Pyrrethroid resistance in Varroa destructor: Investigating the role of mutations in the voltage-gated sodium channel

Entre les majors amenaces de l'apicultura contemporània es troba el parasitisme de Varroa destructor, Anderson & Trueman (Acari: Varroidae). Aquest àcar ectoparàsit altament especialitzat s'alimenta directament de les pupes i els adults de l'abella mel·lífera europea, Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae), la qual cosa debilita greument a les abelles i les indueix una immunosupressió que desemboca en brots d'infeccions preexistents o vectorizades pels àcars que comprometen la viabilitat de les colònies. El control dels àcars V. destructor es un problema agreujat pel limitat número de tractaments de control disponibles i l'evolució de la resistència a aquests en les poblacions d'àcars. Encara que es disposa de tractaments alternatius no sintètics, la seua eficàcia és variable, ja que els resultats es veuen afectats per factors externs, com les condicions climàtiques, les del rusc i l'aplicació del producte. El desenvolupament d'acaricides sintètics basats en nous ingredients actius és cada vegada més difícil i costós, per la qual cosa sembla poc probable que es puguen comercialitzar nous acaricides eficaços front a V. destructor en un futur pròxim. Per tant, ara cal centrar-se en mantindre l'eficàcia dels acaricides actuals durant el major temps possible; però això es veu amenaçat per l'evolució de la resistència. Per a desenvolupar mesures eficaces de gestió de la resistència a aquests productes, és essencial comprendre el mecanisme molecular subjacent a la resistència en V. destructor, així com els factors dinàmics que influeixen en la incidència dels al·lels de resistència en les poblacions. D'aquesta manera, es pot abordar la amenaça del parasitisme de V. destructor en el context específic del moment, evitant el fracàs del tractament i minimitzant l'aparició de futurs esdeveniments de resistència. En aquesta tesi, hem evidenciat la implicació de les mutacions en la posició 925 del canal de sodi de V. destructor en la resistència als piretroides (capítol 1). Els resultats del nostre seguiment han revelat que, encara que amb una incidència variable, tant els al·lels resistents L925I com L925M estan molt estesos per tot els Estats Units d’Amèrica, sent la causa més probable de la baixa eficàcia del tractament amb piretroides al país (capítol 3). A més, hem trobat per primera vegada la substitució M918L en els àcars V. destructor, associada també amb resistència als piretroides en altres espècies (capítol 2). Els anàlisis filogenètiques donen suport a l'origen únic de cada mutació de tipus kdr en el VGSC de V. destructor, a més d’una estreta relació entre els al·lels L925M i L925I (capítol 2). També hem desenvolupat un mètode de detecció dels al·lels mutants de 925 senzill i assequible basat en una PCR-RFLP que pot adaptar-se com a assaig de rutina en qualsevol laboratori (capítol 4). Conèixer l'eficàcia esperada d'un producte abans de aplicar-lo milloraria sens dubte el resultat en el control de V. destructor en els ruscos a curt termini. De la mateixa manera, disposar d'aquesta informació reduiria els tractaments acaricides innecessaris. Al mateix temps, es minimitzaria la seua acumulació en les matrius dels ruscos, i també es reduiria la probabilitat de que es desenvolupessin noves mutacions resistents en una població d'àcars. A més, un seguiment regular permetrà detectar les fluctuacions dels al·lels resistents i actuar en conseqüència, per exemple, programant un període sense piretroides quan aquests no vagin a ser eficaços. La detecció precisa dels àcars resistents abans del tractament obri una finestra per a una estratègia de gestió de la resistència, dirigida a aconseguir un control suficient de l'àcar; al mateix temps que es protegeix l'eficàcia dels piretroides durant el màxim temps possible. La finalitat d'aquest treball és el d'aportar coneixement sobre les implicacions que aquestes mutacions en la resistència a piretroides en V. destructor, la seua relació evolutiva i la situació actual de distribució. Aquest coneixement pot ajudar a assentar unes bases necessàries per al desenvolupament d'un protocol basat en el Control Integrat de Plagues. One of the largest challenges facing beekeepers today is controlling Varroa destructor mites, a problem exacerbated by the limited number of control products available and the evolution of resistance in mite populations. Pyrethroid compounds have been among the most common treatments for controlling Varroa, strongly used over many generations, even after resistance evolved in the mid 1990s. The mechanism of resistance to pyrethroids in V. destructor has been associated with amino acid substitutions in the voltage-gated sodium channel (VGSC), the target protein of pyrethroids. In particular, the mutations found associated with resistance to pyrethroids are substitutions at position 925 of the VGSC (numbered after the housefly para-type sodium channel protein). To date, three different resistant alleles have been described at this position, replacing wild-type Leucine by Valine (L925V), Isoleucine (L925I) or Methionine (L925M). These three resistant alleles are found in different mite populations worldwide, showing certain geographical distribution, with the L925V mutation found in European mite populations, while L925I and L925M were first detected in some hives in the Southeastern USA. In this thesis, we have evidenced the implication of these mutations in the resistance to pyrethroids in V. destructor, by electrophysiological and pharmacological characterization of the wild-type and 925-mutant VGSC. Our study on the distribution of these mutations in the USA territory, have revealed that, although with varying incidence, both L925I and L925M resistant alleles are widespread throughout the USA, being the most plausible cause of pyrethroid treatment failure in the country. In addition, we have found for the first time in V. destructor the M918L substitution, associated with pyrethroid resistance in other arthropod species, in mites collected from apiaries in Spain. Phylogenetic analyses of the gene region linked to position 925 of the V. destructor VGSC revealed a single origin for each resistant mutation and a close relationship between the L925M and L925I alleles. We also developed a simple and affordable detection method of 925-mutant alleles based on PCR-RFLP that can be adapted as a routine assay in any laboratory. Accurate pre-treatment detection of resistant mites opens a window for a resistance management strategy aimed at achieving sufficient control of the mite while protecting the efficacy of pyrethroids for the longest possible time. Knowing the expected efficacy of a product beforehand would undoubtedly improve the outcome of Varroa control in the short term. In the same way, having such information would cut down on unnecessary acaricide treatments. Therefore, they minimise their accumulation in hive matrixes, and also reduce the likelihood of new resistant mutations developing in a mite population. In addition, regular monitoring will allow the detection of fluctuations in resistant alleles and allow us to act accordingly, e.g., by scheduling a pyrethroid-free period when pyrethroids become less effective. The intention of this research study was to shed light on the implications of these mutations on pyrethroid resistance, their evolutive relationship, and present status, with the eventual purpose of establishing some basic keystones to develop an effective Integrated Pest Management (IPM) approach. Integrated Pest Management is considered by experts to be the most successful and environmentally friendly approach to deal with arthropod pests. It integrates the use of chemical pesticides in combination with better cultural and biological techniques, minimizing the management impact on the environment. In an IPM approach, pesticide treatments only shall be applied when pest damage suppose an economic loss for the beekeeper, following a phased treatment plan according to need.