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Edición génica del gen SERPINA1 mediante el uso de CRISPR/Cas9 en células sanguíneas de pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina
- Source :
- RODERIC. Repositorio Institucional de la Universitat de Valéncia, instname
- Publication Year :
- 2022
-
Abstract
- Introducción. El déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) es una enfermedad rara caracterizada por niveles bajos en sangre de una proteína denominada alfa-1 antitripsina (AAT), principal enzima antiproteasa del suero. El DAAT está provocado por mutaciones en el gen SERPINA1, que codifica para la AAT. Las dos mutaciones más frecuentes se denominan Pi*Z y Pi*S, provocando la primera una sintomatología más grave. A la variante normal se le denomina Pi*M. CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición génica adaptada del sistema de inmunidad adquirida presente en bacterias y arqueas que consiste en una endonucleasa, Cas9, guiada por una molécula de RNA simple (sgRNA), complementaria al gen diana. Objetivos. Generar una línea celular estable mediante inmortalización de células procedentes de pacientes con DAAT. Editar la mutación Pi*Z del gen SERPINA1 primero en líneas celulares establecidas y finalmente, en la línea celular de DAAT generada. Metodología. Para la inmortalización de líneas celulares se realizaron tanto infecciones virales como transfecciones no virales para inducir la expresión del antígeno T grande de SV40, la subunidad catalítica de la telomerasa humana o la quinasa 4 dependiente de ciclina en monocitos primarios. Finalmente, se procedió a la inmortalización de linfocitos B de pacientes mediante infección con el virus de Epstein-Barr. Las líneas celulares obtenidas se caracterizaron mediante el ensayo de expresión génica del gen SERPINA1 y la determinación del número de copias del gen por qPCR, el genotipado mediante secuenciación Sanger y la detección de la proteína AAT en los lisados celulares mediante Western Blot. Para la edición de la mutación Pi*Z se diseñaron tres sgRNA que fueron testadas inicialmente en la línea celular HEK293. Posteriormente, se transfectaron monocitos primarios y macrófagos derivados de monocitos y, por último, los linfocitos B inmortalizados. Para las transfecciones se utilizaron ribonucleoproteínas formadas por la Cas9 y las sgRNA que se introdujeron en las células mediante la formación de lipoplejos y electroporación. Para validar las sgRNA se utilizó el ensayo de la endonucleasa T7. Resultados. La inmortalización de monocitos primarios no fue posible con ninguno de los métodos probados, aunque se producían alteraciones del cultivo, no se mantuvo la proliferación del mismo durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, la inmortalización de linfocitos B dio lugar a cuatro líneas de genotipo: Pi*MM, Pi*MS, Pi*SS y Pi*MZ. La expresión de AAT en estas líneas se pudo detectar tanto a nivel de transcripción mediante qPCR como de síntesis proteica mediante Western Blot. Se comprobó que el porceso de transformación no había alterano ni el número de copias del gen ni el genotipo de los donantes. El ensayo de la endonucleasa T7 permitió detectar que las sgRNA diseñadas fueron capaces de editar de forma no homóloga la mutación Pi*Z tanto en la línea HEK293 como en monocitos primarios y macrófagos derivados de monocitos y en los linfocitos B inmortalizados. Conclusiones. Se han generado cuatro líneas de linfocitos B con diferentes fenotipos del DAAT y se ha descrito por primera vez que estas células son productoras de AAT. El sistema CRISPR/Cas9 con las sgRNA diseñadas ha sido capaz de editar de forma no homóloga la mutación Pi*Z del gen SERPINA1 tanto en la línea celular HEK293, como en monocitos primarios, macrófagos derivados de monocitos y linfocitos B inmortalizados. Introduction. Alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) is a rare disease characterized by diminished plasmatic levels of the protein called alpha-1 antitrypsin (AAT), the main circulating antiprotease enzyme. It is related to respiratory and hepatic symptoms. AATD is caused by mutations in the SERPINA1 gene, located on the 14th chromosome, which codifies for AAT protein. The most frequent mutations are single nucleotide polymorphisms, they are named Pi*Z and Pi*S. Pi*Z mutation is related to more severe symptomatology than the Pi*S mutation. The functional variant of the gene is called Pi*M. CRISPR/Cas9 is a genome editing tool developed from an immune system of archaea and bacteria. It is based on an endonuclease enzyme, Cas9, and a single guide RNA molecule (sgRNA), complementary to the target gene. Objectives. Two main objectives have been established. To generate a cellular stable line through immortalization of AATD patients’ cells (1). To edit Pi*Z SERPINA1 gene mutation by CRISPR/Cas9 gene editing tool, first in cell lines and then, in the generated AATD cell line (2). Methods. In order to immortalize a primary AATD cell line, both viral and non-viral transfection methods were used trying to induce in human primary monocytes the expression of SV40 large T antigen, human telomerase reverse transcriptase (hTERT), and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4). Finally, B-cells transformation with Epstein-Barr virus was performed with peripheral blood samples from AATD patients. Obtained cell lines were characterized regarding SERPINA1 gene expression and copy number assay by quantitative PCR, genotyping by Sanger sequencing, and AAT production by denaturing western blotting. Aiming to edit Pi*Z mutation, three sgRNA were designed and synthesized in vitro. Lipofectamine and nucleofection were used as non-viral vectors to introduce CRISPR/Cas9 system. Different cell lines were transfected with ribonucleoprotein complexes, formed by the Cas9 endonuclease and the sgRNA. First of all, the sgRNAs were tested in the Hek293 cell line, afterward, in primary monocytes, monocyte-derived macrophages, and finally in the generated immortalized B-cell lines. To validate the designed sgRNA, the T7 endonuclease assay was performed after 72-hour incubation. Results. None of the different methods used to immortalize human primary monocytes were successful. Despite the fact that culture alterations were detected, proliferation was not maintained for long periods of time. However, B-cell immortalization results in four different stable cell lines with the following genotypes: Pi*MM, Pi*MS, Pi*SS y Pi*MZ. AAT expression in these cell lines was detected both at mRNA and protein levels. It was confirmed that the transformation process did not affect the gene copy number and donor genotype. T7 endonuclease assay allowed to detect SERPINA1 gene non-homologous edition using the designed sgRNA in the different tested cell lines: Hek293, primary monocytes, monocyte-derived macrophages and immortalized B-cells. Conclusion. Four B-cell lines were generated representing four different AATD phenotypes. It was described, for the first time, that these cells are also capable of expressing AAT. CRISPR/Cas9 system and designed sgRNA were able to edit following the non-homologous end-joining pathway the Pi*Z mutation of SERPINA1 gene in all tested cell lines: Hek293, primary monocytes, monocyte-derived macrophages and immortalized B-cells.
Details
- Language :
- Spanish; Castilian
- Database :
- OpenAIRE
- Journal :
- RODERIC. Repositorio Institucional de la Universitat de Valéncia, instname
- Accession number :
- edsair.dedup.wf.001..aa9811e29fb2705e64134c780fc5b970