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Upon arrival of an action potential at the neuronal synapse, calcium ions (Ca2+) enter the neuron, allowing soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptor (SNARE) proteins to fully zipper, leading to the fusion of pre-docked synaptic vesicles containing neurotransmitters with the plasma membrane of the neurone. Regulatory proteins such as Complexin and Synaptotagmin are closely coupled to SNAREs during synaptic vesicle fusion and lead to synchronous, fast fusion. Synaptotagmin-1 (Syt1) is a transmembrane protein found in synaptic vesicles and is the Ca2+ sensor for synaptic transmission. Syt1 has two Ca2+ binding domains, C2A and C2B, with a flexible linker domain from the membrane region to C2A, and a short linker between C2A and C2B. A polybasic patch in C2B has been shown to bind to anionic lipids such as phophidylserine (PS) and phosphisotinol (PIP2) in the absence of Ca2+. Upon Ca2+ influx, Ca2+ ions bind in C2A and C2B. Ca2+ binding to Syt1 allows non-polar residues nearby the Ca2+ binding sites to insert into the membrane. While these mechanisms are relatively well-accepted, the precise biochemical and biophysical mechanisms for the Syt1 Ca2+ trigger remain unclear. In this work, we directly measure the interactions of Syt1-coated membranes with anionic membranes including PS and PIP2 lipids by the surface forces apparatus (SFA) technique, in order to mimic a Syt1-coated synaptic vesicle membrane interacting with the anionic plasma membrane. We perform site directed mutagenesis of the Ca2+ binding sites of C2A and C2B, along with the polybasic patch in C2B, to fully map the site-binding energetics of Syt1 with membranes, both in the absence and presence of divalent ions. We find that Syt1 binds with ~6 kBT in EGTA, ~10 kBT in Mg2+, and ~18 kBT in Ca2+. Molecular rearrangements measured during confinement of Syt1 between membranes are more prevalent in Ca2+ and Mg2+ and suggest that Syt1 initially binds through C2B, then reorients the C2 domains into the preferred binding configuration. Neutralization of C2B Ca2+ binding site leads to a drastic decrease of Syt1 binding energy in Ca2+, while the same mutation in C2A has a milder effect. These results illuminate that C2A and C2B cooperate in membrane binding, with an apparent predominant role of C2B., A l’arrivée d’un potentiel d’action au niveau d’une synapse neuronale, des ions calcium (Ca2+) pénètrent dans le neurone, permettant aux protéines SNAREs (N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptor) de s’assembler entièrement, engendrant la fusion des vésicules synaptiques contenant les neurotransmetteurs avec la membrane plasmique du neurone. Des protéines régulatrices telles que la Complexine et la Synaptotagmine sont étroitement couplées aux SNAREs et permettent une fusion rapide et synchrone. La Synaptotagmin-1 (Syt1), une protéine transmembranaire localisée sur les vésicules synaptiques, est le senseur calcique de la neurotransmission. Syt1 possède deux domaines de liaison au Ca2+, C2A et C2B, un domaine flexible reliant la région membranaire au C2A, ainsi qu’un court lien entre C2A et C2B. Il a été montré qu’une région polybasique dans le C2B se liait aux lipides anioniques tels que phosphatidylserine (PS) et phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) en l’absence de Ca2+. A l’entrée du Ca2+, les ions Ca2+ se lient au C2A et au C2B. La liaison de Syt1 aux ions Ca2+ permet aux résidus non polaires à proximité des sites de liaison au Ca2+ de s’insérer dans la membrane. Si ces mécanismes sont relativement bien acceptés, les mécanismes biochimiques et biophysiques précis du déclenchement de la fusion induit par la liaison de Syt1 au Ca2+ restent flous. Dans ce travail, nous mesurons directement les interactions de Syt1 liée à une membrane avec des membranes anioniques comprenant des lipides PS et PIP2 par un appareil à force de surface (SFA), afin d’imiter la membrane d’une vésicule synaptique contenant Syt1 interagissant avec la membrane plasmique anionique. Nous réalisons une mutagénèse dirigée sur les sites de liaison au Ca2+ de C2A et C2B, ainsi que sur le site polybasique de C2B, pour entièrement cartographier les énergies de liaison à la membrane relatives à ces sites, à la fois en présence et en l’absence d’ions divalents. Nous trouvons que Syt1 se lie avec une énergie de ~6 kBT dans l’EGTA, ~10 kBT dans le Mg2+, et ~18 kBT dans le Ca2+. Des réarrangements moléculaires mesurés pendant le confinement de Syt1 entre les membranes prévalent dans le Ca2+ et dans le Mg2+, et suggèrent que Syt1 se lie initialement via le C2B puis réoriente ses domaines C2 dans la conformation de liaison privilégiée. La neutralisation des sites de liaison au Ca2+ de C2B engendre une réduction radicale de l’énergie de liaison de Syt1 dans le Ca2+, alors que la même mutation dans le C2A a un effet plus nuancé. Ces résultats éclairent sur la coopérativité de C2A et C2B dans leur liaison à la membrane, et montrent un rôle apparent prédominant de C2B.

The doctoral work was divided in two parts, one on the structure-function studies of aminopeptidase A, and the second one, on those of the apelin receptor. I/Aminopeptidase A (APA) is a membrane bound monozinc aminopeptidase which generates, in the brain, angiotensin (Ang) III from Ang II. Ang III is one of the main effector peptides of the brain renin-angiotensin system, which exerts a tonic stimulatory action on the control of blood pressure in hypertensive rats. Thus, the blockade of brain APA by a specific and selective inhibitor, EC33 or its prodrug, RB150, normalizes blood pressure in two animal models of arterial hypertension (HTA). APA constitutes a potential therapeutic target for the treatment of HTA that justifies the development of more potent and selective APA inhibitors than EC33, with enhanced pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles when compared to RB150. With this aim, we built a three dimensional (3D) model of APA based on the recently published crystal structure of human APA. We validated this model by structure-function studies combining molecular modeling and site-directed mutagenesis demonstrating the crucial role of one residue in the S1 subsite responsible for substrate specificity of APA for N-terminal acidic amino-acid residues and two other residues constituting the S2' subsite of APA involved in the binding of the P2' acidic residue of tripeptidic inhibitors, previously developed in the laboratory. II/Apelin is the endogenous ligand of the human orphan receptor named APJ (ApelinR), a G protein-coupled receptor. Apelin and ApelinR are involved in the control of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. ApelinR constitutes a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retentions. Given that apelin half-life in the blood circulation is in the minute range, we aimed to develop potent metabolically stable apelin analogs.. In this context, it is necessary to understand how apelin binds to ApelinR and how it is activated. To do so, we build a 3D model of ApelinR based on the crystal structure of the chemokine receptor, CXCR4. We validated this model by structure-function studies by molecular modeling and site-directed mutagenesis. We showed that apelin interacts with the receptor through interactions between the basic residues of the peptide and the acidic residues of the ApelinR, located in the extracellular loops. ,We then developed metabolically stable apelin-17 (K17F) analogs following two different strategies. First, we substituted each residue of K17F by its D-isomer or a synthetic amino-acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain at the N-terminal part of K17F. These two strategies allowed to significantly improve plasma half-life of the modified peptides for several hours without modifying their pharmacological properties as compared to K17F. Two apelin metabolically stable analogs, P92 and LIT01-196, were found to have significantly higher in vivo activity than K17F with a strong capacity to decrease blood pressure and to inhibit vasopressin release in the blood stream inducing an increased aqueous diuresis. These new validated 3D models will be now used to perform in silico screening of virtual chemical libraries to discover new APA inhibitors and ApelinR agonists that could ultimately lead to new drug candidates. These compounds could be useful for the treatment of HTA and heart failure.; Ces travaux de thèse s'articulent autour de deux projets : les études structure-fonction de l'aminopeptidase A, d'une part, et celles du récepteur de l'apéline, d'autre part. I/L'aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) est une aminopeptidase monozinc membranaire qui, dans le cerveau, produit l'angiotensine (Ang) III à partir de l'Ang II. L'Ang III est l'un des principaux peptides effecteurs du système rénine-angiotensine cérébral qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle chez le rat hypertendu. Ainsi le blocage de l'APA par un inhibiteur spécifique et sélectif, l'EC33 ou sa prodrogue, le RB150, normalise la pression artérielle dans deux modèles expérimentaux d'hypertension artérielle (HTA). L'APA constitue une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l'HTA qui justifie le développement de nouveaux inhibiteurs de cette enzyme plus puissants et plus sélectifs que l'EC33 et avec un profil pharmacodynamique et pharmacocinétique amélioré par rapport au RB150. Pour cela, nous avons construit un modèle tridimensionnel (3D) de l'APA sur la base de la structure cristallographique de l'APA humaine récemment publiée. Nous avons ensuite validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée en démontrant l'implication, d'un résidu du sous-site S1 dans la spécificité de substrat acide de l'APA et de deux résidus formant le sous-site S2' interagissant avec le résidu P2' acide d'inhibiteurs tripeptidiques précédemment développés dans le laboratoire.II/L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ (ApélineR), un récepteur à sept domaines transmembranaires couplé aux protéines G. L'apéline et son récepteur sont impliqués dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Etant donné que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, l'objectif est de développer des analogues de l'apéline métaboliquement stables. Pour développer de tels composés, nous avons entrepris de comprendre comment l'apéline se lie à son récepteur et comment elle l'active. Dans ce but, nous avons construit un modèle 3D de l'ApélineR basé sur la structure cristallographique du récepteur aux chimiokines, CXCR4. Nous avons validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée. Nous avons identifié à la surface du récepteur, les résidus acides des boucles extracellulaires qui interagissent avec les résidus basiques de l'apéline. Nous avons ensuite développé des analogues de l'apéline-17 (K17F) métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de l'apéline. Ces deux stratégies ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés particulièrement actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse. Les modèles 3D validés de l'APA et de l'ApélineR seront utilisés pour des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l'APA et des agonistes de l'ApélineR qui pourraient conduire à terme à de nouveaux candidats-médicaments. Ces composés pourraient être utiles pour le traitement de l'HTA et de l'insuffisance cardiaque.

The physiological function of Human Neuroglobin (Ngb), discovered in 2000, is still unknown. Compared to other classical globins Haemoglobin and Myoglobin, Ngb has some structural specificities. Its haem, which is its reactive centre, is hexacoordinated by distal histidine 64 and exists under two isomer forms A and B. Moreover, Ngb possesses an intramolecular disulfide bridge between two cysteines 46 and 55.The relationship between its structural characteristics and its functions in vivo does not remain well-understood. The goal of this thesis was to underline the impact of some structural features on the Ngb properties and reactivity in vitro. Thus Ngb variants H64V, F106L, A90P and C46G were produced. Experimental studies were performed by UV-Visible spectrophotometry, circular dichroism and NMR. Variants were characterized : their stability as a function of pH were tested and their reactivity trough the CN binding reaction were evaluated.We have shown that the Ngb structure was strongly dependant on the presence of the distal histidine, the disulfide bridge and the haem environment. The first and unique determination of variants’ molar absorption coefficients underlined the influence of the haem vicinity and disulfide bridge on the electronic haem environment. We have brought some evidence that the disulfide bridge and the mutated amino acids have an impact on the isomer A Ngb ability to bind the cyanide whereas isomer B is poorly affected by those two parameters. This phenomenon raises the issue of the existence and function of the two isomer forms in vivo., La neuroglobine humaine (Ngb) est une globine découverte en 2000 dont la fonction principale demeure encore inconnue. Par comparaison avec l’hémoglobine (Hb) et la myoglobine (Mb), les globines les plus étudiées, la Ngb possède une séquence en acides aminés particulière. Il en résulte des caractéristiques structurales propres à la Ngb. L’hème, qui constitue le site actif de la Ngb, est hexacoordiné par l’histidine distale 64 et existe sous deux formes isomères A et B. La Ngb comprend également un pont disulfure Cys46-Cys55 intramoléculaire.La relation entre ces spécificités et d’éventuelles fonctions de la Ngb demeure cependant assez mal explorée. Notre objectif durant la thèse, était de mettre en évidence in vitro l’influence de différents éléments structuraux sur les propriétés et la réactivité de la Ngb. Pour ce faire, les mutations H64V, F106L, A90P et C46G ont été réalisées. Des études expérimentales à l’aide de spectrophotométrie UV-visible, de dichroisme circulaire et de RMN, ont été effectuées pour caractériser les mutants synthétisés, tester leur stabilité en fonction du pH et évaluer leur réactivité vis-à-vis de la fixation du ligand CN.Nous avons ainsi montré que la structure de la Ngb était influencée par la présence de l’histidine distale, du pont disulfure et de l’environnement de l’hème. L’étude, pour la première fois, des coefficients d’extinction molaire des protéines mutées a permis de souligner l’impact des acides aminés au voisinage de l’hème mais aussi du pont disulfure sur l’environnement électronique de l’hème. Nous avons aussi mis en évidence que le pont disulfure et les acides aminés mutés influaient sur la capacité de la forme isomère A de la Ngb à fixer le cyanure. La forme isomère B est en revanche peu impactée par ces deux paramètres. Cela soulève la question de l’existence et de la fonction des deux formes isomères de l’hème in vivo.

Hydroperoxide lyase (HPL) is an enzyme found in higher plants and involved in the lipoxygenase pathway. HPL acts on the 9- and/or 13-hydroperoxy fatty acids to produce C6 or C9 aldehydes, responsible for the fresh odor of cut grass known as "green note" and widely used by cosmetic and food industries. Production systems using recombinant enzymes are developed to meet the growing demand for natural green leaf volatiles. Thus, HPL from olive fruit (HPLwt) and the enzyme with its chloroplast transit peptide deleted (HPLdel), were cloned in the laboratory and expressed in Escherichia coli. Both recombinant enzymes were purified and biochemically characterized. They act only on 13-hydroperoxides, exhibit maximum activity at pH 7.5 and 25°C, and are more effective on the 13-hydroperoxy linoleic acid. The study of HPLwt and HPLdel stability over time has shown that all of the enzymatic activity is retained during a five weeks storage at -80°C in the presence of 10% glycerol. Furthermore, the addition of chemical compounds such as NaCl, Na2SO4 and glycine have increased the activity of both enzymes. Meanwhile, recombinant HPLs have been expressed in the eukaryotic system Pichia pastoris yeast. The HPLs are not secreted into the culture medium, but are expressed intracellularly, with a maximum after 24h of induction. Moreover, HPL structure-function relations were studied. The olive 13-HPL three dimensional structure has been built by computational modelling. Amino acids potentially involved in regiospecificity of the enzyme have been identified and modified by site-directed mutagenesis. Thus, T302K mutant has a catalytic efficiency on 13-hydroperoxides similar to the HPLwt, but it is also active on the 9-hydroperoxide of linoleic acid., L’hydroperoxyde lyase (HPL) est une enzyme présente chez les végétaux supérieurs et impliquée dans la voie de la lipoxygénase. Elle agit sur les 9- et/ou les 13-hydroperoxydes d’acide gras pour produire des aldéhydes à 6 ou 9 carbones, responsables de l’odeur fraîche de l’herbe coupée dite « note verte », et très utilisés par les industries cosmétiques et agroalimentaires. Afin de répondre à la demande croissante en molécules à note verte naturelles, des systèmes de production utilisant des enzymes recombinantes sont développés. Ainsi, l’HPL d’olive (HPLwt) et l’enzyme dépourvue de son peptide de transit chloroplastique (HPLdel), ont été clonées au laboratoire et exprimées chez Escherichia coli. Les deux enzymes recombinantes ont été purifiées puis caractérisées biochimiquement. Elles sont spécifiques des 13-hydroperoxydes, présentent une activité maximale à pH 7,5 et à 25°C, et agissent plus efficacement sur le 13-hydroperoxyde d’acide linolénique. L’étude de la stabilité de l’HPLwt et de l’HPLdel au cours du temps a montré que la totalité de l’activité enzymatique est conservée durant cinq semaines de stockage à -80°C en présence de glycérol 10%. De plus, l’ajout de composés chimiques tels que le NaCl, le Na2SO4 et la glycine ont permis d’augmenter l’activité des deux enzymes. Parallèlement, les HPL recombinantes ont été exprimées dans un système eucaryote, la levure Pichia pastoris. Les enzymes ne sont pas sécrétées dans le milieu de culture, mais exprimées au niveau intracellulaire, avec une activité maximale obtenue après 24h d’induction. Par ailleurs, les relations structure-fonction de l’HPL ont été étudiées. La structure tridimensionnelle de la 13-HPL d’olive a été modélisée grâce à des méthodes computationnelles. Des acides aminés potentiellement impliqués dans la régiospécificité de l’enzyme ont été ciblés, puis modifiés par mutagénèse dirigée. Ainsi, le mutant T302K présente une efficacité catalytique sur les 13-hydroperoxydes similaire à celle de l’HPLwt, mais il est également actif sur le 9-hydroperoxyde d’acide linolénique.

International audience; In Arabidopsis thaliana, the acyl acid amido synthetase Gretchen Hagen 3.5 (AtGH3.5) conjugates both indole-3-acetic acid (IAA) and salicylic acid (SA) to modulate auxin and pathogen response pathways. To understand the molecular basis for the activity of AtGH3.5, we determined the X-ray crystal structure of the enzyme in complex with IAA and AMP. Biochemical analysis demonstrates that the substrate preference of AtGH3.5 is wider than originally described and includes the natural auxin phenylacetic acid (PAA) and the potential SA precursor benzoic acid (BA). Residues that determine IAA versus BA substrate preference were identified. The dual functionality of AtGH3.5 is unique to this enzyme although multiple IAA-conjugating GH3 proteins share nearly identical acyl acid binding sites. In planta analysis of IAA, PAA, SA, and BA and their respective aspartyl conjugates were determined in wild-type and overexpressing lines of A thaliana This study suggests that AtGH3.5 conjugates auxins (i.e., IAA and PAA) and benzoates (i.e., SA and BA) to mediate crosstalk between different metabolic pathways, broadening the potential roles for GH3 acyl acid amido synthetases in plants.

Bioelectrical systems, such as enzymatic biofuel cells, often require a molecular construction complex comprising the enzyme cofactor, intermediary molecules and electrochemical mediators. In order to simplify them, we have replaced these different partners by 13 analogs that are simple to synthesize after identification by screening in silico. The nicotinamide ring is coupled to an aromatic moiety and an electrochemical mediator is then coupled to it as well, resulting in various colored powders (pink, red). The first step' s yield is around 83% with a purity of approximately 92%. The second step's yield is comprised between 45% and 65% with a purity of 97%. The analogs were characterized chemically (NMR, mass spectrometry) and electrochemically (cyclic voltammetry, spectroelectrochemistry). The activities of two enzymes, the formate dehydrogenase (FDH) and the horse liver alcohol dehydrogenase (HLADH), and an organometallic catalyst, [Cp*Rh(bpy)H2O]2+, were evaluated with these analogs. Weak activities were observed for 4 analogs using the HLADH and 1 analog using the FDH. Unlike the enzymes, the reduction of a conjugated mediator was confirmed with the catalyst [Cp*Rh(bpy)H2O]2+ using cyclic voltammetry. The wild type FDH is not adapted to function with these new substrates, which can be solubilized in an IL such as [MMIm][Me2PO4]. An FDH (N187S/T321S) shown to be tolerant to [MMIm][Me2PO4], and obtained previously by directed evolution, was studied by isolating the two single mutants, N187S and T321S. The double mutant N187S/T321S and the mutant N187S are 4 times more active in aqueous solution and in [MMIm][Me2PO4]. Fluorescence spectroscopy analyses showed that the single mutation N187S favorises FDH dimer stability by modifying the pKa of the amino acid E163. The latter is involved in FDH thermal stability and tolerance in ILs, Les systèmes bioélectroniques tels que les biopiles enzymatiques nécessitant souvent l'utilisation des assemblages moléculaires complexes comprenant le cofacteur de l'enzyme, des agents de couplage et des médiateurs électrochimiques. Afin de les simplifier, nous avons remplacé ces différents partenaires par 13 analogues simples à synthétiser après identification par criblage in silico. Le noyau aromatique est couplé à un noyau aromatique et puis un médiateur électrochimique est couplé à celui-ci. Les produits sont des poudres de couleurs variées (rose, rouge). Le rendement de la première étape est de 83% avec une pureté d'environ 92%. Le rendement de la seconde étape est compris entre 45% et 65% avec une pureté de 97%. Ces analogues ont été caractérisés chimiquement (RMN, spectrométrie de masse) et électrochimiquement (voltammétrie cyclique et spectroélectrochimie). Les activités de deux enzymes, la formiate déshydrogénase (FDH) et l'alcool déshydrogénase de foie de cheval (HLADH), et d'un catalyseur organométallique, le [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+, ont été évaluées avec ces analogues. De faibles activités ont été observées en présence de l'HLADH avec 4 analogues et en présence de la FDH avec un seul analogue. Au contraire aux enzymes, la réduction d'un médiateur a pu été confirmée en présence du catalyseur [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+ par voltammétrie cyclique. La FDH native n'est pas adaptée à fonctionner avec ces nouveaux substrats solubles dans un LI, le [MMIm][Me2PO4]. Une FDH tolérante (N187S/T321S) au [MMIm][Me2PO4] précédemment obtenue par évolution dirigée a été donc étudiée en isolant les simples mutants N187S et T321S. Le double mutant N187S/T321S et le simple mutant N187S sont 4 fois plus actifs en solution aqueuse et en présence de LI. Des analyses par spectroscopie de fluorescence ont montré que la simple mutation N187S favorise la stabilité du dimère de FDH en modifiant le pKa de l'acide aminé E163. Celui-ci est impliqué dans la thermostabilité et la tolérance des FDHs aux LIs

International audience; Mutagenesis experiments suggest that Asp79 in cellulase Cel6A (E2) from Thermobifida fusca has a catalytic role, in spite of the fact that this residue is more than 13 Å from the scissile bond in models of the enzyme–substrate complex built upon the crystal structure of the protein. This suggests that there is a substantial conformational shift in the protein upon substrate binding. Molecular mechanics simulations were used to investigate possible alternate conformations of the protein bound to a tetrasaccharide substrate, primarily involving shifts of the loop containing Asp79, and to model the role of water in the active site complex for both the native conformation and alternative low-energy conformations. Several alternative conformations of reasonable energy have been identified, including one in which the overall energy of the enzyme–substrate complex in solution is lower than that of the conformation in the crystal structure. This conformation was found to be stable in molecular dynamics simulations with a cellotetraose substrate and water. In simulations of the substrate complexed with the native protein conformation, the sugar ring in the –1 binding site was observed to make a spontaneous transition from the 4C1 conformation to a twist-boat conformer, consistent with generally accepted glycosidase mechanisms. Also, from these simulations Tyr73 and Arg78 were found to have important roles in the active site. Based on the results of these various MD simulations, a new catalytic mechanism is proposed. Using this mechanism, predictions about the effects of changes in Arg78 were made which were confirmed by site-directed mutagenesis.

The detection of odorant molecules has become an important challenge in different research area, such as the food industry, medical diagnostics and homeland security. Indeed, the thousands of odorants in our environment provide information on their chemical nature or their concentration. Human olfactory system is capable of discriminating thousands of different molecules thanks to biochemical mechanisms involving multiple protein receptor partners and a combinatorial coding. These biomolecules that include olfactory receptors and odorant-binding proteins (OBP) represent an interesting source of detectors for the design of biosensors. OBPs are small soluble proteins present in nasal mucus at millimolar concentrations. Their hydrophobic binding pocket gives them the ability to reversibly bind odorant molecules. OBPs are robust and easy to produce and are thus good candidates for the design of biosensors. In this work, we focused on the detection of odorant molecules associating OBPs as a bioreceptor and electrochemistry as a transduction method. Using site-directed mutagenesis, we have shown that by substituting a single amino acid in the binding pocket of two rat OBPs (rOBP2 and rOBP3), it is possible to modulate their binding affinities towards odorants. In parallel, we described a qualitative and quantitative method for the detection of volatile molecules using OBPs. We have shown that rOBP3 binds 2-methyl-1,4-naphtoquinone (MNQ), an electrochemical probe. The amount of MNQ displaced from the binding pocket of rOBP3 by the model odorant 3-isobutyl-2-methoxypyrazine (IBMP), was measured using square-wave voltammetry. We determined the dissociation constants of the rOBP3 / MNQ and rOBP3 / IBMP complexes. These values measured by electrochemistry were confirmed by a competitive fluorescent assay and isothermal titration calorimetry. By combining this new analytical method to rOBP3 variants with different and complementary binding profiles, we were able to selectively detect each of the components of a ternary mixture of odorants. This work, that combines the engineering of OBPs and electrochemistry, offers us interesting perspectives in the field of electronic noses., La détection de molécules odorantes représente un enjeu important dans divers domaines tels que l’industrie alimentaire, le diagnostic médical et la sécurité du territoire, par exemple. En effet, les odorants, présents par milliers dans notre environnement, véhiculent de nombreuses informations, via leur nature chimique ou leur concentration. Notre système olfactif est capable de discriminer des milliers de molécules différentes via des mécanismes biochimiques impliquant l’association de nombreux partenaires protéiques et un codage combinatoire de l’information. Ces biomolécules, qui englobent notamment les récepteurs olfactifs et les protéines de liaison aux odorants (OBP), constituent une source intéressante d’éléments de détection pour la conception de biocapteurs. Les OBP sont de petites protéines solubles présentent dans le mucus nasal à des concentrations de l’ordre du millimolaire. Leur poche de liaison hydrophobe leur confère la capacité de lier de façon réversible les molécules odorantes. Leur robustesse et leur manipulation aisée en font de bonnes candidates pour l’élaboration de biocapteurs. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la détection de molécules odorantes en associant des OBP comme biorécepteur et l’électrochimie comme méthode de transduction. Par une méthode de mutagenèse dirigée, nous avons montré qu’en modifiant un seul des acides aminés dans la poche de liaison de deux OBP de rat (rOBP2 et rOBP3), il était possible de moduler leurs affinités envers les odorants. En parallèle, nous avons décrit la détection qualitative et quantitative de molécules volatiles à partir d’OBP. Nous avons montré que rOBP3 lie la 2-méthyl-1,4-naphtoquinone (MNQ), une sonde électrochimique. La quantité de MNQ déplacée de la poche de liaison de rOBP3 par la 3-isobutyl-2-méthoxypyrazine (IBMP), un odorant modèle, a été mesurée par voltammétrie cyclique à vagues carrées. Nous avons déterminé les constantes de dissociation des complexes rOBP3 / MNQ et rOBP3 / IBMP. Les valeurs mesurées par électrochimie ont été confirmées par compétition avec une sonde fluorescente et par titration calorimétrique isotherme. En combinant cette nouvelle méthode analytique à des variants de rOBP3 qui présentent des profils de liaison différents et complémentaires, nous avons détecté sélectivement chacun des constituants d’un mélange ternaire d’odorants. Ces travaux, qui allient ingénierie des OBP et électrochimie, offrent des perspectives intéressantes dans le domaine des nez électroniques.

Lipoxygenases (LOXs, EC 1.13.11.12) are widespread dioxygenases containing a non heminic iron atom. In plants, LOXs are at the beginning of a metabolic pathway involved in several physiological processes and in the response to environmental stress. A LOX initiates the pathway, catalyzing a regiospecific and stereospecific insertion of oxygen on the pentadiene system of a free polyunsaturated fatty acid (linoleic or linolenic acid) to form fatty acid hydroperoxides.An olive lipoxygenase called olive LOX1, cloned at laboratory, has been expressed in E. coli strain and purified. Olive LOX1 produces 9S-hydroperoxides of and 13R-hydroperoxides from linoleic acid, in a ratio of 2:1, being the only plant LOX to produce R-hydroperoxides described to date. From the currently known models explaining the control of reactional specificity, none can be applied to olive LOX1. A three-dimensional model has been built by homology modeling to understand the catalytic mechanism of olive LOX1. Site-directed mutagenesis experiments have been used to modify two residues of particular interest, the phenylalanine 277 and the tyrosine 280, allowing us to point the active site entrance near these two residues. Other residues of interest have been modified to study their role in the catalytic mechanism and the reactional specificity of olive LOX1. The results have led us to propose a first hypothesis for the reactional mechanism of this enzyme: the substrate could enter into the active site with its carboxylate-end first, and could be stabilized in the active site by hydrophobic side chains of several residues. A channel could bring oxygen into the active site at a position near the side chain of the leucine 579 residue, this one targeting oxygen onto the pentadiene system of the substrate, controlling by this way the reactional specificity of olive LOX1.LOX are involved in oxylipins synthesis. Arabidopsides are a class of oxylipins found in Arabidopsis that could be produced by action of a 13-LOX on galactolipids, which carry esterified fatty acids. Activity of soybean 13-LOX, olive 9/13-LOX1 and potato 9-LOX has been investigated with galactolipids. A low activity was measured when soybean and olive LOXs were used. Activity was far more important when potato LOX was used. These results suggest that LOX can act on esterified fatty acids, especially galactolipids., Les lipoxygénases (LOX, EC 1.13.11.12) sont des dioxygénases à fer non héminique très répandues. Chez les végétaux, ces enzymes sont à l’origine d’une voie métabolique impliquée dans de nombreux processus physiologiques, mais aussi dans la réponse à un stress environnemental. La LOX initie la voie en catalysant l’incorporation régiospécifique et stéréospécifique de dioxygène sur le système pentadiénique d’un acide gras libre polyinsaturé (préférentiellement l’acide linoléique ou l’acide linolénique) pour générer un hydroperoxyde d’acide gras.Une lipoxygénase d’olive appelée LOX1, clonée au laboratoire, a été exprimée chez E. coli et purifiée. Elle produit à partir d’acide linoléique des hydroperoxydes de configuration 9S et 13R dans des proportions 2:1. Elle est la seule lipoxygénase végétale décrite à ce jour produisant des hydroperoxydes de configuration R. Les modèles proposés pour expliquer le contrôle de la spécificité réactionnelle des LOX ne s’appliquent pas à la LOX1 d’olive. Afin de mieux comprendre son mécanisme de fonctionnement, un modèle tridimensionnel de la LOX1 d’olive a été construit. La modification par mutagénèse dirigée de deux résidus particuliers, la phénylalanine 277 et la tyrosine 280, a permis d’identifier l’entrée du site actif de la LOX1 d’olive. D’autres résidus particuliers ont été modifiés par mutagénèse dirigée afin d’étudier leur rôle dans le mécanisme catalytique et le contrôle de la spécificité réactionnelle de la LOX1 d’olive. L’analyse globale des résultats obtenus a permis de proposer une première hypothèse quant au fonctionnement de cette enzyme : le substrat pénètrerait dans le site actif de la LOX1 d’olive par son extrémité carboxylate, et serait stabilisé dans le site actif par plusieurs résidus hydrophobes. Un canal pourrait cibler l’oxygène dans le site actif par l’intermédiaire du résidu L579 sur le système pentadiénique du substrat, contrôlant de cette manière la spécificité réactionnelle de la LOX1 d’olive.Par ailleurs, des oxylipines retrouvées chez Arabidopsis, appelées arabidopsides, pourraient être formées par action directe d’une 13-LOX sur des acides gras estérifiés des galactolipides. L’action de la 13-LOX1 de soja, la 9/13-LOX1 d’olive et la 9-LOX de pomme de terre a été testée avec des galactolipides. Une faible activité a été mesurée avec la 13-LOX1 de soja et la 9/13-LOX1 d’olive. Une activité plus importante a été mesurée avec la 9-LOX de pomme de terre. Ces résultats suggèrent que l’action des LOX est possible sur des acides gras estérifiés des galactolipides.

U3 snoRNA contains two conserved pairs of boxes C'/D and B/C needed to bind the stably associated proteins. Binding of protein Snu13p/15.5 kD to each of the conserved motifs is a prerequisite for recruitment of the 4 other U3 snoRNP proteins, namely: Nop1p, Nop56p and Nop58p on the C'/D motif and the Rrp9p U3 specific protein on the B/C motif. We used the known 3D structure of a human G protein containing 7 WD-40 motifs and 3D structure homology modeling methods to build a 3D structure model for Rrp9p. In parallel, by production of variant U3 snoRNAs, and by testing their in vivo stabilities and activities, we identified the C'/D determinants needed for association of proteins Snu13p, Nop1p, Nop56p and Nop58p to U3 snoRNA. Based on a 3D structure model of U3 C/D box RNP built by C Charron, we then formulated hypotheses on the possible interactions between the C'/D motif and amino acids from Snu13p and Nop58p and verified the hypotheses by site-directed mutagenesis of yeast cell components. The data also revealed that very low amounts of U3 snoRNA are sufficient to ensure yeast growth. By site directed mutagenesis, I also studied how the C'/D and B/C motifs should be positioned one relative to the other in order to be functional. Taken together, my work brings important information on the architecture of yeast U3 snoRNP and its functional constraints, Le snoRNA U3 contient deux motifs conservés C'/D et de B/C qui permettent de recruter les protéines constitutives de la snoRNP U3. La liaison de la protéine Snu13p/15.5 kD à chacun de ces motifs est un préalable pour le recrutement des 4 autres protéines, à savoir : Nop1p, Nop56p et Nop58p sur le motif C'/D et de Rrp9p, une protéine spécifique du snoRNA U3, sur le motif B/C. Nous avons utilisé la structure 3D connue d'une protéine humaine contenant 7 motifs WD-40 et des méthodes de modélisation moléculaire pour proposer un modèle de structure 3D de Rrp9p. En parallèle, nous avons identifié les déterminants nécessaires à l'association des protéines Snu13p, Nop1p, Nop56p et Nop58p sur le motif C'/D du snoRNA U3, ceci en produisant différents variants du snoRNA U3 et en testant leurs capacités fonctionnelles et leurs stabilités dans la levure. Sur la base d'un modèle 3D d'une snoRNP C/D construit par C. Charron, nous avons ensuite formulé des hypothèses sur les interactions possibles entre le motif C'/D et les acides aminés des protéines Snu13p et Nop58p et confirmé ces hypothèses par mutagénèse dirigée. Les données ont en plus révélé qu'une faible quantité de snoRNA U3 est suffisante pour assurer la croissance des levures. Toujours par mutagénèse dirigée et étude des conséquences in cellulo, j'ai pu montrer quelles sont les contraintes en distance entre les motifs C'/D et B/C. Ce qui nous permet de formuler des hypothèses sur leurs positionnements relatifs dans la snoRNP. Au total mon travail a permis d'apporter des informations importantes sur l'architecture et les contraintes fonctionnelles de la snoRNP U3 de levure

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +., Nitrogen is one of the most vital elements in the world for living creatures since it is essential for the production of the basic building blocks of the cell; amino acids, nucleic acids and other cellular constituents. The atmosphere is 78% nitrogen gas (N2), a source of nitrogen unusable by most organisms except for those possessing the enzyme nitrogenase, such as diazotrophic bacteria species. These microorganisms are capable of converting atmospheric nitrogen to ammonia (NH3), which is one of the most preferable nitrogen sources. This ATP demanding reaction, called nitrogen fixation, is catalysed by the nitrogenase enzyme, which is the most important enzyme in the nitrogen cycle. Some proteins are potential regulators of nitrogenase synthesis and activity; AmtB, DraT, DraG, PII proteins and etc. In this thesis I performed various experiments in order to better understand their roles in Rhodobacter capsulatus, in more detail. The membrane protein AmtB, which is widespread among archaea, bacteria and eukaryotes, is a member of the MEP/Amt/Rh family. The AmtB proteins are ammonium transporters, taking up external ammonium, and have also been suggested to sense the presence of ammonium. It has been shown that in Rhodobacter capsulatus AmtB functions as a sensor for the presence of external ammonium in order to regulate nitrogenase. Nitrogenase consists of two metalloprotein components named MoFe-protein and Fe-protein. The addition of ammonium to R. capsulatus culture medium leads to a series of reactions which result in the deactivation of nitrogenase, called “nitrogenase switch-off”. A critical reaction in this process is one in which DraT adds an ADP-ribose group to the Fe-protein of nitrogenase. The entrance of ammonia through the AmtB pore is regulated by GlnK sequestration. GlnK is a PII protein and PII proteins are one of the central proteins in the regulation of nitrogen metabolism. Not only is GlnK-AmtB sequestration important in nitrogenase regulation, but binding of ammonium by AmtB or its partial transport is also necessary. AmtB-GlnK complexes are thought to bind DraG, which is responsible for removing the ADP-ribose that DraT adds to nitrogenase, to form a ternary complex. In this thesis details of the signal transduction mechanism and ammonium transport were examined by generating and characterizing RCZC, a (D335A) site- directed mutant of AmtB. The ability of this mutant, as well as previously constructed mutants RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) and RCIA4 (W237A), to “switch-off” nitrogenase activity was measured by gas chromatography. The results revealed that all the above amino acid residues have critical roles in nitrogenase regulation. Immunoblotting was also carried out to check the presence of ADP-ribosylated Fe-protein. D335, D388 and W237 seem to be crucial for NifH ADP-ribosylation, since their mutants (RCZC, RCIA1 and RCIA4 respectively) didn't show ADP-ribosylation on Fe-protein. In addition, although a slight ADP-ribosylation was observed for RCIA2 (G344C) we still consider it as an important amino acid residue in this matter whereas the remaining mutant RCIA3 (H193E) showed Fe-protein ADP-ribossylation after an ammonium shock, therefore it doesn't seem to be important in NifH ADP-ribosylation. In addition R. capsulatus possesses a second Amt called AmtY, which in contrast to AmtB, doesn't appear to have any specific roles. In order to find out its functionality, AmtY was overexpressed in an E. coli strain lacking AmtB (GT1001 pRSG1) (which was carried out previously by other lab members) and AmtY-GlnK complex formation in response to ammonium addition was examined. It was shown that even though AmtY is able to take up ammonia when expressed in E. coli it fails to associate with GlnK in response to NH4+.

The Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) is a variant of Green Fluorescent Protein extracted from the jellyfish Aequaria Victoria (GFPav). The ECFP, emitting in the cyan, is one of the most donors used in studies of resonant transfer excitation energy and is integrated in many constructions of biosensors. However, it suffers from several drawbacks. In particular, it presents a complex photophysical properties and high environmental sensitivity that are obstacles to its quantitative interpretation of fluorescence signals in cellular imaging. Our goal is to develop, through the introduction of minimum mutations, a derivative of the ECFP with simplified emission properties and low environmental sensitivity.Mutations were introduced by site-directed mutagenesis, into two positions in the peptide sequence of ECFP which helped to generate derivatives with modulated photophysical properties and low pH sensitivity. In particular, we have managed to generate a fluorescent protein, Aquamarine, with almost ideal photophysical properties characterized by a quantum yield of about 0.9 and pure single exponential fluorescence decay. It also has a greatly reduced sensitivity to the pH with half transition point near 3.3.This manuscript presents a detailed study of fluorescence properties of various proteins generated. Several parameters for proper use in fluorescence imaging were evaluated. In addition to the pH sensitivity based on a wide range of pH (2.5 to 11), particular attention was paid to the photophysical performance (simpler fluorescence emission decay, average lifetime, quantum yield, brightness, ...) of these derivatives. In addition, we studied structural changes on these derivatives at acidic pH by circular dichroism. Finally, a detailed examination of the steady state fluorescence and time-resolved fluorescence helped to highlight the existence of several emissive species contributing to the photophysics of these proteins and the origin of their acid transition. These results constitute a first approach to a better understanding of the structure-photophysical dynamics of ECFP-and these derivatives; La Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) est un variant spectral de la Green Fluorescent Protein extraite de la méduse Aequaria Victoria (GFPav). La ECFP, émettant dans le cyan, est un des donneurs les plus utilisés dans les études de transfert résonnant d’énergie d’excitation et est integré dans de nombreuses constructions de biosenseurs. Pourtant, elle souffre de nombreux inconvenients. Notamment elle pésente des propriétés photophysiques complexes et une forte sensibilité environnementale qui sont des freins à une interprétation quantitative de ses signaux de fluorescence en imagerie cellulaire. Notre objectif vise à mettre au point, grâce à l’introduction d’un minimum de mutations, un dérivé de la ECFP présentant des propriétés d’émission simplifiées et performantes ainsi qu’une faible sensibilité environementale. Des mutations ont été introduites, par mutagenèse dirigée, à deux positions clefs de la séquence peptidique de la ECFP ce qui a permis de générer des dérivés présentant des propriétés photophysiques et une sensibilité au pH modulées. En particulier, nous avons réussit à générer une protéine fluorescente, l’Aquamarine, aux propriétés photophysiques quasi-idéales caractérisée par un rendement quantique de l’ordre de 0,9 et des déclins d'émission de fluorescence quasi-monexponentiels. Elle présente également une sensibilité au pH fortement réduite avec un pH de demi-transition acide de 3,3.Ce manuscrit présente l’étude détaillée des propriétés d’émission de fluorescence des diverses protéines générées. Plusieurs paramètres présentant un intérêt particulièrement important pour une utilisation adéquate en imagerie de fluorescence ont été évalués. Outre la sensibilité au pH établie sur une large gamme de pH (2,5-11), une attention particulière a été portée sur les performances photophysiques (monoexponentialité du déclin d'émission de fluorescence, durée de vie moyenne, rendement quantique, brillance,…) de ces dérivés. De plus, grâce à des expériences de dichroïsme circulaire, des informations sur les changements structuraux, dont ces dérivés sont le siège à pH très acide, ont été obtenues. Enfin, l’examen détaillé des données spectroscopiques stationnaires et résolues en temps a permis de mettre en lumière l’existence de plusieurs espèces émissives contribuant à la photophysique de ces protéines et à l’origine de leur transition acide. L’ensemble de ces résultats constitue une première approche pour une meilleure compréhension de la relation structure-photophysique-dynamique de la ECFP et de ces dérivés.

Glutaredoxins (Grxs) are small ubiquitous proteins implicated in numerous biological processes through their disulfide bonds reduction capacity, especially glutathione adducts, and to bind ironsulfur clusters. In higher plants, this multigenic family's members (30 to 40 genes) are distributed through 4 classes. The work done during this internship aimed at the biochemical characterization of GrxC1, C2, C3 and C4 (class I) from Populus trichocarpa to complete the data already obtained on the poplar GrxS12 and the GrxC5 of Arabidopsis thaliana, to attempt to elucidate the catalytic mechanism at stake as well as to understand the role of the 3rd cysteine present in the C-terminal region in PtGrxC1 and PtGrxC2. These proteins and their respective cysteinic mutants have been produced in recombinant form in the heterolog system Escherichia coli and then purified. The measurement of the free thiol groups and the mass spectrometry experiences habe revealed that these 4 proteins are produced oxydized and that, as for PtGrxS12 and AtGrxC5, the catalytic cysteine of PtGrxC3 and C4 is stably glutathionylated. The redox state analysis of the wild type isoforms suggest the implication of the C-ter cysteine of PtGrxC1 and C2 in a covalent dimer's formation, of which the properties should be explored further. The activities of the wild type isoforms have been assessed in vitro for 2 classical substrates for the Grxs, dehydroascorbate and hydroxyéthyldisulfide. The reduction capacity of insulin disulfide bonds has also been assessed. The results suggest that these 4 Grxs use a mechanism previously described as monothiol, as GrxS12 and GrxC5, which implicate only one cysteine over the 2 or 3 present. Finaly, the Western blot analysis of the Grxs abundance in several organs shows that PtGrxC4 is expressed in most of the analysed tissues, particularly in stems and fruits.; Les glutarédoxines (Grxs) sont de petites protéines ubiquitaires impliquées dans de nombreux processus biologiques à travers leur capacité à réduire des ponts disulfure, notamment des adduits glutathion et à lier des centres fer-soufre. Chez les plantes supérieures, les membres de cette famille multigénique (30 à 40 gènes) sont répartis en 4 classes. Les travaux réalisés au cours de ce stage visait à caractériser biochimiquement les GrxC1, C2, C3 et C4 (classe I) de Populus trichocarpa afin de compléter les données déjà obtenues sur GrxS12 de peuplier et GrxC5 d'Arabidopsis thaliana, de tenter d'élucider le mécanisme catalytique mis en jeu ainsi que le rôle de la 3ème cystéine présente en région C-terminale chez PtGrxC1 et PtGrxC2. Les protéines et leurs mutants cystéiniques respectifs ont été produits sous forme recombinante dans le système hétérologue Escherichia coli puis purifiés. La mesure des groupements thiols libres et les expériences de spectrométrie de masse ont révélé que ces 4 protéines sont produites sous forme oxydée et que, tout comme PtGrxS12 et AtGrxC5, la cystéine catalytique de PtGrxC3 et C4 est glutathionylée de manière stable. L'analyse de l'état redox des isoformes sauvages suggère l'implication de la cystéine en C-ter de PtGrxC1 et C2 dans la formation d'un dimère covalent dont les propriétés devront être étudiées plus avant. Les activités des isoformes sauvages ont été mesurées in vitro pour 2 substrats classiquement utilisés dans le cas des Grxs, le déhydroascorbate et l?hydroxyéthyldisulfide. La capacité de réduction des ponts disulfure de l'insuline a également été évaluée. Les résultats obtenus suggèrent que ces 4 Grxs utilisent un mécanisme dit monothiol, tout comme GrxS12 et C5, faisant intervenir une seule cystéine sur les 2 ou 3 cystéines présentes. Enfin, l'analyse par Western blot de l'abondance de ces Grxs dans plusieurs organes indique que PtGrxC4 est exprimée dans la plupart des tissus analysés, et de manière importante dans les tiges et les fruits.

La fixation de l’azote diatomique est un processus très important à la vie, vu sa nécessité dans la biosynthèse de plusieurs molécules de base; acides aminés, acides nucléiques, etc. La réduction de l’azote en ammoniaque est catalysée par la nitrogénase, une enzyme consommatrice de beaucoup d’énergie étant donné qu’elle nécessite 20 à 30 moles d’ATP pour la réduction d’une mole d’azote. De ce fait une régulation rigoureuse est exigée afin de minimiser le gaspillage d’énergie. Plusieurs systèmes de contrôle sont connus, aussi bien au niveau post-traductionnel que traductionnel. Chez la bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse R. capsulatus, la régulation de l’activité de la nitrogénase nécessite une panoplie de protéines dont la protéine membranaire AmtB, qui est impliquée dans le transport et la perception d’ammonium, et les protéines PII qui jouent plusieurs rôles clés dans la régulation de l’assimilation d’azote. Suite à l’ajout de l’ammonium dans le milieu, une inhibition réversible de l’activité de la nitrogénase est déclenchée via un mécanisme d’ADP-ribosylation de la nitrogénase. La séquestration de GlnK (une protéine PII) par l’AmtB permet à DraT, une ADP-ribosyltransférase, d’ajouter un groupement ADP-ribose sur la protéine-Fe de la nitrogénase l’empêchant ainsi de former un complexe avec la protéine-MoFe. Donc, le transfert d’électrons est bloqué, engendrant ainsi l’inhibition de l’activité de la nitrogénase qui dure aussi long que la concentration d’azote fixé reste élevé, phénomène appelé le « Switch-off/Switch-on » de la nitrogénase. Dans ce mémoire, pour mieux comprendre ce phénomène de régulation, des mutations ponctuelles au niveau de certains résidus conservés de la protéine AmtB, dont D338, G367, H193 et W237, étaient générées par mutagénèse dirigée, afin d’examiner d’avantage leur rôle dans le transport d’ammonium, la formation du complexe AmtB-GlnK, ainsi que dans le « Switch-off » et l’ADP-ribosylation. Les résultats permettent de conclure l’importance et la nécessité de certains résidus telle que le G367 dans la régulation de la nitrogénase et le transport d’ammonium, contrairement au résidu D338 qui ne semble pas être impliqué directement dans la régulation de l’activité de la nitrogénase. Ces résultats suggèrent d’autres hypothèses sur les rôles des acides aminés spécifiques d’AmtB dans ses fonctions comme transporteur et senseur d’ammonium., The reduction of diatomic nitrogen is a very important biological process given the need of all organisms for fixed nitrogen for the biosynthesis of basic key molecules such as, amino acids, nucleic acids, etc.. The reduction of nitrogen to ammonia is catalyzed by nitrogenase, an enzyme with high energy demands since it requires 20 to 30 moles of ATP for the reduction of one mole of nitrogen. Therefore a strict control is required to minimize energy waste. Several systems of regulation are known, both at the translational and post-translational level. In the purple non-sulfur photosynthetic bacterium R. capsulatus, the post-translational regulation of nitrogenase activity requires an array of proteins, including; the membrane protein AmtB, implicated in the perception and transport of ammonium, and PII proteins, which play key roles in the regulation of nitrogen assimilation. Following the addition of ammonium to the medium nitrogenase activity is reversibly inhibited (nitrogenase switch-off) via a mechanism of ADP-ribosylation of nitrogenase. Sequestration of GlnK (PII protein) by AmtB allows DraT, an ADP-ribosyltransferase, to add an ADP-ribose group to the Fe protein preventing it from forming a complex with the MoFe protein and nitrogenase activity is consequently inhibited. To better understand this phenomenon, in this Master’s thesis point mutations were created by site-directed mutagenesis at specific conserved residues of the AmtB protein, namely, D338, G367, H193 and W237, in order to examine their role in ammonium transport, formation of an AmtB-GlnK complex, and the regulation of nitrogenase (Switch-off/ADP-ribosylation). Plasmid-borne mutant alleles were transferred to a ∆AmtB strain of R. capsulatus, and the resultant strains were subjected to a series of tests. These demonstrated the importance and necessity of certain residues, such as G367, in the regulation of nitrogenase and ammonium transport, in contrast to residue D338, which seems to have no direct role in the regulation of nitrogenase activity. These results suggest further hypotheses about the roles of specific amino acids of AmtB in its functions as a sensor and transporter for ammonium.

The aim of this work was to characterize the genetic and biochemical mechanisms involved in the PASR, the phenolic acid stress response induced by phenolic acids Bacillus subtilis. By genetics and molecular biology strategies, like reverse genetic, PCR or transposon random mutagenesis, gene deletion, complementation of strains, and gene expression, the main components of the PASR were identified and quantified. Site-directed and random mutagenesis of respectively the promoter of padC encoding the phenolic acid decaroxylase, and PadR, the repressor of the padC expression, allowed us to identify the site of binding of PadR with this promoter, as well as the amino-acid residues involved in the functionality of PadR. Results obtained by the use of reporter strains of B. Subtilis construct for this aim, were confirmed by in vitro foot-printing and EMSA, and heterologous co-expression of the genes in E. Coli. This work provides evidence that a supposed non-functional truncated yveFG gene, co-transcript with padC, encoded a YveF peptid which is a moderator of the padC expression, and that the repaired gene was a non-inactivable repressor of padC expression., Ce travail a porté sur la caractérisation des mécanismes génétiques et biochimiques impliqués dans la PASR, la réponse au stress acide phénol, chez Bacillus subtilis. Cela a été réalisé grâce à des stratégies de génétique et biologie moléculaire comme la génétique inverse, la mutagenèse aléatoire par PCR ou par transposition, la délétion de gènes, la complémentation de gènes. Les éléments impliqués dans la PASR ont été identifiés, en particulier PadR, le régulateur transcriptionnel de l’expression du gène padC qui codent pour l’acide phénol décarboxlyase, élément clé de la PASR. Les séquences du promoteur du gène padC et les résidus acides aminés impliqués dans la fonctionnalité de PadR ont pu être identifiés par une stratégie mettant en œuvre, d’une part la mutagenèse dirigée du promoteur de padC, et la mutagenèse aléatoire par Error-prone PCR du gène padR, et d’autre part un criblage et une analyse fonctionnelle de ces éléments in vivo dans des souches mutantes de B. Subtilis construites pour ces objectifs. Cette analyse in vivo a été couplée à des études in vitro d’empreintes DNAseI et d’EMSA, ainsi qu’à une co-expression hétérologue chez E. Coli de ces gènes impliqués. Ce travail a également montré qu’un gène inconnu yveFG tronqué, donc supposé non-fonctionnel, co-transcrit avec padC, codait pour un peptide yveF modérateur de l’expression de padC. La réparation de ce gène yveFG et son expression chez B. Subtlis a montré qu’il codait pour un répresseur non activable du gène padC.

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane., The L-type calcium channel, Cav1.2, plays an important role in the excitation-contraction coupling of the ventricular myocytes. It has been shown that the alternative splicing of Cavα1.2 subunit could lead to a truncated protein in the C-terminus at exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). Many groups have studied deletions in the C-terminus (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). The currents, measured in the whole cell configuration, were significantly higher with the full-length channel. We chose to test some of these deletions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) in the presence or absence of the Cavβ3 auxiliary subunit which is likely to interact with the C-terminus of the Cavα1.2 subunit through its SH3 domain (Lao, Kobrinsky et al. 2008). The truncated Cavα1.2 subunit, expressed in Xenopus Oocytes, showed macroscopic currents that were greater than those of the full length channel in presence of the Cavβ3 subunit. In addition, the truncated Cavα1.2 subunits displayed currents in the absence of the Cavβ3 subunit in contrast with the Cavα1.2 full length subunit. To investigate whether the larger macroscopic currents resulted in an increase in the number of Cavα1.2 subunits at the plasma membrane, we chose the FACS (« Fluorescence Activated Cell Sorting ») method. An HA-tag was inserted in an extracellular region of the Cavα1.2 subunit and a FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») coupled anti-HA antibody was used to measure fluorescence. Our results showed that the Cavα1.2-HA subunit of L- type channel is expressed at the plasma membrane in the presence of the Cavβ3 subunit whereas the Cavα1.2-HA subunit is slightly or not expressed at the plasma membrane in its absence. The same results were obtained for the three C-terminal deletions tested under the same conditions (CaVα1.2-HA ΔC1935, CaVα1.2-HA ΔC1856 and CaVα1.2-HA ΔC1733). Taken together, these results suggest that the increased macroscopic currents observed after a partial deletion of the C-terminus is not caused by an increased number of Cavα1.2 proteins expressed at the plasma membrane. Keywords

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Diplôme : Dr. d'Universite

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

National audience

It is claimed that bifidobacteria have several health-promoting effects. To increase the amount of bifidobacteria in the colon the concept of probiotics and/or prebiotics can be applied. Bifidobacterium adolescentis is one of the main species of bifidobacteria in the gastro-intestinal tract of human adults. B. adolescentis is able to degrade a wide range of oligosaccharides and a number of glycosyl hydrolases have been characterized in detail. The hydrolytic activity of the glycosyl hydrolases from B. adolescentis toward prebiotics like arabinoxylan-oligosaccharides, isomalto-oligosaccharides, arabinogalactan, and sucrose-based oligosaccharides (raffinose, stachyose, and fructo-oligosaccharides) is reviewed. Alternatively, some of these glycosyl hydrolases are able to catalyze transglycosylation, which allows them to elongate oligosaccharides and to prepare potentially prebiotic oligosaccharides. Such oligosaccharides might be used to influence the microbial composition in the more distal parts of the colon. In nature, not all enzyme-substrate encounters are transglycosylating. So, the hydrolytic activity of the enzyme makes the oligosaccharide elongation less efficient than desired. Site-directed mutagenesis was applied to improve the transglycosylation reaction of the $\alpha$-galactosidase from B. adolescentis., Les glycosyl hydrolases de Bifidobacterium adolescentis DSM20083. Il est affirmé que les bifidobactéries ont des propriétés bénéfiques sur la santé. Pour augmenter la teneur en bifidobactéries au niveau du colon, le concept de probiotiques et/ou prébiotiques peut être appliqué. Bifidobacterium adolescentis est l'une des principales espèces de bifidobactéries dans le tractus gastro-intestinal des adultes. Certaines des glycosyl hydrolases de B. adolescentis ont été caractérisées en détail et elles semblent dégrader un large éventail d'oligosaccharides. L'activité d'hydrolyse des glycosyl hydrolases de B. adolescentis envers des prébiotiques tels que les arabino-xylanes, isomalto-oligosaccharides, arabino-galactanes et les oligosaccharides contenant du saccharose (raffinose, stachyose et fructo-oligosaccharides) est passée en revue. De plus, certaines de ces glycosyl hydrolases peuvent être utilisées pour préparer des oligosaccharides prébiotiques potentiels par transglycosylation, ce qui permet d'allonger les oligosaccharides. De tels oligosaccharides peuvent être utilisés pour influencer la composition microbienne au niveau des parties plus distales du colon. Les produits de rencontre enzymes-substrates ne sont pas tous transglycosylés naturellement et l'activité d'hydrolyse de l'enzyme entraîne une élongation de l'oligosaccharide moindre que celle désirée. La mutagenèse dirigée a été appliquée pour améliorer la réaction de transglycosylation de l'$\alpha$-galactosidase de B. adolescentis.

Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), the major lipid of plant and algal plastids, is synthesized by MGD (or MGDG synthase), a dimeric and membrane-bound glycosyltransferase of the plastid envelope that catalyzes the transfer of a galactosyl group from a UDP-galactose donor onto a diacylglycerol acceptor. Although this enzyme is essential for biogenesis, and therefore an interesting target for herbicide design, no structural information is available. MGD monomers share sequence similarity with MURG, a bacterial glycosyltransferase catalyzing the transfer of N-acetyl-glucosamine on Lipid 1. Using the x-ray structure of Escherichia coli MURG as a template, we computed a model for the fold of Spinacia oleracea MGD. This structural prediction was supported by site-directed mutagenesis analyses. The predicted monomer architecture is a double Rossmann fold. The binding site for UDP-galactose was predicted in the cleft separating the two Rossmann folds. Two short segments of MGD (beta2-alpha2 and beta6-beta7 loops) have no counterparts in MURG, and their structure could not be determined. Combining the obtained model with phylogenetic and biochemical information, we collected evidence supporting the beta2-alpha2 loop in the N-domain as likely to be involved in diacylglycerol binding. Additionally, the monotopic insertion of MGD in one membrane leaflet of the plastid envelope occurs very likely at the level of hydrophobic amino acids of the N-terminal domain.

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The aim of this thesis has been to modify CYP2C9 and 2C8 at specific positions by directed mutagenesis in order to evaluate the influence of the mutated residues on specific substrate transformations and help to define their active site. Expression of the mutants was done in yeast (saccharomyces cervisiae) in vector V60. For CYP2C9 the mutant F114I show that the aromatic phenylalanine 114 is involved as a pi donnor to substrates and inhibitors like sulphafenazole. Also phenylalanine 476 is important in the substrate binding as shown by mutant F476I. For CYP 2C8 , a number of mutations have been done on positions Arg97, Ser100, Ser114, Phe201, Phe205, Arg241. Arg 97 is important for heme fixation. Ser100, Ser114, Phe201, Phe205, interact with the substrates. Arg241 is probably involved in the entrance channel of the substrate. The mutagenesis result were analysed in function of the published x-ray structures of CYP2C5 and CYP2C9 at the end of the thesis, Le but de ce travail a été de modifier par mutagénèse dirigée diverses positions des cytochromes P450 CYP2C9 et 2C8, afin de déterminer l'influence topologique es aminoacides mutés sur le devenir des substrats et l'interaction avec les inhibiteurs. Les P450 ont été exprimés dans la levure (vecteur V60). Pour le CYP2C9, la phenylalanine 114 est importante dans la fixation des substrats aromatique par le rle Pi donneur du phényl comme le montre le mutant F114I. De même la phenylalanine 476 a un rôle dans la fixation des substrats (F476I). Pour le CYP2C8 l'arginine 97 intervient dans la fixation de l'ème. Les Ser100, Ser114, Phe201, Phe205, tapissent le site actif de l'enzyme et l'arginine 241 est probablement situé dans le canal d'accès du substrat. Tous les résultats précédents ont été confrontés avec les structures cristallines des CYP2C5 et CYP2C9 publiés à la fin de la thèse.

The control of glycosylation of recombinant proteins presents a considerable stake in the development of therapeutic proteins production in heterologous expression systems. Indeed glycosylation plays a key role in their properties, in particular pharmacokinetic properties. The remodelling of N-glycosylation of recombinant proteins was considered via the use of glycosynthase Cel7B E197A from Humicola insolens. This enzyme must first of all be modified in order to be able to accomodate an N-acetylglucosaminyl group in the acceptor subsite +1. Molecular modelling studies highlighted two amino acids which could prevent from positioning a carbohydrate unit substituted in position 2. Various mutants were prepared by site-directed mutagenesis in order to study their substrate specificity. Their glycosynthase activities were characterized, showing the influence of the introduced mutations. Even if the desired substrate specificity has not been obtained, a modification of the regioselectivity of the glycosynthase was highlighted with a substrate substituted in position 2 by an azido group., Le contrôle de la glycosylation des protéines recombinantes présente un enjeu considérable dans le développement de la production de protéines d'intérêt thérapeutique dans des systèmes d'expression hétérologues. La glycosylation joue en effet un rôle essentiel dans leurs propriétés, notamment pharmacocinétiques. Le remodelage de la N-glycosylation des protéines recombinantes a été envisagé via l'utilisation de la glycosynthase Cel7B E197A d'Humicola insolens. Cette enzyme doit tout d'abord être modifiée afin de pouvoir fixer un groupement N-acétylglucosaminyle dans le sous-site accepteur +1. Des études de modélisation moléculaire ont mis en évidence deux acides aminés qui pourraient empêcher le positionnement d'une unité glucosidique substituée en position 2. Différents mutants ont été préparés par mutagénèse dirigée afin d'étudier leur spécificité de substrat. Leurs activités glycosynthases ont été caractérisées, montrant l'influence des mutations introduites. Même si la spécificité de substrat désirée n'a pu être obtenue, une modification de la régiosélectivité de la glycosynthase a été mise en évidence vis-à-vis d'un substrat substitué en position 2 par un groupement de type azido.

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I have studied two enzymes involved in phenylpropanoid metabolism in plants. The phenylpropanoid pathway leads from phenylalanine, to a large array of compounds involved in the development and interactions with the environment. Among these products are flower pigments, antibiotics (termed phytoalexins) that accumulate in diseased plants, signals implicated in the recognition of microbes, UV irradiation protectants, and the building units of lignin. Lignin is an essential component of wood that provides rigidity to cell walls and impermeability to vascular tissues. It is a three-dimensional polymer comprising three units having in common the same aromatic ring but differing in their degree of methylation and hydroxylation. Caffeoyl-coenzyme A O-methyltransferase (CCoAOMT) is the first of the two O-methyltransferase involved in lignin biosynthesis. This enzyme uses specifically CoA-esters as substrates. My initial work was to characterize the active site of CCoAOMT taking avantage of the fact that animal catechol O-methyltransferases and plant CCoAOMT share about 20% amino acid sequence identity and display common structural features. The crystallographic structure of rat liver catechol O-methyltransferase was used as a template to construct a homology model for tobacco CCoAOMT. Integrating site-directed mutagenesis and substrate specificity data, the three-dimensional model identified several amino acid residues involved in CoA-esters binding. I also characterized a new acyltransferase named hydroxycinnamoyl-CoA: shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase (HCT) involved in phenylpropanoid metabolism. HCT belongs to a plant acyltransferase gene family, the members of which have various functions. In vitro, HCT catalyzed the synthesis of shikimate and quinate esters, shown to be substrates of the cytochrome P450 3-hydroxylase. Finally, I confirmed by spatio temporal analyses and virus-induced gene silencing approach the involvement of HCT in lignin biosynthesis., Le métabolisme des phénylpropanoïdes est un métabolisme secondaire spécifique au règne végétal. Il conduit, à partir de la phénylalanine, à la synthèse d'une grande variété de substances telles que les anthocyanes, les isoflavonoïdes, les stilbènes, des esters d'acides hydroxycinnamiques, ou encore à la lignine. Ces métabolites secondaires interviennent dans la pigmentation florale ou encore la protection des tissus végétaux contre divers stress biotiques et abiotiques. Quant à la lignine, elle assure rigidité aux parois cellulaires végétales et imperméabilité aux tissus conducteurs. La lignine est un polymère tridimensionnel constitué de trois unités monomériques qui possèdent le même squelette carboné phénylpropane mais diffèrent par leur degré de méthoxylation et d'hydroxylation. Une partie de mon travail de thèse a consisté à étudier la relation structure/fonction de la caféoyl-coenzyme A O-méthyltransférase (CCoAOMT) de N. tabacum, responsable de l'introduction de la première des deux fonctions méthyles. Des études bioinformatiques couplées à des approches de biochimie et de mutagenèse dirigée, nous ont permis de modéliser l'interaction de la CCoAOMT avec son substrat, le caféoyl-CoA. Trois acides aminés du site actif ont notamment été identifiés comme intervenant dans la reconnaissance spécifique de la chaîne latérale de CoA. J'ai également caractérisé, chez N. tabacum, une nouvelle acyltransférase à activité HydroxyCinnamoyl-CoA : shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT) impliquée dans le métabolisme des phénylpropanoïdes. Nous avons montré que l'enzyme HCT recombinante synthétisait, in vitro, les substrats de l'hydroxylation en position 3 du noyau aromatique. De plus, la répression de l'expression du gène HCT par le «VIGS» conduit à un ralentissement de la croissance des plantes, à une perturbation importante du pool d'acide chlorogénique, ainsi qu'à une diminution de la quantité et à une modification de la composition de la lignine synthétisée.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Measles virus is a negative-strand RNA virus, member of the family Paramyxoviridae. Its replicative complex is composed of three main viral proteins : the RNA-dependent RNA polymerase (L), the nucleoprotein (N) and the phosphoprotein (P). This thesis presents a structural study, using biochemical and biophysical methods, of the phosphoprotein and of the nucleoprotein produced in the bacteria Escherichia coli. I have studied the regions involved in the polymerisation of N and identified a variant of interest for the study of N using X-ray crystallography. I have also set up the purification of a complex of N and P, a prelude to its structural study. Besides, I have shown that the N-terminal moiety of P is intrinsically disordered. I was able to extend this result to the P proteins of numerous related virus using biocomputing methods. Then, I have demonstrated the importance of structural disorder within the replicative complex of Paramyxoviridae (both from a functional point of view and because of its abundance). Beyond their immediate practical interest, these results indicate that the replicative machinery of these viruses might constitute a model system for the study of structural disorder in proteins. Furthermore, they raise numerous questions, and command a rethink of our vision of the replicative complex of these viruses, the study of which has a major importance in human health., Le virus de la rougeole est un virus à ARN négatif, membre de la famille des Paramyxoviridae. Le complexe de réplication viral comprend trois protéines principales : la polymérase à ARN ARN-dépendante (L), la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). Cette thèse présente une étude structurale, par des méthodes biochimiques et biophysiques, de la phosphoprotéine et de la nucléoprotéine produites dans la bactérie Escherichia coli. J'ai étudié les déterminants de la polymérisation de N et identifié un variant intéressant pour l'étude de N par cristallographie aux rayons X. J'ai aussi mis au point la purification d'un complexe de N et P, prélude à son étude structurale. Par ailleurs, j'ai montré que la partie N-terminale de P est intrinsèquement désordonnée. J'ai pu étendre ce résultat aux protéines P de nombreux virus apparentés par une étude bio-informatique. J'ai ensuite démontré l'importance du désordre structural au sein du complexe réplicatif des Paramyxoviridae #à la fois par son abondance et d'un point de vue fonctionnel#. Au-delà de leur intérêt pratique immédiat, ces résultats indiquent que la machinerie réplicative de ces virus pourrait constituer un système modèle pour l'étude du désordre structural dans les protéines. De plus, ils soulèvent de nombreuses questions et sont donc un prélude à une refonte de notre vision du complexe réplicatif de ces virus dont l'étude revêt une importance majeure en santé humaine.

In order to modify the catalytic properties of trypsin, lysine-188 (S1) of the substrate binding pocket was substituted by an aromatic amino acid residue (Phe, Tyr, Trp) or by a histidyl residue. Two other mutants were obtained by displacement or elimination of the negative charge of aspartic acid-189 (K188D/D189K and G187W/K188F/D189Y, respectively). The high affinity inhibitors, like PSTI II and BPTI, behaved as specific substrates of the trypsin and its mutants. Their inhibiting effect toward modified trypsins was studied. The bovine inhibitor had a higher affinity for all tested enzymes than pea inhibitor. The inhibition constants differed according to the mutations on the protease.

Non disponible / Not available, Les UDP-glucuronosyltransférases appartiennent à une famille d'enzymes membranaires impliquées dans le métabolisme des médicaments de substances endogènes (hormones, bilirubine) et la synthèse de macromolécules polysaccharidiques (glycosaminoglycanes). Nous avons développé la caractérisation du site actif de l'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine glucuronoconjuguant les composés phénoliques plans, l'UGT1A6. L'enzyme recombinante est exprimée de façon stable dans les cellules V79. Au cours de ce travail, la modification chimique de cette enzyme par des inhibiteurs irréversibles tels que les carbodiimides ou la butanedione à permis de mettre en évidence la présence de résidus arginine, aspartique/glutamique impliqués dans la réaction de glucuronoconjugaison. La position de ces acides aminés essentiels a été postulée par alignement de séquence d'après leur conservation entre isoformes. La mutagenèse dirigée de ces résidus a été réalisée. Elle a permis de confirmer la contribution importante des résidus His 54 et Arg 52 dans la réaction de glucuronoconjugaison, après caractérisation des mutants en termes cinétiques et immunologiques. [...]

Non disponible / Not available, La vitamine A est un facteur nutritionnel qui est métabolisé en acide rétinoïque (RA). Au niveau moléculaire, la découverte des gènes codant pour les récepteurs de l'acide rétinoïque (RARs et RXRs) ont permis d'effectuer des progrès considérables dans la compréhension du mécanisme d'action de RA. Chaque classe de récepteur consiste en trois sous-types appelés [alpha], [beta] et [gamma] et leurs isoformes respectifs. [...] Ce travail consistait à étudier le domaine de liaison (LBD) du récepteur humain de l'acide rétinoïque [alpha] (hRAR[alpha]) et plus particulièrement visait à répondre à trois questions : l)Y-a t-il une ou plusieurs cystéine(s) du hRAR[alpha]-LBD intervenant dans l'interaction récepteur-ligand ? 2)Y-a t-il un ou plusieurs résidu(s) arginine impliqué(s) dans cette interaction ? 3)Quelle est la région minimale du récepteur nécessaire pour garder l'interaction récepteur-ligand ? [...]

Non disponible / Not available, La vitamine A est un facteur nutritionnel qui est métabolisé en acide rétinoïque (RA). Au niveau moléculaire, la découverte des gènes codant pour les récepteurs de l'acide rétinoïque (RARs et RXRs) ont permis d'effectuer des progrès considérables dans la compréhension du mécanisme d'action de RA. Chaque classe de récepteur consiste en trois sous-types appelés [alpha], [beta] et [gamma] et leurs isoformes respectifs. [...] Ce travail consistait à étudier le domaine de liaison (LBD) du récepteur humain de l'acide rétinoïque [alpha] (hRAR[alpha]) et plus particulièrement visait à répondre à trois questions : l)Y-a t-il une ou plusieurs cystéine(s) du hRAR[alpha]-LBD intervenant dans l'interaction récepteur-ligand ? 2)Y-a t-il un ou plusieurs résidu(s) arginine impliqué(s) dans cette interaction ? 3)Quelle est la région minimale du récepteur nécessaire pour garder l'interaction récepteur-ligand ? [...]