species indicate that these are very probably double-stranded forms of subgenomic RNAs allowing the expression of the internal open reading frames coding respectively for the ACLSV 50K and coat proteins. The subgenomic messenger for the coat protein was indeed detected in total RNA preparations from infected plants. Surprisingly, the two most abundant dsRNA species, of 6.4 and 5.4 kbp, were found to be 5'-coterminal with the genomic RNA. A model for the expression of the genome of ACLSV and for the production of the molecules 5'-coterminal with the genomic RNA is presented.