Dinâmica do rizobioma na interação Pinus spp.- Fusarium circinatum: suscetibilidade do hospedeiro e priming

The rhizobiome (i.e. the rhizosphere microbiome) may play an important role in plant growth and defence against pathogens. Pitch canker, caused by the fungus Fusarium circinatum, infects a wide range of Pine species with different degrees of susceptibility, Pinus radiata is highly sensitive while Pinus pinea is resistant. To date, there are no suitable approaches available to control this threat, being associated with elevated economic losses to the forestry sector. Priming by chemical compounds such as phosphite, a priming agent with antifungal activity, is pointed as environmental-friendly approach to boost plant immune system. However, the relation between microbiome and host behaviour and priming was never studied in this pathosystem. Therefore, the aim of this study is to unveil the dynamics of the rhizobiome in Pinus spp. -F. circinatum interaction. Specific aims are to elucidate rhizobiome dynamics: 1) in a susceptible and in a resistant Pine species in response to F. circinatum inoculation; and 2) after phosphite application (foliarly or irrigation) in of the susceptible species. To attain these aims, two experiments were set up using 8 month-old Pinus seedlings of both species. Plants were artificially stem inoculated with 1x106 spores of the fungus. A non-inoculated control group was set up. The effect of phosphite (3%) was analyzed in P. radiata, testing two application modes (foliarly and irrigation) and included inoculated and noninoculated plants (control). For both experiments, plant symptoms were monitorized over time and sampled after 10 days, then physiological performance was assessed in needle by gasexchange parameters and antioxidant capacity. DNA was purified from the rhizosphere and used to evaluate the rhizobiome structure by 16S rRNA gene PCR-DGGE and massive parallel sequencing. The functional diversity of the community was inferred using the Piphillin software. When the two species were compared, visible symptoms were observed only in P. radiata, in parallel with significant alteration of gas-exchange parameters. Looking at species level, both rhizobiomes were significantly different, with a higher relative abundance of families known for their specific plant growth promoting traits (e.g. Nocardioidaceae, Burkholderiaceae, Xanthomonadaceae) in P. pinea. In P. pinea rhizobiome a higher abundance of genes related to the synthesis of monoterpenes, compounds with antimicrobial activity, was also estimated. However, F. circinatum inoculation had low impact on both species rhizobiome. Yet in P. radiata a higher abundance of Kofleriaceae, a family associated with plant necrotic tissues was evident after inoculation. The use of phosphite resulted in a priming effect resulting in a clear reduction in of symptomatic plants after 10 days, particularly when applied by irrigation (30%) in comparison to foliar application mode (50%). Moreover, a slight alleviation of the negative impacts on gas exchange parameters comparing to non- priming inoculated plants were observed. At rhizobiome level, phosphite significantly affected the abundance of several families, especially when applied through irrigation. This response is probably related to soil pH decrease, selecting bacteria adapted to acidic soils such as Acidimicrobiaceae, while Polyangiaceae abundance may be related to an increase in phosphorus bioavailability. In conclusion, our study compared for the first time the P. radiata and P. pinea rhizobiome, detecting significant differences that may play a role in the differential host susceptibility to F. circinatum infection. Despite the observed priming effect of phosphite, the strong impact on the plants’ rhizobiome may has further implications on plant development, which deserve further investigation. O rizobioma (i.e. o microbioma da rizosfera) tem um papel importante no crescimento da planta e na sua defesa contra agentes patogénicos. O cancro resinoso, causado pelo fungo Fusarium circinatum, afeta várias espécies de pinheiro. Estas têm diferentes graus de suscetibilidade à doença, desde Pinus radiata que é mais suscetível a Pinus pinea que é resistente. Esta doença está associada a elevadas perdas económicas no setor florestal, não tendo ainda sido identificadas estratégias eficazes para o seu controlo. O priming é um método ecológico que permite melhorar as defesas da planta. O fosfito tem sido usado com este fim, apresentando atividade antifúngica. No entanto, a interação do rizobioma, hospedeiro e priming nunca foi estudada neste patossistema. O principal objetivo deste trabalho é elucidar a dinâmica do rizobioma na interação entre Pinus spp. e F. circinatum. Os objetivos específicos são: 1) elucidar a dinâmica do rizobioma numa espécie de pinheiro suscetível e numa espécie resistente em resposta à inoculação de F. circinatum; 2) avaliar o impacto do fosfito e do seu modo de aplicação (foliar e rega) no rizobioma de uma espécie sensível. Para atingir estes objetivos, foram efetuadas duas experiências com plântulas de pinheiro com 8 meses de ambas as espécies (P. radiata e P. pinea). As plantas foram inoculadas artificialmente no caule com 1x106 esporos do fungo. Plantas não inoculadas constituíram o grupo controlo. O efeito do fosfito (3%) foi analisado em P. radiata, testando dois modos de aplicação (foliar e rega), assim como a resposta de plantas inoculadas e não inoculadas. Para ambas as experiências, as plantas foram monitorizadas e amostradas após 10 dias. No momento da amostragem a performance das plantas foi analisada, usando parâmetros fisiológicos, de trocas gasosas e capacidade antioxidante. O ADN foi purificado da rizosfera e foi utilizado para avaliar a estrutura do rizobioma através de PCR-DGGE e sequenciação massiva paralela do gene 16S rRNA. A diversidade funcional foi inferida usando o software Piphillin. Comparando as duas espécies, apenas P. radiata demonstrou sintomas visíveis, assim como alterações significativas de parâmetros relacionados com trocas gasosas. Os rizobiomas das duas espécies revelaram ser significativamente diferentes. No rizobioma de P. pinea verificou-se uma maior abundância relativa de bactérias de famílias com funções específicas de promoção de crescimento em plantas (ex: Nocardioidaceae, Burkholderiaceae, Xanthomonadaceae). Para este rizobioma também foi estimada uma maior abundância de genes relacionados com a produção de monoterpenos, compostos com atividade antimicrobiana. A inoculação com F. circinatum teve um baixo impacto no rizobioma de ambas as espécies. Contudo, em P. radiata verificou-se uma maior abundância de Kofleriaceae após inoculação. Esta família tem sido associada a tecidos necróticos vegetais. A utilização de fosfito resultou numa redução de plantas sintomáticas após 10 dias, sendo esta redução mais evidente quando o fosfito foi aplicado por irrigação (30% de plantas sintomáticas) em comparação com a aplicação foliar (50%). Este efeito verificou-se também nos parâmetros de trocas gasosas, embora pouco acentuado. Em termos do rizobioma, o fosfito alterou significativamente a abundância de diversas famílias, especialmente quando foi aplicado por irrigação. Esta resposta parece estar relacionada com o decréscimo do pH do solo, que seleciona bactérias adaptadas a solos mais ácidos, como Acidimicrobiaceae, ou com o aumento da biodisponibilidade de fósforo que seleciona famílias adaptadas a essa condição como Polyangiaceae. Em suma, este trabalho compara pela primeira vez a composição do rizobioma de P. pinea e P. radiata, tendo sido detetadas diferenças significantes que podem ter um papel importante na suscetibilidade destas espécies à infeção por F. circinatum. Apesar do fosfito ter um efeito de priming, o impacto deste composto no rizobioma pode ter implicações no desenvolvimento da planta, o que deve ser investigado. Apoio financeiro da FCT e do FEDER através do programa COMPETE no âmbito do projeto de investigação “URGENTpine: UnRaveling hostpathoGEn iNteracTions in pine pitch canker disease” (PTDC/AGRFOR/2768/2014; POCI-01-0145-FEDER-016785). Mestrado em Microbiologia