Estudio del patrón de expresión de microRNAs en subtipos de leucemia aguda mieloblástica (LAM) poco frecuentes y análisis del valor pronóstico de microRNAas en LAM de riesgo citogenético intermedio

[spa] Estudios previos han demostrado que los miRNAs juegan un papel muy importante en infinidad de procesos celulares, y son imprescindibles para la correcta homeostasis celular. Su desregulación ha sido ampliamente descrita en cáncer. En este sentido algunos estudios han demostrado que la expresión de miRNAs puede definir entidades de forma más precisa que el estudio de expresión mediante microarrays de miles de RNAs. A partir de este fundamento en esta tesis llevamos a cabo la caracterización del perfil de expresión de miRNA en una amplia cohorte de pacientes con LMA diagnosticados y tratados en nuestro centro y en otros centros del grupo cooperativo CETLAM, correspondientes a una amplia diversidad de variedades citogenéticas y moleculares, con un doble objetivo: una mejor caracterización de los mecanismos biológicos subyacentes de algunas variedades biológicas, menos conocidas, y, por otra parte, el análisis del posible valor pronóstico del nivel de expresión de algunos miRNAs expresados en la enfermedad. Así, y como resultado de los estudios de esta tesis, obtuvimos la firma de miRNA distintiva de la LMA t(8;16). Por otra parte, en un segundo estudio, pudimos identificar algunos miRNA cuyo nivel de expresión proporcionaba información pronóstica adicional a las mutaciones de los genes más habitualmente analizados en la categoría de pacientes con riesgo citogenético intermedio. La leucemia mieloide aguda (LMA) con t(8;16)(p11;p13) (LMA t(8;16)) tiene un perfil clínico- biológico característico, pero su patrón de expresión de microRNAs es desconocido. En el presente trabajo hemos analizado 670 miRNAs maduros en 7 pacientes con LMA con t(8;16) y en 113 pacientes con otros subtipos de LMA, así como en tres controles CD34+ de donante sano. El análisis jerárquico de grupos (“Hierarchical cluster analysis”) demostró que todos los pacientes con LMA t(8;16) se agruparon en un grupo (“cluster”) independiente. Asimismo, el análisis supervisado reveló una firma distintiva de 94 miRNAs, la mayoría de los cuales estaban infraexpresados, entre los que se encontraban el miR-21 y el cluster miR-17-92. Con el objetivo de entender porqué miR-21 y el cluster miR-17-92 se encontraban infraexpresados en este subgrupo en comparación con el resto de grupos de LMA, se estudió la expresión de sus factores de transcripción STAT3 y c-Myc respectivamente. El análisis de expresión del RNAm de dos conocidos factores de transcripción de estos miRNAs (STAT3 y c-Myc) mostró una infraexpresión significativa de STAT3 (P=0.04). Por otra parte, el análisis bioinformático mostró que 29 de los miRNAs que estaban infraexpresados podrían estar regulados por metilación. Con el fin de comprobar si estos miRNAs podían estar regulados por metilación, tratamos una muestra de células primarias de LMA t(8;16) con 5-aza-2'-deoxycytidina (5-AZA-dC) y Tricostatin A (TSA) y encontramos que 27 miRNAs se reexpresaron después de dicho tratamiento. Sin embargo, no se encontraron diferencias en el estado de metilación entre las LMA con t(8;16) y los otros subtipos ni en metilación global, ni en metilación de promotores de miRNAs. Finalmente, se correlacionó la expresión de RNAm (de la que disponíamos de un estudio previo: Camós, Esteve et al; Cancer Res 2006) con la expresión de miRNAs para identificar posibles dianas reguladas por los miRNAs de la firma. La correlación entre la expresion de mRNA y la de miRNAs identificó RET como una potencial diana de tres de los miRNAs característicos de esta entidad. Mediante ensayo de Renilla-Luciferas y citometría de flujo tras la transfección con pre-miRNAs se confirmó que RET estaba regulado por los miRNAs de la firma miR-218, miR-128, miR-27b, miR-15a y miR-195. En conclusión, la LMA t(8;16) presenta una firma característica de miRNAs que está regulada parcialmente mediante mecanismos epigenéticos y que tienen como diana el protooncogén RET. La LMA es una enfermedad heterogénea cuyo tratamiento óptimo varía de acuerdo a los factores de riesgo citogenéticos y los marcadores moleculares. Varios estudios han demostrado la importancia pronóstica de los miRNAs en LMA. En este trabajo analizamos en una serie de 238 pacientes con LMA de riesgo citogenético intermedio (LMA-RI) que provienen de 16 instituciones que forman parte del grupo cooperativo CETLAM, la asociación entre la expresión de algunos miRNAs y el pronóstico clínico. En primer mediante el estudio de expresión de 670 miRNAs en un subgrupo de 85 pacientes de LMA-RI que provenían de una sola institución identificamos 10 miRNAs con valor pronóstico. Posteriormente validamos estos 10 miRNAs mediante ensayos individuales en toda la cohorte (n=288) confirmando el impacto pronóstico de 4 miRNAs. Niveles altos de miR-196b y miR-644 se asociaron de manera independiente con una supervivencia acortada y niveles bajos de miR-135a y miR-409-3p se asociaron con un mayor riesgo de recaída. De manera interesante miR-135a y miR-409-3p mantuvieron su valor pronóstico independiente dentro del subgrupo molecular de mal pronóstico (NPM1 no mutado y CEBPA no mutado y/o FLT3-ITD), y miR-644 mantuvo su valor pronóstico en el subgrupo molecular favorable. En conclusión, en el presente trabajo se han identificado 4 miRNAs con valor pronóstico en LMA-RI, y que además añaden información pronóstica adicional a los marcadores moleculares.
[eng] MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs (22–24 nucleotides in length) that have an important regulatory role in most biological processes, including development, regulation of cell proliferation and apoptosis, and stem cell self-renewal and differentiation. Moreover, their expression is altered in cancer, where they can function as both oncogenes and tumor suppressor genes. Several studies have shown the importance of microRNA (miRNA) deregulation in AML. Distinctive miRNA profiles have been identified correponding to specific cytogenetic subtypes. From the prognostic standpoint, some studies have identified several miRNAs associated with clinical outcome. Given the relevant regulatory role of miRNAs in hematopoiesis and their deregulated expression in hematological malignancies including AML, we have analyzed miRNAs expression in AML patients and we have performed two main studies. First, we have described a specific miRNA profile of t(8;16) AML subype and second the prognostic value of miRNAs in a large cohort of patients with IR-AML treated within the Spanish cooperative group CETLAM. Acute myeloid leukemia (AML) with t(8;16)(p11;p13) (t(8;16) AML) has unique clinico-biological characteristics, but its microRNA pattern is unknown. We analyzed 670 microRNAs in seven patients with t(8;16) AML and 113 with other AML subtypes. Hierarchical cluster analysis showed that all t(8;16) AML patients grouped in an independent cluster. Supervised analysis revealed a distinctive signature of 94-microRNAs, most of which were downregulated, including miR-21 and cluster miR-17-92. The mRNA expression analysis of two known transcription factors of these microRNAs (STAT3 and c-Myc, respectively) showed significant downregulation of STAT3 (P=0.04). A bioinformatic analysis showed that 29 of the downregulated microRNAs might be regulated by methylation; we treated a t(8;16) AML sample with 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AZA-dC) and trichostatin A and found that 27 microRNAs were re-expressed after treatment. However, there was no difference in methylation status between t(8;16) and other AML subtypes, either overall or in the microRNA promoter. Cross-correlation of mRNA and microRNA expression identified RET as a potential target of several microRNAs. A Renilla-luciferase assay and flow cytometry after transfection with pre-microRNAs confirmed that RET is regulated by miR-218, miR-128, miR-27b, miR-15a and miR-195. In conclusion, t(8;16) AML harbors a specific microRNA signature that is partially epigenetically regulated and targets RET proto-oncogene. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disease, and optimal treatment varies according to cytogenetic risk factors and molecular markers. Several studies have demonstrated the prognostic importance of microRNAs (miRNAs) in AML. Here we report a potential association between miRNA expression and clinical outcome in 238 intermediate-risk cytogenetic AML (IR-AML) patients from 16 institutions in the CETLAM cooperative group. We first profiled 670 miRNAs in a subset of 85 IR-AML patients from a single institution and identified 10 outcome-related miRNAs. We then validated these 10 miRNAs by individual assays in the total cohort and confirmed the prognostic impact of 4 miRNAs. High levels of miR-196b and miR-644 were independently associated with shorter overall survival, and low levels of miR-135a and miR-409-3p with a higher risk of relapse. Interestingly, miR-135a and miR-409-3p maintained their independent prognostic value within the unfavorable molecular subcategory (wild-type NPM1 and CEBPA and/or FLT3-ITD), and miR-644 retained its value within the favorable molecular subcategory. miR-409-3p, miR-135a, miR-196b and mir-644 arose as prognostic markers for IR-AML, both overall and within specific molecular subgroups.