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Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A conjuntivite alérgica canina (CAc) é a causa mais comum de conjuntivite em cães, e integra frequentemente a sintomatologia da dermatite atópica canina (DAc). Com este estudo pretende-se contribuir para uma melhor caracterização clínica e imunológica da CAc através da avaliação da expressão da IL-6, TNF-alfa e IL-12 nesta doença. Para este fim recorreu-se a um grupo de animais diagnosticados concomitantemente com CAc e DAc no HEV-FMV (n=20) e a um grupo controlo (n=21). Os pacientes foram caracterizados clinicamente recorrendo a um score de CAc e ao sistema de classificação Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index – fourth version (CADESI-04) e foram realizadas biópsias conjuntivais. A partir destas amostras fez-se a quantificação relativa da expressão génica das três interleucinas por qRT-PCR. Os resultados foram calculados através do método 2-DeltaCt. Para comparar a expressão génica das interleucinas entre o grupo atópico e o grupo controlo utilizou-se o Welch Two Sample t-test. De seguida, aplicou-se a correlação de Spearman para avaliar a correlação entre a expressão das interleucinas e o score de CAc, e procedeu-se da mesma forma para os valores relativos ao CADESI-04. Os resultados obtidos pela técnica de qRT-PCR permitiram verificar uma sobrexpressão génica de IL-6 e IL-12, de 291.48 (p=1.306e-09) e 4.85 (p=0.00033) folds, respetivamente, nos animais com conjuntivite alérgica. Apesar de a expressão média de TNF- Alfa estar aparentemente aumentada no grupo experimental (7.33 folds), não foi possível demonstrar uma diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos (p=0.18). Os resultados sugerem que quanto maior o score de CAc maior a expressão génica de TNF-Alfa (Rho=-0.57; p=0.02) e IL-12 (Rho=-0.50; p=0.049). Não se verificou nenhuma correlação entre os níveis de expressão génica das interleucinas e os valores de CADESI-04. Com este estudo verificou-se um aumento das citoquinas pró-inflamatórias na CAc, importantes na resposta imunitária inata, e uma ativação de uma resposta Th1, apontando assim a IL-6 e IL-12 como potenciais alvos de imunoterapia nos animais com esta doença. Os resultados sugerem ainda que a expressão génica destas três interleucinas possa ser uma ferramenta útil no diagnóstico e classificação da CAc, mas não da DAc. ABSTRACT - CONTRIBUTION TO IMMUNOLOGICAL AND CLINICAL CHARACTERIZATION OF CANINE ALLERGIC CONJUNCTIVITIS - Canine allergic conjunctivitis (cAC) is the most common type of conjunctivitis in dogs and is often included in the symptoms of canine atopic dermatitis (cAD). With this study we aimed to contribute to improve the clinical and immunological characterization of cAC through the evaluation of IL-6, TNF-Alfa and IL-12 expression in this disease. For this purpose, conjunctival biopsies were performed on a group of 20 animals diagnosed with both cAC and cAD and a control group (n=21). From those samples, a relative quantification of the interleukin’mRNA expression was performed by qRT-PCR. The results were obtained through the 2-DeltaCt method. To compare interleukin gene expression between the atopic group and the control group Welch Two Sample t-test was used. Then Spearman correlation was applied to evaluate the correlation between interleukin gene expression and cAC clinical score, the same procedure was used for the CADESI-04 values. The results provided by qRT-PCR showed a significant gene overexpression of respectively 291.48 (p=1.306e-09) and 4.85 (p=0.00033) folds on IL-6 and IL-12 in dogs with allergic conjunctivitis. Even though the average expression of TNF-Alfa seems apparently higher in the experimental group (7.33 folds), there were no statistical significant differences between the atopic and the healthy group (p=0.18). The results suggest that the higher the cAC score, the greater the TNF-Alfa (Rho=-0.57; p=0.02) and IL-12 (Rho=-0.50; p=0.049) gene expression. There was no correlation between the interleukin gene expression levels and the CADESI-04 values. The results indicate an increase of pro-inflammatory cytokines in cAC, which are strongly involved on the innate immune response, and a Th1 subset activation, identifying IL-6 and IL-12 as potential targets for immunotherapy. This study suggests that the gene expression of those three interleukins may be an useful tool for cAC diagnose and classification, but not for cAD. N/A

No contexto tumoral, o sistema imunológico desempenha papeis que podem prevenir o desenvolvimento ou a progressão tumoral. Assim, a produção de citocinas, principalmente por linfócitos T CD4+, representa um fenômeno crucial na resposta imune, uma vez que variações nesta regulação podem resultar em uma resposta inadequada. Anteriormente, esse grupo de pesquisa demonstrou que linfócitos T CD4+ de pacientes com estádios avançados de câncer expressavam interleucina-12, o mesmo se aplicando a camundongos induzidos a câncer de mama com DMBA (7, 12 – Dimetilbenzantraceno). Então, o objetivo do presente estudo foi avaliar a síntese de IL-12 em linfócitos T CD4+ do sangue periférico de pacientes com câncer, correlacionando com a expressão dos fatores de transcrição T-bet, GATA-3, RORγt e FoxP3, utilizando citometria de fluxo e abordagens moleculares. As células T CD3+CD4+IL-12+ foram isoladas a partir do sangue periférico obtido de pacientes com câncer, utilizando técnica de citometria de fluxo com princípio de cell sorting (triagem de células) e submetidas a análise do perfil transcricional. Os resultados demonstram uma porcentagem significativamente maior de linfócitos T CD3+CD4+IL-12+ no sangue periférico de pacientes com câncer (p

Paracoccidioidomycosis (PCM) is an infectious disease endemic to South America, caused by the thermally dimorphic fungi Paracoccidioides. Currently, there is no effective human vaccine that can be used in prophylactic or therapeutic regimes. We tested the hypothesis that the immunogenicity of the immunodominant CD4+ T-cell epitope (P10) of Paracoccidioides brasiliensis gp43 antigen might be significantly enhanced by using a hepatitis B virus-derived particle (VLP) as an antigen carrier. This chimera was administered to mice as a (His)6-purified protein (rPbT) or a replication-deficient human type 5 adenoviral vector (rAdPbT) in an immunoprophylaxis assay. The highly virulent Pb18 yeast strain was used to challenge our vaccine candidates. Fungal challenge evoked robust P10-specific memory CD4+ T cells secreting protective Th-1 cytokines in most groups of immunized mice. Furthermore, the highest level of fungal burden control was achieved when rAdPbT was inoculated in a homologous prime-boost regimen, with 10-fold less CFU recovering than in non-vaccinated mice. Systemic Pb18 spreading was only prevented when rAdPbT was previously inoculated. In summary, we present here VLP/P10 formulations as vaccine candidates against PCM, some of which have demonstrated for the first time their ability to prevent progression of this pernicious fungal disease, which represents a significant social burden in developing countries., Author summary Human paracoccidioidomycosis (PCM) represents a serious public health issue due to its disabling sequelae in working-age people and mortality rates (8th among chronic infectious parasitic diseases in endemic countries and first among mycoses in Brazil). Although antifungal drugs have been widely used and provide clinical improvement for patients, the long duration of treatments (commonly from 6 to 12 months) has contributed to non-compliance and worsening of the disease in many cases. Induction of protective immune responses (either prophylactic or immune-therapeutic) remains the most cost-effective approach against most infectious agents. Members of our group have previously reported the protective properties of P10, a peptide contained in Paracoccidioides brasiliensis gp43 antigen, against PCM. However, the magnitude of the CD4+ T-cell responses elicited lacked the capacity of completely protecting experimental animals. We demonstrate here that immunogenic virus-like particles (VLP) carrying multiple copies of P10 peptide substantially improve P10-related cellular immunity in mice. This was particularly true when an adenoviral immunization vector expressed the chimeric VLP. Moreover, VLP/P10 formulations were capable of controlling the host fungal burden and prevented fungal systemic dissemination. The efficacy of diverse VLP/P10 formulations in murine PCM showed at least one promising candidate vaccine against human PCM.

O desenvolvimento de uma resposta imune do tipo Th1 é o evento chave para prevenir a infecção murina por Leishmania e está interligada à produção de IL-12 por monócitos, células dendríticas, macrófagos e neutrófilos. A sinalização via IL-12 aumenta a produção de IFN-γ por células T, favorecendo o perfil Th1 da resposta imune e o fenótipo de resistência à infecção. A leishmania, no hospedeiro vertebrado, reside em células do sistema fagocítico mononuclear (SFM), o qual também é responsável pela eliminação do parasito. A participação de células indiferenciadas do SFM na produção de IL-12 vem sendo discutida. Foi demonstrado recentemente que uma população de fagócitos mononucleares, derivados de cultura de medula óssea e expressando o marcador ER-HR3 produzia grande quantidade de IL-12p40 após estimulação in vitro com formas procíclicas ou metacíclicas de L. (L.) major. A produção de IL-12 na infecção por L. (L.) major por fagócitos em diferentes estágios de maturação in vivo ainda não está claro. Neste trabalho, avaliamos o envolvimento de células em diferentes estágios de maturação em linfonodos drenantes após 48 h de infecção por L. (L.) major em camundongos BALB/c, quanto à produção de IL- 12p40. Verificamos que células CD31+ (precursores de fagócitos mononucleares) estão ausentes nos linfonodos drenantes do sítio do inóculo e que o número de células ER-HR3+ (fagócitos mononucleares em estágio intermediário de maturação), células ER-MP58+ (fagócitos imaturos) e 33D1+ (subpopulações de células dendríticas) aumenta no período de 48 h após a infecção. Mostramos também que, células ER-MP58+ são as principais responsáveis por grande parte da produção de IL-12 nos linfonodos drenantes 48 h após a infecção por L. (L.) major em camundongos BALB/c. Sugerimos que, in vivo, a população ER-MP58+ com as outras populações celulares, conhecidas como produtoras de IL-12, têm um papel relevante na inflamação induzida pelo inóculo parasitário. The development of a Th1 immune response is the key event to prevent Leishmania infection and is linked with the IL-12 production by monocytes, dendritic cells, macrophages and neutrophils. The IL-12 signal induces the increase of IFN-γ production by T cells, favoring the profile of the Th1 immune response and the resistance phenotype to the infection. In the vertebrate host, the leishmania inhabits in cells of the mononuclear phagocyte system (MPS), which is also responsible for the elimination of the parasite. The participation of immature cells of MPS in the initial production of IL-12 has been discussed. It was demonstrated recently that a population of mononuclear phagocytes, derived from bone marrow culture and expressing the marker ER-HR3 produced great amount of IL-12p40 after stimulation in vitro with procyclic or metacyclic promastigotes of L. (L.) major. The initial production of IL-12 by MPS cells is under investigation. It is unclear the role of mononuclear phagocytes, in different stages of maturation, in the production of IL-12p40 in vivo. In this work, we evaluated the involvement of MPS cells, in different stage of maturation, with the IL-12p40 production in vivo in draining lymph nodes of BALB/c mice after 48 h of infection with L. (L.) major. Our results showed that CD31+ cells (mononuclear phagocytes precursors) were absent in the draining lymph nodes of the subcutaneously footpad injection and that the number of ER-MP58+ (immature mononuclear phagocytes), ER-HR3+ cells (mononuclear phagocytes in the intermediate stage of maturation) and 33D1+ (mature phagocytes) increase in the period of 48 h after infection. We showed, also, that ER-MP58+ responsible for great part of the draining lymph nodes IL-12 production 48 h after infection with stationary-phase promastigotes of L. (L.) major in mice BALB/c. We suggested that, in vivo, the ER-MP58+ population, together with other cellular populations, known as IL-12 producers, ER-MP58+ cell has an important role in the inflammation induced by the parasitic inoculum. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES