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La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique rare et la plus fréquente des maladies musculaires. Elle est due à la déficience d'une protéine appelée dystrophine et se caractérise par une faiblesse progressive et une dégénérescence des muscles squelettiques. Come qu'aucun remède contre la DMD n'a encore été trouvé, il est urgent d'identifier de nouvelles thérapies. Étant donné les mécanismes pathogènes de cette maladie ne sont pas entièrement compris, la réalisation de dépistages phénotypiques de médicaments in vivo représente une stratégie prometteuse pour la découverte thérapeutique. Dans ce but, nous croyons qu’une stratégie de dépistage chimique à haut débit permettra d’identifier de petites molécules potentielles qui restaureront les phénotypes liés à la maladie dans les modèles de DMD, fournissant finalement des candidats pour les essais cliniques. Un criblage précédent par notre groupe a permis d’identifier un total de 26 molécules chimiques qui présentaient une amélioration significative de la motilité dans les modèles de vers mutants DMD. Cette étude vise à valider ces candidats dans un modèle génétique de poisson zèbre de la DMD. Nous avons d’abord créé un modèle de poisson zèbre mutant DMD à l’aide du système CRISPR/Cas. Une caractérisation phénotypique détaillée de ce mutant a démontré des caractéristiques de la pathologie de la DMD consistant en un taux de survie réduit, un affaiblissement musculaire et un dysfonctionnement moteur manifestés par des défauts de natation et une organisation anormale des fibres musculaires. Nous avons ensuite examiné les 26 molécules candidates pour leur capacité à sauver le phénotype de type DMD dans ce modèle. Aucun de ces 26 candidats n’a présenté d’impact statistiquement thérapeutique sur les caractéristiques pathologiques de la DMD dans notre modèle de poisson zèbre. D’autres études visant à améliorer les méthodes de dépistage des médicaments et les lectures du phénotype dans nos modèles de DMD sont nécessaires afin d’utiliser cette approche puissante pour identifier les cibles thérapeutiques potentielles pour la DMD chez les humains., Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a rare genetic disorder and the most frequent among muscular diseases. It is due to the deficiency of a protein called dystrophin and is characterized by progressive weakness and degeneration of skeletal muscles. Since no cure for DMD has yet been found, there is an urgent need to identify new therapies. Given that the pathogenic mechanisms of this disease are not fully understood, performing phenotypic drug screens in vivo represents a promising strategy for therapeutic discovery. With this aim, we believe that a chemical high-throughput screening strategy will identify potential small molecules that will restore disease-related phenotypes in DMD models, ultimately providing lead candidate compounds for clinical testing. A previous screen by our group has identified a total of 26 chemical compounds that presented a significant improvement of motility in DMD-mutant worm models. This study aims at validating these hit candidates in a zebrafish genetic model of DMD. We first generated a DMD-mutant zebrafish model using the CRISPR/Cas system. Detailed phenotypic characterization of this mutant demonstrated features of the DMD pathology consisting of a reduced survival rate, muscle weakening and motor dysfunction manifested by swimming defects and abnormal organization of muscle fibers. We next screened the 26 candidate small molecules for their ability to rescue the DMD-like phenotype in this model. None of these 26 candidate compounds presented a statistically therapeutic impact on the pathology’s characteristics of DMD in our zebrafish model. Additional studies aimed at ameliorating the drug screening methods and phenotype readouts in our DMD models are needed in order to use this powerful approach to identify potential therapeutic targets for DMD in humans.

L'acide rétinoïque (AR) est nécessaire au développement de plusieurs organes, dont le cerveau, les yeux, le coeur et les poumons. La perte ainsi que le gain de la signalisation de l’AR perturbent le développement de ces organes, indiquant qu’une régulation précise est nécessaire pour un développement approprié. L’AR se lie aux récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR), qui sont des facteurs de transcription qui modulent l'expression des gènes cibles. Des mutations de novo du gène RARB conduisent à un syndrome rare et sévère appelé PDAC caractérisé principalement par une hypoplasie Pulmonaire, une hernie Diaphragmatique, une Anophtalmie et/ou une microphtalmie et des anomalies Cardiaques. Au total, notre groupe a identifié 15 variants pathogènes de RARB chez plus de 30 patients atteints du syndrome PDAC. In vitro, certains de ces variants induisent un gain de fonction (GOF) tandis que d'autres agissent de manière dominante-négative (DN). L'objectif de ce projet est d'utiliser le modèle du poisson zèbre pour étudier l'impact fonctionnel des variants RARB in vivo. Nous avons constaté que la surexpression de l'ARN de RARB humain de type sauvage (WT) chez le poisson zèbre provoquait des anomalies développementales, notamment une microphtalmie, des défauts de la vessie natatoire et un oedème cardiaque, tandis que l'introduction d'une mutation non-sens (p.K102X) abolit ces effets. Nous avons testé l'impact des présumés GOF (p.R269T, p.R387C) et DN (p.M290R, p.L402P). Nous montrons que la surexpression des GOF provoque un phénotype moins sévère que celui de RARB WT. La co-injection des DN révèle que le variant L402P se comporte comme un DN dans un contexte développemental, alors que M290R agit comme une perte de fonction. De plus, nous avons caractérisé une lignée de poisson zèbre rarga -/-. Nous avons découvert que le poisson zèbre rarga -/- développe des défauts de la vessie natatoire et des arcs branchiaux. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliquant RARB au cours du développement pourrait aider à développer des stratégies thérapeutiques efficaces par la modulation de la signalisation de l’AR., Retinoic acid (RA) is required for the development of several organs, including the brain, eye, heart, and lungs. Both loss and gain of RA signalling disrupt the development of these organs, indicating that its precise regulation is required for appropriate development. RA can bind to retinoic acid receptors (RARs), which are transcription factors that modulate target gene expression. De novo mutations in the RARB gene lead to a severe, rare and complex syndrome called PDAC charcaterized mainly by a Pulmonary hypoplasia, Diaphragmatic hernia, Anophthalmia and/or microphthalmia and Cardiac defects. In total, our group have identified 15 pathogenic variants in RARB in more than 30 patients affected with PDAC. Some of these variants induce gain-of-function (GOF) whereas others act in a dominant-negative (DN) manner in cell-based transcriptional assays. The goal of this project is to use the zebrafish model to study the functional impact of RARB variants in vivo. We found that expression of wild-type human RARB RNA in zebrafish caused RA dependent developmental defects including microphthalmia, swim bladder defects and cardiac edema. The introduction of a non-sense variant (p.K102X) abolished these effects. We tested the impact of putative GOF (p.R269T, p.R387C) and DN (p.M290R, p.L402P) on this RARB activity. We show that overexpression of the putative GOF cause a less severe phenotype compared to the WT RARB. However, the co-injection of the putative DN reveal that variant L402P behave as a DN in a developmental context, whereas M290R does not. Also, we characterize a rarga mutant line carrying a frameshift deletion in the middle of the ligand binding domain. We discovered that homozygous rarga zebrafish are lacking inflated swimbladder and branchial arches. A better understanding of the molecular mechanism of RARB during development might help develop effective therapeutic strategies through the modulation of the RA signaling.

The perception of external sensory cues is referred to as ‘exteroception’ and has been considerably investigated, while the ‘interoception’ or the sensation of internal sensory modalities coming from the body has remained elusive. Interoception comprises different senses, including proprioception defined as the perception of body position. However, proprioception does not entail spine position in the trunk. Are there specific sensory cells that detect the position of the spine? The cerebrospinal-fluid contacting neurons (CSF-cNs) have emerged as candidate sensors of spine position. Notably, CSF-cNs have been shown to detect spinal tail bending in zebrafish and lamprey and to, in turn, modulate locomotion and posture. However, chemosensory functions of CSF-cNs have not been investigated in vivo. I analyzed their transcriptomic profile looking for chemoreceptors and found that CSF-cNs express a large variety of receptors for chemosensory cues, comprising immune-related receptors. I contributed to the investigation of the role of CSF-cNs in innate immunity upon bacterial infection by developing a protocol of primary cell culture and showing that CSF-cNs robustly respond to known pathogenic bacterial metabolites. This result was confirmed in vivo where a bacterial invasion of the CSF elicits strong and prolonged activation of CSF-cNs. Altogether, my work helped establish CSF-cNs as critical interoceptive chemosensory neurons that detect bacterial metabolites during infection., La perception des signaux sensoriels externes est appelée "extéroception" et a fait l'objet de nombreuses recherches, mais "l'interoception" ou la sensation des modalités sensorielles internes, est moins comprise. L'interoception comprend différents sens, dont la proprioception, soit la perception de la position du corps. Cependant, la proprioception n'implique pas la position de la colonne vertébrale dans le tronc. Existe-t-il des cellules sensorielles spécifiques qui détectent la position de la colonne vertébrale ? Les neurones de contact du liquide cérébrospinal (NcLCS) sont apparus comme des capteurs potentiels de la position de la colonne vertébrale. Il a notamment été démontré que les NcLCS détectent la flexion de la queue chez le poisson zèbre et la lamproie, et qu'ils modulent à leur tour la locomotion et la posture. Cependant, les fonctions chimiosensorielles des NcLCS n'ont pas été étudiées in vivo. J'ai analysé leur profil transcriptomique à la recherche de chimiorécepteurs et découvert que les NcLCS expriment une grande variété de récepteurs chimiosensoriels, comprenant des récepteurs liés à l'immunité. J'ai contribué à l'étude du rôle des NcLCS dans l'immunité innée lors d'une infection bactérienne en développant un protocole de culture de cellules primaires et en montrant que les NcLCS répondent de manière robuste à des métabolites bactériens pathogènes connus. Ce résultat a été confirmé in vivo où l'invasion bactérienne du LCS provoque une activation forte et prolongée des NcLCS. Finalement, mes travaux ont contribué à établir que les NcLCS sont des neurones chimiosensoriels intéroceptifs détectant des métabolites bactériens pendant une infection.

Succinate dehydrogenase inhibitor (SDHI) fungicides are increasingly used in agricultureto combat molds and fungi, two major threats to both food supply and public health. However,the essential requirement for the succinate dehydrogenase (SDH) complex—the molecular target ofSDHIs—in energy metabolism for almost all extant eukaryotes and the lack of species specificity ofthese fungicides raise concerns about their toxicity toward off-target organisms and, more generally,toward the environment. Herein we review the current knowledge on the toxicity toward zebrafish(Brachydanio rerio) of nine commonly used SDHI fungicides: bixafen, boscalid, fluxapyroxad, flutolanil,isoflucypram, isopyrazam, penthiopyrad, sedaxane, and thifluzamide. The results indicatethat these SDHIs cause multiple adverse effects in embryos, larvae/juveniles, and/or adults, sometimesat developmentally relevant concentrations. Adverse effects include developmental toxicity,cardiovascular abnormalities, liver and kidney damage, oxidative stress, energy deficits, changes inmetabolism, microcephaly, axon growth defects, apoptosis, and transcriptome changes, suggestingthat glycometabolism deficit, oxidative stress, and apoptosis are critical in the toxicity of most ofthese SDHIs. However, other adverse outcome pathways, possibly involving unsuspected moleculartargets, are also suggested. Lastly, we note that because of their recent arrival on the market, thenumber of studies addressing the toxicity of these compounds is still scant, emphasizing the need tofurther investigate the toxicity of all SDHIs currently used and to identify their adverse effects andassociated modes of action, both alone and in combination with other pesticides., Les fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI) sont de plus en plus utilisés en agriculturepour lutter contre les moisissures et les champignons, deux menaces majeures pour l'approvisionnement alimentaire et la santé publique. Cependant,l'exigence essentielle pour le complexe succinate déshydrogénase (SDH) - la cible moléculaire deSDHI - dans le métabolisme énergétique pour presque tous les eucaryotes existants et le manque de spécificité d'espèce deces fongicides soulèvent des inquiétudes quant à leur toxicité vis-à-vis des organismes non ciblés et, plus généralement,envers l'environnement. Ici, nous passons en revue les connaissances actuelles sur la toxicité envers le poisson zèbre(Brachydanio rerio) de neuf fongicides SDHI couramment utilisés : bixafen, boscalid, fluxapyroxad, flutolanil,isolucypram, isopyrazam, penthiopyrad, sedaxane et thifluzamide. Les résultats indiquentque ces SDHI provoquent de multiples effets indésirables chez les embryons, les larves/juvéniles et/ou les adultes, parfoisà des concentrations pertinentes pour le développement. Les effets indésirables comprennent la toxicité pour le développement,anomalies cardiovasculaires, lésions hépatiques et rénales, stress oxydatif, déficits énergétiques, modifications demétabolisme, microcéphalie, défauts de croissance axonale, apoptose et modifications du transcriptome, suggérantque le déficit du glycométabolisme, le stress oxydatif et l'apoptose sont critiques dans la toxicité de la plupart desces SDHI. Cependant, d'autres voies de résultats indésirables, impliquant peut-être des molécules moléculaires insoupçonnéescibles, sont également suggérées. Enfin, notons qu'en raison de leur arrivée récente sur le marché, lesnombre d'études portant sur la toxicité de ces composés est encore faible, soulignant la nécessité deétudier plus avant la toxicité de tous les SDHI actuellement utilisés et identifier leurs effets indésirables etmodes d'action associés, à la fois seuls et en combinaison avec d'autres pesticides.

The epicardium, a mesothelial cell layer covering the myocardium, is essential for heart development, as it promotes myocardial growth, coronary vasculature formation and intracardiac fibroblast generation. In zebrafish, epicardial progenitors arise from the dorsal pericardium (DP). Some DP cells round up and protrude forming the proepicardial (PE) cluster. Yap1 and Wwrt1, central nodes of the Hippo pathway, are localized in the developing epicardium in mice. Although Yap1/Wwrt1-Tead activity is involved in cardiac development in zebrafish, its impact during PE cluster formation remains elusive. We characterized Yap1/Wwrt1-Tead reporter line during PE cluster formation. Next, we assessed the role of Yap1/Wwrt1-Tead activity in this process modifying it. We further studied PE cluster development and how it is affected by changes in mechanical forces. Finally, we searched as well for new regulators of PE cluster formation. Our work suggests that Yap1/Taz-Tead activity is involved during PE cluster formation although Yap1 mutants do no present any PE phenotype. Our work also suggests that fluid forces are key to modulate PE localisation and formation in the pericardial cavity., L'épicarde est une couche de cellules mésothéliales recouvrant le myocarde. L’épicarde est essentiel pour le développement cardiaque, car il favorise la croissance myocardique, la formation de la vascularisation coronaire et la génération de fibroblastes intracardiaques. Chez le poisson zèbre, les progéniteurs épicardiques proviennent du péricarde dorsal. Lors du développement des progéniteurs épicardiques certaines cellules du péricarde dorsal s’arrondissent et font saillie pour former le cluster proépicardique (PE). Yap1 et Wwrt1 sont des protéines essentielles de la voie Hippo qui sont exprimées dans l'épicarde en développement chez la souris. Bien que l'activité Yap1 / Wwrt1 soit impliquée dans le développement cardiaque chez le poisson zèbre, son impact pendant la formation du PE reste inexploré. Nous avons caractérisé une lignée rapportant l’activité transcriptionelle de Yap1 / Wwrt1-Tead lors de la formation du PE. Ensuite, nous avons évalué le rôle de Yap1 / Wwr1- Tead lors de la formation du PE en modifiant l'activité Yap1 / Wwrt1-Tead. Nous avons également étudié le développement de PE en réponse aux forces mécaniques. Enfin, nous avons également recherché un nouveau régulateur de la formation de cluster PE. Nos travaux suggèrent que Yap1 / Wwrt1 est nécessaire pour la formation du cluster PE bien que les mutants yap1 ne présentent aucun phénotype PE. Nos travaux suggèrent également que les forces mécaniques sont essentielles pour moduler la localisation PE lors de sa formation dans la cavité péricardique.

The epicardium, a mesothelial cell layer covering the myocardium, is essential for heart development, as it promotes myocardial growth, coronary vasculature formation and intracardiac fibroblast generation. In zebrafish, epicardial progenitors arise from the dorsal pericardium (DP). Some DP cells round up and protrude forming the proepicardial (PE) cluster. Yap1 and Wwrt1, central nodes of the Hippo pathway, are localized in the developing epicardium in mice. Although Yap1/Wwrt1-Tead activity is involved in cardiac development in zebrafish, its impact during PE cluster formation remains elusive. We characterized Yap1/Wwrt1-Tead reporter line during PE cluster formation. Next, we assessed the role of Yap1/Wwrt1-Tead activity in this process modifying it. We further studied PE cluster development and how it is affected by changes in mechanical forces. Finally, we searched as well for new regulators of PE cluster formation. Our work suggests that Yap1/Taz-Tead activity is involved during PE cluster formation although Yap1 mutants do no present any PE phenotype. Our work also suggests that fluid forces are key to modulate PE localisation and formation in the pericardial cavity., L'épicarde est une couche de cellules mésothéliales recouvrant le myocarde. L’épicarde est essentiel pour le développement cardiaque, car il favorise la croissance myocardique, la formation de la vascularisation coronaire et la génération de fibroblastes intracardiaques. Chez le poisson zèbre, les progéniteurs épicardiques proviennent du péricarde dorsal. Lors du développement des progéniteurs épicardiques certaines cellules du péricarde dorsal s’arrondissent et font saillie pour former le cluster proépicardique (PE). Yap1 et Wwrt1 sont des protéines essentielles de la voie Hippo qui sont exprimées dans l'épicarde en développement chez la souris. Bien que l'activité Yap1 / Wwrt1 soit impliquée dans le développement cardiaque chez le poisson zèbre, son impact pendant la formation du PE reste inexploré. Nous avons caractérisé une lignée rapportant l’activité transcriptionelle de Yap1 / Wwrt1-Tead lors de la formation du PE. Ensuite, nous avons évalué le rôle de Yap1 / Wwr1- Tead lors de la formation du PE en modifiant l'activité Yap1 / Wwrt1-Tead. Nous avons également étudié le développement de PE en réponse aux forces mécaniques. Enfin, nous avons également recherché un nouveau régulateur de la formation de cluster PE. Nos travaux suggèrent que Yap1 / Wwrt1 est nécessaire pour la formation du cluster PE bien que les mutants yap1 ne présentent aucun phénotype PE. Nos travaux suggèrent également que les forces mécaniques sont essentielles pour moduler la localisation PE lors de sa formation dans la cavité péricardique.

The perception of external sensory cues is referred to as ‘exteroception’ and has been considerably investigated, while the ‘interoception’ or the sensation of internal sensory modalities coming from the body has remained elusive. Interoception comprises different senses, including proprioception defined as the perception of body position. However, proprioception does not entail spine position in the trunk. Are there specific sensory cells that detect the position of the spine? The cerebrospinal-fluid contacting neurons (CSF-cNs) have emerged as candidate sensors of spine position. Notably, CSF-cNs have been shown to detect spinal tail bending in zebrafish and lamprey and to, in turn, modulate locomotion and posture. However, chemosensory functions of CSF-cNs have not been investigated in vivo. I analyzed their transcriptomic profile looking for chemoreceptors and found that CSF-cNs express a large variety of receptors for chemosensory cues, comprising immune-related receptors. I contributed to the investigation of the role of CSF-cNs in innate immunity upon bacterial infection by developing a protocol of primary cell culture and showing that CSF-cNs robustly respond to known pathogenic bacterial metabolites. This result was confirmed in vivo where a bacterial invasion of the CSF elicits strong and prolonged activation of CSF-cNs. Altogether, my work helped establish CSF-cNs as critical interoceptive chemosensory neurons that detect bacterial metabolites during infection., La perception des signaux sensoriels externes est appelée "extéroception" et a fait l'objet de nombreuses recherches, mais "l'interoception" ou la sensation des modalités sensorielles internes, est moins comprise. L'interoception comprend différents sens, dont la proprioception, soit la perception de la position du corps. Cependant, la proprioception n'implique pas la position de la colonne vertébrale dans le tronc. Existe-t-il des cellules sensorielles spécifiques qui détectent la position de la colonne vertébrale ? Les neurones de contact du liquide cérébrospinal (NcLCS) sont apparus comme des capteurs potentiels de la position de la colonne vertébrale. Il a notamment été démontré que les NcLCS détectent la flexion de la queue chez le poisson zèbre et la lamproie, et qu'ils modulent à leur tour la locomotion et la posture. Cependant, les fonctions chimiosensorielles des NcLCS n'ont pas été étudiées in vivo. J'ai analysé leur profil transcriptomique à la recherche de chimiorécepteurs et découvert que les NcLCS expriment une grande variété de récepteurs chimiosensoriels, comprenant des récepteurs liés à l'immunité. J'ai contribué à l'étude du rôle des NcLCS dans l'immunité innée lors d'une infection bactérienne en développant un protocole de culture de cellules primaires et en montrant que les NcLCS répondent de manière robuste à des métabolites bactériens pathogènes connus. Ce résultat a été confirmé in vivo où l'invasion bactérienne du LCS provoque une activation forte et prolongée des NcLCS. Finalement, mes travaux ont contribué à établir que les NcLCS sont des neurones chimiosensoriels intéroceptifs détectant des métabolites bactériens pendant une infection.

Pesticides have enabled humankind to protect its crops from pests, intensifying thus the crop yields to sustain the growing population. However, pesticides often end up in aquatic water bodies, e.g. via field runoff, where they may harm non-target organisms. The environmental concentrations of pesticides are often considered safe for aquatic ecosystems although they might induce sublethal changes in exposed organisms. Moreover, the organisms are generally not dealing with only one pesticide issued from a nearby field but with a complex mixture of various chemical compounds, interacting amongst themselves, and creating a toxic cocktail with unknown and hardly predictable impacts. These compounds, each with different environmental fate, eventually degrade and form more or less toxic and persistent metabolites aggravating the complexity of the mixtures.This dissertation thesis summarizes the state-of-the-art in pesticide mixture toxicity research and is composed of five research articles dealing with sublethal effects of selected pesticides on non-target aquatic species. Vulnerable embryo-larval stages of two model organisms: freshwater zebrafish (Danio rerio) and euryhaline bivalve Pacific oyster (Magallana gigas) were used to assess the sublethal toxicity of especially environmental concentrations (detected in selected European water bodies) of commonly used herbicide S metolachlor with its two metabolites metolachlor oxanilic acid and metolachlor ethanesulfonic acid, insecticide imidacloprid, and fungicide propiconazole, alone and in a mixture. A complementary in situ approach was carried out to evaluate a real impact on early-life stages of the Pacific oyster in Arcachon Bay in France, a final recipient of various substances including pesticides from respective watersheds.First, zebrafish embryo-larval stages were observed to be highly sensitive to environmentally relevant concentrations of propiconazole and to a lesser extent also to imidacloprid. In contrast, S-metolachlor and its metabolites had almost no effect on their development, neurobehavioral functions, or gene expression except for altered genes implicated in the thyroid system. A mixture of these compounds exhibited a concentration addition effect on zebrafish development. These observations imply that the development of freshwater fish may be at risk with current agricultural practice.Second, a study with Pacific oyster embryos and larvae revealed very low toxicity of propiconazole and imidacloprid on their development and locomotion patterns. Few effects caused by these compounds were observed at the molecular level, as well as the effects caused by the mixture. The environmental concentration of the mixture induced developmental malformations in oyster larvae, however, those exposed in situ in Arcachon Bay did not show higher proportions of abnormal larvae suggesting that the water quality of Arcachon Bay is sufficient for oyster development. Nevertheless, oyster larvae exposed in the inner part of Arcachon Bay showed different gene expression levels than larvae from the reference site located near the ocean entrance, which may indicate consequences of a potential long term impact.These results documented that embryo-larval stages of zebrafish and Pacific oysters are relevant tools for the assessment of low concentrations of pesticides and pesticides in a mixture, and that laboratory studies complemented with field research are useful for (eco)toxicity assessment and of high ecological relevance., Les pesticides ont pour rôle de protéger les cultures des espèces nuisibles permettant ainsi d’intensifier le rendement agricole pour nourrir une population toujours en augmentation. Néanmoins, les pesticides se retrouvent souvent dans le réseau aquatique, par exemple via le ruissellement, où ils peuvent nuire aux organismes non-cibles. Les concentrations environnementales des pesticides sont souvent considérées sans risque pour les écosystèmes aquatiques, mais elles peuvent cependant induire des effets sublétaux dans les organismes exposés. De plus, les organismes ne font généralement pas face à un seul pesticide provenant d’un champ voisin, mais à un mélange complexe de différents composés chimiques qui interagissent entre eux pour former un cocktail potentiellement toxique avec des impacts inconnus et difficilement prévisibles. Ces composés, peuvent se dégrader au fil du temps et forment des métabolites plus au moins toxiques et persistants qui aggravent encore la complexité des mélanges.Cette thèse s’intéresse à la toxicité de pesticides seuls, en mélange ou en nanoformulation sur des organismes aquatiques non-cibles. Les stades de vie précoces vulnérables de deux organismes modèles : le poisson zèbre (Danio rerio) d’eau douce et un bivalve euryhalin l’huître creuse (Magallana gigas) ont été utilisés afin d’évaluer les effets sublétauxe de concentrations environnementales (détectées dans les cours d’eau européens) de différents pesticides couramment utilisés dont l’herbicide S-métolachlore avec ses deux métabolites acides oxanilique et sulfonique du métolachlore, l’insecticide imidaclopride et le fongicide propiconazole. En complément, une approche in situ a été développée pour évaluer les effets toxiques sur les stades embryo-larvaires de l’huître creuse associés à la qualité de l’eau du Bassin d’Arcachon, réceptacle final de différentes substances provenant des bassins versants.Les résultats indiquent une grande sensibilité des embryons et larves de poisson zèbre aux concentrations environnementales de propiconazole et à un degré moindre de l’imidaclopride. Au contraire, le S-métolachlore et ses métabolites ne présentent que peu d’effet sur le développement, les fonctions neurocomportementales et l’expression des gènes à l’exception des gènes impliqués dans le système thyroïdien. Ces pesticides en mélange semblent se comporter selon un modèle d’addition des concentrations si l’on considère le développement du poisson zèbre. Ces observations sont en lien avec un risque des pratiques agricoles actuelles.Les résultats obtenus lors de ce travail montrent une faible toxicité du propiconazole et de l’imidaclopride sur le développement et le comportement des embryons et larves de l’huître creuse. Quelques effets causés par ces composés seuls ou en mélange sont observés au niveau moléculaire. La concentration environnementale du mélange a induit les malformations larvaires, néanmoins, les embryons d’huître encagés dans le Bassin d’Arcachon ne présentent pas de malformations quel que soit le site d’exposition, ce qui suggère une qualité suffisante de l’eau du Bassin pour le développement de l’huître creuse. Cependant, des différences au niveau de l’expression des gènes sont observées pour les embryons exposés dans la partie interne du bassin d’Arcachon suggérant des conséquences potentielles sur le long terme.Ces résultats indiquent que les stades embryo-larvaires du poisson zèbre et de l’huître creuse sont des outils pertinents pour l’évaluation des faibles concentrations de pesticides seuls ou en mélange. De plus, la mise en œuvre d’expérimentations in situ en complément des approches de laboratoire s’avère utile dans une démarche d’évaluation des risques environnementaux.

In some regions of the adult vertebrate brain, Neural Stem Cells (NSCs) generate fully functional neurons. NSCs are found mostly in quiescence, but can shuttle from quiescence to activation (division). At the population level, the proportion of NSCs dividing at a given time remains constant throughout adulthood and perturbations of NSC activation rate correlate with pathological situations. Also, the spatiotemporal distribution of NSC activation events is expected to impact the homogeneous maintenance of the NSC pools and the locations of neuronal production. What controls the rate and spatiotemporal distribution of NSC activation events remain poorly understood. The adult zebrafish telencephalon is a good model to address these questions. The telencephalon hosts many NSCs and it allow the recording of their behaviors over weeks thanks to an intravital imaging procedure. In this thesis, we have used this model to study the regulation of adult NSCs behaviors from two perspectives. First, we assessed the existence of non-cell-autonomous mechanisms controlling the quiescence-activation balance of the NSC population in space and time. Second, we investigated the relevance of intrinsic heterogeneities on individual NSC behaviors. This work highlighted (i) the importance of NSC geometry for their fate decisions during activation and (ii) the role of their differentiated progeny to locally exert a delayed inhibition, via Notch signaling, to prevent neighboring NSC activation. Using modeling we also show how the lineage-related inhibition maintains NSCs with specific spatiotemporal correlations and can spatially homogenize the distribution of adult-born neurons.; Dans certaines régions du cerveau adulte des vertébrés, les cellules souches neurales (NSC) génèrent des neurones fonctionnels. Les NSC sont principalement en quiescence, mais peuvent passer de l’état quiescent à l’état activé (division). A l’échelle de la population, la proportion des NSCs activées reste constante pendant plusieurs années. Les changements du taux d'activation corrèlent avec le développement de pathologies. Aussi, la distribution spatio-temporelle des événements d'activation peut impacter le maintien homogène des NSCs ainsi que le positionnement des nouveaux neurones. Les mécanismes contrôlant le taux et la distribution spatio-temporelle des événements d'activation ne sont pas bien connus. Nous utilisons le télencéphale du poisson zèbre adulte pour répondre à ces questions. Le télencéphale héberge une grande quantité de NSCs et permet l'enregistrement de leurs comportements, sur plusieurs semaines, grâce à une procédure d'imagerie intra-vitale. Dans cette thèse, nous avons évalué l'existence de mécanismes non-cellulaires autonomes contrôlant l'équilibre activation/quiescence dans l'espace et au cours du temps. Nous avons aussi étudié la pertinence des hétérogénéités moléculaires et géométriques sur le comportement des NSCs. Ces travaux ont mis en évidence l'importance de la géométrie des NSCs lors de l'activation et le rôle des cellules progénitrices, produites par les NSCs, pour exercer une inhibition, via la signalisation Notch, empêchant l'activation des NSCs voisines. Grâce à un modèle analytique, nous montrons que cette inhibition maintient la distribution spatio-temporelle des NSCs et homogénéise spatialement la distribution des nouveaux neurones.

The vestibular apparatus provides animals with postural and movement-related information that is essential to adequately execute numerous sensorimotor tasks. In order to activate this sensory system in a physiological manner, one needs to macroscopically rotate or translate the animal’s head, which in turn renders simultaneous neural recordings highly challenging. My thesis work focused on the development of a miniaturized light-sheet microscope that can be dynamically co-rotated with a head-restrained zebrafish larva, enabling control- led vestibular stimulation. The mechanical rigidity of the microscope allows me to perform whole-brain functional imaging with state-of-the-art resolution and signal-to-noise ratio while imposing up to 25◦ in angular position and 6 000◦/s2 in rotational acceleration. I illustrate the potential of this novel setup by producing the first whole-brain response maps to rolling and tilting vestibular stimulation. The responsive population spans multiple brain areas and displays bilateral symmetry, and its organization is highly stereotypic across individuals. Using Fourier and regression analyses, I identified three major functional clusters that exhibit well defined phasic and tonic response patterns to vestibular stimulation. This rotatable light-sheet microscope provides a unique tool for systematically studying vestibular processing in the vertebrate brain and extends the potential of virtual- reality systems to explore complex multisensory and motor integration during simulated 3D navigation.; L’appareil vestibulaire fournit aux animaux des informations relatives à la posture et aux mouvements qui sont essentielles pour exécuter correctement les tâches sensori-motrices. Afin d’activer ce système sensoriel de manière physiologique, il est nécessaire d’effectuer une rotation ou une translation macroscopique de la tête de l’animal, ce qui rend les enregistrements neuronaux simultanés très difficiles. Mon travail de thèse a porté sur le développement d’un microscope à feuille de lumière miniaturisé, qui peut être mis en rotation dynamique avec une larve de poisson zèbre retenue par la tête permettant une stimulation vestibulaire contrôlée. La rigidité mécanique du microscope m’a permis d’effectuer une imagerie fonctionnelle de l’ensemble du cerveau avec une résolution et un rapport signal/bruit équivalent à l’état de l’art, tout en imposant jusqu’à 25◦ d’amplitude et 6 000◦/s2 d’accélération angulaire. Le potentiel de ce nouveau système m’a permis de produire les premières cartes de réponses du cerveau entier à la stimulation vestibulaire en roulis et en tangage. Les neurones excités s’étendent sur plusieurs zones cérébrales et présentent une symétrie bilatérale, et son organisation est très stéréotypée d’un individu à l’autre. En utilisant l’analyse de Fourier et de régression, j’ai identifié trois grands groupes fonctionnels qui présentent des schémas de réponse phasique et tonique bien définis à la stimulation vestibulaire. Ce microscope rotatif fournit un outil unique pour l’étude du traitement vestibulaire dans le cerveau des vertébrés.

The vestibular apparatus provides animals with postural and movement-related information that is essential to adequately execute numerous sensorimotor tasks. In order to activate this sensory system in a physiological manner, one needs to macroscopically rotate or translate the animal’s head, which in turn renders simultaneous neural recordings highly challenging. My thesis work focused on the development of a miniaturized light-sheet microscope that can be dynamically co-rotated with a head-restrained zebrafish larva, enabling control- led vestibular stimulation. The mechanical rigidity of the microscope allows me to perform whole-brain functional imaging with state-of-the-art resolution and signal-to-noise ratio while imposing up to 25◦ in angular position and 6 000◦/s2 in rotational acceleration. I illustrate the potential of this novel setup by producing the first whole-brain response maps to rolling and tilting vestibular stimulation. The responsive population spans multiple brain areas and displays bilateral symmetry, and its organization is highly stereotypic across individuals. Using Fourier and regression analyses, I identified three major functional clusters that exhibit well defined phasic and tonic response patterns to vestibular stimulation. This rotatable light-sheet microscope provides a unique tool for systematically studying vestibular processing in the vertebrate brain and extends the potential of virtual- reality systems to explore complex multisensory and motor integration during simulated 3D navigation.; L’appareil vestibulaire fournit aux animaux des informations relatives à la posture et aux mouvements qui sont essentielles pour exécuter correctement les tâches sensori-motrices. Afin d’activer ce système sensoriel de manière physiologique, il est nécessaire d’effectuer une rotation ou une translation macroscopique de la tête de l’animal, ce qui rend les enregistrements neuronaux simultanés très difficiles. Mon travail de thèse a porté sur le développement d’un microscope à feuille de lumière miniaturisé, qui peut être mis en rotation dynamique avec une larve de poisson zèbre retenue par la tête permettant une stimulation vestibulaire contrôlée. La rigidité mécanique du microscope m’a permis d’effectuer une imagerie fonctionnelle de l’ensemble du cerveau avec une résolution et un rapport signal/bruit équivalent à l’état de l’art, tout en imposant jusqu’à 25◦ d’amplitude et 6 000◦/s2 d’accélération angulaire. Le potentiel de ce nouveau système m’a permis de produire les premières cartes de réponses du cerveau entier à la stimulation vestibulaire en roulis et en tangage. Les neurones excités s’étendent sur plusieurs zones cérébrales et présentent une symétrie bilatérale, et son organisation est très stéréotypée d’un individu à l’autre. En utilisant l’analyse de Fourier et de régression, j’ai identifié trois grands groupes fonctionnels qui présentent des schémas de réponse phasique et tonique bien définis à la stimulation vestibulaire. Ce microscope rotatif fournit un outil unique pour l’étude du traitement vestibulaire dans le cerveau des vertébrés.

During the last decades, plastics have gained interest from media, public and scientists. Plastics have been categorized as emerging pollutants particularly in the marine environment due to their ubiquity and persistence, particularly microplastics (< 5 mm, MPs). Numerous studies reported the occurrence of MPs in the marine environment (surface water, sediments). However, neither there exist standardized nor harmonized methods to evaluate their potential toxicity and their role as vector of hazardous chemicals into organism. This thesis had three main objectives, (1) the investigation of sorption of chemicals models on MPs, (2) the study of the toxic potential of these sorbed chemicals on zebrafish and (3) the characterization and the study of the toxicity of environmental MPs. The first part of the thesis aimed at the investigation of the sorption processes of three model pollutants - perfluorooctanesulfonic acid (PFOS), benzo[a]pyrene (BaP) and oxybenzone (BP3) - on pristine MPs using different sizes and polymer types. The second part studied the vectorization of the three compounds sorbed on MPs toward zebrafish (Danio rerio) embryos, juveniles and adults through direct or trophic exposures, and their toxicities. The third part investigated the toxicity of environmental samples of MPs from two sandy beaches (Guadeloupe Island, France), using the same procedure as above, as well as the characterization of additives and adsorbed chemicals through a non-target approach. Study of pollutants sorption demonstrated differences in pattern (e.g. kinetics, sorption efficiency), depending on size particles and chemical used. Potential adverse effects of MPs associated with chemicals were investigated in zebrafish embryos using OECD 236 guideline and by using a chronic exposure from larvae or juveniles up to 5-months old adults through trophic exposure. Molecular and individual toxicological endpoints were monitored during exposure. Main findings were the low acute toxicity of MPs on early life stages (embryos and larvae) exposed to particles, organic extracts or leachates. Nevertheless, the ingestion of MPs by juveniles and adults led to a significant long-term toxicity for all tested MPs albeit with different intensity according to the spiked chemicals and to the environmental samples. Deleterious effects included growth alteration, reprotoxicity, behavioral disturbances as well as hyperactivity observed in offspring of exposed fish. In conclusion, the present work revealed that (1) MPs may play a role in the vectorization of pollutants and (2) may induce significant sublethal effects in juveniles of zebrafish chronically fed with pristine MPs or MPs artificially spiked with pollutants. Same conclusions were observed (3) with environmental MPs., Au cours des dernières années, les plastiques ont attiré un intérêt particulier du public et des scientifiques. Les plastiques ont été classés parmi les polluants émergents, notamment dans le milieu marin de par leur présence ainsi que leur persistance, en particulier les microplastiques (< 5mm, MPs). De nombreuses études ont reportées la présence de MPs dans le milieu marin (eau de surface et sédiments). Cependant, il n’existe pas de méthodes standards pour évaluer leurs potentielle toxicités ainsi que leur rôle en tant que vecteur de polluants au sein des organismes. Cette thèse avait pour objectif, (1) l’étude de la sorption de composés chimiques modèles sur des MPs, (2) l’étude de la toxicité de ces composés adsorbés artificiellement sur le poisson zèbre (Danio rerio) ainsi que (3) la caractérisation et l’étude de MPs environnementaux. La première partie de cette thèse avait pour but d’étudier les processus de sorption de trois composés modèles ; l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS), benzo[a]pyrene (BaP) et l’oxybenzone (BP3) ; sur différentes tailles et différents polymères industriels. La seconde partie concernait l’étude de la vectorisation de ces 3 composés modèles adsorbés sur MPs en utilisant les stades précoces, juvéniles et adultes de poisson zèbre, au travers d’exposition directe ou via exposition trophique. La dernière partie évaluait la toxicité de MPs environnementaux provenant de deux plages (Guadeloupe, France), en utilisant les mêmes procédures que pour l’évaluation de la toxicité de MPs artificiels. La caractérisation polymérique et chimique des échantillons environnementaux a également été étudiée. L’étude de la sorption des polluants démontra des différences de réponses (cinétiques et efficacité de la sorption) dépendant de la taille des particules ainsi que des propriétés chimiques des composés. La toxicité des MPs artificiellement dopés avec des composés modèles a d’abord été évaluée selon la ligne directrice de l’OCDE 236 ainsi que via une exposition trophique chronique, débutant à l’état larvaire jusqu’à des poissons âgés de 5 mois. Des biomarqueurs à l’échelle individuelle et moléculaire ont été suivis au cours de l’exposition. Les résultats principaux correspondaient à une faible toxicité aiguë sur les stades précoces de développement (embryons et larves) exposés aux particules, aux extraits organiques mais également aux lixiviats, de MPs artificiels ou environnementaux. Néanmoins, l’ingestion des MPs au cours de l’exposition trophique a conduit à des effets à long-terme, avec des intensités différentes liées aux composés chimiques adsorbés aux MPs. Les effets toxiques incluaient des altérations de la croissance (taille et poids des poissons), des effets sur la reproduction, des modifications comportementales des adultes exposés ainsi que des changement d’activité natatoire des larves de la génération F1. En conclusion, cette thèse a permis de mettre en évidence le fait que (1) les MPs ont la capacité d’être des vecteurs de polluants mais qu’ils peuvent également (2) induire des effets sublétaux sur des juveniles et adultes de poisson exposés aux MPs via la nourriture mais également sur la progéniture F1.

During the last decades, plastics have gained interest from media, public and scientists. Plastics have been categorized as emerging pollutants particularly in the marine environment due to their ubiquity and persistence, particularly microplastics (< 5 mm, MPs). Numerous studies reported the occurrence of MPs in the marine environment (surface water, sediments). However, neither there exist standardized nor harmonized methods to evaluate their potential toxicity and their role as vector of hazardous chemicals into organism. This thesis had three main objectives, (1) the investigation of sorption of chemicals models on MPs, (2) the study of the toxic potential of these sorbed chemicals on zebrafish and (3) the characterization and the study of the toxicity of environmental MPs. The first part of the thesis aimed at the investigation of the sorption processes of three model pollutants - perfluorooctanesulfonic acid (PFOS), benzo[a]pyrene (BaP) and oxybenzone (BP3) - on pristine MPs using different sizes and polymer types. The second part studied the vectorization of the three compounds sorbed on MPs toward zebrafish (Danio rerio) embryos, juveniles and adults through direct or trophic exposures, and their toxicities. The third part investigated the toxicity of environmental samples of MPs from two sandy beaches (Guadeloupe Island, France), using the same procedure as above, as well as the characterization of additives and adsorbed chemicals through a non-target approach. Study of pollutants sorption demonstrated differences in pattern (e.g. kinetics, sorption efficiency), depending on size particles and chemical used. Potential adverse effects of MPs associated with chemicals were investigated in zebrafish embryos using OECD 236 guideline and by using a chronic exposure from larvae or juveniles up to 5-months old adults through trophic exposure. Molecular and individual toxicological endpoints were monitored during exposure. Main findings were the low acute toxicity of MPs on early life stages (embryos and larvae) exposed to particles, organic extracts or leachates. Nevertheless, the ingestion of MPs by juveniles and adults led to a significant long-term toxicity for all tested MPs albeit with different intensity according to the spiked chemicals and to the environmental samples. Deleterious effects included growth alteration, reprotoxicity, behavioral disturbances as well as hyperactivity observed in offspring of exposed fish. In conclusion, the present work revealed that (1) MPs may play a role in the vectorization of pollutants and (2) may induce significant sublethal effects in juveniles of zebrafish chronically fed with pristine MPs or MPs artificially spiked with pollutants. Same conclusions were observed (3) with environmental MPs.; Au cours des dernières années, les plastiques ont attiré un intérêt particulier du public et des scientifiques. Les plastiques ont été classés parmi les polluants émergents, notamment dans le milieu marin de par leur présence ainsi que leur persistance, en particulier les microplastiques (< 5mm, MPs). De nombreuses études ont reportées la présence de MPs dans le milieu marin (eau de surface et sédiments). Cependant, il n’existe pas de méthodes standards pour évaluer leurs potentielle toxicités ainsi que leur rôle en tant que vecteur de polluants au sein des organismes. Cette thèse avait pour objectif, (1) l’étude de la sorption de composés chimiques modèles sur des MPs, (2) l’étude de la toxicité de ces composés adsorbés artificiellement sur le poisson zèbre (Danio rerio) ainsi que (3) la caractérisation et l’étude de MPs environnementaux. La première partie de cette thèse avait pour but d’étudier les processus de sorption de trois composés modèles ; l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS), benzo[a]pyrene (BaP) et l’oxybenzone (BP3) ; sur différentes tailles et différents polymères industriels. La seconde partie concernait l’étude de la vectorisation de ces 3 composés modèles adsorbés sur MPs en utilisant les stades précoces, juvéniles et adultes de poisson zèbre, au travers d’exposition directe ou via exposition trophique. La dernière partie évaluait la toxicité de MPs environnementaux provenant de deux plages (Guadeloupe, France), en utilisant les mêmes procédures que pour l’évaluation de la toxicité de MPs artificiels. La caractérisation polymérique et chimique des échantillons environnementaux a également été étudiée. L’étude de la sorption des polluants démontra des différences de réponses (cinétiques et efficacité de la sorption) dépendant de la taille des particules ainsi que des propriétés chimiques des composés. La toxicité des MPs artificiellement dopés avec des composés modèles a d’abord été évaluée selon la ligne directrice de l’OCDE 236 ainsi que via une exposition trophique chronique, débutant à l’état larvaire jusqu’à des poissons âgés de 5 mois. Des biomarqueurs à l’échelle individuelle et moléculaire ont été suivis au cours de l’exposition. Les résultats principaux correspondaient à une faible toxicité aiguë sur les stades précoces de développement (embryons et larves) exposés aux particules, aux extraits organiques mais également aux lixiviats, de MPs artificiels ou environnementaux. Néanmoins, l’ingestion des MPs au cours de l’exposition trophique a conduit à des effets à long-terme, avec des intensités différentes liées aux composés chimiques adsorbés aux MPs. Les effets toxiques incluaient des altérations de la croissance (taille et poids des poissons), des effets sur la reproduction, des modifications comportementales des adultes exposés ainsi que des changement d’activité natatoire des larves de la génération F1. En conclusion, cette thèse a permis de mettre en évidence le fait que (1) les MPs ont la capacité d’être des vecteurs de polluants mais qu’ils peuvent également (2) induire des effets sublétaux sur des juveniles et adultes de poisson exposés aux MPs via la nourriture mais également sur la progéniture F1.

Nucleoplasmin 2(npm2) is an essential maternal-effect gene that mediates early embryonic events through its function as a histone chaperone that remodels chromatin. Here we report the existence of twonpm2(npm2aandnpm2b) genes in zebrafish. We examined the evolution ofnpm2aandnpm2bin a variety of vertebrates, their potential phylogenetic relationships, and their biological functions using knockout models via the CRISPR/cas9 system. We demonstrated that the twonpm2duplicates exist in a wide range of vertebrates, including sharks, ray-finned fish, amphibians, and sauropsids, whilenpm2awas lost in Coelacanth and mammals, as well as some specific teleost lineages. Using phylogeny and synteny analyses, we traced their origins to the early stages of vertebrate evolution. Our findings suggested thatnpm2aandnpm2bresulted from an ancient local gene duplication, and their functions diverged although key protein domains were conserved. We then investigated their functions by examining their tissue distribution in a wide variety of species and found that they shared ovarian-specific expression, a key feature of maternal-effect genes. We also showed that bothnpm2aandnpm2bare maternally-inherited transcripts in vertebrates. Moreover, we used zebrafish knockouts to demonstrate thatnpm2aandnpm2bplay essential, but distinct, roles in early embryogenesis.npm2afunctions very early during embryogenesis, at or immediately after fertilization, whilenpm2bis involved in processes leading up to or during zygotic genome activation. These novel findings will broaden our knowledge on the evolutionary diversity of maternal-effect genes and underlying mechanisms that contribute to vertebrate reproductive success.Author SummaryThe protein and transcript of thenpm2gene have been previously demonstrated as maternal contributions to embryos of several vertebrates. Recently, twonpm2genes, denoted here asnpm2aandnpm2b, were discovered in zebrafish. This study was conducted to explore the evolutionary origin and changes that occurred that culminated in their current functions. We found that an ancient local duplication of the ancestralnpm2gene created the current two forms, and while most vertebrates retained both genes, notably, mammals and certain species of fish lostnpm2aand, albeit rarely, bothnpm2aandnpm2b. Our functional analyses showed thatnpm2aandnpm2bhave diverse but essential functions during embryogenesis, asnpm2amutants failed to undergo development at the earliest stage whilenpm2bmutants developed, although abnormally, until the zygotic genome activation stage after which their development was arrested followed subsequently by death. Our study is the first to clearly demonstrate the evolution, diversification, and functional analyses of thenpm2genes, which are essential maternal factors that are required for proper embryonic development and survival.

Heat shock proteins (HSPs) are reported to play an important role in erythropoiesis. The expression of HSP genes is mainly controlled by Heat shock factor 1 (HSF1), a highly conserved transcription factor. So far, a detailed understanding of the function of HSF1 in erythropoiesis remains uncharacterized. This study has employed zebrafish as a relevant model to investigate the role of Hsf1 during embryonic erythropoiesis. We established hsf1-disrupted zebrafish lines using the CRISPR/Cas9 technology and performed phenotypic analyses throughout embryogenesis. We found that Hsf1 deficient embryos had a decreased number of primitive erythrocytes, while erythrocyte number in adults was unchanged. In Hsf1 deficient embryos, expression of embryonic a and b-globin genes was reduced as well as gata1 expression. In addition, the morphology of erythrocytes suggested an inhibition of erythrocyte maturation. On the other hand, no significant changes were observed in myeloid cells.Altogether our results support a key role for Hsf1 in erythrocyte maturation in vivo., Il a été démontré que les protéines de choc thermique (HSP) jouent un rôle important dans l'érythropoïèse. Or, l'expression des gènes HSP est contrôlée par le facteur de choc thermique 1 (HSF1), un facteur de transcription hautement conservé. Jusqu'à présent, une compréhension détaillée de la fonction d’HSF1 dans l'érythropoïèse reste à établir. Dans notre étude, nous avons utilisé le poisson zèbre, modèle animal pertinent, pour étudier le rôle du gène hsf1 pendant l'érythropoïèse embryonnaire. Nous avons établi des lignées de poisson-zèbre invalidées pour le gène hsf1 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 et nous avons effectué des analyses phénotypiques tout au long de l'embryogenèse. Nous avons constaté que les embryons déficients en Hsf1 ont un nombre réduit d'érythrocytes primitifs, alors que le nombre d'érythrocytes chez les poissons zèbres adultes reste inchangé. L'expression des gènes embryonnaires des chaînes a et b-globines est réduite ainsi que l'expression de gata1. De plus, la morphologie des érythrocytes révèle une inhibition de la maturation des érythrocytes. En revanche, aucun changement significatif n'a été observé dans les cellules myéloïdes.Nos résultats montrent que le gène hsf1 est un régulateur positif de la maturation des érythrocytes in vivo.

Whole genome duplications (WGD) are important evolutionary events. Our understanding of underlying mechanisms, including the evolution of duplicated genes after WGD, however remains incomplete. Teleost fish experienced a common WGD (teleost-specific genome duplication, or TGD) followed by a dramatic adaptive radiation leading to more than half of all vertebrate species. The analysis of gene expression patterns following TGD at the genome level has been limited by the lack of suitable genomic resources. The recent concomitant release of the genome sequence of spotted gar (a representative of holosteans, the closest lineage of teleosts that lacks the TGD) and the tissue-specific gene expression repertoires of over 20 holostean and teleostean fish species, including spotted gar, zebrafish and medaka (the PhyloFish project), offered a unique opportunity to study the evolution of gene expression following TGD in teleosts. We show that most TGD duplicates gained their current status (loss of one duplicate gene or retention of both duplicates) relatively rapidly after TGD (i.e. prior to the divergence of medaka and zebrafish lineages). The loss of one duplicate is the most common fate after TGD with a probability of approximately 80%. In addition, the fate of duplicate genes after TGD, including subfunctionalization, neofunctionalization, or retention of two ‘similar’ copies occurred not only before, but also after the radiation of species tested, in consistency with a role of the TGD in speciation and/or evolution of gene function. Finally, we report novel cases of TGD ohnolog subfunctionalization and neofunctionalization that further illustrate the importance of these processes.

Bacteria belonging to the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are life threatening opportunistic pathogens of cystic fibrosis patients and an emerging cause of serious infections in immune-compromised individuals. These bacteria are intrinsically resistant to clinically used antibiotics, which complicates disease management and treatment. Therefore, it is important to identify and develop new antimicrobial strategies to counteract Bcc infections.It has recently been shown that macrophages are essential for replication of Burkholderia cenocepacia and for triggering acute pro-inflammatory and fatal infection in zebrafish larvae. A major objective of this thesis was to apply Transposon-Directed Insertion Sequencing (TraDIS) to detect mutants with reduced intracellular survival and virulence in zebrafish embryos. Massive parallel sequencing of insertion sequences followed by bioinformatics analysis showed that the use of Himar1 transposon resulted in a large bias for insertion in rRNA and tRNA genes, with over 70% of reads mapped to these genes for yet unknown reasons. Although based on one biological experiment, analysis of the remaining insertion sequences identified several mutants that were absent or underrepresented at 8 and 18 hours post infection, including mutants of the afc cluster, a gene cluster that specifies the production of a compound with antifungal activity. This finding is in agreement with recent studies in the laboratory, showing that the LysR-type transcriptional regulator ShvR and its regulatory target afc are essential for the switch from persistent to acute infection by B. cenocepacia K56-2 in zebrafish embryos. This proof of principle shows the feasibility of identifying bacterial factors important for virulence of intracellular bacteria in zebrafish larvae using transposon-based high throughput screens.B. cenocepacia H111 is closely related to strain K56-2, yet is less virulent in different animal models. We found that constitutive expression of shvR in B. cenocepacia H111 increased virulence in zebrafish larvae to almost K56-2 levels in an afc dependent manner, which strengthens the finding that AFC is a key factor in acute virulence of B. cenocepacia K56-2, and strengthens our hypothesis that differences in regulatory signals between strains may be a major reason for differences in pathogenicity.In a second objective, I further analysed the role of several established bacterial factors in virulence of B. cenocepacia K56-2 in zebrafish embryos. While MgtC slightly contributed to virulence only in older larvae, we found that the zinc metalloprotease zmpA mutant was significantly attenuated in virulence, as found in a rat model of chronic infection. Previous unpublished results obtained in the laboratory have shown that B. cenocepacia K56-2 triggers autophagy in macrophages of infected zebrafish larvae, visualized as labeling of bacteria containing vacuoles with Lc3-GFP. Although no significant differences in the increase of pro-inflammatory gene expression was found, I observed that fewer zmpA containing vacuoles in infected macrophages in vivo recruited Lc3 compared to phagosomes containing wildtype bacteria. Together the data suggest that ZmpA contributes to induction of autophagy and inflammation in infected macrophages in zebrafish. Further research is needed to determine the correlation between bacterial factors, the engagement of the autophagy machinery and the extent of pro-inflammatory responses, which may lead to the discovery of new therapeutic targets against these important opportunistic pathogens.; Les bactéries apparentant au complexe Burkholderia cepacia sont des pathogènes opportunistes chez les patients atteints de mucoviscidose, et sont responsables de sérieuses infections chez les individus immunodéprimés. Ces bactéries sont intrinsèquement résistantes aux antibiotiques cliniquement utilisés, ce qui complique le traitement et la prévention des infections. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer de nouvelles stratégies antimicrobiennes afin de combattre les infections causées par le Bcc.Nous avons récemment démontré que les macrophages sont essentiels pour la réplication de Burkholderia cenocepacia, et pour le développement d’une infection pro-inflammatoire aigue et fatale dans des embryons de poisson zèbre. Le premier objectif de cette thèse est d’utiliser la technique de TraDIS (transposon-directed insertion sequencing) pour détecter des mutants atténués en virulence dans les embryons de poisson zèbre. Le séquençage parallèle massif des séquences d’insertion suivi d’analyses bioinformatiques a révélé un biais d’insertion du transposon Himar1, avec plus de 70% des « reads » présents dans des séquences codantes pour des ARNt et ARNr, pour des raisons toujours méconnues. L’analyse des séquences restantes a identifié plusieurs mutants absents ou sous-représentés à 8 et 18 heures post-infection, dont des mutants dans le cluster afc, impliqué dans la production d’un composé doté d’une activité antifongique. Cette découverte est en accord avec des études récentes de notre laboratoire, qui démontrent que le régulateur transcriptionnel ShvR, ainsi que sa cible afc, sont essentiels pour le switch entre une infection persistante et une infection aigue causée par B. cenocepacia K56-2 dans des embryons de poisson zèbre. Ceci confirme la possibilité d’identification de facteurs bactériens importants pour la virulence des bactéries intracellulaires dans les embryons de poisson zèbre, en utilisant la technique de mutagenèse de transposon couplée au séquençage parallèle massif.B. cenocepacia H111 est une souche proche de K56-2, mais moins virulente dans différents modèles animaux. Nous avons montré que l’expression constitutive de shvR dans H111 augmente la virulence de la souche dans les embryons de poisson zèbre, à un niveau similaire à K56-2, dépendamment de la présence de afc. Ceci renforce notre hypothèse que AFC est un facteur clé pour la virulence aigue, et que la différence de pathogénicité observée entre différentes souches pourrait être due à des différences de régulation.En un second objectif, nous avons analysé dans des embryons de poisson zèbre, le rôle de différents facteurs bactériens déjà établis importants pour la virulence de B. cenocepacia K56-2 dans d’autres modèles. Nous avons montré que le mutant de la zinc métalloprotéase zmpA est atténué en virulence. Des résultats antécédents obtenus dans notre laboratoire ont montré que B. cenocepacia K56-2 déclenche l’autophagie dans des macrophages infectés, dans les embryons de poisson zèbre, visualisé par le marquage des vacuoles contenant les bactéries par Lc3-GFP. Nous avons observé que les vacuoles contenant le mutant zmpA recrutent moins de Lc3-GFP que le wildtype. Nos résultats suggèrent que ZmpA contribue au déclenchement de l’autophagie et à l’inflammation, dans les macrophages infectés.Des études plus poussées seront nécessaires afin de déterminer la corrélation entre les facteurs bactériens, l’induction de l’autophagie, ainsi que l’ampleur de la réponse pro-inflammatoire, ce qui pourrait mener à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques contre ces pathogènes opportunistes importants.

Bacteria belonging to the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are life threatening opportunistic pathogens of cystic fibrosis patients and an emerging cause of serious infections in immune-compromised individuals. These bacteria are intrinsically resistant to clinically used antibiotics, which complicates disease management and treatment. Therefore, it is important to identify and develop new antimicrobial strategies to counteract Bcc infections.It has recently been shown that macrophages are essential for replication of Burkholderia cenocepacia and for triggering acute pro-inflammatory and fatal infection in zebrafish larvae. A major objective of this thesis was to apply Transposon-Directed Insertion Sequencing (TraDIS) to detect mutants with reduced intracellular survival and virulence in zebrafish embryos. Massive parallel sequencing of insertion sequences followed by bioinformatics analysis showed that the use of Himar1 transposon resulted in a large bias for insertion in rRNA and tRNA genes, with over 70% of reads mapped to these genes for yet unknown reasons. Although based on one biological experiment, analysis of the remaining insertion sequences identified several mutants that were absent or underrepresented at 8 and 18 hours post infection, including mutants of the afc cluster, a gene cluster that specifies the production of a compound with antifungal activity. This finding is in agreement with recent studies in the laboratory, showing that the LysR-type transcriptional regulator ShvR and its regulatory target afc are essential for the switch from persistent to acute infection by B. cenocepacia K56-2 in zebrafish embryos. This proof of principle shows the feasibility of identifying bacterial factors important for virulence of intracellular bacteria in zebrafish larvae using transposon-based high throughput screens.B. cenocepacia H111 is closely related to strain K56-2, yet is less virulent in different animal models. We found that constitutive expression of shvR in B. cenocepacia H111 increased virulence in zebrafish larvae to almost K56-2 levels in an afc dependent manner, which strengthens the finding that AFC is a key factor in acute virulence of B. cenocepacia K56-2, and strengthens our hypothesis that differences in regulatory signals between strains may be a major reason for differences in pathogenicity.In a second objective, I further analysed the role of several established bacterial factors in virulence of B. cenocepacia K56-2 in zebrafish embryos. While MgtC slightly contributed to virulence only in older larvae, we found that the zinc metalloprotease zmpA mutant was significantly attenuated in virulence, as found in a rat model of chronic infection. Previous unpublished results obtained in the laboratory have shown that B. cenocepacia K56-2 triggers autophagy in macrophages of infected zebrafish larvae, visualized as labeling of bacteria containing vacuoles with Lc3-GFP. Although no significant differences in the increase of pro-inflammatory gene expression was found, I observed that fewer zmpA containing vacuoles in infected macrophages in vivo recruited Lc3 compared to phagosomes containing wildtype bacteria. Together the data suggest that ZmpA contributes to induction of autophagy and inflammation in infected macrophages in zebrafish. Further research is needed to determine the correlation between bacterial factors, the engagement of the autophagy machinery and the extent of pro-inflammatory responses, which may lead to the discovery of new therapeutic targets against these important opportunistic pathogens., Les bactéries apparentant au complexe Burkholderia cepacia sont des pathogènes opportunistes chez les patients atteints de mucoviscidose, et sont responsables de sérieuses infections chez les individus immunodéprimés. Ces bactéries sont intrinsèquement résistantes aux antibiotiques cliniquement utilisés, ce qui complique le traitement et la prévention des infections. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer de nouvelles stratégies antimicrobiennes afin de combattre les infections causées par le Bcc.Nous avons récemment démontré que les macrophages sont essentiels pour la réplication de Burkholderia cenocepacia, et pour le développement d’une infection pro-inflammatoire aigue et fatale dans des embryons de poisson zèbre. Le premier objectif de cette thèse est d’utiliser la technique de TraDIS (transposon-directed insertion sequencing) pour détecter des mutants atténués en virulence dans les embryons de poisson zèbre. Le séquençage parallèle massif des séquences d’insertion suivi d’analyses bioinformatiques a révélé un biais d’insertion du transposon Himar1, avec plus de 70% des « reads » présents dans des séquences codantes pour des ARNt et ARNr, pour des raisons toujours méconnues. L’analyse des séquences restantes a identifié plusieurs mutants absents ou sous-représentés à 8 et 18 heures post-infection, dont des mutants dans le cluster afc, impliqué dans la production d’un composé doté d’une activité antifongique. Cette découverte est en accord avec des études récentes de notre laboratoire, qui démontrent que le régulateur transcriptionnel ShvR, ainsi que sa cible afc, sont essentiels pour le switch entre une infection persistante et une infection aigue causée par B. cenocepacia K56-2 dans des embryons de poisson zèbre. Ceci confirme la possibilité d’identification de facteurs bactériens importants pour la virulence des bactéries intracellulaires dans les embryons de poisson zèbre, en utilisant la technique de mutagenèse de transposon couplée au séquençage parallèle massif.B. cenocepacia H111 est une souche proche de K56-2, mais moins virulente dans différents modèles animaux. Nous avons montré que l’expression constitutive de shvR dans H111 augmente la virulence de la souche dans les embryons de poisson zèbre, à un niveau similaire à K56-2, dépendamment de la présence de afc. Ceci renforce notre hypothèse que AFC est un facteur clé pour la virulence aigue, et que la différence de pathogénicité observée entre différentes souches pourrait être due à des différences de régulation.En un second objectif, nous avons analysé dans des embryons de poisson zèbre, le rôle de différents facteurs bactériens déjà établis importants pour la virulence de B. cenocepacia K56-2 dans d’autres modèles. Nous avons montré que le mutant de la zinc métalloprotéase zmpA est atténué en virulence. Des résultats antécédents obtenus dans notre laboratoire ont montré que B. cenocepacia K56-2 déclenche l’autophagie dans des macrophages infectés, dans les embryons de poisson zèbre, visualisé par le marquage des vacuoles contenant les bactéries par Lc3-GFP. Nous avons observé que les vacuoles contenant le mutant zmpA recrutent moins de Lc3-GFP que le wildtype. Nos résultats suggèrent que ZmpA contribue au déclenchement de l’autophagie et à l’inflammation, dans les macrophages infectés.Des études plus poussées seront nécessaires afin de déterminer la corrélation entre les facteurs bactériens, l’induction de l’autophagie, ainsi que l’ampleur de la réponse pro-inflammatoire, ce qui pourrait mener à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques contre ces pathogènes opportunistes importants.

The aim of my research project was to link brain structures and functions, to better understand the fundamental bases of cognition. The first part of my thesis consisted in the development of behavioral tests to analyze the essential principles of cognition. The results strongly suggest the existence of executive functions in teleosts similar to those of mammals. Then I looked for the anatomical structures responsible for these cognitive capacities, in particular in the pallium (equivalent of the mammalian cerebral cortex). However, little is known about adult zebrafish neuroanatomy. Indeed, zebrafish is often studied at larval stage. A second part of my work aimed at studying adult structures in more detail through their developmental origin. This has redefined some parts of the brain. We have discovered that some of the structures that were considered as part of the forebrain (prosencephalon) are actually part of the midbrain (mesencephalon) in zebrafish. This includes the inferior lobe, previously classified as hypothalamus. Another structure is the major sensory relay nucleus, the preglomerular nucleus, functional analogue of the thalamus (part of the forebrain) in amniotes. This sensory pathway contains the main visual pathway to the pallium. Thus, even if some structures have the same function, they may have an evolutionary and developmental origin different from structures known in mammals. In summary, similar functions have independently evolved in amniotes and teleosts. This comparative work adds new perspectives for neuroscience research. It also allows us to approach the fundamentals of cognition in a new way: what are the essential building blocks for a higher level of cognition like the human one?, L'objectif de mon projet de recherche était de faire le lien entre structures cérébrales et fonctions, pour mieux comprendre les bases de la cognition. La première partie de ma thèse a été de développer des tests comportementaux pour analyser la cognition et ses fondamentaux. Les résultats suggèrent fortement que les téléostéens possèdent des fonctions exécutives semblables à celles des mammifères. J’ai par la suite cherché le substrat anatomique de ces capacités cognitives nouvellement mises à jour chez cette espèce, notamment dans le pallium (équivalent du cortex cérébral des mammifères). Cependant la neuroanatomie du poisson zèbre adulte est mal connue, car il est souvent utilisé au stade larvaire. Une seconde partie de mon travail a cherché à analyser et identifier l'origine développementale des structures cérébrales adultes. Nous avons découvert que certaines structures considérées jusqu'ici comme faisant partie du cerveau antérieur (prosencéphale) font en fait partie du cerveau médian (mésencéphale) chez le poisson zèbre. L’une de ces structures est le lobe inférieur, précédemment considéré comme hypothalamique. Une autre structure est le noyau préglomérulaire, le noyau sensoriel relais majeur et analogue fonctionnel du thalamus. Cette voie sensorielle contient la principale voie visuelle vers le pallium. Ainsi, même si certaines structures ont la même fonction, elles peuvent avoir une origine évolutive et développementale différente des structures connues chez les mammifères. En résumé, des fonctions similaires ont évolué indépendamment chez les amniotes et les téléostéens. Ce travail élargit ainsi les champs d'application pour la recherche en neurosciences, et permet d'approcher les fondamentaux de la cognition de manière nouvelle par l'identification des structures essentielles à l'émergence d'une cognition de haut niveau telle qu'elle est observée dans l'espèce humaine.

Les paraplégies spastiques familiales (PSF) sont un groupe de maladie neurodégénératives hétérogènes affectant les neurones moteurs supérieurs et causant une faiblesse musculaire progressive des membres inférieurs entrainant des problèmes de marche. Plus de 60 gènes ont été lies à cette maladie, leur nombre augmentant régulièrement. La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative à déclenchement tardif qui affecte les neurones moteurs supérieurs et inférieurs, entrainant une atrophie musculaire accompagnée de spasticité. La mort, causée par une insuffisance respiratoire survient dans les 2 à 5 ans après le début de la maladie. Ces deux maladies de neurones moteurs, bien que différentes, ont des gènes et des mécanismes pathologiques en commun. Ainsi, accroitre notre connaissance de leurs similarités et de leurs différences pourra nous aider à mieux comprendre chacune individuellement. Pour étudier ces deux maladies, nous avons utilisé des modèles de poisson zébré précédemment caractérisés et en avons développé de nouveaux pour approfondir nos connaissances sur les mécanismes physiopathologiques. Dans la première partie de cette thèse, nous avons identifié le stress du réticulum endoplasmique (RE) comme un nouveau mécanisme pathologique induit par la perte de fonction de spastin, un gène impliqué dans la PSF, et avons montré que des modulateurs du stress du RE sont capables de renverser le phénotype locomoteur. Nous avons aussi identifié un nouveau gène causatif de la PSF, CAPN1 (SPG76), et avons validé in vivo la pathogénicité de sa perte de fonction en identifiant une désorganisation des réseaux de microtubules comme phénotype principal. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons généré plusieurs nouveaux modèles de poisson zébré de la SLA. Deux lignées transgéniques exprimant la protéine humaine de type sauvage ou mutante sous le contrôle d’un promoteur inductible nous ont permis de reproduire des résultats obtenus précédemment par l’injection d’ARNm et d’identifier des changements transcriptomiques similaires à ceux obtenus récemment avec des modèles de souris. Nous ii avons aussi généré deux nouvelles lignées en introduisant des mutations ponctuelles liées à la SLA dans les gènes tardbp et fus du poisson zébré en utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Ces résultats soulignent la valeur du poisson zébré comme modèle pour étudier les maladies des neurones moteurs et leurs mécanismes physiopathologiques, et suggèrent de nouvelles approches thérapeutiques., Hereditary spastic paraplegias (HSP) are a group of heterogeneous neurodegenerative diseases affecting upper motor neurons, causing progressive gait dysfunction and more than 60 genes have been linked to this disease. On the other hand, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a late-onset progressive neurodegenerative disorder that affects both upper and lower motor neurons, leading to muscle atrophy with spasticity and death in two to five years due to respiratory failure. These two motor neuron disorders, while separate, share common genes and pathological mechanisms and as such, increasing our knowledge about their similarities and differences can help us have a better understanding of each of them individually. In order to study these two diseases, we used previously characterized zebrafish models and developed new ones to deepen our understanding of the pathophysiological mechanisms of HSP and ALS. In the first part of this thesis, we identified ER stress as a new pathological mechanism at play in HSP due to spastin loss-of-function and showed that ER stress modulators are able to rescue the locomotor phenotype. We also identified a new gene causative of HSP, CAPN1 (SPG76), provided in vivo validation of its loss-of-function pathogenicity and identified microtubule networks disorganization as one of the main defects. In the second part of this thesis, we generated several new zebrafish models to study ALS. Two transgenic lines expressing either a wild-type or a mutant TDP-43 protein under the control of an inducible promoter allowed us to recapitulate previous findings obtained with mRNA injections and identify transcriptomic changes due to the mutant protein that are in line with recent transcriptomic data obtained in mouse models. We also generated two new lines with knock-in of ALS-causative point mutations in the tardbp and fus zebrafish endogenous genes using the CRISPR/Cas9 technology. These results underscore the value of the zebrafish model to study motor neuron disorders and their pathophysiological mechanisms as well as open new therapeutic avenues.

Background Egg quality can be defined as the egg ability to be fertilized and subsequently develop into a normal embryo. Previous research has shed light on factors that can influence egg quality. Large gaps however remain including a comprehensive view of what makes a bad egg. Initial development of the embryo relies on maternally-inherited molecules, such as transcripts, deposited in the egg during its formation. Bad egg quality is therefore susceptible to be associated with alteration or dysregulation of maternally-inherited transcripts. We performed transcriptome analysis on a large number (N = 136) of zebrafish egg clutches, each clutch being split to monitor developmental success and perform transcriptome analysis in parallel. We aimed at drawing a molecular portrait of the egg in order to characterize the relation between egg transcriptome and developmental success and to subsequently identify new candidate genes involved in fertility. Results We identified 66 transcript that were differentially abundant in eggs of contrasted phenotype (low or high developmental success). Statistical modeling using partial least squares regression and genetics algorithm demonstrated that gene signatures from transcriptomic data can be used to predict developmental success. The identity and function of differentially expressed genes indicate a major dysregulation of genes of the translational machinery in poor quality eggs. Two genes, otulina and slc29a1a, predominantly expressed in the ovary and dysregulated in poor quality eggs were further investigated using CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Mutants of each gene revealed remarkable subfertility whereby the majority of their eggs were unfertilizable. The Wnt pathway appeared to be dysregulated in the otulina mutant-derived eggs. Conclusions Here we show that egg transcriptome contains molecular signatures, which can be used to predict developmental success. Our results also indicate that poor egg quality in zebrafish is associated with a dysregulation of (i) the translational machinery genes and (ii) novel fertility genes, otulina and slc29a1a, playing an important role for fertilization. Together, our observations highlight the diversity of the possible causes of egg quality defects and reveal mechanisms of maternal origin behind the lack of fertilization and early embryonic failures that can occur under normal reproduction conditions. Electronic supplementary material The online version of this article (10.1186/s12864-019-5930-8) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a degenerative disease of motoneurons. Its histological hallmark is the presence of ubiquitin-positive cytoplasmic inclusions in motor neurons of patients which indicates defective proteostasis. In the majority of cases, these inclusions are positive for TDP-43, an RNA-binding protein. Alterations of autophagy and RNA metabolism are widely investigated in ALS. This thesis explores the role of TDP-43 on autophagy regulation with a focus on autophagy receptors p62 and OPTN and their upstream activator TBK1. In the zebrafish embryo, knockdown of tardbp leads to an altered motor phenotype and correlates with a downregulation of tbk1. Human TBK1 RNA ameliorates this phenotype in a significant manner. In SH-SY5Y cells, knockdown of TARDBP leads to a profile of expression of key autophagy genes that is in opposition with the one obtained in the zebrafish. However, activating basal autophagy through Torin 1 treatment unveils conditional effect of TDP-43 on p62/SQSTM1 and TBK1. Moreover, Torin 1 treatment inhibits binding of TDP-43 to RAPTOR and OPTN mRNAs but promotes novel binding to p62/SQSTM1 and TBK1 mRNAs. In these cell lines, increasing overexpression of TARDBP also seems to affect p62/SQSTM1 in different manners. Overall, modulating TARDBP expression is accompanied by the appearance of characteristic traits of TDP-43 pathology in ALS. In parallel, techniques to visualize target RNAs in vivo and in vitro are being developed. This work highlights TDP-43 ability to adapt to cellular context and affect autophagy in different manners., La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative des neurones moteurs. Sa signature est la présence d’inclusions cytoplasmiques ubiquitinées (synonyme de protéostasie défaillante) majoritairement positives pour TDP-43, une protéine de liaison aux ARNs. Les altérations de l’autophagie et du métabolisme des ARNs sont particulièrement étudiées dans la SLA. Cette thèse explore le rôle de TDP-43 dans la régulation de l’autophagie et particulièrement sur les récepteurs de l’autophagie p62 et OPTN ainsi que leur kinase activatrice TBK1. Chez l’embryon de poisson zèbre, la sous-expression de tardbp (codant pour tdp-43) conduit à un phénotype moteur altéré que nous associons à une régulation négative de tbk1. De l’ARN humain de TBK1 améliore ce phénotype. Sur des cellules SH-SY5Y, une sous-expression de TARDBP conduit à un profil d’expression de gènes clés de l’autophagie contradictoire à celui du poisson zèbre. Cependant, activer l’autophagie basale grâce à la Torine 1 conditionne l’effet d’une déplétion de TDP-43 sur l’expression de p62/SQSTM1 et TBK1. De plus, la Torine 1 inhibe les liaisons de TDP-43 aux ARNs de RAPTOR et OPTN mais promeut celles avec p62/SQSTM1 et TBK1. Dans ces cellules, la surexpression progressive de TDP-43 conduit potentiellement à des effets antagonistes sur p62/SQSTM1. Plus globalement, moduler TARDBP se traduit par une apparition de phénomènes caractéristiques de la protéinopathie TDP-43 chez les patients SLA. Parallèlement, des techniques de visualisation des ARNs in vivo et in vitro sont développées. Ce travail met en lumière la faculté de TDP-43 à s’adapter au contexte cellulaire et d’influer différemment sur l’autophagie.

A large amount of chemicals are released to the environment each year. Among them, bisphenol A (BPA) is of utmost concern since it interferes with the reproductive system of wild organisms due to its capacity to bind to hormone receptors. Additionally, BPA epigenotoxic activity is known to affect basic processes during embryonic life. However, its effects on primordial germ cells (PGCs) proliferation and migration, both mechanisms being crucial for gametogenesis, remain unknown. To investigate the effects of BPA on PGCs migration and eventual testicle development, zebrafish embryos were exposed to 100, 2000 and 4000 &micro, g/L BPA during the first 24 h of development. Vasa immunostaining of PGCs revealed that exposure to 2000 and 4000 &micro, g/L BPA impaired their migration to the genital ridge. Two pivotal genes of PGCs migration (cxcr4b and sdf1a) were highly dysregulated in embryos exposed to these doses, whereas DNA methylation and epigenetic marks in PGCs and their surrounding somatic cells were not altered. Once embryos reached adulthood, the morphometric study of their gonads revealed that, despite the reduced number of PGCs which colonized the genital ridges, normal testicles were developed. Although H3K9ac decreased in the sperm from treated fishes, it did not affect the progeny development.

Background Previously, we have demonstrated that genes involved in ovarian function are highly conserved throughout evolution. In this study, we aimed to document the conservation of genes involved in spermatogenesis from flies to vertebrates and their expression profiles in vertebrates. Results We retrieved 379 Drosophila melanogaster genes that are functionally involved in male reproduction according to their mutant phenotypes and listed their vertebrate orthologs. 83% of the fly genes have at least one vertebrate ortholog for a total of 625 mouse orthologs. This conservation percentage is almost twice as high as the 42% rate for the whole fly genome and is similar to that previously found for genes preferentially expressed in ovaries. Of the 625 mouse orthologs, we selected 68 mouse genes of interest, 42 of which exhibited a predominant relative expression in testes and 26 were their paralogs. These 68 mouse genes exhibited 144 and 60 orthologs in chicken and zebrafish, respectively, gathered in 28 groups of paralogs. Almost two thirds of the chicken orthologs and half of the zebrafish orthologs exhibited a relative expression ≥50% in testis. Finally, our focus on functional in silico data demonstrated that most of these genes were involved in the germ cell process, primarily in structure elaboration/maintenance and in acid nucleic metabolism. Conclusion Our work confirms that the genes involved in germ cell development are highly conserved across evolution in vertebrates and invertebrates and display a high rate of conservation of preferential testicular expression among vertebrates. Among the genes highlighted in this study, three mouse genes (Lrrc46, Pabpc6 and Pkd2l1) have not previously been described in the testes, neither their zebrafish nor chicken orthologs. The phylogenetic approach developed in this study finally allows considering new testicular genes for further fundamental studies in vertebrates, including model species (mouse and zebrafish). Electronic supplementary material The online version of this article (10.1186/s12862-019-1462-8) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Oviparous vertebrates produce multiple forms of vitellogenin (Vtg), the major source of yolk nutrients, but little is known about their individual contributions to reproduction and development. This study employed a CRISPR/Cas9 genome editing to assess essentiality and functionality of zebrafish (Danio rerio) type-I and -III Vtgs. The multiple CRISPR approach employed to knock out (KO) all genes encoding type-Ivtgs(vtg1, 4, 5, 6,and7) simultaneously (vtg1-KO), and the type-IIIvtg(vtg3) individually (vtg3-KO). Results of PCR genotyping and sequencing, qPCR, LC-MS/MS and Western blotting showed that onlyvtg6andvtg7escaped Cas9 editing. In fish whose remaining type-Ivtgswere incapacitated (vtg1-KO), and invtg3-KO fish, significant increases in Vtg7 transcript and protein levels occurred in liver and eggs, a heretofore-unknown mechanism of genetic compensation to regulate Vtg homeostasis. Fecundity was more than doubled invtg1-KO females, and fertility was ~halved invtg3-KO females. Substantial mortality was evident invtg3-KO eggs/embryos after only 8 h of incubation and invtg1-KO embryos after 5 d. Hatching rate and timing were markedly impaired invtgmutant embryos and pericardial and yolk sac/abdominal edema and spinal lordosis were evident in the larvae, with feeding and motor activities also being absent invtg1-KO larvae. By late larval stages,vtgmutations were either completely lethal (vtg1-KO) or nearly so (vtg3-KO). These novel findings offer the first experimental evidence that different types of vertebrate Vtg are essential and have disparate requisite functions at different times during both reproduction and development.

Supplementary data to this article can be found online at : https://doi.org/10.1016/j.cbpb.2018.11.005; The understanding of muscle tissue formation and regeneration is essential for the development of therapeutic approaches to treat muscle diseases or loss of muscle mass and strength during ageing or cancer. One of the critical steps in muscle formation is the fusion of muscle cells to form or regenerate muscle fibres.To identify new genes controlling myoblast fusion, we performed a siRNA screen in c2c12 myoblasts. The genes identified during this screen were then studiedi n vivo by knock down in zebrafish using morpholino. We found that N-alpha-acetyl transferase 15 (Naa15) knockdown enhanced c2c12 myoblast fusion, suggesting that Naa15 negatively regulates myogenic cell fusion. We identified two Naa15 orthologous genes in the zebrafish genome: Naa15a and Naa15b. These two orthologs were expressed in the myogenic domain of the somite. Knockdown of zebrafish Naa15a and Naa15b genes induced a“U”-shaped segmentation of the myotome and alteration of myotome boundaries, resulting in the formation of abnormally long myofibres spanning adjacent somites. Taken together, these results show that Naa15 regulates myotome formation and myogenesis in fish.

Background Although the overall brain organization is shared in vertebrates, there are significant differences within subregions among different groups, notably between Sarcopterygii (lobe-finned fish) and Actinopterygii (ray-finned fish). Recent comparative studies focusing on the ventricular morphology have revealed a large diversity of the hypothalamus. Here, we study the development of the inferior lobe (IL), a prominent structure forming a bump on the ventral surface of the teleost brain. Based on its position, IL has been thought to be part of the hypothalamus (therefore forebrain). Results Taking advantage of genetic lineage-tracing techniques in zebrafish, we reveal that cells originating from her5-expressing progenitors in the midbrain-hindbrain boundary (MHB) participate in the formation of a large part of the IL. 3D visualization demonstrated how IL develops in relation to the ventricular system. We found that IL is constituted by two developmental components: the periventricular zone of hypothalamic origin and the external zone of mesencephalic origin. The mesencephalic external zone grows progressively until adulthood by adding new cells throughout development. Conclusion Our results disprove a homology between the IL and the mammalian lateral hypothalamus. We suggest that the IL is likely to be involved in multimodal sensory integration rather than feeding motivation. The teleost brain is not a simpler version of the mammalian brain, and our study highlights the evolutionary plasticity of the brain which gives rise to novel structures. Electronic supplementary material The online version of this article (10.1186/s12915-019-0631-y) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Cardiac valves are necessary for maintaining a unidirectional blood flow in the cardiovascular system of vertebrates. Their efficient gating function requires a highly controlled developmental program. However, this program may be impaired and thus leading to defective valves. In fact, congenital heart valve diseases represent the most common form of birth defects. Therefore, cardiac valve development studies constitute a challenging research field. In this thesis, we used the zebrafish as a model organism for studying the formation of atrioventricular valves. To date, it is known that mechanical forces generated by blood flow constitute key modulators dictating valve formation. In particular, they initiate valvulogenesis by restricting the expression of the transcription factor Klf2a in a subset of endocardial cells of the atrio-ventricular canal. Our work demonstrated the activation of another transcription factor, Egr1, in this same region and within the same time window. We aimed at deciphering the mechanosentitive gene network involving klf2a, its paralog klf2b as well as egr1, by combining genome-wide analysis of gene expression and chromatin accessibility with live imaging. We addressed the potential interactions of these factors and studied their downstream signalling pathways. Finally, we demonstrated that egr1, klf2a/klf2b modulates valve morphogenesis by specifically controlling flt1, has2 and wnt9b expression.; La circulation du flux sanguin à sens unique dans le système cardiovasculaire des vertébrés est assurée par les valves cardiaques. Leur formation est très contrôlée au cours du développement embryonnaire. Cependant, il arrive que celle-ci soit défectueuse, et donc à l’origine de maladies cardiaques congénitales. Ces maladies représentent une des causes majeures de décès à la naissance. L’étude de la formation des valves cardiaques constitue donc un champ de recherche majeur. Dans cette thèse, nous avons utilisé le poisson zèbre, comme animal d’étude modèle pour étudier la formation des valves atrio-ventriculaires. Les forces mécaniques générées par le flux sanguin constituent un signal modulant le programme génétique valvulaire. Elles initient la formation des valves en contraignant l’expression du facteur de transcription, Klf2a, à un groupe de cellules endothéliales du canal atrio-ventriculaire. Nos travaux ont démontré l’activation d’un autre facteur, Egr1, dans cette même région dans le même lapse de temps. Notre étude a cherché à élucider le réseau génétique impliquant klf2a, son paralogue klf2b, et egr1 en combinant une analyse pangénomique de l’expression génique et des sites accessibles de la chromatine avec une approche d’imagerie haute résolution in vivo. Nous avons déterminé les interactions entre ces facteurs et les réseaux qu’ils régulent. Cette étude a finalement démontré qu’egr1, klf2a/klf2b modulent la morphogénèse des valves cardiaques en contrôlant en particulier flt1, has2 et wnt9b.

Super-enhancers and CTCF are considered as central players in the organization of mammalian genomes that directly impact the regulation of gene expression. Here, to gain insight into their functional conservation, analyses of super-enhancers and CTCF in zebrafish were performed. Super-enhancers annotated in zebrafish show high cell and tissue specificity, and the main difference identified when compared to mammalian super-enhancers is their distribution relative to transcription start sites. Conservation analyses indicate that super-enhancers do not have higher sequence conservation than typical enhancers. By restricting the analysis to those super-enhancers associated with orthologs, a subset of super-enhancers that have higher sequence conservation than the rest was identified. Comparison of the expression patterns driven by constitutive regions of two of these super-enhancers enabled the identification of regions controlling similar expression patterns in spite of no evident sequence conservation. Analyses of CTCF peaks that overlap promoters indicate a correlation between the abundance of CTCF and gene expression, which could be explained by blockage of nucleosome deposition at those promoters. In summary, these results show evidence of conserved and divergent functions of gene regulators in vertebrates and set a precedent for studies of genome organization in zebrafish.; Les super-amplificateurs et CTCF sont considérés comme des acteurs centraux de l'organisation du génome ayant un impact direct sur la régulation de l'expression génique. Ici, pour mieux comprendre leur conservation fonctionnelle, des analyses de super-amplificateurs et de CTCF chez le poisson zèbre ont été effectuées. Les super-amplificateurs annotés dans le génome du poisson zèbre présentent une grande spécificité cellulaire et tissulaire. Des analyses de conservation indiquent que les super-amplificateurs n'ont pas une conservation de séquence supérieure à celle des amplificateurs. En limitant l'analyse de conservation de séquence aux super-amplificateurs situés à proximité d'orthologues, il est possible d'identifier un sous-ensemble de super-amplificateurs ayant une conservation de séquence plus élevée que le reste des super-amplificateurs. La comparaison d'expression régulée par les régions constitutives de deux super-amplificateurs associés à des orthologues a permis l'identification de régions fonctionnellement conservées, malgré l'absence de conservation évidente de la séquence d'ADN. Analyses des régions de liaison à CTCF situées dans les promoteurs des gènes indiquent une corrélation entre l'abondance de CTCF et l'expression génique, ce qui pourrait s'expliquer par le blocage du dépôt de nucléosomes dans ces promoteurs.

During the establishment of left-right asymmetry in the zebrafish brain, a small group of cells, the parapineal, collectively migrates from the dorsal midline of the epithalamus to the left in most wild-type embryos. Parapineal migration requires Fibroblastic Growth Factor 8 (Fgf8), a secreted signal expressed bilaterally in epithalamic tissues surrounding the parapineal. The left bias in the orientation of parapineal migration depends on the activity of Cyclops, a secreted factor of the Nodal/TGFß family that is transiently expressed in the left epithalamus prior to parapineal migration. Therefore, the parapineal provides a powerful new model to understand FGF dependent collective cell migration and to study how other signaling pathways modulate this process. Live imaging of an FGF reporter transgene revealed that the FGF pathway is activated in only few parapineal cells that are usually located at the leading edge of migration. Global expression of a constitutively activated Fgf receptor (CA-FGFR) delays migration in wild-type, while it partially restores both parapineal migration and focal activation of the FGF reporter transgene in fgf8-/- mutant embryos. Importantly, focal activation of FGF signaling in few parapineal cells is sufficient to restore collective migration in fgf8-/- mutants. Finally, Nodal asymmetry contributes to restrict and left-bias the activation of the FGF pathway (Manuscript n°1). Following this work, my thesis project aimed at understanding how the activation of the FGF pathway is restricted to few cells, despite all parapineal cells apparently being competent to activate the pathway. We showed that Notch signaling is able to restrict FGF activity. Loss or gain of function of the Notch pathway respectively triggers an increase or decrease in FGF activity, which correlate with PP migration defects. Moreover, decreasing or increasing FGF activity levels respectively rescues or aggravates parapineal migration defects in Notch loss-of-function context. Our data indicate that Notch signaling restricts the activation of the FGF pathway within parapineal cells to promote their collective migration (Manuscript n°2). We also found that Notch pathway is required for the specification of a correct number of parapineal cells, independently of FGF pathway. In parallel, we analysed the function of MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), a protein mosaïcally expressed in the parapineal and a candidate to modulate FGF signaling. However, we found no significant defects in the specification or migration of parapineal cells in mmp2-/- mutant embryos (Manuscript n°3). My PhD work reveals a role for Notch signaling in restricting the activation of FGF signaling within few parapineal cells, a process that is biased by Nodal pathway to the left and required for the migration of the entire parapineal. These data provide insights into the interaction of FGF, Notch and Nodal/TGFb signaling pathways that may be applicable to other models of collective cell migration, such as cancer cells migration for instance.; Lors du développement de l'asymétrie gauche droite dans le cerveau du poisson zèbre, un petit groupe de cellules, le parapinéale, migre collectivement depuis la ligne médiane vers la partie gauche de l'épithalamus. Cette migration est défectueuse dans des mutants pour le gène fgf8, indiquant que le facteur Fgf8 (Fibroblast Growth Factor 8), sécrété de part et d'autre de la ligne médiane, est requis pour la migration. Cependant, l'orientation gauche de la migration dépend de l'activation, plus précocement dans l'épithalamus gauche, de la voie de signalisation Nodal/TGFb (Transforming Growth Factor). Par conséquent, la parapinéale est un modèle de choix pour comprendre comment les cellules migrent collectivement en réponse aux Fgf et pour étudier comment d'autres voies de signalisation modulent ce processus. L'imagerie en temps réel d'un transgène rapporteur de la signalisation FGF a révélé que la voie FGF est activée préférentiellement dans quelques cellules de tête, c'est à dire localisées au front de migration. L'expression globale d'un récepteur aux Fgf activé de façon constitutive (CA-FgfR1) interfère avec la migration de la parapinéale en contexte sauvage mais est capable de restaurer à la fois la migration de la parapinéale et l'activation focale de la voie FGF au front de migration dans les mutants fgf8-/-. De plus, l'activation focale de la voie FGF dans seulement quelques cellules de parapinéale est suffisante pour restaurer la migration de tout le collectif dans les mutants fgf8-/-. Finalement, nos données montrent que la signalisation Nodal contribue à restreindre et à biaiser l'activation de la voie FGF afin d'orienter la migration de la parapinéale vers le côté gauche (Manuscript n°1). Par la suite, mes travaux de thèse ont visé à comprendre comment l'activation de la voie FGF est restreinte à quelques cellules, bien que toutes les cellules de parapinéale semblent compétentes pour activer la voie. Nos résultats montrent que la signalisation Notch est capable de restreindre l'activation de la voie FGF. La perte ou le gain de fonction de la voie Notch entrainent respectivement une augmentation ou une diminution de l'activité FGF, associés à des défauts de migration de la parapinéale dans les deux contextes. De plus, la diminution ou l'augmentation artificielle du niveau d'activation de la voie FGF peut respectivement restaurer la migration de la parapinéale ou aggraver les défauts de migration en absence d'activité Notch. Nos données indiquent que la signalisation Notch restreint l'activation de la voie FGF au sein des cellules de parapinéale pour permettre la migration du collectif (Manuscript n°2). La voie Notch est également requise pour la spécification d'un nombre correct de cellules de parapinéale, indépendamment de la voie FGF. En parallèle, nous avons analysé la fonction de MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), une protéine exprimée mosaïquement dans la parapinéale et candidate pour moduler la signalisation FGF. Cependant, nous n'avons observé aucun défaut de spécification ou de migration de la parapinéale dans les embryons mutants pour le gène mmp2 -/- (Manuscript n°3). Mon travail de thèse révèle un rôle de la voie Notch pour restreindre l'activation de la signalisation FGF dans quelques cellules de parapinéale, un processus qui est biaisé par la voie Nodal afin d'orienter la migration du collectif vers la gauche. Ces données pourraient permettre de mieux comprendre les interactions entre les voies de signalisation FGF, Notch et Nodal dans d'autres modèles de migration cellulaire collective comme, par exemple, la migration des cellules cancéreuses.

During the establishment of left-right asymmetry in the zebrafish brain, a small group of cells, the parapineal, collectively migrates from the dorsal midline of the epithalamus to the left in most wild-type embryos. Parapineal migration requires Fibroblastic Growth Factor 8 (Fgf8), a secreted signal expressed bilaterally in epithalamic tissues surrounding the parapineal. The left bias in the orientation of parapineal migration depends on the activity of Cyclops, a secreted factor of the Nodal/TGFß family that is transiently expressed in the left epithalamus prior to parapineal migration. Therefore, the parapineal provides a powerful new model to understand FGF dependent collective cell migration and to study how other signaling pathways modulate this process. Live imaging of an FGF reporter transgene revealed that the FGF pathway is activated in only few parapineal cells that are usually located at the leading edge of migration. Global expression of a constitutively activated Fgf receptor (CA-FGFR) delays migration in wild-type, while it partially restores both parapineal migration and focal activation of the FGF reporter transgene in fgf8-/- mutant embryos. Importantly, focal activation of FGF signaling in few parapineal cells is sufficient to restore collective migration in fgf8-/- mutants. Finally, Nodal asymmetry contributes to restrict and left-bias the activation of the FGF pathway (Manuscript n°1). Following this work, my thesis project aimed at understanding how the activation of the FGF pathway is restricted to few cells, despite all parapineal cells apparently being competent to activate the pathway. We showed that Notch signaling is able to restrict FGF activity. Loss or gain of function of the Notch pathway respectively triggers an increase or decrease in FGF activity, which correlate with PP migration defects. Moreover, decreasing or increasing FGF activity levels respectively rescues or aggravates parapineal migration defects in Notch loss-of-function context. Our data indicate that Notch signaling restricts the activation of the FGF pathway within parapineal cells to promote their collective migration (Manuscript n°2). We also found that Notch pathway is required for the specification of a correct number of parapineal cells, independently of FGF pathway. In parallel, we analysed the function of MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), a protein mosaïcally expressed in the parapineal and a candidate to modulate FGF signaling. However, we found no significant defects in the specification or migration of parapineal cells in mmp2-/- mutant embryos (Manuscript n°3). My PhD work reveals a role for Notch signaling in restricting the activation of FGF signaling within few parapineal cells, a process that is biased by Nodal pathway to the left and required for the migration of the entire parapineal. These data provide insights into the interaction of FGF, Notch and Nodal/TGFb signaling pathways that may be applicable to other models of collective cell migration, such as cancer cells migration for instance.; Lors du développement de l'asymétrie gauche droite dans le cerveau du poisson zèbre, un petit groupe de cellules, le parapinéale, migre collectivement depuis la ligne médiane vers la partie gauche de l'épithalamus. Cette migration est défectueuse dans des mutants pour le gène fgf8, indiquant que le facteur Fgf8 (Fibroblast Growth Factor 8), sécrété de part et d'autre de la ligne médiane, est requis pour la migration. Cependant, l'orientation gauche de la migration dépend de l'activation, plus précocement dans l'épithalamus gauche, de la voie de signalisation Nodal/TGFb (Transforming Growth Factor). Par conséquent, la parapinéale est un modèle de choix pour comprendre comment les cellules migrent collectivement en réponse aux Fgf et pour étudier comment d'autres voies de signalisation modulent ce processus. L'imagerie en temps réel d'un transgène rapporteur de la signalisation FGF a révélé que la voie FGF est activée préférentiellement dans quelques cellules de tête, c'est à dire localisées au front de migration. L'expression globale d'un récepteur aux Fgf activé de façon constitutive (CA-FgfR1) interfère avec la migration de la parapinéale en contexte sauvage mais est capable de restaurer à la fois la migration de la parapinéale et l'activation focale de la voie FGF au front de migration dans les mutants fgf8-/-. De plus, l'activation focale de la voie FGF dans seulement quelques cellules de parapinéale est suffisante pour restaurer la migration de tout le collectif dans les mutants fgf8-/-. Finalement, nos données montrent que la signalisation Nodal contribue à restreindre et à biaiser l'activation de la voie FGF afin d'orienter la migration de la parapinéale vers le côté gauche (Manuscript n°1). Par la suite, mes travaux de thèse ont visé à comprendre comment l'activation de la voie FGF est restreinte à quelques cellules, bien que toutes les cellules de parapinéale semblent compétentes pour activer la voie. Nos résultats montrent que la signalisation Notch est capable de restreindre l'activation de la voie FGF. La perte ou le gain de fonction de la voie Notch entrainent respectivement une augmentation ou une diminution de l'activité FGF, associés à des défauts de migration de la parapinéale dans les deux contextes. De plus, la diminution ou l'augmentation artificielle du niveau d'activation de la voie FGF peut respectivement restaurer la migration de la parapinéale ou aggraver les défauts de migration en absence d'activité Notch. Nos données indiquent que la signalisation Notch restreint l'activation de la voie FGF au sein des cellules de parapinéale pour permettre la migration du collectif (Manuscript n°2). La voie Notch est également requise pour la spécification d'un nombre correct de cellules de parapinéale, indépendamment de la voie FGF. En parallèle, nous avons analysé la fonction de MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), une protéine exprimée mosaïquement dans la parapinéale et candidate pour moduler la signalisation FGF. Cependant, nous n'avons observé aucun défaut de spécification ou de migration de la parapinéale dans les embryons mutants pour le gène mmp2 -/- (Manuscript n°3). Mon travail de thèse révèle un rôle de la voie Notch pour restreindre l'activation de la signalisation FGF dans quelques cellules de parapinéale, un processus qui est biaisé par la voie Nodal afin d'orienter la migration du collectif vers la gauche. Ces données pourraient permettre de mieux comprendre les interactions entre les voies de signalisation FGF, Notch et Nodal dans d'autres modèles de migration cellulaire collective comme, par exemple, la migration des cellules cancéreuses.

The myotendinous junction (MTJ) is a specialized extracellular matrix which allows the transmission of skeletal muscle forces to bones. My thesis project aimed at characterizing the in vivo role of COLXXII using the zebrafish as a model. The zebrafish col22a1 gene encodes COLXXII whose expression begins in the entire somite, and is then restricted gradually at the MTJ, where the protein is deposited. Morphants (Knockdown) develop a dystrophic phenotype and we have demonstrated that COLXXII is likely a member of the integrin a7ß1 anchoring complex. However, because morpholinos are efficient only few days after injection, our study was limited to early stages of zebrafish development. We thus generated two mutant lines (CRISPR-Cas9) invalidated for col22a1. The typical sarcolemmal interdigitations of the MTJ are almost absent in mutants, from larvae to adult (as in morphants), which could impact the force transmission and/or the muscle attachment to myosepta (tendons). In the two mutant lines, the same proportion of larvae displays a severe phenotype leading to fish death 14 days post-fertilization. On the contrary, other larvae survive without any obvious general phenotype. A first candidate genes approach was realized by qPCR and tends to show that the phenotypic differences may be due to both, variable expressivity and genetic compensation. Finally, I have shown that 6 months col22a1-/- fish show a highly decreased swimming capacity and consume more O2 during effort compared to wild type animals. Thus, we conclude that the musculoskeletal system efficiency seems altered in absence of COLXXII. Our results should allow considering COL22A1 as a candidate gene for muscular dystrophies with unclarified genetic cause., Le collagène XXII (COLXXII) a été décrit, en 2004, comme un marqueur des jonctions tissulaires chez la souris. En particulier, la jonction myotendineuse (JMT) est une matrice extracellulaire spécialisée qui assure une liaison structurale entre le muscle squelettique et le tendon et permet la transmission des forces de contraction au squelette. Mon projet de thèse a visé à caractériser le rôle de COLXXII in vivo; le modèle du poisson zèbre a été choisi. Chez le poisson zèbre, col22a1 code pour COLXXII dont l'expression débute dans tout le somite, puis, se restreint progressivement aux extrémités des fibres musculaires au niveau de la JMT, où est déposée la protéine. Utilisant la technique de morpholino-knockdown, nous avons montré que les morphants développent un phénotype dystrophique et que le COLXXII fait très probablement partie du complexe d'ancrage intégrine α7β1. Cependant, compte tenu de la durée d'efficacité réduite des morpholinos, notre étude était limitée. Utilisant la technologie CRISPR-Cas9, nous avons donc généré deux lignées invalidées pour col22a1. L'analyse ultra-structurale des poissons col22a1-/-, de la jeune larve à l'adulte, montre que les interdigitations du sarcolemme, caractéristiques de la JMT, sont pratiquement absentes chez les mutants (comme chez les morphants), pouvant impacter la transmission des forces et/ou l'attachement du muscle aux myoseptes (tendons). De façon intéressante, pour les deux lignées, la même proportion de larves présente un phénotype très sévère entrainant la mort vers 2 semaines post-fécondation (spf). Les autres larves, elles, survivent et ne montrent pas de phénotype global particulier. En revanche, une forte réduction des interdigitations de la JMT est constatée et dans de rares cas, après challenge des poissons, une rupture musculaire est observée. Une première approche de q- PCR par gène candidat a été réalisée et il semble possible que les différences phénotypiques soient liées à des évènements conjoints d'expressivité variable et de compensation génique. Enfin, utilisant un système original de test de nage à contre-courant par palier, j'ai montré que les poissons col22a1-/- âgés de 6 mois ont une capacité de nage très diminuée et consomment d'avantage d'O2 pendant l'effort comparés aux animaux sauvages. L'efficacité du système musculo-squelettique semble donc moindre en l'absence de collagène XXII. Nos résultats devraient permettre de considérer COL22A1 comme un gène candidat pour les cas de dystrophies musculaires dont la cause génétique est non élucidée

This thesis was carried out in the Laboratory of Pharmacognosy, in health department of the University of Burgundy. The principal theme of this Laboratory is the research of natural compounds from tropical biodiversity, mainly saponins. These molecules are known for their various pharmacological activities. The study of 3 species belonging to 2 different families: Chlorophytum blepharophyllum Schweinf. ex Baker, Ornithogalum dubium Houtt (Asparagaceae) and Weigela × « kosteriana variegata » (Caprifoliaceae), led to the isolation and characterization of 16 natural glycosides by column chromatography, medium pressure liquid chromatography, and vacuum liquid chromatography. The spectral analysis was achieved using mainly 2D NMR and mass spectrometry. Among them, 4 were phenolic glucosides, 8 were steroidic saponins with 6 new structures and 4 were triterpenic saponins with one new structure. The cytotoxic activities of 5 isolated steroidic saponins were evaluated on 2 strains cancer cells (A549 and HL 60). The results showed a low sensitivity of these two cell lines to these saponins. The toxic and teratogenic effects of 3 triterpenic saponins were also determined in by using an in vivo zebrafish assay. The results showed a lethal effect at low concentrations of these 3 saponins. Structure / activity relationships have been proposed.; Cette thèse s’inscrit dans le cadre de la thématique du Laboratoire de Pharmacognosie de l’UFR Pharmacie, au sein de l’Université de Bourgogne. Elle vise essentiellement la recherche de molécules d’origine végétale issues de la biodiversité tropicale dont principalement des saponines. Ces composés suscitent un grand intérêt de par leur large éventail d’applications pharmacologiques. Dans ce contexte l’étude de trois espèces végétales appartenant à deux familles, à savoir Chlorophytum blepharophyllum Schweinf. ex Baker, Ornithogalum dubium Houtt (Asparagaceae) et Weigela × « kosteriana variegata » (Caprifoliaceae), a conduit à l’isolement de 16 glycosides naturels par les techniques chromatographiques (Chromatographie liquide sous vide, Chromatographie d’exclusion moléculaire, Chromatographie liquide moyenne pression). Les structures de ces derniers ont été élucidées principalement par les techniques spectroscopiques de RMN1D et -2D, et de spectrométrie de masse. Il s’agit de 4 glycosides phénoliques de structure connue, 8 saponines stéroïdiques parmi lesquelles 6 sont de structure nouvelle, ainsi que 4 saponines triterpéniques dont une nouvelle. 5 saponines stéroïdiques ont été testées en vue d’évaluer leur activité cytotoxique sur deux lignées cellulaires cancéreuses (A549 et HL 60). Les résultats ont montré une faible sensibilité de ces deux lignées cellulaires à ces saponines. Les effets toxiques et tératogènes des 3 saponines triterpéniques ont été également déterminés à l’aide d'un test in vivo de poisson-zèbre (zebrafish). Les résultats ont montré un effet létal à de faibles concentrations des 3 saponines. Des relations structure/activité ont été ainsi proposées.

This thesis was carried out in the Laboratory of Pharmacognosy, in health department of the University of Burgundy. The principal theme of this Laboratory is the research of natural compounds from tropical biodiversity, mainly saponins. These molecules are known for their various pharmacological activities. The study of 3 species belonging to 2 different families: Chlorophytum blepharophyllum Schweinf. ex Baker, Ornithogalum dubium Houtt (Asparagaceae) and Weigela × « kosteriana variegata » (Caprifoliaceae), led to the isolation and characterization of 16 natural glycosides by column chromatography, medium pressure liquid chromatography, and vacuum liquid chromatography. The spectral analysis was achieved using mainly 2D NMR and mass spectrometry. Among them, 4 were phenolic glucosides, 8 were steroidic saponins with 6 new structures and 4 were triterpenic saponins with one new structure. The cytotoxic activities of 5 isolated steroidic saponins were evaluated on 2 strains cancer cells (A549 and HL 60). The results showed a low sensitivity of these two cell lines to these saponins. The toxic and teratogenic effects of 3 triterpenic saponins were also determined in by using an in vivo zebrafish assay. The results showed a lethal effect at low concentrations of these 3 saponins. Structure / activity relationships have been proposed.; Cette thèse s’inscrit dans le cadre de la thématique du Laboratoire de Pharmacognosie de l’UFR Pharmacie, au sein de l’Université de Bourgogne. Elle vise essentiellement la recherche de molécules d’origine végétale issues de la biodiversité tropicale dont principalement des saponines. Ces composés suscitent un grand intérêt de par leur large éventail d’applications pharmacologiques. Dans ce contexte l’étude de trois espèces végétales appartenant à deux familles, à savoir Chlorophytum blepharophyllum Schweinf. ex Baker, Ornithogalum dubium Houtt (Asparagaceae) et Weigela × « kosteriana variegata » (Caprifoliaceae), a conduit à l’isolement de 16 glycosides naturels par les techniques chromatographiques (Chromatographie liquide sous vide, Chromatographie d’exclusion moléculaire, Chromatographie liquide moyenne pression). Les structures de ces derniers ont été élucidées principalement par les techniques spectroscopiques de RMN1D et -2D, et de spectrométrie de masse. Il s’agit de 4 glycosides phénoliques de structure connue, 8 saponines stéroïdiques parmi lesquelles 6 sont de structure nouvelle, ainsi que 4 saponines triterpéniques dont une nouvelle. 5 saponines stéroïdiques ont été testées en vue d’évaluer leur activité cytotoxique sur deux lignées cellulaires cancéreuses (A549 et HL 60). Les résultats ont montré une faible sensibilité de ces deux lignées cellulaires à ces saponines. Les effets toxiques et tératogènes des 3 saponines triterpéniques ont été également déterminés à l’aide d'un test in vivo de poisson-zèbre (zebrafish). Les résultats ont montré un effet létal à de faibles concentrations des 3 saponines. Des relations structure/activité ont été ainsi proposées.

L’encéphalopathie glycinergique (EG) est une maladie génétique récessive rare causée par un clivage de la glycine défectueux et caractérisée par l’accumulation de glycine dans l’organisme. Les patients atteints de la forme sévère d’EG présentent une forte létalité durant la première semaine post-natale, de l’hypotonie, de la léthargie, et survivent avec un retard développemental et des convulsions intraitables. Les traitements disponibles sont souvent inefficaces sur l’EG sévère, et peu de recherche translationnelle s’est penchée sur cette maladie. Ici, nous avons généré un modèle de la forme sévère d’EG chez le poisson zébré en invalidant l’orthologue du gène «GLycine DeCarboxylase» (GLDC), fréquemment muté dans la maladie. Nous montrons que les larves de poisson-zèbre gldc -/- récapitulent l’EG au niveau moléculaire, avec une réduction de l’expression de gldc et une augmentation des niveaux de glycine. Les mutants ont un phénotype rappelant les symptômes des patients, comme la léthargie, l’hypotonie, et la mort prématurée. La caractérisation moléculaire des mutants gldc -/- démontre qu’ils ont d’importants troubles métaboliques, affectant d’autres acides aminés et neurotransmetteurs que la glycine, avec de l’acidose lactique précédant la mort. Le cerveau des mutants présente aussi un déséquilibre transitoire de prolifération cellulaire, sans conséquence sur les principaux réseaux nerveux. Enfin, nous confirmons que le phénotype d’hypotonie des mutants est dû à la sur-activation des récepteurs NMDA et glycinergiques, et démontrons que l’hyperglycinémie à ces synapses est exacerbée, ce qui peut être sauvé pharmacologiquement en antagonisant ces récepteurs , et génétiquement en sur-exprimant le transporteur de glycine 1 (GlyT1)., Glycine encephalopathy (GE) is a rare recessive genetic disease caused by defective glycine cleavage and characterized by increased accumulation of glycine in all tissues. In severe GE, patients have a high lethality in the first week of life, hypotonia, lethargy, and survive with variable developmental delay and intractable seizures. The treatments available are often inefficient on the severe form of the disease and little translational research has focused on the pathogenic mechanisms involved in GE. Here, we generated a zebrafish model of severe GE by knocking out the ortholog of the ‘GLycine DeCarboxylase’ gene GLDC, commonly mutated in the disease. We show that the gldc -/- zebrafish larvae recapitulate GE on a molecular level, with reduced gldc expression and increased glycine levels in the body. Gldc - /- also shows a phenotype reminiscent of severe GE symptoms, such as early lethality, hypotonia, and lethargy. A broad molecular characterization of gldc -/- mutants showed that there is a large metabolic disturbance affecting other amino acids and neurotransmitters than glycine, with lactic acidosis at stages preceding death. A transient imbalance was found in cell proliferation in the brain of gldc -/- but that does not have obvious consequences on major brain networks. Importantly, we confirmed that the gldc -/- hypotonic phenotype is due to NMDA and glycine receptor overactivation and demonstrated that there is an exacerbated hyperglycinemia at these synapses, which can be rescued pharmacologically using NMDA and/or glycine receptor antagonists, as well as genetically by overexpressing the glycine transporter GlyT1.

Introduction: Fsh is a pituitary gonadotropin that regulates both gonadal functions, gametogenesis and steroidogenesis, in fish. The biological actions of Fsh are mediated through its binding to a membrane receptor (Fshr) that belongs to the superfamily of the G protein-coupled receptor (GPCR). Previous reports on in vivo disruption of the Fshr gene showed that Fsh signaling pathway was dispensable for male fertility but was required for oogenesis. In the present study we generated new mutant zebrafish lines to further investigate the role of fshr in reproductive and growth performances. Methods: We disrupted the fshr gene in zebrafish using the CRISPR/Cas9 method. We selected three CRISPR sites in the 10th exon of the gene to cause a large deletion easily detectable by a PCR-based genotyping method. Two mutant lines were generated from independent founders mated with transgenic vasa:eGFP females. The mutations were characterized by DNA sequencing in both lines. The deletions led to predicted truncated proteins enable to anchor to the membrane and to transduce Fsh signal. Results and Discussion: Heterozygous mutant males and females developed an apparently normal gametogenesis and were fertile. However heterozygous zebrafish population (fshr+/-) showed a female biased sexratio compared to the non mutated siblings. At 27 days post fertilization heterozygous mutants showed higher relative abundance of the gonadal aromatase gene (cyp19a1a) and increased levels of transcripts involved in granulosa cell differentiation (foxl2a2, gsdf, fshr, sox9a). In addition, transcripts accumulated during late oocyte growth (vasa, sox9b and nanos2) were also detected at higher levels. The relative abundance of sycp1 was unchanged indicating that meiosis initiation was normal. In contrast, in homozygous mutant meiosis was altered as revealed by decreased expression levels of sycp1. In addition, oocytes did not progress beyond the pre-follicle phase of primary growth. All adult homozygous mutants became males suggesting that impaired oogenesis during early ontogenesis caused sex reversal. Additional new phenotypes were observed in the homozygous males including lower sperm count and viability. This could result from 11-KT deficiency as revealed by decreased expression levels of cyp11b2. Perturbation of steroidogenesis could also explain the increased body weight and length observed in homozygous mutants. Conclusion: The marked phenotypic perturbations induced by the Fshr mutation confirm that Fsh and Lh have distinct functions. We showed that the loss of one fshr gene copy favours the differentiation of granulosa cells and oocyte growth. Fsh signalling pathway is dispensable for Sertoli cell differentiation but remains important for sperm quality and excretion.

Accepted manuscript; In zebrafish, there exists a clear need for new tools to study sex differentiation dynamic and its perturbation by endocrine disrupting chemicals. In this context, we developed and characterized a novel transgenic zebrafish line expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of the zebrafish cyp19a1a (gonadal aromatase) promoter. In most gonochoristic fish species including zebrafish, cyp19a1a, the enzyme responsible for the synthesis of estrogens, has been shown to play a critical role in the processes of reproduction and sexual differentiation. This novel cyp19a1a-eGFP transgenic line allowed a deeper characterization of expression and localization of cyp19a1a gene in zebrafish gonads both at the adult stage and during development. At the adult stage, GFP expression was higher in ovaries than in testis. We showed a perfect co-expression of GFP and endogenous Cyp19a1a protein in gonads that was mainly localized in the cytoplasm of peri-follicular cells in the ovary and of Leydig and germ cells in the testis. During development, GFP was expressed in all immature gonads of 20 dpf-old zebrafish. Then, GFP expression increased in early differentiated female at 30 and 35 dpf to reach a high GFP intensity in well-differentiated ovaries at 40 dpf. On the contrary, males consistently displayed low GFP expression as compared to female whatever their stage of development, resulting in a clear dimorphic expression between both sexes. Interestingly, fish that undergoes ovary-to-testis transition (35 and 40 dpf) presented GFP levels similar to males or intermediate between females and males. In this transgenic line our results confirm that cyp19a1a is expressed early during development, before the histological differentiation of the gonads, and that the down-regulation of cyp19a1a expression is likely responsible for the testicular differentiation. Moreover, we show that although cyp19a1a expression exhibits a clear dimorphic expression pattern in gonads during sexual differentiation, its expression persists whatever the sex suggesting that estradiol synthesis is important for gonadal development of both sexes. Monitoring the expression of GFP in control and exposed-fish will help determine the sensitivity of this transgenic line to EDCs and to refine mechanistic based-assays for the study of EDCs. In fine, this transgenic zebrafish line will be a useful tool to study physiological processes such as reproduction and sexual differentiation, and their perturbations by EDCs.

In humans, most cardiovascular disorders lead to the destruction of cardiac tissue which will be replaced by fibrosis, leading to arrhythmia and reduced contractile function, resulting in an increase in ventricular load. In order to maintain an overall cardiac output, cardiomyocytes undergo hypertrophic response, leading to pathological hypertrophy and heart failure. This increase in ventricular load, have to be sensed by mechanosensors such as the mechanosensitive ion channels such as TREK-1. Unlike mammals, adult zebrafish (zf) can fully regenerate their heart after an extensive insult through cardiomyocyte dedifferentiation followed by proliferation. We believe that in adult mammals, cardiomyocyte proliferation has been blocked/inhibited. Therefore it’s likely that genes which respond to increased ventricular load in mammals and trigger pathological hypertrophy will trigger cardiomyocyte proliferation during heart regeneration in zf. In this study we show that zTREK1a and zTREK1b have similar biophysical and pharmacological properties to mammalian TREK1 and they are important for successful zebrafish heart regeneration.; Chez l'Homme, la plupart des maladies cardio-vasculaires provoquent une destruction du tissu cardiaque. Ce dernier est remplacé par de la fibrose conduisant à une diminution de la fonction contractile et une augmentation de la charge ventriculaire avec des risques d’arythmie. Pour maintenir un débit cardiaque constant, les cardiomyocytes vont alors s’hypertrophier, induisant sur le long terme le développement une insuffisance cardiaque. L’augmentation de la charge ventriculaire pourrait être perçue par des mécanosenseurs tels que les canaux ioniques mecanosensibles TREK-1. Contrairement aux mammifères adultes, le cœur du poisson zèbre se régénère suite à une destruction massive du ventricule. Cette régénération se fait par un mécanisme de dédifférenciation, suivie d'une étape de prolifération des cardiomyocytes. Chez les mammifères adultes, la prolifération des cardiomyocytes pourrait être bloquée / inhibée empêchant ainsi la régénération. L’hypothèse que les gènes responsables de l’hypertrophie pathologique chez les mammifères adultes suite à l’augmentation de la charge ventriculaire, soient également responsables la prolifération des cardiomyocytes au cours de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre est ainsi consistante. Cette étude, a montré que les canaux TREK-1a et TREK-1b du poisson zèbre possèdent des propriétés biophysiques et pharmacologiques, similaires à ceux du canal TREK-1 de mammifères, et qu’ils jouent un rôle fondamental dans la régénération cardiaque.

Genome editing reveals developmental dependencies on specific types of vitellogenesis in Zebrafish (Danio rerio). 11. International Symposium on Reproductive Physiology of Fish

Super-enhancers and CTCF are considered as central players in the organization of mammalian genomes that directly impact the regulation of gene expression. Here, to gain insight into their functional conservation, analyses of super-enhancers and CTCF in zebrafish were performed. Super-enhancers annotated in zebrafish show high cell and tissue specificity, and the main difference identified when compared to mammalian super-enhancers is their distribution relative to transcription start sites. Conservation analyses indicate that super-enhancers do not have higher sequence conservation than typical enhancers. By restricting the analysis to those super-enhancers associated with orthologs, a subset of super-enhancers that have higher sequence conservation than the rest was identified. Comparison of the expression patterns driven by constitutive regions of two of these super-enhancers enabled the identification of regions controlling similar expression patterns in spite of no evident sequence conservation. Analyses of CTCF peaks that overlap promoters indicate a correlation between the abundance of CTCF and gene expression, which could be explained by blockage of nucleosome deposition at those promoters. In summary, these results show evidence of conserved and divergent functions of gene regulators in vertebrates and set a precedent for studies of genome organization in zebrafish., Les super-amplificateurs et CTCF sont considérés comme des acteurs centraux de l'organisation du génome ayant un impact direct sur la régulation de l'expression génique. Ici, pour mieux comprendre leur conservation fonctionnelle, des analyses de super-amplificateurs et de CTCF chez le poisson zèbre ont été effectuées. Les super-amplificateurs annotés dans le génome du poisson zèbre présentent une grande spécificité cellulaire et tissulaire. Des analyses de conservation indiquent que les super-amplificateurs n'ont pas une conservation de séquence supérieure à celle des amplificateurs. En limitant l'analyse de conservation de séquence aux super-amplificateurs situés à proximité d'orthologues, il est possible d'identifier un sous-ensemble de super-amplificateurs ayant une conservation de séquence plus élevée que le reste des super-amplificateurs. La comparaison d'expression régulée par les régions constitutives de deux super-amplificateurs associés à des orthologues a permis l'identification de régions fonctionnellement conservées, malgré l'absence de conservation évidente de la séquence d'ADN. Analyses des régions de liaison à CTCF situées dans les promoteurs des gènes indiquent une corrélation entre l'abondance de CTCF et l'expression génique, ce qui pourrait s'expliquer par le blocage du dépôt de nucléosomes dans ces promoteurs.

International audience; Chaperone-mediated autophagy (CMA) is a major pathway of lysosomal proteolysis essential for the control of intermediary metabolism. So far, the absence of any identifiable LAMP2A—a necessary and limiting protein for CMA—outside of the tetrapod clade, led to the paradigm that this cellular function was (presumably) restricted to mammals and birds. However, after we identified expressed sequences displaying high sequence homology with the mammalian LAMP2A in several fish species, our findings challenge that view and suggest that CMA likely appeared much earlier during evolution than initially thought. Hence, our results do not only shed an entirely new light on the evolution of CMA, but also bring new perspectives on the possible use of complementary genetic models, such as zebrafish or medaka for studying CMA function from a comparative angle/view.

The family of forkhead box (Fox) transcription factors regulate gonadogenesis and embryogenesis, but the role of foxr1/foxn5 in reproduction is unknown. Evolution of foxr1 in vertebrates was examined and the gene found to exist in most vertebrates, including mammals, ray-finned fish, amphibians, and sauropsids. By quantitative PCR and RNA-seq, we found that foxr1 had an ovarian-specific expression in zebrafish, a common feature of maternal-effect genes. In addition, it was demonstrated using in situ hybridization that foxr1 was a maternally-inherited transcript that was highly expressed even in early-stage oocytes and accumulated in the developing eggs during oogenesis. We also analyzed the function of foxr1 in female reproduction using a zebrafish CRISPR/Cas9 knockout model. It was observed that embryos from the foxr1-deficient females had a significantly lower survival rate whereby they either failed to undergo cell division or underwent abnormal division that culminated in growth arrest at around the mid-blastula transition and early death. These mutant-derived eggs contained a dramatically increased level of p21, a cell cycle inhibitor, and reduced rictor, a component of mTOR and regulator of cell survival, which were in line with the observed growth arrest phenotype. Our study shows for the first time that foxr1 is an essential maternal-effect gene and is required for proper cell division and survival via the p21 and mTOR pathways. These novel findings will broaden our knowledge on the functions of specific maternal factors stored in the developing egg and the underlying mechanisms that contribute to reproductive fitness.

Oviparous vertebrates produce multiple forms of vitellogenin (Vtg), the major source of yolk nutrients, but little is known about their individual contributions to reproduction and development. This study employed a CRISPR/Cas9 genome editing to assess essentiality and functionality of zebrafish (Danio rerio) type-I and -III Vtgs. The multiple CRISPR approach employed to knock out (KO) all genes encoding type-I vtgs (vtg1, 4, 5, 6, and 7) simultaneously (vtg1-KO), and the type-III vtg (vtg3) individually (vtg3-KO). Results of PCR genotyping and sequencing, qPCR, LC-MS/MS and Western blotting showed that only vtg6 and vtg7 escaped Cas9 editing. In fish whose remaining type-I vtgs were incapacitated (vtg1-KO), and in vtg3-KO fish, significant increases in Vtg7 transcript and protein levels occurred in liver and eggs, a heretofore-unknown mechanism of genetic compensation to regulate Vtg homeostasis. Fecundity was more than doubled in vtg1-KO females, and fertility was ~halved in vtg3-KO females. Substantial mortality was evident in vtg3-KO eggs/embryos after only 8 h of incubation and in vtg1-KO embryos after 5 d. Hatching rate and timing were markedly impaired in vtg mutant embryos and pericardial and yolk sac/abdominal edema and spinal lordosis were evident in the larvae, with feeding and motor activities also being absent in vtg1-KO larvae. By late larval stages, vtg mutations were either completely lethal (vtg1-KO) or nearly so (vtg3-KO). These novel findings offer the first experimental evidence that different types of vertebrate Vtg are essential and have disparate requisite functions at different times during both reproduction and development.