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Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Uma das maiores preocupações dos profissionais de saúde e da comunidade científica é a significativa presença de resistência aos antibióticos em todo o mundo. Os antibióticos β-lactâmicos correspondem a classe de agentes antibacterianos mais prescritos. Contudo, ao longo dos anos, tem se observado uma crescente resistência a estes fármacos. Um dos principais mecanismos de resistência passa pela expressão de β-lactamases (BL), enzimas presentes em diversas espécies de bactérias e que conseguem de uma forma eficaz inativar estes fármacos. Atualmente, a estratégia utilizada para superar a ação das BL é a utilização de uma terapêutica combinada, associando aos antibióticos moléculas inibidoras das BL com pouca ou nenhuma atividade antimicrobiana, como é o caso da amoxicilina associada com o ácido clavulânico. Existe uma classe de BL estruturalmente diferente, as metalo-β-lactamases (MBL) que, além terem um espectro de ação substancialmente alargado, isto é, conseguem hidrolisar praticamente todos os antibióticos β-lactâmicos, têm sido isoladas em estirpes bacterianas patogénicas.Nos últimos anos, vários grupos científicos trabalharam para encontrar novas moléculas com atividade inibitória nestas enzimas, sendo que foi possível identificar algumas famílias de potenciais candidatos. Todavia, neste momento, clinicamente não existe nenhum inibidor eficaz para estas enzimas.As MBL IMP-1 correspondem ao grupo de enzimas com elevado espectro de ação e além disso são geneticamente codificadas em cassetes móveis que são facilmente transmissíveis entre diferentes bactérias, podendo estar na origem da multirresistência bacteriana, o que justifica o interesse na descoberta de inibidores destas enzimas.O relatório do estágio em farmácia comunitária e i foi escrito de acordo com o exigido em forma de uma análise SWOT fundamentada, tal como indicado nas Normas orientadoras. O estágio foi realizado nas Caldas da Rainha, de janeiro a abril. Neste período tive a oportunidade de acompanhar o trabalho realizado na farmácia, seja ao nível da receção de encomendas, como o atendimento ao público, bem como nas decisões de organização e gestão. O estágio em Indústria Farmacêutica foi realizando em Lisboa, nos Laboratórios Expanscience, de maio em julho. Durante este período de tempo tive oportunidade de acompanhar o trabalho desenvolvido na área dos assuntos regulamentares bem como no marketing. O relatório do estágio foi escrito de acordo com o exigido nas Normas orientadoras, em forma de uma análise SWOT fundamentada. One of the major concerns of health professionals and the scientific community is the noticeable presence of antibiotic resistance throughout the world. β-lactam antibiotics correspond to the most prescribed class of antibacterial agents. Over the years, however, increasing resistance to these drugs has been observed. One of the main mechanisms of resistance is the expression of β-lactamases (BL), enzymes which are present in several species of bacteria that effectively inactivate these drugs.Currently, the strategy used to overcome the action of BL is the use of a combined therapy, associating antibiotics, with inhibitory molecules, with little or none antimicrobial activity, but which have a high affinity to BL, as is the case of amoxicillin associated with clavulanic acid.There is a structurally different class of BL which is currently generating major concerns, the metallo-β-lactamases (MBL). These enzymes not only have a substantially broad spectrum of action, this is, they succeed in hydrolysing virtually almost all β-lactams, but they have also been isolated in pathogenic bacterial strains.In the last years, several scientific groups have been working to find novel molecules with inhibitory activity against these enzymes and have already identified some families of potential candidates. However, at this moment, there is no inhibitor clinically efficient.MBL IMP-1 corresponds to the group of enzymes with a high action spectrum which are genetically encoded in mobile cassettes that are easily transmissible among different bacteria. It may also be the source of multidrug resistant bacteria, which justifies the interest in the discovery of inhibitors to these enzymes.The report on my internship at a Community Pharmacy was written in the form of a SWOT analysis, as indicated in the Guidelines. It took place in Caldas da Rainha, from January to April. In this period, I had the opportunity to follow the work carried out in the pharmacy. This included receiving orders, providing pharmaceutical care and help to the public, and participating in decisions of organization and management.The Pharmaceutical Industry internship report follows a SWOT structure, as required in the Guidelines. It took place in Lisbon, from May to July. In this period, I had the opportunity to follow the work carried out at the Expanscience Laboratories, focusing on regulatory issues and marketing.

O aumento de bactérias resistentes a antibióticos envolvidas em doenças infeciosas é um dos temas mais preocupantes da atualidade. Em particular, tem sido alarmante o aumento de Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp. e Pseudomonas sp. resistentes a antibióticos β-lactâmicos do grupo dos carbapenemos. A resistência aos carbapenemos em bacilos de Gram negativo está fundamentalmente associada a genes que codificam para carbapenemases, isto é, β-lactamases com capacidade para hidrólise sobre carbapenemos, inativando a sua ação. Atualmente existe uma grande diversidade de carbapenemases, existindo esquemas de classificação que facilitam o seu agrupamento de acordo com algumas características que partilham. Muitos dos genes que codificam para carbapenemases têm sido fundamentalmente associados a plasmídeos, o que contribui para a sua rápida disseminação entre diferentes grupos bacterianos e nichos (unidades de cuidados de saúde/comunidade). Adicionalmente, estes plasmídeos albergam também frequentemente genes de resistência a outras famílias de antibióticos (quinolonas, aminiglicosídeos, entre outros), conduzindo a fenótipos de MDR, XDR e PDR. Esta situação tem um impacto clínico assinalável, uma vez que fica não só comprometido o uso de antibióticos β-lactâmicos (muito eficazes e pouco tóxicos), mas também de antibióticos de outras famílias, no tratamento das infeções por bacilos de Gram negativo produtores de carbapenemases. A epidemiologia global de algumas espécies de bacilos de Gram negativo produtores de carbapenemases é hoje conhecida, embora existam diferenças geográficas assinaláveis. Nos últimos anos os isolados bacterianos produtores de carbapenemases têm-se disseminado globalmente, surgindo por isso uma preocupação cada vez maior face às elevadas taxas de morbilidade e mortalidade associadas. Trata-se de microrganismos associados a infeções nosocomiais graves, a elevadas taxas de mortalidade e de difícil tratamento, sendo muito escassas as opções terapêuticas eficazes. As evidências apontam que a medida mais eficaz no combate às infeções hospitalares é a higienização das mãos, sendo esta uma prática fundamental para a redução da disseminação da resistência bacteriana. Ao associar a isto medidas de limpeza e desinfeção de superfícies contribui-se de forma efetiva para evitar e minimizar o surgimento de reservatórios ambientais e fontes de infeção. Para evitar surtos hospitalares por estas bactérias podem ser feitos a rastreios de colonização intestinal. As bactérias produtoras de carbapenemases representam uma grande ameaça para a saúde humana em todo o mundo e constituem um dos problemas mais desafiadores para a contenção de doenças infeciosas nos próximos anos. Como alternativas terapêuticas para tratar infeções causadas por bactérias produtoras de carbapenemases restam as polimixinas (por exemplo, colistina) e a tigeciclina. As polimixinas permanecem ativas contra a maioria destes isolados multirresistentes, no entanto, já começam a surgir resistências à colistina decorrentes do aumento do seu uso. The increase of antibiotic resistant bacteria involved in infectious diseases is one of the most worrying issues today. In particular, it has been alarming the increase of Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp. and Pseudomonas sp. resistant to β-lactam antibiotics of the carbapenem group. Resistance to carbapenems in Gram-negative bacilli is mainly associated with genes encoding carbapenemases, that is, β-lactamases capable of hydrolysis over carbapenems, inactivating their action. Currently there is a great diversity of carbapenemases, and some classification schemes were created to facilitate their grouping according to some characteristics that they share. Many of the genes encoding carbapenemases have been associated with plasmids, contributing to their rapid spread between different bacterial groups and niches (health care / community units). In addition, these plasmids also frequently harbor resistance genes to other families of antibiotics (quinolones, aminoglycosides, amongst others), leading to MDR, XDR and PDR phenotypes. This situation has a remarkable clinical impact, since not only the use of β-lactam antibiotics (very effective and not very toxic), but also antibiotics of other families, is compromised in the treatment of the infections by carbapenemase-producing Gram-negative bacilli. The global epidemiology of some species of Gram-negative bacilli producing carbapenemases is now known, although there are marked geographical differences. In recent years, bacterial isolates producing carbapenemases have spread globally, resulting in increasing concern about the high rates of morbidity and mortality. These are microorganisms associated with serious nosocomial infections, with high mortality rates and difficult to treat, with very few effective treatment options. The evidence indicates that the most effective measure in the fight against hospital infections is hand hygiene, a key practice in reducing the spread of bacterial resistance. By associating with this, measures of cleaning and disinfection of surfaces contribute in an effective way to avoid and minimize the appearance of environmental reservoirs and sources of infection. To prevent hospital outbreaks by these bactéria, intestinal colonization screenings can be done. Carbapenemases pose a major threat to human health throughout the world and are one of the most challenging problems for the containment of infectious diseases in the coming years. Therapeutic alternatives for treating infections caused by carbapenemase-producing bacteria include polymyxin (for example, colistin) and tigecycline. Polymyxins remain active against most of these multiresistant isolates; however, resistance to colistin has begun to emerge due to increased use.

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Of 396 Pseudomonas aeruginosa strains isolated from hospital sewage, the blaSPM-1 gene was confirmed in nine. This is the first report of environmental P. aeruginosa strains carrying the blaSPM-1 gene in Brazil. The carbapenem resistance, already disseminated among clinical isolates, has been detected among environmental isolates.Ao todo, 396 isolados de Pseudomonas aeruginosa foram estudados. O gene blaSPM-1 foi encontrado em nove isolados de efluente hospitalar. Este estudo é o primeiro relato de isolados ambientais de P. aeruginosa com o gene blaSPM-1no Brasil. A resistência aos carbapenêmicos, amplamente disseminada entre isolados clínicos, já é detectada em isolados ambientais.

Of 396 Pseudomonas aeruginosa strains isolated from hospital sewage, the blaSPM-1 gene was confirmed in nine. This is the first report of environmental P. aeruginosa strains carrying the blaSPM-1 gene in Brazil. The carbapenem resistance, already disseminated among clinical isolates, has been detected among environmental isolates. Ao todo, 396 isolados de Pseudomonas aeruginosa foram estudados. O gene blaSPM-1 foi encontrado em nove isolados de efluente hospitalar. Este estudo é o primeiro relato de isolados ambientais de P. aeruginosa com o gene blaSPM-1no Brasil. A resistência aos carbapenêmicos, amplamente disseminada entre isolados clínicos, já é detectada em isolados ambientais.

A emergência e disseminação da resistência aos antimicrobianos são problemas de grande importância mundial, particularmente entre patógenos nosocomiais de importância clínica como os bacilos Gram negativos não fermentadores e membros da família Enterobacteriaceae. O principal mecanismo de resistência desses patógenos é a produção de β-lactamases, que são enzimas que hidrolisam o anel β-lactâmico impedindo assim a ação dos antimicrobianos β-lactâmicos. As β-lactamases foram dividas em quatro classes de acordo com a sua estrutura primária e podem também ser classificadas dentro de dois grupos com base no seu mecanismo catalítico, isto é, serina-β-lactamases (Classes A, C e D) e metalo-β-lactamases (Classe B). As metalo-β-lactamases (MβL) utilizam íons divalentes, comumente zinco, como co-fator para sua atividade catalítica e são atualmente uma das classes que mais merece destaque, devido à sua capacidade de hidrolisar todos os antimicrobianos β-lactâmicos, incluindo os carbapenens. Estes antimicrobianos são utilizados no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes e conseguem se manter estáveis frente às serina-β-lactamases. A detecção de microrganismos produtores de MβL tem por finalidade auxiliar a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) na prevenção da disseminação desse mecanismo de resistência no ambiente hospitalar e impedir que ele chegue até a comunidade, bem como enfatizar o uso racional dos antimicrobianos disponíveis para uso clínico, pois, atualmente,há poucos investimentos da indústria farmacêutica na pesquisa de novos agentes antimicrobianos.The emergence and dissemination of antimicrobial resistance are problems of great importance worldwide, particularly between nosocomial pathogens of clinical importance such as nonfermentative Gram-negative bacilli and members of the family Enterobacteriaceae. The main mechanism of resistance these pathogens is the production of β-lactamases, which are enzymes that hydrolyzing the ring β-lactam hindering the action of antimicrobial β-lactam. The β- lactamases were classified into four classes of according its primary structure and may also be classified in two groups based on their catalytic mechanism, that is, serine-β-lactamases (Classes A, C and D) e metallo-β-lactamases (Class B). The metallo-β-lactamases (MβL) using ions divalentes, commonly zinc, as co-factor for its catalytic activity and currently represent one the most important class of enzymes, due of their ability to hydrolyze all antimicrobial β-lactam, including carbapenens, which are used in the treatment of Gram-negative bacteria multidrug-resistant and to remain stable before the serine-β-lactamases. The detection of samples producing of MβL helps infection control practioners to prevent the dissemination of this mechanism of resistance in the nosocomial environment and to prevent it come to the community, and emphasize the rational use of antimicrobial currently available for clinical use, since there are few investments in the pharmaceutical industry in search of new antimicrobial agents.

The production of metallo-β-lactamases enzymes (MβL) by some pathogens such as Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. clinical and epidemiological implications triggers very important because of the limited number of really effective antimicrobial treatment of infections caused by these microorganisms. A total of 114 strains were studied, 92 P. aeruginosa and 22 Acinetobacter spp. The tests were performed: antimicrobial susceptibility test, determination of minimum inhibitory concentration (MIC), phenotypic tests to detect MβL (double-disk synergy test, combined disc test and modified Hodge synergy test and polymerase chain reaction (PCR) for detection of genes MβL, and blaIMP-1 blaSPM-1. Acinetobacter spp. presented as multidrug-resistant opportunistic pathogen, and gentamicin was the antibiotic that showed greater sensitivity to this genus. High rate of strains of P. aeruginosa AmpC positive was found, and the emergence of resistance to polymyxin B, which represents the beginning of a therapeutic problem in our institution. We detected, by PCR, the presence of genes blaIMP-1 blaSPM-1and at 4.95% and 8.91% of strains, respectively. All strains with the gene blaIMP-1 were from the Acinetobacter genus. The lack of new antimicrobial agents for gram-negative non-fermenters (GN-NF) and its rapid spread multiresistant leads to therapeutic failures. Moreover, the presence of strains producing MβL in hospitals represents a serious problem for the infection control committee. A produção das enzimas metalo-β-lactamases (MβL) por alguns patógenos como Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp. desencadeia implicações clínicas e epidemiológicas muito importantes em virtude do número restrito de antimicrobianos realmente efetivos ao tratamento das infecções causadas por esses microrganismos. Um total de 114 isolados clínicos foi estudado, 92 P. aeruginosa e 22 Acinetobacter spp. Os testes efetuados foram: teste de sensibilidade a antimicrobianos, determinação da concentração inibitória mínima (CIM), testes fenotípicos para detecção de MβL (disco aproximação, disco combinado e teste de Hodge modificado), reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção dos genes de MβL, blaSPM-1 e blaIMP-1. Acinetobacter spp. apresentou-se como patógeno oportunista multirresistente, sendo gentamicina o antimicrobiano que mostrou maior sensibilidade para este gênero. Elevada taxa de isolados de P. aeruginosa AmpC positivas foi encontrada, além de emergência da resistência à polimixina B, o que representa o início de um problema terapêutico em nossa Instituição. Através da PCR foi detectada a presença dos genes blaSPM-1 e blaIMP-1 em 4,95 % e 8,91 % dos isolados clínicos, respectivamente. Todos os isolados que apresentaram o gene blaIMP-1 eram do gênero Acinetobacter. A ausência de novos agentes antimicrobianos para bacilos gram-negativos não-fermentadores (BGN-NF) multirresistentes e sua rápida propagação leva a falhas terapêuticas. Além disso, a presença de isolados produtores de MβL no ambiente hospitalar representa um grave problema para o controle das infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS).

A emergência e disseminação da resistência aos antimicrobianos são problemas de grande importância mundial, particularmente entre patógenos nosocomiais de importância clínica como os bacilos Gram negativos não fermentadores e membros da família Enterobacteriaceae. O principal mecanismo de resistência desses patógenos é a produção de β-lactamases, que são enzimas que hidrolisam o anel β-lactâmico impedindo assim a ação dos antimicrobianos β-lactâmicos. As β-lactamases foram dividas em quatro classes de acordo com a sua estrutura primária e podem também ser classificadas dentro de dois grupos com base no seu mecanismo catalítico, isto é, serina-β-lactamases (Classes A, C e D) e metalo-β-lactamases (Classe B). As metalo-β-lactamases (MβL) utilizam íons divalentes, comumente zinco, como co-fator para sua atividade catalítica e são atualmente uma das classes que mais merece destaque, devido à sua capacidade de hidrolisar todos os antimicrobianos β-lactâmicos, incluindo os carbapenens. Estes antimicrobianos são utilizados no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes e conseguem se manter estáveis frente às serina-β-lactamases. A detecção de microrganismos produtores de MβL tem por finalidade auxiliar a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) na prevenção da disseminação desse mecanismo de resistência no ambiente hospitalar e impedir que ele chegue até a comunidade, bem como enfatizar o uso racional dos antimicrobianos disponíveis para uso clínico, pois, atualmente,há poucos investimentos da indústria farmacêutica na pesquisa de novos agentes antimicrobianos. The emergence and dissemination of antimicrobial resistance are problems of great importance worldwide, particularly between nosocomial pathogens of clinical importance such as nonfermentative Gram-negative bacilli and members of the family Enterobacteriaceae. The main mechanism of resistance these pathogens is the production of β-lactamases, which are enzymes that hydrolyzing the ring β-lactam hindering the action of antimicrobial β-lactam. The β- lactamases were classified into four classes of according its primary structure and may also be classified in two groups based on their catalytic mechanism, that is, serine-β-lactamases (Classes A, C and D) e metallo-β-lactamases (Class B). The metallo-β-lactamases (MβL) using ions divalentes, commonly zinc, as co-factor for its catalytic activity and currently represent one the most important class of enzymes, due of their ability to hydrolyze all antimicrobial β-lactam, including carbapenens, which are used in the treatment of Gram-negative bacteria multidrug-resistant and to remain stable before the serine-β-lactamases. The detection of samples producing of MβL helps infection control practioners to prevent the dissemination of this mechanism of resistance in the nosocomial environment and to prevent it come to the community, and emphasize the rational use of antimicrobial currently available for clinical use, since there are few investments in the pharmaceutical industry in search of new antimicrobial agents.