Search

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) include malignancies that arise in the oral cavity, nasopharynx, oropharynx, hypopharynx, and larynx. HNSCC is the eighth most common cancer worldwide. The 5-year overall survival rate of HNSCC patients is approximately 50%, but varies depending on the anatomical site of the tumor. Treatment approaches for HNSCC include surgery in combination with radiotherapy, chemotherapy, targeted therapy, immunotherapy, or combinations thereof. Although radiotherapy is an effective nonsurgical single treatment, resistance to radiotherapy often occurs. More effective therapies and personalized treatment approaches for HNSCC patients are urgently needed. This doctoral thesis aimed to I) identify a histological/immunohistological marker to predict which patients are more likely to respond to radio- or chemoradiotherapy; II) investigate how culturing conditions affect the gene expression profile of freshly isolated cancer cells using RNA sequencing transcriptome profile and the effect of these changes on the cancer cell responses to anti-cancer treatments, including radiotherapy; III) conduct a systematic review to investigate the effectiveness of combining angiogenesis inhibitors with radiotherapy for HNSCC treatment; IV) study the possible anti-metastatic effect of fascin 1 inhibitor, compound G2, and to determine if radiotherapy can synergistically enhance this effect; V) screen and identify a possible new effective targeted therapy compound that could have a synergistic effect with radiotherapy. In study I, we obtained formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples from 71 oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) patients treated with radio- or chemoradiotherapy and used immunohistochemistry (IHC) to study different prognostic markers. In study II, we isolated single cells from fresh tissue samples from 7 HNSCC patients, obtained a transcriptome profile via RNA sequencing, and performed a cell viability assay to determine how culturing matrices affect the gene expression profile and drug response of cancer cells. In study III, we performed a systematic review and found 301 records, of which 38 were clinical trials that studied the effectiveness of angiogenesis inhibitors in the treatment of HNSCC patients. In study IV, the anti-metastatic effect of compound G2 with radiotherapy was investigated using high-throughput drug screening (HTS), migration and invasion assays, and a zebrafish larvae assay of HNSCC cells. We also studied the prognostic value of fascin 1 in OTSCC tissue samples. In study V, we used 13 primary and metastatic HNSCC cell lines and performed a HTS drug screen on 396 Food and Drug Administration (FDA)-approved compounds and tested them with and without irradiation. In study I, we did not identify any significant associations between the evaluated markers and disease-free survival (DFS) of OTSCC patients treated with surgery and adjuvant radio- or chemoradiotherapy. Nevertheless, a trend of association between depth of invasion (DOI) and budding and DFS was observed, where low DOI or non-budding resulted in improved DFS. In study II, we showed that after isolating and culturing freshly obtained carcinoma cells, the gene expression profile significantly changed regardless of culturing conditions. Furthermore, results of anti-cancer treatment testing varied between the different culturing conditions. In study III, although most studies did not show benefit of angiogenesis inhibitors in treating HNSCC, endostatin and lenvatinib were well tolerated and their anticancer effects appeared promising. Study IV revealed that targeted inhibition of fascin 1 with compound G2 diminished HNSCC cell migration and invasion both in vivo and in vitro. Although we did not detect any cytotoxic effects of compound G2 in the HTS or in zebrafish assay, the anti-metastatic effect was clear. No synergy between compound G2 and irradiation was observed. In study V, HTS screening identified several radiosensitive and radioresistant compounds. The most promising synergistic effect was seen with navitoclax. Although we have previously shown that DOI and budding are reliable prognostic markers for OTSCC, we saw only a trend of association between these markers and DFS, presumably due to the small number of patients in study I. Thus, larger cohorts are needed to explore the prognostic value of DOI and budding for OTSCC patients treated with postoperative radio- or chemoradiotherapy. Study II revealed the challenges of in vitro testing of cancer treatments using enzymatic cell digestion. The artificial upregulation of some pathways in cultured cells compared with fresh carcinoma tissue may partially explain the common clinical failures of targeted therapies that appear promising in in vitro testing. In study III, the clinical trials of HNSCC patients in the systematic review examined various treatment combinations. However, as only 12 out of 38 studies included radiotherapy, we were not able to determine the effectiveness of combining angiogenesis inhibitors with irradiation. Nevertheless, considering the promising effects and tolerability of endostatin and lenvatinib, further investigations of these agents are warranted, particularly as a combination therapy for HNSCC patients. The findings of compound G2 in study IV indicated that targeting fascin 1 mainly affects the metastatic properties of the HNSCC but not cancer cell proliferation. We also confirmed the prognostic power of fascin 1 for HNSCC patients with advanced disease. In study V, we identified navitoclax as a promising agent and recommend that it is tested in clinical trials of HNSCC patients in combination with irradiation. Pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinooma (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) on maailmanlaajuisesti kahdeksanneksi yleisin syöpätyyppi ja se voi esiintyä suuontelossa, nenäontelossa, nielussa tai kurkunpäässä. Pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinoomapotilaiden viiden vuoden eloonjäämisennuste on vain noin 50 %, mutta se vaihtelee anatomisen sijainnin mukaan. Hoitomuotoja ovat leikkaus yhdistettynä sädehoitoon, kemoterapiaan, täsmälääke- ja/tai immunoterapiahoitoon. Sädehoito on yksi tehokkaimmista konservatiivisista hoitomuodoista, mutta vaste sädehoitoon vaihtelee potilaiden välillä ja joidenkin kohdalla vaste jää alhaiseksi. Tämän takia on suuri tarve kehittää tehokkaampia lääkkeitä sekä henkilökohtaisempia hoitomuotoja pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinoomapotilaille. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli: I) löytää histologinen/immunohistologinen markkeri, jonka avulla voidaan ennustaa mitkä potilaat todennäköisimmin hyötyvät säde- tai kemosädehoidosta; II) tutkia kuinka kasvatusolosuhteet vaikuttavat tuumorista eristettyjen karsinoomasolujen geeniekspressioon, sekä kuinka nämä muutokset vaikuttavat syöpäsolujen vasteeseen yleisesti käytettyihin syöpälääkkeisiin; III) tehdä systemaattinen kirjallisuuskatsaus, jossa selvitetään angiogeneesi-inhibiittoreiden tehokkuus pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinoomapotilailla sekä olisiko sädehoito yhdistettynä näihin lääkkeisiin tehokas hoitomuoto; IV) tutkia minkälainen anti-mestastaattinen vaikutus fascin 1 inhibiittori G2:della on, sekä voisiko sädehoito toimia synergisesti tämän lääkkeen kanssa; V) etsiä ja identifioida mahdollinen uusi tehokas täsmälääke, joka voisi toimia synergistisesti yhdessä sädehoidon kanssa. Tutkimuksessa I käytimme 71 säde- tai kemosähdehoitoa saaneen kielisyöpäpotilaan kudosnäytteitä ja tutkimme erilaisia prognostisia markkereita sekä histologian että immunohistokemian avulla. Tutkimuksessa II eristimme syöpäsoluja seitsemän suusyöpäpotilaan kasvaimesta otetusta näytteestä ja tutkimme, kuinka kasvatusolosuhteet vaikuttavat solujen geeniekspressiioon sekä lääkevasteeseen RNA sekvensoinnin sekä viabiliteettikokeiden avulla. Tutkimuksessa III teimme systemaattisen kirjallisuuskatsauksen, jossa löysimme 301 artikkelia joista 38 olivat kliinisiä tutkimuksia, joissa tutkittiin angiogeneesi-inhibiittoreiden tehokkuutta HNSCC potilaiden hoidossa. Tutkimuksessa IV, tutkimme fascin inhibiittori G2:den tehokkuutta HNSCC soluihin suuritehoisen seulonnan, migraatio ja invaasio kokeiden, sekä seeprakalamallin avulla. Tutkimme myös fascin 1 prognostista arvoa kielisyöpäpotilaiden kudosnäytteiden avulla. Tutkimuksessa V käytimme 13 HNSCC primaari- ja metastaasisolulinjaa ja toteutimme suuritehoisen seulonnan käyttäen 396 lääkettä, jotka sisälsivät sekä Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkeviraston (FDA) hyväksymiä että tutkittavia lääkevalmisteita. Tutkimuksessa I emme pystyneet osoittamaan merkitsevää yhteyttä minkään eri markkerin ja taudittoman hoidon jälkeisen jakson välillä säde- tai kemosädehoitoa saaneilla kielisyöpäpotilailla. Tuloksissa oli kuitenkin havaittavissa trendi taudittoman hoitojakson sekä invaasiosyvyys ja silmuilu analyysitulosten välillä, jossa alhainen invaasiosyvyys sekä silmuilu johtivat pidempään taudittomaan jaksoon. Tutkimuksessa II osoitimme, että karsinoomasolujen geeniekspressio muuttui merkittävästi eristyksen ja kasvatuksen jälkeen, riippumatta kasvatusolosuhteista. Lisäksi totesimme tulosten perusteella, että eri kasvuympäristöt eivät merkittävästi eroa lääkevasteen kannalta. Tutkimuksessa III, suurin osa kliinisistä tutkimuksista eivät osoittaneet merkittävää hyötyä angiogeneesi-inhibiittoreista HNSCC potilailla, mutta endostatiini sekä lenvatiniibi olivat hyvin siedettyjä, ja niiden teho oli lupaava. Tutkimuksessa IV fascinin 1 kohdennettu inhibiitio G2:den avulla vähensi selkeästi HNSCC solujen migraatiota ja invaasiota in vitro ja in vivo. Vaikka emme kyenneet osoittamaan G2:della olevan sytotoksisia vaikutuksia suuritehoisessa seulonnassa tai seeprakalamallissa, lääkeaineen antimetastaattinen vaikutus oli selkeä. Emme pystyneet osoittamaan synergistä vaikutusta G2:den ja sädehoidon välillä. Tutkimuksessa V löysimme suuritehoisen seulonnan avulla useita radiosensitiivisiä sekä sädehoitoon reagoimattomia lääkkeitä. Lupaavin synergistinen vaikutus sädehoidon kanssa oli navitoklaks-lääkkeellä. Vaikka olemme aikaisemmissa tutkimuksissa osoittaneet, että sekä invaasiosyvyys että silmuilu ovat luotettavia prognostisia markkereita kielisyöpäpotilailla, pystyimme tässä kyseisessä tutkimuksessa osoittamaan vain trendin näiden markkereiden ja taudittoman hoitojakson välillä. Tämä johtuu luultavasti tutkimuksen pienestä potilasmäärästä. Näiden tulosten perusteella lisätutkimukset isommilla kohorteilla ovat perusteltuja, jotta voidaan tutkia invaasiosyvyys- ja silmuilumarkkereiden prognostista arvoa säde- ja kemosädehoitoa saaneilla kielisyöpäpotilailla. Tulokset tutkimuksessa II osoittavat syöpälääkkeiden in vitro testauksessa yleisesti käytettyjen enstymaattisten digestiomenetelmien haasteet. Joidenkin geenireittien keinotekoinen aktivoituminen kasvatetuissa soluissa verrattuna tuoreeseen kudosnäytteeseen, voi osittain selittää joidenkin täsmälääkkeiden huono vaste kliinisissä kokeissa, vaikka edeltävät in vitro kokeet ovat olleet lupaavia. Tutkimuksen III kirjallisuuskatsaus sisälsi kliinisiä tutkimuksia HNSCC potilailla erilaisilla hoitomuotokombinaatioilla. Kuitenkin, vain 12 kaikista 38:sasta tutkimuksesta sisälsi sädehoitoa, joten emme voineet vetää johtopäätöksiä angiogeensi inhibiittoreiden ja sädehoidon yhdistelmän tehokkuudesta. Tästä huolimatta, endostatiinin ja lenvatiniibin osoittivat lupaavia tuloksia tehokkuuden ja siedettävyyden kannalta, minkä takia lisätutkimukset angiogeneesi-inhibiittoreista HNCSS potilailla ovat yhä perusteltuja. Tutkimuksen IV tulosten perusteella voidaan todeta, että fascin 1 inhibiittori G2 vaikuttaa pääasiassa solujen metastaattisiin ominaisuuksiin, eikä niinkään vähennä solujen proliferaatiota. Tutkimuksessa todettiin myös, että fascin 1 on lupaava prognostinen markkeri HNSCC potilailla pitkälle edenneessä taudissa. Tutkimuksessa V löysimme lupaavan navitoklas-lääkkeen, ja suosittelemme kliinisiä tutkimuksia navitoklaksin ja sädehoidon yhdistelmästä HNSCC potilailla.

Head and neck cancer (HNSCC) is the 8th most common cancer globally. Despite improved therapy, the 5-year survival rate has remained stagnant, at approximately 50%. Current preclinical in vitro anticancer compound testing features a low predictive value. Traditionally, in vitro cancer cell studies are conducted on a plastic surface or using animal–derived extracellular matrices, thereby overlooking the important interaction between cancer cells and the human tumor microenvironment. To overcome this problem, we have developed a human tumor leiomyoma–derived matrix Myogel. The aim of this PhD project was to develop reliable in vitro methods for anticancer drug testing by providing a human TME for HNSCC cells. The first approach was to investigate whether the use of a Myogel matrix could improve the reliability of drug screening compared to conventional plastic or the typically applied mouse sarcoma–derived matrix, Matrigel. We applied a high-throughput drug screening (HTS) to test 19 anticancer compounds, targeting EGFR, MEK, or PI3K/mTOR on 12 HNSCC cell lines under five different culturing conditions; cells on a plastic surface and on top of or embedded in Myogel or Matrigel. We found that cells cultured in Myogel were less sensitive to the EGFR and MEK inhibitors than cultured in Matrigel or on plastic. Additionally, Myogel cultured cells reflected better the response rates of EGFR inhibitor clinical trials compared to the other cultures. Therefore, we concluded that Myogel improves the predictability of in vitro anticancer drug testing compared to the plastic and Matrigel. Next, we performed a high-throughput drug screen to identify synergistic combinations using a compound library (n=396) and irradiation using HNSCC cell lines cultured on Myogel. The Bcl-2/Bcl-xL inhibitor navitoclax, which emerged as the most promising radiosensitizer, exhibited a synergy with irradiation in 13 HNSCC cell lines. Additionally, the navitoclax–irradiation combination halted the cell cycle and increased the irradiation-induced apoptosis. Overall, we demonstrated that the navitoclax–irradiation combination resulted in strong synergistic antitumor effects in HNSCC cell lines, and thereby it might possess therapeutic potential for HNSCC patients. The third, we manufactured a fully human in vitro microfluidic chip assay to test immunotherapeutic agents for personalized medicine purposes for HNSCC patients. First, the assay was run using the oral tongue cancer cell line (HSC-3) embedded in a Myogel–fibrin mixture and immune cells, isolated from healthy blood samples. After successful testing, the chip was applied for freshly isolated patent cells. Immune checkpoint inhibitors, IDO1 inhibitor (NLG-919) and a PD-L1 antibody were applied to chips and the immune cell migration and cancer cell proliferation were measured over three days. We found that the immune cell migration was associated with cancer cell density. The IDO1 inhibitor increased the immune cell migration towards cancer cells in HSC-3 and in two patient samples. In the future, this assay could possibly be utilized to predict an individual patient’s immunotherapy response against HNSCC. Pään ja kaulan alueen syöpä on maailmanlaajuisesti kahdeksanneksi yleisin syöpätyyppi. Kehittyneistä hoidoista huolimatta, 5 vuoden eloonjäämisennuste on edelleen vain 50 %. Nykyisten prekliinisten syöpälääkekokeiden ennustearvo on alhainen. Solututkimukset tehdään tavallisesti muovialustalla tai käyttämällä kaupallisia eläinperäisiä väliaineita, kuten hiiriperäistä Matrigeeliä. Nämä menetelmät jäljittelevät kuitenkin heikosti ihmisyöpäsolujen kasvuympäristöä. Parantaaksemme solukokeiden ennustettavuutta, olemme kehittäneet ihmisen kohdun myoomasta valmistetun väliaineen Myogeelin. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli kehittää luotettavampia in vitro -menetelmiä tarjoamalla syöpäsoluille ominaisempi kasvuympäristö. Ensimmäiseksi tutkimme, voisiko Myogeelin käyttö parantaa lääkeseulonnan luotettavuutta muovialustaan tai Matrigeeliin verrattuna. Tutkimuksessa testattiin 19 täsmälääkkeen (EGFR:n, MEK:n ja PI3K / mTOR:n estäjien) tehoa kahdellatoista pään ja kaulan alueen syöpäsolulinjalla viidessä eri kasvuympäristössä; muovin päällä, Myogeelillä ja Matrigeelillä päällystetyillä levyillä ja geelien sisällä. Myogeelin päällä ja sisällä kasvatetut syöpäsolut reagoivat huomattavasti heikommin EGFR:n ja MEK:n estäjiin kuin Matrigeelissä tai muovin päällä kasvatetut solut. Lisäksi Myogeelissä tehdyt kokeet vastasivat muita koeolosuhteita paremmin kliinisiä EGFR:n estäjillä tehtyjä lääkekokeita. Tutkimustuloksien perusteella Myogel parantaa in vitro ‑syöpälääketestausten kliinistä ennustettavuutta. Seuraavaksi tutkimme suuritehoisella seulonnalla uusia säde- ja lääkehoitoyhdistelmiä. Tutkimuksessa käytettiin lääkekirjastoa (n = 396) ja sädehoitoa Myogeelissä viljellyille pään ja kaulan alueen syöpäsoluille. Tutkimuksessa osoitettiin lupaavimman lääkekandidaatin, Bcl-2/Bcl-xL estäjän, navitoklaksin ja sädehoidon yhdistelmällä olevan synerginen vaikutus kolmessatoista testatussa solulinjassa. Lisäksi yhdistelmä pysäytti syöpäsolujen jakautumisen ja aiheutti apoptoosia. Tutkimuksen perusteella navitoklaksi-sädehoitoyhdistelmällä saattaisi olla potentiaalia pään ja kaulan alueen syövän hoidossa. Kolmantena aiheena oli kehittää ihmisperäinen mikrofluidinen sirumääritys yksilöidyn immunoterapiavasteen testaukseen. Ensiksi siru testattiin käyttäen kielisyöpäsolulinjaa (HSC-3) ja terveiden verenluovuttajien immuunisoluja. Syöpäsolut kasvatettiin sirussa Myogeeli-fibriini-väliaineessa. Immuunijärjestelmän tarkastuspiste-estäjiä, IDO1-estäjää (NLG-919) ja PD-L1-vasta-ainetta lisättiin siruille, minkä jälkeen immuunisolujen liikkumista sekä syöpäsolujen jakautumista mitattiin kolmen päivän ajan. Seuraavaksi sirumäärityksen suoritettiin potilaista eristetyille syöpäsoluille ja veren immuunisoluille. Tutkimuksemme osoittivat syöpäsolujen määrän vaikuttavan immuunisolujen liikkumiseen. IDO1-estäjä lisäsi immuunisolujen liikkumista syöpäsoluja kohden kahdella potilasnäytteellä sekä HSC-3-soluilla. Määritystä voitaisiin mahdollisesti tulevaisuudessa käyttää apuna potilaan immunoterapiavasteen ennustamisessa.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a common and aggressive malignancy. It includes the tumors arising in the head and neck area with oral cancer representing one of the most common types. Intraorally, squamous cell carcinomas arising from the tongue (OTSCC) are the most frequent. The multimodality treatment regime includes surgery, radio and/or chemotherapy depending on the spread of the disease. Unfortunately, the five-year survival rates in the Nordic countries remain between 50-60% for oral cancer, with the incidence of OTSCC increasing without clear etiology. The newest addition to the treatment regime of recurrent and/or metastasized oral squamous cell carcinoma (OSCC) patients is immune checkpoint inhibitors (ICIs), namely anti-PD-1. These ICIs provide improved survival rates, and the expression of the immune checkpoints (ICs) are being investigated as potential prognostic factors. This dissertation aimed to investigate the role of ICs in the development of oral carcinogenesis. Our first project was to explore the expression of selected ICs, indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1), and programmed death-ligand 1 (PD-L1) in oral dysplasia, a potentially malignant oral lesion. We retrospectively gathered 63 archival oral dysplasia samples from Oulu and Tampere University Hospitals from 2005 to 2016, with 9 samples extracted during wisdom tooth extractions to act as healthy controls. The samples were stained for anti-PD-L1 and anti-IDO1 and scored for the expression of both immune checkpoints, dysplastic grade, and immune cell infiltration. The expression of the ICs was modulated during the development of dysplastic changes associated with inflammatory cell infiltration. Eight patients were followed up to 36 months and biopsies were taken more than once. The expression of ICs fluctuated over time, suggesting that they are not useful as biomarkers for malignant transformation. Since the start of our first project, several articles have been published on the prognostic value of ICs in OSCC. Our second project aimed to systematically review the prognostic value of ICs in OSCC. By the end of 2017, 12 ICs had been studied for their prognostic value in OSCC. Seven of them (ALHD1, FKBP51, PD-L1, B7-H3, B7-H4, B7-H6, and IDO1) had been reported as adverse prognostic factors and five (CTLA-4, PD-1, PD-L2, TLT-2 and VISTA) did not have prognostic value. Only two molecules, PD-L1 and B7-H3, had sufficient data for conducting a meta-analysis. PD-L1 had controversial findings as a prognostic marker, with weak evidence suggesting high B7-H3 expression was an adverse prognostic factor for overall survival. Based on the systematic review results, we aimed to validate B7-H3 as an adverse prognostic factor in OTSCC. 323 OTSCC samples from Brazil, Finland, and Norway were retrospectively gathered and stained for B7-H3. High B7-H3 expression was not significantly associated with patient survival in the whole OTSCC cohort. The immune status/phenotype of the Brazilian and Finnish cases (n=191) was analyzed by the amount of tumor infiltrated lymphocytes (TILs), classifying the cases into ‘immune hot’ and ‘immune cold’. The immune status of the patient (n=191) was significantly associated with patient survival, with immune cold patients having an adverse outcome in univariate and multivariate survival. Our findings suggest that the immune status of the tumor should be considered when investigating the prognostic value of ICs and could be an individual prognostic factor aiding in identifying potential high-risk cases. Based on studies I and II, a research question arose regarding what would be the functional effect of the ICI on lymphocyte infiltration in the presence of cancer cells and what would happen to the cross-talk between lymphocytes and cancer cells. In a newly developed microfluidic chip model, we injected OTSCC cells (HSC-3) embedded in a 3D human tumor-derived matrix “myogel/fibrin” together with different lymphocyte populations (CD4+ T, NK and CD8+ T cells). The chips were incubated with different ICIs, anti-PD-1, nivolumab or the IDO1 inhibitor, epacadostat. Study IV revealed that each subpopulation of lymphocytes responded differently to ICI therapy with the release of specific cytokines. The IDO1 inhibitor significantly increased the migration of CD4+ T and NK cells towards the OTSCC cell line. This could potentially reverse the immune cell exclusion firing up cold tumors to hot. Anti-PD-1 significantly increased the release of IL-6, IL-8, and MIP-1α from CD4+ T, NK and CD8+ T cells, respectively. The elevation of IL-6 and IL-8 serum levels after ICI therapy in patients has been associated with nonresponding tumors. The blockage of these cytokines may be a promising direction for future studies. Pään ja kaulan alueen levyepiteeli karsinooma on kahdeksanneksi yleisin syöpä maailmassa sisältäen suun alueen levyepiteelisyövän. Uusista syöpähoidoista huolimatta viiden vuoden eloonjäämisennuste Pohjoismaissa on kuitenkin vain 50–60 % suusyöville uusien kielisyöpä tapausten lukumäärän kasvaessa ilman selkeää etiologista syytä. Uusin lisäys metastoituneiden tai uusiutuneiden suusyöpien hoitoon ovat immuunivasteen sääteljämolekyylien estäjät. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia immuunivasteen säätelijämolekyylejä syövän esiasteissa ja niiden kykyä ennustaa syövän kehitystä. Ensimmäisessä julkaisussa tutkittiin immuunivasteen säätelijä molekyylien, indoleamiini 2,3-dioksygenaasi 1 (IDO1) ja ohjattu solukuolema ligandi 1 (PD-L1) proteiini-ilmentymiä suusyöpä vaaraa mahdollisesti lisäävissä muutoksissa, dysplasioissa. 63 suunlimakalvojen dysplasia ja 9 kontrolli näytettä värjättiin IDO1 ja PD-L1 vasta-aineilla sekä pisteytettiin proteiini-ilmentymien, dysplastisen asteen ja immuuni solujen infiltroinnin mukaan. Immuunivasteen säätelijämolekyylien ilmentymät muovaantuivat dysplasia asteen edetessä ja korreloivat immunisolu infiltraatin kanssa. Kahdeksaa potilasta seurattiin useammalla biopsialla aina 36 kuukauteen asti. Immuunivasteen säätelijämolekyylien ilmentymät vaihtelivat tarkoittaen, etteivät ne todennäköisesti sovi ennustaviksi tekijöiksi syövän kehitykselle. Toisessa julkaisussa halusimme arvioida systemaattisesti immuunivasteen säätelijämolekyylien ennustavaa arvoa suusyövissä. Vuoden 2o17 loppuun mennessä, 12 immuunivasteen säätelijämolekyyliä oli tutkittu ennustavana tekijän suusyövässä. Seitsemän molekyyliä (ALHD1, FKBP51, PD-L1, B7-H3, B7-H4, B7-H6, ja IDO1) oli raportoitu suusyövän ennustetta huonontaviksi tekijöiksi, kun taas viidellä tutkitulla molekyylillä (CTLA-4, PD-1, PD-L2, TLT-2 ja VISTA) ei ollut ennustavaa arvoa. Ainoastaan PD-L1 ja B7-H3 molekyyleillä oli tarpeeksi julkaistua tietoa suorittaa meta-analyysi. PD-L1 oli ristiriitaisia tuloksia ennustavana tekijänä, kun taas korkea B7-H3 proteiini-ilmentymä näytti olevan ennustava tekijä huonontuneelle potilaan kokonaiseloonjäämisennusteelle. Varmentaaksemme meta-analyysin tulokset keräsimme arkistosta 323 kielisyöpä näytettä Brasiliasta, Suomesta ja Norjasta ja värjäsimme ne B7-H3 vasta-aineilla sekä pisteytimme. Korkea B7-H3 proteiini-ilmentymä ei korreloinut tilastollisesti merkittävästi potilaan ennusteen kanssa koko tutkitussa kielisyöpä populaatiossa. Tuumoreiden immuuniaktiivisuus pisteytettiin Brasilian ja Suomen tapauksista (n=191) analysoimalla tuumoria infiltroivien lymfosyyttien lukumäärän jakaen tapaukset immuuniaktiivisiin ja immuuniepäaktiivisiin ryhmiin. Immuuniaktiivisessa ryhmässä, B7-H3 korreloi tilastollisesti merkittävästi huonontuneeseen syöpä spesifiseen eloonjäämisennusteeseen suomalaisissa kielisyövissä (n=89) manuaalisella pisteytyksellä ja kokonaiseloonjäämisennusteelle brasilialaisissa kielisyövissä (n=27) digitaalisesti automatisoidulla pisteytyksellä. Aiempien julkaisujen pohjalta, meille heräsi tutkimuskysymys, että miten immuunivasteen säätelijämolekyylien estäjät vaikuttaisivat immuunisolujen pääsemiseen syöpäsolukudoksessa ja syöpäsolujen ja immuunisolujen väliseen kommunikaatioon. Viljelimme kielisyöpäsoluja istutettuina myogeeli/fibriini 3D matriisiin eri immuunisolu tyyppien (CD4+T, luonnolliset tappaja ja CD8+ T solut) kanssa mikrofluidiseen siruun. Siruihin lisättiin solujen jälkeen joko PD-1-vasta—ainetta tai IDO1-inhibiittoria. Jokainen testattu immuunisolutyyppi reagoi eri tavalla immuunivasteen säätelijämolekyylin estäjiin erittäen eri viestimolekyylien pitoisuuksia. IDO1-inhibiittori lisäsi merkittävästi CD4+ T ja luonnollisten tappaja solujen migraatiota kielisyöpäsoluja kohti. Tämä voisi potentiaalisesti tehdä immuuniepäaktiivisesta tuumorista aktiivisen. PD-1-vasta-aine nosti merkittävästi interleukiini 6 ja 8 eritystä. Interleukiini 6 ja 8 seerumikonsentraatin nousu immuunivasteen säätelijämolekyylien estäjä terapian jälkeen on havaittu korreloivan hoitoresistenssin kanssa. Näiden sytokiinien estämistä kombinaationa immuunivasteen säätelijämolekyylien estäjien kanssa tulisi tutkia tulevaisuudessa.