Role of microorganisms in processes of capture and emission of greenhouse gases in underground environments

Tesis doctoral leída en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid.
[EN] Karstic environments are the most representative underground ecosystems on a global scale since they cover approximately 20% of the land surface of the Earth and contain shallow caves that belong to the Critical Zone of the Earth. Although they could play an important role in regulation of the external atmosphere composition, the underground ecosystems have not yet been included in the annual carbon balances of the main GHGs. However, the research interest in this field has recently increased. In this Doctoral Thesis, entitled “Role of microorganisms in processes of capture and emission of greenhouse gases in underground environments”, the research has focused on: (1) Characterize the microbial populations present in three caves of three karstic systems with different geological origin and different climatic and environmental parameters. • Epigenic cave with a high rate of exchange with the outside: Pindal Cave (Asturias) • Epigenic cave with low rate of exchange with the outside: Castañar de Ibor Cave (Cáceres) • Hypogenic cavity: Sima del Vapor (Murcia) (2) Characterize the structure and function of the microorganisms that live in different substrata of the three caves. (3) Determine the influence of environmental conditions on the microbial activity involved in the regulation of GHG (CO2, CH4 and NOx) in each of the cave. (4) Characterize the most effective taxa and metabolic pathways involved in the biogeochemical and geo-microbiological processes that regulate GHG sediment-atmosphere exchange fluxes and quantifying these fluxes. Here, we used a pioneering multidisciplinary approach, combining environmental monitoring, in situ measurement of CO2 and CH4 fluxes and characterization of microbial communities (Bacteria, Archaea and Fungi) using microscopy and metabarcoding techniques. Regarding the characterization of the microbial communities of the three cavities, the most relevant results have been the following: • The composition and structure of the microbial populations in the caves studied is determined by their geological and geomorphological characteristics and by their degree of connection with the outside environment. The comparative study of the three caves showed a clear difference in the bacterial composition, especially in the Actinobacteriota and Proteobacteria phyla. • In Vapor Cave, the most frequent actinobacteria were of the genus Streptomyces. In this cave, an evident vertical stratification of the microbial groups was observed depending on the temperature and O2 concentration of in the subterranean air, highlighting a great diversity of Archaea with great abundance of the Micrarchaeota phylum in the hypoxic zones. • In Pindal Cave, the most characteristic actinobacteria were those related to the genus Crossiella, a rare genus that, in this case, was associated with a high degree of colonization by visible colonies and moonmilk deposits. Within the Proteobacteria phylum, the wb1-P19 lineage was exclusively detected in this cave. • Castañar de Ibor is the cave with the highest degree of isolation and the lowest values of microbial diversity. The most frequent actinobacteria were of the order Micrococcales and within the Proteobacteria phylum it should be noted the presence of the genus Lysobacter, related to the presence of the fungal genus Fusarium. Regarding the role of microorganisms in the processes of capture and emission of GHG, which is the main objective of this thesis, the main conclusions are the following: • Vapor Cave acts as a CH4 filter and a source of CO2, N2O and NO2. The emissions of N2O and NO2 to the outside atmosphere are the result of the activity of ammonia-oxidizing archaea and denitrifying fungi Fusarium oxyporum. Vapor cave acts as an important filter for the geogenic emissions of CH4, generated in deep zones, due to activity of denitrifying methanotrophic bacteria of the Methylomirabilota phylum (also known as the NC10 or Rokubacteria phylum). • Pindal Cave acts as an important CO2 reservoir and CH4 sink. The results of the in situ monitoring of CO2 diffusive fluxes from the sediments and the bioinformatic analysis showed that the metabolic activity of Crossiella combines with the chemoautotrophic fixation by nitrifying bacteria wb1-P19 were the main responsible for CO2 consumption fluxes and calcium carbonate precipitation that gives rise to the formation of moonmilk deposits. Likewise, in situ measurements showed a continuous consumption of CH4 by type I methanotrophic bacteria, related to the Methylomonadaceae family, present in the sediments and in moonmilk deposits. These moonmilk deposits presented the highest consumption rate of CH4 being the most effective sinks of CH4 and CO2. • Castañar de Ibor Cave, due to its isloation conditions, functions as a CO2 reservoir and CH4 sink. The results of this study allowed us to identify the most abundant methanotrophs within the Methylomirabilota phylum in the cave sediments. In conclusion, although the microbial communities differ in the three environments, the caves contain an abundant microbial biomass, which regulates the physicochemical properties of the subterranean atmosphere by capturing, filtering and emitting GHGs. In Vapor Cave, the microbial communities are responsible for the emission of N2O and NO2, but they also act as a reducing filter for CH4 emissions into the outside atmosphere. Ventilated epigenic environments act as important CH4 sinks, since large amounts of CH4 from outside are consumed inside them by the oxidative action of the methanotrophic populations present in their sediments. Bacteria involved in CO2 sequestration and fixation mechanisms play an active role in the regulation of carbon in subterranean environments and have been identified in sediments, visible colonies and mineral deposits (moonmilk). This type of bacteria are common in caves and, consequently, the multidisciplinary methodology and the microbiological information provided in this thesis could be applied in conservation studies and to improve the calculation of global GHG balances.
[ES] Los ambientes kársticos son los ecosistemas subterráneos más representativos a escala global ya que ocupan aproximadamente el 20 % de la superficie terrestre, albergan cavidades próximas a la superficie y forman parte de lo que se conoce como Zona Crítica de la Tierra. A pesar de que podrían jugar un papel importante en la regulación de la composición de la atmósfera externa, los ecosistemas subterráneos aún no han sido incluidos en las estimaciones globales de los balances de los principales GEI, pero son cada vez más numerosos los trabajos de investigación en este campo. Dentro de esta línea de investigación, la presente Tesis Doctoral, titulada “Papel de los microorganismos en procesos de captación y emisión de gases de efecto invernadero en ambientes subterráneos”, ha enfocado su investigación en: (1) Caracterizar las poblaciones microbianas presentes en tres cuevas de tres sistemas kársticos con diferentes origen y características geológicas, climáticas y ambientales. • Cavidad epigénica con alta tasa de intercambio con el exterior: Cueva del Pindal (Asturias) • Cavidad epigénica con baja tasa de intercambio con el exterior: Cueva de Castañar (Cáceres) • Cavidad hipogénica: Sima del Vapor (Murcia) (2) Caracterizar la estructura y función de los microrganismos que habitan en diferentes sustratos de las tres cavidades. (3) Determinar la influencia de las condiciones ambientales en la actividad microbiana involucrada en la regulación de GEI (CO2, CH4 y NOx) en cada una de las cavidades. (4) Caracterizar los taxones y las vías metabólicas más efectivas involucradas en los procesos biogeoquímicos y geomicrobiológicos reguladores de los flujos de intercambio de GEI sedimentos-atmósfera, cuantificando dichos flujos. El estudio se planteó con un enfoque multidisciplinar, combinando monitorización ambiental, medida in situ de flujos de CO2 y CH4 y caracterización de las comunidades microbianas (bacterias, arqueas y hongos) mediante técnicas de microscopía y metabarcoding. Respecto a la caracterización de las comunidades microbianas de las tres cavidades, los resultados más relevantes han sido los siguientes: • La composición y estructura de las poblaciones microbianas de las cuevas estudiadas está condicionada por sus características geológicas y geomorfológicas y por su grado de conexión con el ambiente exterior. El estudio comparativo de las tres cavidades mostró una clara diferencia en la composición bacteriana, entre la que destaca la referente a los filos Actinobacteriota y Proteobacteria. • En la Sima del Vapor, las actinobacterias más frecuentes fueron del género Streptomyces. En esta cueva se observó una estratificación vertical evidente de los grupos microbianos en función de la temperatura y concentración de O2 en aire, destacando una gran diversidad de arqueas con gran abundancia del filo Micrarchaeota en las zonas hipóxicas. • En la Cueva del Pindal, las actinobacterias más características fueron las relacionadas con el género Crossiella, un género poco común que, este caso, se asocia con un alto grado de colonización visible. Dentro del filo Proteobacteria, el linaje wb1-P19 se detectó exclusivamente en esta cueva. • Castañar de Ibor, es la cueva con el mayor grado de aislamiento y los valores más bajos de diversidad microbiana. Las actinobacterias más frecuentes fueron del orden Micrococcales y dentro de las Proteobacterias destacó la presencia de Lysobacter relacionada con la presencia predominante de hongos del género Fusarium. En cuanto al papel de los microorganismos en los procesos de captación y emisión de GEI, principal objetivo de esta tesis, las principales conclusiones son las siguientes: • La Sima del Vapor actúa como filtro de CH4 y fuente de CO2, N2O y NO2. Las emisiones de N2O y NO2 a la atmósfera exterior son el resultado de la actividad de arqueas oxidantes de amoniaco y hongos desnitrificantes de la especie Fusarium oxyporum. La Sima del Vapor actúa como un importante filtro de las emisiones geogénicas de CH4 generado en zonas profundas gracias a la abundancia y acción de las bacterias metanotrofas desnitrificantes del filo Methylomirabilota (filo NC10 o Rokubacteria). • La Cueva del Pindal, actúa como un importante reservorio de CO2 y sumidero de CH4. Los resultados de la monitorización in situ de los flujos de difusión de CO2 procedentes de los sedimentos y del análisis bioinformático, han permitido concluir que la actividad metabólica combinada de Crossiella y la fijación quimioautótrofa de las bacterias nitrificantes wb1-P19, son las principales responsables de los flujos de consumo de CO2 y de la precipitación de carbonato cálcico que da lugar a la formación de depósitos minerales bioinducidos tipo moonmilk. Asimismo, las mediciones in situ han demostrado un consumo continuo de CH4 por bacterias metanotrofas de tipo I, relacionadas con la familia Methylomonadaceae presentes en los sedimentos y en los depósitos tipo moonmilk. Estos últimos presentaron los mayores consumos de CH4 y son los sumideros de CH4 y CO2 más efectivos. • La Cueva de Castañar de Ibor, por sus condiciones de aislamiento funciona como un reservorio de CO2 y sumidero de CH4. Los resultados del estudio permitieron identificar en los sedimentos a las metanotrofas más abundantes dentro del filo Methylomirabilota. En conclusión, aunque las comunidades microbianas difieren de un ambiente subterráneo a otro, las cavidades contienen una biomasa microbiana abundante cuya actividad metabólica actúa regulando las propiedades fisicoquímicas de la atmósfera subterránea mediante la captación, filtrado y emisión de GEI. En la Sima del Vapor son los responsables de la emisión de N2O y NO2, pero también actúan como filtro reductor de las emisiones CH4 a la atmósfera exterior. Los ambientes epigénicos ventilados actúan como importantes sumideros de CH4, ya que en su interior se consumen grandes cantidades de CH4 procedente del exterior por acción oxidativa de las poblaciones metanotrofas presentes en sus sedimentos. Se han identificado bacterias captadoras y fijadoras de CO2 presentes en sedimentos y colonias visibles y asociadas a depósitos minerales bioinducidos (moonmilk) que juegan un papel activo en la regulación del carbono en ambientes subterráneos. Este tipo de bacterias son habitantes comunes de las cuevas y, por lo tanto, la metodología de carácter multidisciplinar y la información microbiológica aportada en esta tesis es de aplicación directa en estudios de conservación y para mejorar las estimaciones de los balances globales de GEI.
La presente Tesis Doctoral se ha realizado en Departamento de Geología del Museo Nacional de Ciencias Naturales (MNCN-CSIC), en el marco de los proyectos CGL2016-78318-C2-1-R, financiado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad, y PID2019-110603RB-I00, financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación. Durante la realización de la presente Tesis, su autora fue beneficiaria de una ayuda para contratos predoctorales para la formación de doctores del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad en la convocatoria de 2017, referencia BES-2017-080980.