Multifactorial approach to non-viral gene therapy: development of an efficient system for the retina

Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016 A terapia génica é uma estratégia terapêutica que se caracteriza pela entrega de material genético a uma célula alvo. A terapia génica tem sido vastamente utilizada no combate a diversas doenças genéticas e adquiridas, tais como as doenças cardiovasculares, cancro e doenças oculares, entre outras. Devido às suas características únicas, como tamanho reduzido, relativo isolamento da circulação sistémica e fácil acessibilidade a diferentes tipos celulares e tecidos, o olho é considerado o órgão ideal para o desenvolvimento de estratégias de terapia génica. A Retinite Pigmentosa e a Retinopatia Diabética são exemplos de doenças oculares genéticas e adquiridas, respetivamente, que afetam a retina e conduzem a uma perda irreversível de visão. Apesar da sua etiologia ser diferente, ambas as patologias partilham o facto de, atualmente, não existir um tratamento eficaz, o que faz destas bons alvos para terapia génica. Atualmente, cerca de 80% das estratégias de terapia génica usadas para doenças oculares são baseadas na utilização de vírus como vetores de entrega do material genético. Apesar da sua eficácia, esta abordagem acarreta uma série de desvantagens, principalmente do ponto de vista de segurança a nível imunológico e mutagénico. Assim, os vetores não-virais aparecem como estratégia alternativa aos vetores virais, pela sua fácil utilização, ilimitada capacidade de empacotamento de genes e ausência de resposta imunitária. Porém, a sua aplicação clínica encontra-se limitada, não só pela sua reduzida eficiência de transfeção como pela expressão genética transiente conferida pelos, até agora utilizados, sistemas de expressão. Neste sentido, nas últimas décadas têm sido desenvolvidos sistemas de expressão baseados em plasmídeos de ADN, que visam uma expressão prolongada, como os minicírculos, os vetores MIDGE, os pFARs e os plasmídeos epissomais com capacidade de auto-replicação. Exemplos de plasmídeos com capacidade de autoreplicação são os pEPI-1 e pEPito. Nestes plasmídeos, a capacidade de autoreplicação é conferida pela presença de S/MARs (Scaffold/Matrix Attachment Regions) no corpo do plasmídeo. As S/MARs são sequências de ADN ricas em nucleótidos Adenina (A) e Timina (T) capazes de ancorar a cromatina à matriz nuclear. As S/MARs parecem estar envolvidas na destabilização e abertura da dupla hélice de ADN, sugerindo um envolvimento na replicação e expressão do mesmo, uma vez que a transição de cadeia dupla para cadeia simples é necessária para a replicação e transcrição genética. Além disso, vetores com S/MARs são capazes de prevenir o silenciamento epigenético, protegendo o transgene das sequências regulatórias adjacentes e da heterocromatinização, mantendo o vetor num estado transcricionalmente ativo e conferindo, assim, estabilidade mitótica. As S/MARs têm, também, a capacidade de mediar a associação da partícula episomal aos cromossomas metafásicos, permitindo, assim uma distribuição igualitária dos epissomas para as células filhas, após a mitose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma estratégia de terapia génica nãoviral para doenças da retina, recorrendo ao uso de sistemas de expressão epissomais com capacidade de auto-replicação (pEPito) e de um sistema de entrega eficaz (eletroporação), de modo a conseguir uma expressão prolongada dos genes terapêuticos. Experimentalmente é possível dividir este trabalho em três secções: i) identificação de genes com potencial terapêutico em patologias da retina, como RP e RD; ii) clonagem dos genes em questão em vectores epissomais, pEPito e iii) administração dos vetores desenvolvidos in vivo, na retina de ratinhos, utilizando eletroporação como método de entrega dos sistemas de expressão. Foi recentemente descrito em ratinhos que mutações no gene ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related) induzem uma acumulação de pigmento na retina, com consequente degeneração dos fotorrecetores (bastonetes e cones), semelhante à que acontece em pacientes com Retinite Pigmentosa. Nos animais Wild-Type esta proteína está localizada nos cílios dos fotorrecetores. Nos mutantes, a presença da proteína mutada induz um encurtamento dos cílios, originando uma degeneração dos bastonetes e, posteriormente, dos cones. Neste contexto, tentámos investigar qual a função desta proteína na formação e alongamento dos cílios retinianos. Os nossos estudos in vitro demonstraram que esta proteína está associada ao centrossoma das células ciliadas. Nestas células, o centrossoma é o local onde o cílio se forma e por onde começa a alongar. A inibição de ATR (pela cafeína) originou uma diminuição da expressão proteica e, como consequência, verificou-se uma diminuição no comprimento dos cílios das células tratadas, demonstrando uma relação direta entre a expressão de ATR e a função ciliar. Assim, podemos inferir que mutações no gene ATR podem ser responsáveis por alguns dos casos de RP que não estão associados aos genes normalmente implicados na doença. A Retinopatia Diabética é uma das principais complicações da Diabetes Mellitus. É considerada uma doença das barreiras hematorretinianas, na qual a hiperglicemia e isquémia são as principais responsáveis pelo desequilíbrio entre os fatores pro- e antiangiogénicos que conduzem à neovascularização e consequente perda de visão. Neste estudo avaliámos os efeitos da hiperglicemia e isquémia na barreira hematorretiniana externa, in vitro, em culturas de células do epitélio pigmentar da retina, sujeitas a glicose elevada e in vivo, no epitélio pigmentar da retina de ratinhos diabéticos Ins2Akita. Os nossos resultados mostraram um aumento do transportador de glicose (GLUT1) nos nossos modelos diabéticos. Este aumento está associado, não só, a um aumento no número de transportadores na membrana das células do epitélio pigmentar da retina, como também a um aumento da sua atividade, aumentando o consumo de glicose. Este aumento no consumo de glicose induz uma diminuição na produção e secreção de factores anti-angiogénicos, como o PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) por estas células. Esta diminuição contribui para o desequilíbrio entre os fatores pro- e anti-angiogénicos, contribuindo assim para o desenvolvimento da neovascularização. Baseado nos resultados anteriores, decidimos clonar o gene PEDF no vetor de expressão pEPito e, através de injeção subretiniana, administrá-lo nas células do epitélio pigmentar da retina de ratinhos Ins2Akita. Os nossos resultados mostraram que os nossos vetores foram capazes de sobre-expressar PEDF até três meses após a injeção, em níveis semelhantes aos dos animais controlo (não diabéticos). Esta sobreexpressão foi associada a uma diminuição de marcadores inflamatórios e angiogénicos, associados à doença. Estes resultados mostram que a sobre-expressão de PEDF pode constituir uma nova estratégia para o tratamento da RD. Os nossos resultados indicam que esta abordagem baseada em sistemas de expressão com capacidade de auto-replicação e menos susceptíveis ao silenciamento epigenético, como os pEPito, aliada a um método de entrega de ADN eficaz, como a eletroporação, pode ultrapassar as limitações associadas à utilização de vetores virais, conferindo um padrão de expressão génica prolongado e mantendo um elevado perfil de segurança, consistindo assim numa alternativa eficaz para a terapia génica retiniana.