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2014-2015, Natural products are small-molecule secondary metabolites displaying considerable structural complexity and “privileged scaffolds”. They are able to bind several endogenous targets eliciting biological effects as chemical weapons or to convey information from one organism to another. Nowadays, medicinal plant drug discovery continues to provide new and important leads against various pharmacological targets. Therefore, the primary purpose of this PhD thesis has been a comprehensive characterization of the interactome profile and then the molecular mechanism of action of bioactive natural molecules. Achieving this in an effective, unbiased and efficient manner subsists as a significant challenge for the new era in drug discovery and optimization. Indeed, the full understanding of the mechanism of action of natural molecules could lead to a number of advantages: first of all, exploit their full therapeutic potential, the identification of side effects or toxicity, or the ability to set up target-based assays and to allow structure activity relationships studies to guide medicinal chemistry efforts towards lead optimization. In my research project, the attention was paid on ent-kaurane diterpenes, a class of natural terpenoids with a great structural variability and a wide spectrum of biological activities. Firstly, I focused on the determination of the interactome of a semi synthetic compound 15-ketoatractyligenin methyl ester. This compound has been previously reported to possess high antiproliferative activity against several solid tumor-derived cell lines. In this regard, I decided to investigate the mechanism of action of this actratylignin derivative researching first of all its molecular targets, responsible for the biological activity. In order to achieve this goal, I used a chemical proteomic approach first. This study led to the identification of PPARγ as the main cellular partner of this compound; achieved results were supported and validated through different biological assays. Subsequently, I studied another diterpene: oridonin. This molecule has been shown to have multiple biological activities. Among them, the anticancer activity has been repeatedly reported by many research groups. With the aim of expanding and validate our knowledge about this molecule, also seen the limitations of the fishing for partners method, I decided to use two orthogonal compound-centric proteomics approaches to define the possible protein target(s) of oridonin. Using this strategy HSP70 and nucleolin were identified. Therefore, several in vitro and in cell tests have been performed to validate the interaction of oridonin with these proteins, and to evaluate its effect on their activity. Some of these tests were developed and optimized during my period of research abroad at the Massachusset General Hospital- Center for System Biology -Harvard Medical School; in that twelve months period I expanded my knowledge into the techniques useful for the study of the mechanism of action of a small molecule, also applying experimental methods complementary to proteomics and focusing on the use of high-resolution intravital microscopy imaging for drug pharmacology. [edited by Author], XIV n.s.

An expeditious isolation method for the cembrane diterpene alcohols incensol (la) and serratol (2) has been developed from respectively African and Indian frankincense. The two native alcohols and a series of semisynthetic derivatives of incensol were evaluated for transient receptor potential vanilloid 3 (TRPV3) activation and the inhibition of NF-kappa B, the putative molecular targets underlying the psychotropic and anti-inflammatory activities of incensol acetate (IA, 1b). Serratol (2) was the most potent TRPV3 activator, outperforming by 2 orders of magnitude the reference agonist thymol and by 1 order of magnitude incensol acetate (1b). Acylation, epimerization, and oxidation did not significantly improve the affinity of incensol for TRPV3, while NF-kappa B inhibition, marginal for both natural alcohols, could be improved by esterification of incensol (1a) with lipophilic acids. Interestingly, incensol (1a) but not IA (1b) was a potent inhibitor of STAT3, raising the possibility that hydrolysis to incensol (1a) might be involved in the in vivo biological activity of IA (1b). Serratol was not amenable to chemical modification, but some marine cembranoids related to the frankincense diterpenoids showed a certain degree of TRPV3-activating properties, qualifying the aliphatic macrocyclic cembrane skeleton as a selective chemotype to explore the pharmacology of TRPV3, a thermo-TRP otherwise resistant to modulation by small molecules.

2010 - 2011 It is increasingly recognized that the oceans preserve a huge number of natural products and novel chemical entities, with biological activities that may be useful in the quest for finding drugs with greater efficacy and specificity for the treatment of many human diseases. In this light, the aim of my project was to isolate and characterize novel molecules from marine organisms with regard to the identification of new “lead compounds” for pharmaceutical applications. The organisms considered for this study were selected by using two different strategies. The first one was based on enhancement of the taxonomic diversity. In this process, an emphasis was placed on collecting specimens related to - but differing from - those known to contain bioactive natural products. The second approach was to evaluate ecological factors such as costumer pressure, growth form (e.g. thin encrusting), level of resource competition, presence or absence of biofouling, etc., and relate this to the expression of the secondary metabolism. Some invasive species have chemical defences, which may enhance their invasion success, so as many marine organisms are soft bodied and have a sedentary life style necessitating chemical means of defence. Therefore, they have evolved the ability to synthesize or to obtain from marine microorganisms bioactive compounds that help them in deterring predators, keep competitors at bay or paralyze their prey. [edited by the author] X n.s.

Vengono riportati i risultati di una prova di campo con sostanze naturali, saggiate secondo tre diverse modalità d’impiego (solo concia del seme; concia del seme + trattamenti fogliari; solo trattamenti fogliari.) contro i patogeni fungini di frumento duro (cv. Latinur) e tenero (cv. Bologna). Tutti i prodotti hanno influenzato positivamente la vigoria vegetativa ma solo alcuni hanno manifestato un buon controllo della gravità e dell’incidenza delle malattie riscontrate (ruggini da Puccinia recondita e P. graminis) sul tenero. In particolare, si è evidenziato che alcuni prodotti esercitano un miglior controllo dell’incidenza della malattia se utilizzati come concianti; tra questi: Agricolle, Micosat F, Mycostop e Curex. Per quanto riguarda la gravità della malattia alcuni prodotti (Agricolle, Micosat F e Micoplan) hanno controllato l’insorgenza sia di ruggine bruna che nera. L’emergenza del duro è stata fortemente penalizzata dal particolare andamento climatico e inoltre sulle colture non si sono riscontrate malattie fungine.

Il Progetto VITROFLOR si propone di intervenire nella filiera produttiva di piante ornamentali (floricole e da vivaio) prendendo in esame la parte propagativa delle nuove accessioni, individuate a seguito di programmi di miglioramento genetico e/o di selezione, ed intervenendo, in particolare, nell’ottimizzazione delle procedure di micropropagazione e conservazione in vitro. La propagazione su larga scala è spesso un elemento condizionante lo sviluppo commerciale di una novità vegetale, influendo, a volte consistentemente, sui costi di vendita. In tale senso, la micropropagazione è particolarmente indicata per il comparto ornamentale che riesce a sostenerne i costi di produzione ed a trarne vantaggio economico. Le istituzioni di ricerca coinvolte in questo progetto sono state incaricate dalla Ditta proponente (Viavai Piante Battistini, Cesena) di studiare ed approfondire alcuni aspetti della coltura in vitro che potrebbero, una volta a regime, rendere più competitivo il sistema di moltiplicazione, a vantaggio sia della ditta di propagazione, sia degli ibridatori che ad essa si affidano per la fornitura di materiale omogeneo e sano. La tecnica, inoltre, permette di programmare la produzione di piante nell’arco dell’intera stagione vegetativa, svincolandosi dai problemi connessi con la stagionalità della propagazione tradizionale. I partners del progetto utilizzano materiale originale fornito da ibridatori e, tra le attività previste, riporteranno in questo lavoro i risultati intermedi relativi alla fase di sterilizzazione, al contenimento delle batteriosi durante la coltura, ai metodi per ottimizzare le rese di proliferazione e di radicazione e alla conservazione in crescita rallentata (a basse temperature) del materiale stock.

I prodotti naturali ottenuti dalle piante e da altri organismi biologici hanno costituito una continua fonte per l’ottenimento di farmaci. Da uno studio recente è emerso che, di 847 molecole divenute farmaci, il 5% è costituito da prodotti naturali, il 27% da derivati di prodotti naturali e le rimanenti 572 sono molecole sintetiche; di quest’ultime inoltre, 262 possono essere considerate analoghi di prodotti naturali (Newman e Cragg 2007). È interessante sottolineare che i dati riportati non comprendono prodotti biologici e i vaccini che per definizione provengono dalla natura. Si definisce, inoltre, con il termine "xenobiotico" una molecola di qualsiasi tipo, di origine naturale o sintetica, estranea ad un organismo e che può esplicare sia la funzione di farmaco che di veleno tossico. La ricerca svolta nell’ambito del Dottorato si è posta come obiettivo lo studio di composti di origine naturale e xenobiotici mediante la loro caratterizzazione chimica, la valutazione dell'attività biologica e lo studio dei loro potenziali utilizzi come chemioterapici. In particolare, l’attività di ricerca si può così riassumere: A) Identificazione e caratterizzazione di composti biologicamente attivi estratti da Rubus ulmifolius. B) Valutazione e analisi della chimica biologica dei composti organostagno(OT). A) Identificazione e caratterizzazione di composti biologicamente attivi estratti da Rubus ulmifolius Il Rubus ulmifolius Schott è una pianta perenne ampiamente diffusa in Italia e nota come "Rovo" (Pignatti 1982). La pianta di rovo contiene triterpeni, acidi grassi, tannini, flavonoidi (Panizzi et al. 2001) e altre molecole aventi proprietà farmaceutiche non ancora completamente studiate. La ricerca è stata così condotta. In una prima fase è stata indagata in vitro l’attività biologica, citotossica e/o antiproliferativa, dell’estratto alcolico, con particolare attenzione agli effetti sulla proliferazione cellulare e alle modificazioni morfologiche e ultrastrutturali. L’effetto dell’estratto di Rubus ulmifolius è stato valutato sulle linee cellulari tumorali mane HeLa, HepG2, HL60 e HL60/MX2 . Al fine di evidenziare eventuali effetti antiproliferativi o citotossici, inizialmente sono state valutate le conte cellulari e le curve di crescita in seguito a trattamento con estratto di Rovo. Successivamente sono state applicate tecniche di microscopia al fine di verificare le alterazioni a livello morfologico, citoscheletrico e di espressione proteica imputabili al trattamento con l'estratto. Studi successivi, condotti per mezzo di cromatografia su strato sottile (TLC) hanno permesso di isolare tra tutti uno spot denominato “R”, la cui azione biologica è sembrata essere più elevata. Sono state poi effettuate analisi chimiche atte ad individuare la natura del o dei singoli principi attivi presenti nell'estratto di foglie di Rubus ulmifolius ed in particolare nello spot più attivo. Considerando la struttura chimica dei composti attivi individuati, i quali evidenziano una analogia strutturale con i composti in grado di inibire l’attività dell’enzima acetilcolinesterasi, si è proceduto con l'effettuazione di test di inibizione del suddetto enzima. I risultati ottenuti permettono di affermare che all’interno delle foglie di rovo esistono molecole di potenziale interesse farmacologico. E’ da evidenziare come l’intensa attività di inibizione della proliferazione cellulare e dell’attività dell’enzima acetilcolinesterasi degli estratti di foglie di R. ulmifolius sia ascrivibile non tanto alle molecole già molto studiate, i flavonoidi quercetina e kamferolo, quanto, e soprattutto, ai loro derivati glucoronici. B) Valutazione e analisi della chimica biologica dei composti organostagno I composti organostagno (OT) sono composti xenobiotici ubiquitari nell'ambiente. Essi rappresentano gli inquinanti noti più tossici per la vita acquatica; l'inquinamento ambientale da composti OT si è esteso notevolmente a seguito delle ampie applicazioni industriali e agricole. Alcuni composti OT hanno mostrato un effetto anti-neoplastico mentre altri sono risultati citotossici, genotossici, mutageni e neurotossici. Nonostante sia noto il sito di interazione dei composti OT a livello della membrana mitocondriale, i meccanismi di tossicità e di degradazione biologica rimangono poco chiari (Tobin et al. 1999). Studi precedenti hanno dimostrato che un peptide sintetico (SNN-PEP, I1LGCWCYLR9), derivato dalla sequenza primaria della stannina (SNN), proteina coivolta nei processi di detossificazione da composti organostagno e contenente due residui di cisteina vicinali (motivo CXC), è in grado di dealchilare il trimetilstagno a dimetilstagno. Partendo da tali presupposti, sono stati condotti studi con lo scopo di verificare se il SNN-peptide fosse in grado di dealchilare anche i composti organostagno tetra sostituiti a specie dialchilate, modificandone conseguentemente la citotossicità e l’attività biologica. È stata quindi studiata la cinetica di dealchilazione del TetraMT (o 4MT, tetrametilstagno) e di due tra i più comuni OT trisostituiti, TMT (cloruro di trimetilstagno) e TET (bromuro di trietilstagno) mediante spettroscopia di fluorescenza. Il meccanismo di reazione è stato razionalizzato attraverso una reazione pseudoenzimatica che termina in un complesso costituito dalla specie di-alchilata e SNN-PEP legati covalentemente. Poiché i composti tetra- e i tri-alchilstagno mostrano un marcato ritardo nella loro azione tossica rispetto ai corrispondenti analoghi di-e mono-alchilati, è stato ipotizzato che la tossicità ritardata sia una conseguenza della dealchilazione progressiva dei composti OT con produzione di di-e mono-derivati più tossici, che legano e interagiscono con gli enzimi e le proteine coinvolte nella detossificazione. In studi precedenti è stato inoltre ipotizzato che i composti organo stagno, interagendo con la stannina o direttamente con il DNA, possano avviare una cascata di eventi atti ad indurre la morte cellulare o a controllare l’espressione e la sintesi della stannina stessa. È stata quindi studiata l’attività biologica dei diversi composti organostagno utilizzando come modelli cellulari le linee HeLa e NB2a sulle quali sono stati condotti saggi MTT, analisi morfologiche (microscopia ottica) e citoscheletriche (microscopia a fluorescenza). I composti organostagno usati nei trattamenti sono stati i seguenti: cloruro di trifenilstagno (TPT), tetrametilstagno (4MT) ed in particolare dicloruro di dimetilstagno (DMT), cloruro di trimetilstagno (TMT), bromuro di trietilstagno (TET), alle concentrazioni comprese tra 1 e 100μM. Indagini in vitro, per verificare eventuali modificazioni nell’espressione della SNN in seguito al trattamento delle cellule Hela (adenocarcinoma della cervice umana) e NB2a (neuroblastoma murino) con concentrazioni crescenti di tre composti organo stagno DMT, TMT e TET, sono state effettuate mediante immunofluorescenza. Natural products derived from plants and other biological organisms are a continuous source for new drugs. A recent study shows that of 847 drug molecules, 5% are natural products, about 27% derives from natural products and the remaining 572 are synthetic molecules (Newman and Cragg 2007), of which 262 can be considered analogous to natural products. It is interesting to note that these dates do not include biological products and vaccines, which by definition come from nature. It’ s called “xenobiotic” any type of molecule, having natural or synthetic origin, foreign to an organism, that can exert the function both of drug than toxic poison. The research activity,during the PhD, was pointed out on the study of natural and xenobiotic compounds, their chemical characterization, evaluation of biological activity and consequently their potential uses as drugs. The researches were focused on two different topics: A) Identification and characterization of biologically active compounds from Rubus ulmifolius extracts. B) Evaluation and elucidation of the biological chemistry of organotin compounds. A) Identification and characterization of biologically active compounds from Rubus ulmifolius extracts Rubus ulmifolius Schott is a perennial plant widely diffused in Italy and well known as “rovo” (Pignatti 1982). Rubus leaf extract contains triterpenes, fatty acids, tannins, flavonoids (Panizzi et al. 2001) and other molecules having pharmaceutical properties not completely studied. Outline. First, we investigated the biological activity (cytotoxic or antiproliferative) of alcoholic extract, with particular attention to the effects on cell proliferation and morphological changes. The evaluation of the effect of Rubus ulmifolius extract was evaluated on human tumor cell lines HeLa, HepG2, HL60 and HL60/MX2. In order to detect the cytotoxic or antiproliferative effects, we evaluated the cell countings and the growth curves upon treatment with different extracts.. Subsequently, the morphological and cytoskeletal alterations at cellular level were studied by microscopy techniques. Further, by thin layer chromatography (TLC) we isolated a spot, named "R", showing the highest biological activity. Then we identified the molecules contained in the active spot from Rubus ulmifolius leaves extract. On the basis of these results and seen the similarity between the chemical structure of the molecules identified and tacrine, an inhibitor of the acetylcholinesterase previously studied in our lab, we tested these compounds as inhibitors of acetylcholinesterase. The results obtained suggest that molecules from spot “R” have some pharmacological interest. Interestingly the inhibition activity of R. ulmifolius extracts on cell proliferation and on Acetylcholinesterase is not only due to the molecules already known and studied, the flavonoids quercetin and kaempferol, but also to their glucuronide derivatives. B) Evaluation and elucidation of the biological chemistry of organotin compounds. Organotin compounds are xenobiotic compounds ubiquitous in the environment. They represent the most toxic pollutants known for aquatic life; environmental pollution caused by OT compounds extended widely as a result of large industrial and agricultural applications. Some OT compounds showed an anti-neoplastic action while others were cytotoxic, genotoxic, mutagenic and neurotoxic. Although the site of interaction of the OT compounds, at mitochondrial membrane level, is well known, the mechanisms of toxicity and biological degradation remain unclear (Tobin et al. 1999). Previous studies have shown that a synthetic peptide (SNN-PEP, I1LGCWCYLR9), derived from the primary sequence of stannin, a protein involved in the detoxification of OT, and containing two vicinal cysteine residues (CXC motif), is able to dealkylate TMT to DMT suggesting that this reaction is also involved in triggering of cell death by apoptosis. Starting from this point, studies were conducted with the aim of verified whether the SNN-peptide was able to dealkylate organotin compounds in species less substituted, thus altering their cytotoxicity and biological activity. Therefore, we investigated the kinetics of the dealkylation TetraMT and two of the most common OT trisubstituted, TMT and TET by fluorescence spectroscopy,. The reaction mechanism cna be described as a pseudoenzymatic reaction that ends in a covalent complex formed by the di-alkyltin compound bound to SNN-PEP. Tetra-and tri-alkyltin compounds show a marked delay in their toxic action when compared with the corresponding molecules di- and mono-alkylated. So, it was hypothesized that the delayed toxicity is a consequence of progressive dealkylation of compounds with production of more toxic di- and mono-derivatives. In previous studies it was suggested that organotin compounds, interacting with stannin or directly with the DNA, could initiate a cascade of events necessary to induce cell death or else, to control the stannin expression . Thus we study the biological activity of different organotin compounds on two cell lines: HeLa and NB2a by MTT assays, morphological analysis (light microscopy) and cytoskeletal observations (fluorescence microscopy). Organotin compounds used in treatments were: Triphenyltin chloride (TPT), Tetramethyltin (4MT), in particular Dimethyltin dichloride (DMT), Trimethyltin chloride (TMT), Triethyltin bromide (TET) at the concentrations ranging from 1 to 100 μM . Investigations by immunofluorescence were carried out to verify changes in the SNN expression after treatment of Hela (human cervical adenocarcinoma) and NB2a cells (murine neuroblastoma) with increasing concentrations of DMT, TMT and TET. Dottorato di ricerca in Scienze ambientali

Vengono riportati i risultati di una prova in campo con sostanze naturali contro funghi patogeni di patata (Alternaria alternata, Cladosporium fulvum) e cipolla (Peronospora destructor). Tra le sostanze saggiate, si sono dimostrati significativamente efficaci su patata Agricolle, Microsil 500 e Poltiglia bordolese disperss mentre, su cipolla, Poltiglia bordolese disperss, Microsil 500, Peptiram TBCS, Micoplan, Armicarb 100 e Labicuper. Incrementi della vigoria vegetatIva e della resa produttiva si sono ottenuti con Agricolle, Poltiglia bordolese disperss e Microsil 500 nella patata e con Armicarb 100, Peptiram TBCS, Microsil 500 e Poltiglia bordolese disperss nella cipolla.

Le recenti decisioni della commissione consultiva UE sulla limitazione dei fitofarmaci in agricoltura stanno costringendo gli stati europei ad un utilizzo sempre minore di sostanze chimiche di sintesi. Prove da noi condotte negli ultimi anni (Bianchi et al., 1997; Zechini D’Aulerio et al., 1998, 2002, 2004, 2008) hanno dimostrato buona azione antifungina di rameici a basso dosaggio e sostanze naturali di diversa origine, soprattutto contro le peronospore. Si è pertanto ritenuto di estendere la sperimentazione di tali prodotti contro Peronospora destructor su cipolla (cultivar ‘Tropea’) in un campo sperimentale situato a Selva di Imola (BO) e gestito da Astra Innovazione e Sviluppo. Sono stati confrontati prodotti rameici a basso dosaggio [solfato di rame tribasico complessato con peptidi ed aminoacidi (Peptiram TBCS); gluconato di rame 8% (Labicuper); ottanoato di rame 10%] ed altri di origine naturale o biologica [bicarbonato di potassio 85% (Armicarb 100); alginato 28% (Agricolle); un fertilizzante a base di P 26% e K 17% (Micoplan); un biostimolante contenente Al 1%, Fe 0,2%, Zn 0,2%, Mn 0,2% (Microsil 500); un biofungicida a base di Streptomyces griseoviridis (Mycostop)]. Si è utilizzato solfato di rame 20% (Poltiglia Bordolese Disperss) come testimone chimico. I trattamenti sono stati effettuati con pompa a spalla ogni 7 giorni, da metà giugno a fine agosto 2009. I sintomi della malattia sono stati quantificati secondo una scala di gravità con classi percentuali di superficie fogliare colpita. Materiale vegetale infetto è stato campionato per l’identificazione, al microscopio ottico, del patogeno coinvolto, che è risultato essere P. destructor. I risultati finali hanno evidenziato minore presenza di malattia nelle tesi trattate con poltiglia bordolese Disperss (22,2%), Microsil 500 (30,2%), Peptiram TBCS (30,5%), Armicarb 100 (31,1%) e Labicuper (33,3%), rispetto al 67,9% delle parcelle testimoni. Risulta, quindi, confermata l’efficacia di rameici complessati e di alcune sostanze naturali anche nella lotta contro la peronospora della cipolla.

Atti del convegno storico-scientifico in occasione del 150° anniversario della Nascita

Vengono riportati i risultati di una prova biennale di lotta contro malattie fungine in piante orticole con impiego di sostanze di origine naturale, vegetale, minerale, antagonisti. In campo, su pomodoro (Alternaria alternata, Alternaria solani e Cladosporium fulvum) melone (Sphaerotheca fuliginea) e lattuga (A. alternata) si sono dimostrati maggiormente efficaci: Alginato, Micoplan, Bicarbonato di potassio, Microsil 500, Peptiram 5, Beltanol e Poltiglia bordolese, somministrati a cadenza settimanale, mentre in vitro soltanto Beltanol ha rivelato azione fungicida completa anche a basso dosaggio (A. alternata, A. solani, C. fulvum).

The separation of some anthrone-C-glucosyl constituents of aloe was carried out by isocratic capillary electrochromatography using a 50 μm l.D. column packed with 3 μm ODS silica gel. In comparison to HPLC mode, CEC resolution of aloins was obtained in a very short time with a high selectivity factor. The influence of mobile phase parameters (pH and ionic strength of the buffer, acetonitrile amount in the eluent etc.) on the retention of aloins was examined in order to improve the separation conditions and to study the retention mechanism. Efficiency was found to increase with decreasing the EOF up to a reduced plate height of about 2 at a reduced linear velocity of 0.3 mm s−1. This effect was ascribed to the fact that, under the buffer conditions used (pH 8), aloins are partially anionically charged, with a consequent low mass transfer between the mobile and stationary phases. However, resolution remains almost the same in a wide pH range permitting baseline separations of aloins in short analysis times. Since aloins are known to undergo fast degradation reaction dependent on pH, a kinetic study was also carried out. The method was extended to the analysis of aloins in food and cosmetic products.