Optimização dos processos de isolamento e cultura de protoplastos de tamarilho ( Solanum betaceum Cav.)

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. O tamarilho (Solanum betaceum Cav.) é uma espécie arbórea de pequeno porte, pertencente à família Solanaceae, e que apresenta características económicas, nutricionais e biotecnológicas bastante interessantes. No entanto, as populações naturais desta espécie possuem uma baixa variabilidade genética, a qual não é possível ultrapassar sem a aliança entre as técnicas de manipulação genética e os métodos de melhoramento mais convencionais. Os protoplastos podem assim ser considerados como uma ferramenta importante para o melhoramento desta espécie, na medida em que constituem um passo prévio a várias técnicas de manipulação genética, nomeadamente hibridação somática (por fusão de protoplastos) e transformação genética. Recorrendo ao método “one factor at a time”, analisaram-se os principais factores que afectam tanto o rendimento como a viabilidade dos protoplastos obtidos a partir de diferentes explantes em cultura in vitro de tamarilho. Estes dois parâmetros são influenciados pelo estabilizador osmótico (neste caso em concreto, a sacarose), tipos de enzimas hidrolíticas e sua concentração, temperatura e duração da digestão enzimática e métodos de purificação dos protoplastos. O maior rendimento de protoplastos isolados a partir de explantes foliares foi conseguido através da solução K3 com sacarose a 0,4 M contendo celulase “Onozuka” R-10 a 2% (w/v) e macerozima R-10 a 0,5% (w/v). As condições de incubação enzimática com melhores respostas foram a 27 ºC overnight e 30 ºC durante 6 horas para as linhas diplóide e tetraplóide, respectivamente. A centrifugação por gradiente de densidade a 100 g durante 10 min. com obtenção de uma banda interfásica revelou-se o método de purificação dos protoplastos mais eficiente. Para estimar a viabilidade dos protoplastos recorreu-se ao corante de exclusão Evans blue, registando-se valores de protoplastos viáveis acima dos 50%. No entanto, apesar de a quantidade de protoplastos viáveis por grama de peso fresco ser considerável, ainda não foi possível regenerar plantas a partir de protoplastos colocados em meio de cultura. As condições óptimas para o isolamento e purificação de protoplastos de calli e tecidos embriogenicamente induzidos envolveram a digestão enzimática com a combinação de celulase a 1%, driselase a 0,2% e pectinase a 0,02% (w/v), em solução K3 com sacarose a 0,4 M, durante 20 – 22 horas a 25 ºC (para calo embriogénico) ou overnight a 27 ºC (calo não embriogénico e explantes embriogenicamente induzidos), seguida de purificação por sedimentação dos protoplastos num pellet, quando sujeito a uma centrifugação inicial de 100 g durante 10 min. O desenvolvimento de um protocolo eficiente de isolamento e purificação de protoplastos a partir de diferentes explantes permitiu a avaliação do rendimento possível de obter com a extracção de RNA total e a sua aplicabilidade em futuras análises transcriptómicas de populações específicas de células. Tamarillo (Solanum betaceum Cav.) is a small solanaceous tree with interesting economical, nutritional and biotechnological features. The low genetic variability observed in natural populations of tamarillo demands for the need for genetic manipulation techniques to circumvent this problem by complementing the more conventional methods of breeding. Plant protoplast technology can be considered an important tool for S. betaceum improvement because it can be a predecessor step for these genetic manipulation techniques, such as somatic hybridization (by protoplast fusion) and genetic transformation. Thus, the basis of this study was to determine the main factors affecting the isolation of protoplasts from different in vitro cultured tissues of tamarillo. Sucrose as the osmotic stabilizer, types of plant cell wall - degrading enzymes and their concentration, temperature and time of enzymatic incubation, and purification methods were evaluated in terms of their effects on protoplast yield and viability by using the “one factor at a time” method. Results showed that the highest leaf mesophyll protoplast yield was provided by 2% (w/v) cellulase “Onozuka” R-10 and 0.5% (w/v) macerozyme R-10 dissolved in 0.4 M sucrose – K3 solution. This enzymatic mixture was subjected to an overnight incubation at 27 ºC for diploid lines and to 6 h incubation at 30 ºC for tetraploid genotype. The density gradient centrifugation at 100 g for 10 min with the separation of an interphase band was the most effective protoplast purification method tested. The optimal conditions achieved for calli and embryogenic induced - derived protoplast isolation and purification involved an enzymatic digestion with a combination of 1% (w/v) cellulase “Onozuka” R-10, 0.2% (w/v) driselase and 0.02% (w/v) pectinase, also dissolved in 0.4 M sucrose – K3 solution, for a 20 - 22h incubation period at 25 ºC (embryogenic callus) or an overnight incubation at 27ºC (non-embryogenic callus and embryogenic induced explants), followed by centrifugation at 100 g for 10 min to pellet the protoplasts. Viability of protoplasts from leaf mesophyll and embryogenic callus was evaluating using Evans blue staining, with viable protoplasts over 50%. However, despite the high number of viable protoplasts, an efficient regeneration of plants from leaf mesophyll protoplasts was not yet achieved. The development of efficient protoplast isolation and purification protocols, from different explants allowed for the evaluation of the yield possible to achieve with a method for total RNA extraction in order to estimate the application of this technique in subsequent transcriptomic analysis of specific populations of cells.