Administración tópica de lactonas macrocíclicas antiparasitarias en caninos : caracterización del proceso de permeación percutánea in vitro e in vivo

Las principales rutas de administración de los fármacos utilizados en medicina veterinaria son la vía oral (PO), la intramuscular(IM), la subcutánea (SC) y la intravenosa (IV). Aun así, la administración tópica cutánea ha adquirido gran aceptación, particularmente para lograr un efecto local en diferentes regiones anatómicas de la piel, lo cual ya es una práctica común en medicina humana y, cada vez más frecuente, en veterinaria. Sin embargo, durante la última década, se han logrado grandes avances en la formulación y en el uso de la administración tópica cutánea (pour-on, spot-on,spray) de diferentes fármacos con el objetivo de lograr una absorción transdermal y, así, un efecto terapéutico sistémico. En este sentido, cabe destacar que cualquier sustancia aplicada sobre la piel tiene la potencialidad de ser absorbida, teniendo siempre en consideración que la capacidad de penetrar y atravesar la barrera cutánea dependerá de factores inherentes a la piel, a la formulación y a los fármacos. El presente trabajo de tesis doctoral es de índole farmacológico, aunque sus resultados tienen una alta relación con aspectos del tratamiento antiparasitario en caninos. Como resultado de la experiencia adquirida en nuestro lugar de trabajo y de la búsqueda bibliográfica realizada, este trabajo de tesis se basa en la postulación de la siguiente hipótesis general de trabajo: La relación entre las características fisiológicas de la piel (fisiología cutánea) y las propiedades físico-químicas del fármaco administrado tópicamente afecta el proceso de absorción percutánea de lactonas macrocíclicas. El desarrollo y la validación de las metodologías para la extracción físico-química e identificación y cuantificación cromatográfica de las moléculas endectocidas bajo estudio en las diferentes matrices fue un aspecto importante para el desarrollo del presente trabajo de tesis. A partir de un método altamente sensible, como es la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), se logró determinar las concentraciones de moxidectin (MXD) y doramectina (DRM) en las matrices estudiadas. Los resultados obtenidos de las validaciones aseguran que los métodos de extracción y de cuantificación por HPLC sean analíticamente adecuados para detectar y cuantificar MXD y DRM en plasma canino y medio receptor (in vitro) desde concentraciones iguales o superiores a 0,1 ng/ml. Con el propósito de caracterizar profundamente el comportamiento de estas moléculas en caninos, se propuso estudiar la farmacocinética de las vías endovenosa, oral y tópica cutánea. Para ello, se utilizaron seis (6) caninos clínicamente sanos, de raza Beagle, cuatro (4) hembras y dos (2) machos, entre 9,8 y 15,5 kg de peso y entre 12 y 36 meses de edad. Los animales se encontraban alojados en la sección caniles de la Facultad de Ciencias Veterinarias de Universidad de Buenos Aires (FCV-UBA) bajo estrictas normas de bienestar animal. Los resultados obtenidos reflejaron el comportamiento esperable para cada una de las vías, pero con algunas características particulares. Tanto el MXD como la DRM fueron administrados de manera endovenosa, con éxito, con el objetivo de eliminar la influencia del proceso de absorción a las disposiciones de los fármacos. Esto permitió caracterizar con mayor certeza el comportamiento de la absorción de las otras vías bajo estudio. En este sentido, para el MXD, observamos que la biodisponibilidad luego de la administración oral fue superior al 100%. Si bien es teóricamente imposible encontrar una biodisponibilidad mayor a la endovenosa (100%), se pueden hipotetizar algunas explicaciones basadas en las características del fármaco. Para la vía tópica en particular, detectamos un tiempo de absorción prolongado, esto puede observarse no sólo por los casi 10 días requeridos para alcanzar la concentración máxima (Tmax),sino también en los casi 13 días de tiempo medio de absorción (TMA), lo que demuestra la presencia de grandes obstáculos, al ser aplicado sobre la piel, para poder alcanzar la circulación sistémica. Con un comportamiento similar, del análisis comparativo de la DRM por las tres vías, puede verse que la fase de absorción tras la administración tópica difiere significativamente de la correspondiente a la administración oral. Estas diferencias están claramente demostradas por los parámetros farmacocinéticos que caracterizan la absorción, donde el TMA obtenido es significativamente mayor para la vía tópica en comparación con la oral (6,3 ± 2,6 y 1,3 ± 1,9 días, respectivamente). Asimismo, también puede observarse que las diferencias entre los valores del Cl de la administración tópica son estadísticamente significativas cuando se comparan con los valores de Cl de las administraciones endovenosa y oral. Cuando comparamos los perfiles entre ambas drogas, puede verse que el MXD presenta una mayor velocidad de absorción que la DRM, tanto por la vía tópica (0,6 ± 0,4 d y 1,1 ± 0,8 d, respectivamente) como por la oral (0,05 ± 0,02 d y 0,06 ± 0,02 d, respectivamente). Para la vía oral se destaca que, mientras que la DRM no logra alcanzar el 85% de absorción de la dosis, el MXD supera ampliamente el 100%. Esto puede explicarse por las magnitudes de los procesos de distribución y de re-distribución que presenta dicho fármaco. La rápida y total absorción de la dosis oral permite que haya en una fracción corta de tiempo una gran cantidad plasmática de fármaco disponible para distribuirse a los tejidos (Vss 8,2 ± 1,3 L y 1,9 ± 0,4 L para el MXD y la DRM, respectivamente). Esta gran distribución, junto, en parte, con una recirculación entero-hepática, en la cual podría tener una importante participación la actividad de la glucoproteína P (Ward et al., 2004a; 2004b; Lespine et al., 2012), determina que, al iniciarse la fase franca de eliminación, ocurra un fenómeno de re-distribución de una gran magnitud. De los resultados obtenidos y de lo expuesto anteriormente, es importante destacar que la vía tópica demuestra ser beneficiosa en muchos aspectos técnicos, pero requiere de un trabajo farmacotécnico mayor (como ocurre en medicina humana) para lograr una mejor permeación a través de los estratos de la piel y, como consecuencia, alcanzar concentraciones más altas en la circulación sistémica y obtener así mayor eficacia clínica. Para ahondar aún más en el estudio de absorción tópica en piel, se trabajó en un modelo in vitro con cámaras de Franz modificadas. La comparación de las permeaciones cutáneas de ambos fármacos arrojó diferencias estadísticamente significativas en la mayoría de los parámetros estudiados. Así, el flujo de la DRM fue significativamente mayor que el del MXD. Lo mismo ocurrió con el coeficiente de permeación aparente y con el porcentaje de fármaco permeado. Tal como se ha visto en experiencias previas en nuestro Laboratorio, el pasaje de fármacos a través de las capas superficiales de la piel es un proceso dificultoso, lo cual se evidencia claramente, en estos estudios, por las bajas cantidades totales acumuladas en el medio receptor en relación a la dosis total aplicada (aproximadamente 0,01%). Más allá de la originalidad de los datos generados, también se tuvo como objetivo la construcción de un modelo predictor utilizando y combinando la información de ambas fases experimentales, in vivo e in vitro. Para ello, se realizó un análisis de correlación in vivo-in vitro (CIVIV). Así, la presente tesis doctoral presenta alternativas que, con los datos propios generados, ha alcanzado un nivel aceptable de predicción del comportamiento de los fármacos estudiados en los animales experimentales. Esta metodología aún requiere mayores estudios y ser desafiada en distintas pruebas en diferentes escenarios en búsqueda de una mayor robustez. Fil: Nejamkin, Pablo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Sallovitz, Juan Manuel. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Albarellos, Gabriela A. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. In veterinary medicine, the main routes of drug administration are orally (PO), intramuscularly (IM), subcutaneously (SC) and intravenously (IV). Even though, skin topical administration has recently gained great acceptance, especially when looking for a local effect in different anatomical regions. This a common practice in human medicine and is becoming more frequent in veterinary medicine. However, during the last decade, great advancements have been achieved in formulating different drugs for their topical administration (pour-on, spot-on, spray) aiming to a systemic therapeutic effect. It is noteworthy that any drug, when administered on the skin, has the potential to be absorbed, depending on its capability of penetrating into and pass through the skin layers. This will depend on many factors related to the skin, the formulation and the drug. In spite of the present thesis work is mainly pharmacological, its results can be related to many aspects of antiparasitic treatment in dogs. As a result of our own experience and works of other authors, this thesis work is based on the following hypothesis: After their topical administration, the interactions between physiological characteristics of canine skin and physico-chemical properties of the antiparasitic macrocyclic lactones effect the cutaneous absorption process. The development and validation of the analytical chromatographic methods for quantification of the endectocides molecules under study were an important feature of the thesis work. This sensitive and reliable method allowed to determine moxidectin (MXD) and doramectin (DRM) concentrations of or higher than 0.1 ng/mL in the different matrices studied (plasma and receptor medium) in vivo and in vitro. In order to thoroughly characterize the pharmacological behavior of these molecules in canines, the pharmacokinetics after their intravenous, oral and topical administration were studied. Six clinically sound Beagle dogs, 4 females and 2 males, of 9.8-15.5 kg of bogy weight and between 12- to 16-month-old were used. Animals were housed at the small animal facilities of the Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de Buenos Aires. Animals’ health and welfare were monitored along the whole experimental period. Observed results showed pharmacokinetic profiles as expected; however, there were unexpected own features. Both MXD and DRM were successfully intravenously administered in order to characterize drugs’ disposition avoiding biases due to the absorption process. In turn, the observed pure drug disposition allowed to confidently characterize the absorption processes of each of the other two routes of administration (oral and topical). Hence, MXD showed an oral bioavailability in excess of 100%, that is not possible, since only after the intravenous administration a plasma bioavailability of 100% can be reached. Many causes can be responsible of this, such as artifactual and non-stationary or non-lineal pharmacokinetics. However, a more plausible explanation is the role played by transportermediated elimination and absorption processes, which are a characteristic of the antiparasitic macrocyclic lactones. As to the topical administration, a prolonged absorption time was observed (Tmax = 10 days; MAT = 13 days), which suggests that passage through the skin to reach the systemic circulation is a difficult process. Similarly, when comparing oral and topical absorption of DRM, significant differences can be observed. These differences clearly demonstrated by the pharmacokinetic parameters of absorption (TMA 6.3 ± 2.6 y 1.3 ± 1.9 for the topical and oral administration, respectively). When comparing both drugs, MXD presents a faster absorption compared to DRM both after topical (t½ab 0.6 ± 0.4 days and 1.1 ± 0.8 days, respectively) as well after the oral administration (0.05 ± 0.02 days and 0.06 ± 0.02 days, respectively). The oral availability showed marked differences, hence, while DRM oral bioavailability reached to 85%, MXD largely exceeded 100%. The latter case can be explained by an extremely rapid drug absorption, determining high amounts of drug available for distribution, re-distribution and saturation of transporter-mediated elimination. A higher distribution was observed for MXD compared to DRM (Vss 8.2 ± 1.3 L/kg and 1.9 ± 0.4 L/kg para el MXD y la DRM, respectively). Thus, a large distribution along with a saturated elimination and, possibly, increased reabsorption (entero-hepatic circulation) could have determined that, when elimination begun, a huge re-distribution and/or re-absorption took place at the same time. Albeit the topical administration presents many benefits, it needs more pharmacotechnical work (as done in human medicine) in order to achieve a better and more controlled percutaneous permeation and, hence, achieve more predictable plasma concentration profiles and efficacies. To further characterize topical absorption, an in vitro model was developed by utilizing the Franz diffusion cell technique. As with previous experiences in our laboratory, drug passage through the superficial skin layers (particularly, the stratum corneus) is a difficult process and was evidenced for both drugs by the low percentages of permeation observed (approximately 0.01%). The comparison of the in vitro percutaneous absorption of both drugs showed statistically significant differences. DRM flux was higher than MXD flux, as well as the apparent permeation coefficient and the percentage of drug permeated. Although the low skin permeation observed in the in vitro models, this technique has a great potential for the veterinary pharmaceutical industries in the development and testing of topical formulations. Data generated by the present work are quite original, nevertheless, another objective was the development of a mathematical model by combining both in vitro and in vivo data by the convolution technique to predict in vivo plasma profile from in vitro data. An in vivo-in vitro correlation analysis was performed for both drugs. Even though an acceptable predictive level was achieved, further work is needed and predicted profiles have to be challenged under different scenarios.