Meccanismi cellulari e molecolari del processo di tumorigenesi indotto da Virus del Papilloma umano

La relazione di causalità tra carcinoma squamoso della cervice uterina (SCC) e infezione da Virus del Papilloma umano (HPV) mucosali ad alto rischio è ampiamente riconosciuta, mentre in letteratura sono presenti dati contrastanti sulla possibile associazione tra alcuni genotipi di HPV cutanei e lo sviluppo di tumori cutanei di tipo non-melanoma (NMSC). Il progetto di ricerca della tesi è incentrato sullo studio delle capacità trasformanti di HPV, analizzate in un sistema cellulare funzionale ad evidenziare i differenti meccanismi in grado di indurre la tumorigenesi dipendente da genotipi diversi di HPV. Sono stati utilizzati cheratinociti umani trasformati dalle proteine E6 ed E7 di HPV mucosale ad alto rischio di tipo 16 (K16) e cheratinociti umani immortalizzati dalle proteine E6 ed E7 di HPV cutaneo di tipo 38 (K38). L’attività trasformante di E6 ed E7 di entrambi i genotipi di HPV coinvolge principalmente l’inibizione dei soppressori tumorali p53 e pRb con alcune differenze sostanziali che riguardano soprattutto la proteina E6. Infatti, mentre le proteine E7 di HPV16 e HPV38 inibiscono l’attività del soppressore tumorale pRb con un simile meccanismo di azione, l’effetto di E6 dei due diversi genotipi su p53 è molto differente. L’oncoproteina E6 di HPV16 lega p53 promuovendone la degradazione; invece E6 di HPV38, agendo insieme a E7 con meccanismi ancora poco noti, modifica l’attività transattivante di p53 favorendo l’accumulo del suo inibitore ΔNp73 e la conseguente down-regolazione dell’attivazione trascrizionale dei geni target di p53 coinvolti nell’inibizione della proliferazione cellulare. È stato inoltre descritto che la proteina oncogena E7 di HPV16 attiva il fattore di trascrizione κB (NF-κB), implicato nell’attivazione di una serie di geni necessari per la sopravvivenza della cellula. Recenti evidenze, inoltre, indicano che E6 ed E7 agiscono anche su ulteriori meccanismi cellulari regolatori dell’espressione genica quali i microRNA (miRNA). Il coinvolgimento di quest’ultimo meccanismo di regolazione dell’espressione genica nella tumorigenesi associata a HPV è stato valutato utilizzando un approccio di tipo “high throughput” attraverso l’analisi del miRNoma espresso dalle K16 e K38 comparate ai cheratinociti di controllo. Sono stati così identificati miRNA deregolati sia nelle K16 che nelle K38. Saggi specifici eseguiti tramite Real-Time RT-PCR hanno permesso di confermare la deregolazione di un gruppo significativo di miRNA in entrambi i tipi di cheratinociti. Poiché studi precedenti effettuati nel laboratorio hanno dimostrato che l’Interferone (IFN) di tipo I inibisce la proliferazione di linee cellulari di SCC HPV-positive e dei cheratinociti K16 e K38 (Chiantore et al., 2012, Vannucchi et al., 2000, Vannucchi et al., 2005), è stato valutato l’effetto del trattamento di IFN sull’espressione dei miRNA nei cheratinociti E6/E7-trasdotti. L’IFN-β sembra essere in grado di riportare l’espressione di alcuni miRNA deregolati ad un livello simile a quello dei cheratinociti di controllo. L’analisi dei target dei miRNA identificati, tuttora in corso, permetterà di approfondire i meccanismi coinvolti nella deregolazione della proliferazione indotta dalle oncoproteine di HPV e nell’azione antitumorale svolta dall’IFN. 3 E’ stata anche valutata la risposta antitumorale dell’ospite alle cellule HPV-trasformate esaminando la possibilità di indurre in vitro la risposta di linfociti T citotossici (CTL) E6/E7 specifici attraverso l’uso di cellule presentanti l’antigene (APC), quali le cellule dendritiche (DC) o le cellule di Langerhans (LC), differenziate in vitro da monociti umani trattati con GM-CSF+IL-4 o GM-CSF+IL-4+TGF-β, rispettivamente. Le APC sono state poi pulsate con cheratinociti E6/E7-trasdotti necrotici e/o apoptotici. È stato definito il protocollo di priming in vitro valutando la citotossicità dei CTL specifici per E6 ed E7 e MHC-I ristretti, sulla base della diversa capacità d’internalizzazione, del grado di maturazione e del microambiente extracellulare delle APC pulsate. I saggi di citotossicità hanno mostrato che la percentuale maggiore di killing specifico è stata ottenuta stimolando i CTL con LC incubate con frammenti cellulari necrotici ed in presenza di siero umano, indicando che una corretta maturazione delle APC risulta essere importante per l’induzione della risposta immunitaria cellulare. Inoltre, poiché è stato riportato che miRNA specifici sono coinvolti nei pathways di maturazione delle APC (Turner et al., 2011, Jurkin et al., 2010), sono stati analizzati i livelli di espressione di alcuni miRNA selezionati nelle DC e LC utilizzate nello studio. Particolare attenzione è stata focalizzata sui miR-146a e miR-21 attivati dal pathway NF-κB e sul miR-98 associato alla regolazione del differenziamento cellulare e della risposta infiammatoria. I diversi livelli di espressione dei miRNA sono stati valutati nelle APC incubate con frammenti necrotici ottenuti da cellule K16 e K38 e in quelle stimolate con lipopolisaccaride batterico (LPS), rispetto alle APC immature. I dati ottenuti hanno mostrato un’over-espressione del miR-146a in tutte le combinazioni di stimolazione per le LC, mentre il miR-98 è risultato over-espresso solo nelle LC stimolate con K38 necrotiche. La ricerca dei target è stata al momento focalizzata sul miR-98, i cui target validati sono HMGA2 (high mobility group AT- hook 2) e HNRNPP2 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 2) mentre tra i target putativi è presente il recettore 1 per il transforming growth factor-beta (TGF-βR1) la cui funzione potrebbe essere correlata alla maturazione delle LC. I risultati ottenuti mostrano differenze nei pattern di espressione dei miRNA nei cheratinociti immortalizzati dalle proteine E6 ed E7 di HPV di tipo mucosale e cutaneo e indicano che l’IFN-β può esercitare la sua azione antiproliferativa in cellule tumorali HPV-trasformate, anche attraverso meccanismi di regolazione dell’espressione genica da miRNA. Inoltre si individuano le LC come le APC più appropriate nel produrre CTL E6/E7 specifici con un maggiore tasso di killing e indicano che la maturazione delle LC sia dipendente dai differenti cheratinociti E6/E7-trasdotti, quindi dalla capacità oncogena delle proteine dello specifico genotipo di HPV.