Studies on the in vitro - in vivo evaluation of different ocular nano-carrier systems containing antibiotics

Bakteriyal keratit, çok sık karşılaşılan bir kornea hastalığıdır. Özellikle dirençli bakteriler ile tekrarlayan durumlarda, tedavi edilmediği takdirde genellikle körlüğe yol açmaktadır. Ofloksasin bakteriyal keratit tedavisinde uzun zamandan beri kullanılan florokinolon türü bir antibiyotiktir. Ofloksasin'in oftalmik kullanıma özel çözelti şeklinde farmasötik formları mevcuttur. Ne yazık ki günümüze kadar bakteriyal keratit tedavisinde antibakteriyal amaçla uygulanan ilaçlar göz yüzeyinde çok kısa süre kalarak gözyaşı ile enflamasyon bölgesinden akarak uzaklaşmaktadır. Oküler uygulanan ilaçlarda karşılaşılan en temel sorun, kornea bariyerinin geçilememesi ve göz yüzeyinde kalış süresinin çok az olmasıdır. Bu nedenlerle göz yüzeyinde oluşan enfeksiyonların tedavisinde istenen düzeyde başarı elde edilememektedir.Bu çalışmada tüm bu sorunların üstesinden gelmek amacıyla mikroemülsiyon formülasyonu ve yüksek devirli homojenizasyon ve mikroemülsiyon yöntemi ile nano yapılı lipit taşıyıcı formülasyonları hazırlanmıştır. Bu formülasyonlarda yağ olarak oleik asit, katı lipit olarak CHD 5, YEM olarak Tw 80 kullanılmıştır. OFX % 0.3 oranında ilave edilmiştir. Formülasyonların zeta potansiyellerinin arttırılması amacıyla formülasyonlara suda çözünen bir polimer olan kitozan oligosakkarit laktat ilave edilmiştir. Tüm kolloidal formülasyonlar pH, elektriksel iletkenlik, viskozite, TEM görüntüleri, yükleme etkinliği, içerik miktarı, partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli ve salım profilleri açısından değerlendirilmiştir. Göz yüzeyinde kalma açısından önemli bir parametre olan zeta potansiyel değeri en yüksek olan formülasyon NH34 bulunmuştur. Tüm karakterizasyon sonuçları açısından formülasyonların tamamının göze uygulanılabilecek özellikte olduğu tespit edilmiştir. Kararlılık çalışmaları sonucunda 4 oC ve 25 oC'de tüm kolloidal formülasyonların vizkozite, partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli, pH değeri, OFX miktarı ve fiziksel görünüş açısından 12 ay boyunca kararlı oldukları görülmüştür.Yüksek devirli homojenizatör yöntemi ile elde edilen NH34 formülasyonundan hareketle insert formülasyonu çözücü uçurma yöntemi ile elde edilmiştir. İnsert formülasyonlarının geliştirilmesinde bazı formülasyonlara kitozan yerine polimer olarak yine suda çözünen % 0.75 oranında aljinat kullanılmıştır. İnsert formülasyonlarının kalınlık, çap, ağırlık, kırılabilirlik, etkin madde miktarı tespiti, nem absorplama, nem miktarı, yüzey görüntüleri, DSC analizi ve biyoadezyon gibi özellikleri araştırılmıştır. Salım özellikleri incelendiğinde polimer olarak aljinat içeren insertler 8 saatte %100 salımını tamamlamıştır, kitozan içeren insertler ise 36 saatte salımı % 95 civarında yaptığı görülmüştür. Biyoadezyon özellikleri incelendiğinde F3 formülasyonun en yüksek eğri altı alanına sahip olduğu görülmüştür. F3 insertinin özelliklerinin 1 ay boyunca saklanılan ortamlarda kararlı olduğu tespit edilmiştir.Difüzyon hücreleri kullanarak yapılan difüzyon çalışmalarında diyaliz memran kullanıldığında reseptör faza geçiş olduğu tespit edilmiştir. Membran yerine kornea dokusu kullanıldığında ise % 0.7 - 3.5 aralığında çok az bir difüzyon görülmüştür. Kitozan içeren insertlerde herhangi bir difüzyona rastlanmamıştır.Mikrobiyolojik çalışmalar kapsamında, elde edilen formülasyonların sterilizasyonu kontrol edilmiş ve göze uygulanma açısından steril oldukları tespit edilmiştir. OFX'in minunum etkin konsantrasyonu S. aureus ve E. coli'ye karşı araştırılmış ve sırasıyla 0,78 ve 0,39 µg/mL olarak tespit edilmiştir. Formülasyonların in vitro antibakteriyal etkinliklerini araştırmak amacıyla disk difüzyon testi yapılmıştır. Formülasyonlar karşılaştırıldığında kitozanın artibakteriyel aktiviteye katkısı olduğu anlaşılmış ve kitozan içeren formülasyonların içermeyenlere göre etkinliğinin daha fazla olduğu görülmüştür. Bununla birlikte insert formülasyonlarında ise aljinatın E. coli'ye etkili olduğu, S. aureus'a karşı etkisiz olduğu görülmüştür.Formülasyonların göz yüzeyinde kalma süreleri tavşanlarda kıyaslanarak yapılmıştır. NH34 formülasyonu göz yüzeyinde 1 saat kalarak, göz yüzeyinde en uzun süre kalmayı başarabilmiştir. Çözelti tipinde olan ticari preparat ise 10 dakikada göz yüzeyinden kaybolmuştur. Aljnat içeren insertler 3 saat kalmayı başarabilmiş, kitozan içeren insertler ise 24 saat süre boyunca alt göz kapağında kalabildiği tespit edilmiştir.Keratit oluşturulmuş tavşanlar 1 hafta boyunca tedavi edilmiş ve formülasyonların etkinlikleri kıyaslamıştır. Tüm formülasyonların tedavide etkili olduğu gözlenmiştir. Aköz hümörden miktar tayini yapılmış ve aköz hümöre geçen konsantrasyonların minumum etkin konsatrasyondan daha yüksek olduğu tespit edilmiştir.Sonuç olarak, OFX'in daha etkin bir keratit tedavisi sağlaması amacıyla topikal mikroemülsiyon, nanoyapılı lipid taşıyıcılar ve insert formulasyonları başarı ile hazırlanmış ve istenilen oftalmik özelliklerin sağlandığı görülmüştür. Uzun süre gözde kalabilen insert formülasyonları ile hasta uyuncunun artması sağlanabilir ve uygulama sıklığı azaltılabilir. Bacterial keratitis is an often encountered ocular disease. Especially with resistance bacterials in repetitious conditions and if has not been treated this disease may lead to blindness. Ofloxacin is a type of fluoroquinolone antibiotic, that has been used for treatment of bacterial keratitis for a long time. Ofloxacins pharmaceutical forms for ophthalmic usage are available as solutions. Unfortunately, until now antibacterial drugs used for a treatment of bacterial keratitis applied on surface of the eye are staying a very short time period and being moved away from inflammation region by tear flow. The main problem ocurred with the ocular applied drugs are corneal barriers and short residence time in the eye. For these reasons, treatment of infection which is formed on eye surface can not be succeeded in a required level.In this study microemulsion formulation and nanostructured lipid carriers using by high-speed homogenization and microemulsion methods were prepared overcome all these problems. In these formulations, oleic acid was used as oil, CHD 5 was used as solid lipid, Tw 80 was used as surface active material. Ofloxacin was added at the amount of 0.3 %. Chitosan oligosaccharide lactate, a water-soluble polymer, was added into formulations in order to increase the zeta potential of the formulations. pH, electrical conductivity, viscosity, TEM images, entrapment efficiency, drug content, particle size, zeta potential and release profiles of all colloidal formulations were evaluated.The zeta potential, which is an important parameter of formulation from the point of residence time on the surface of the eye, was found the highest value in NH34. The results of characterization studies of all formulations were found to have applicable properties to eye. At the end of the stability studies, all colloidal formulations of viscosity, particle size, zeta potential, pH value, the amount of OFX and physical appearance was observed to be stable at 4 oC and 25 oC for 12 months.Insert formulation was developed by the solvent evaporation method via NH34 formulation obtained by high-speed homogenizer method. In some insert formulations in the development of formulations were done by replacement of chitosan with 0.75% water-soluble alginate as polymer. The characteristics of the insert formulations such as thickness, diameter, weight, brittleness, determination of the amount of active ingredient, moisture absorption, moisture content, surface images, DSC analysis and bioadhesion were investigated. Release properties of the inserts containing alginate as polymer completed the release of 100% in 8 hours, the release from inserts containing chitosan was completed approximately 95% in 36 hours. The highest area under the curve was obtained with F3 formulation when bioadhesion properties were examined. The properties of F3 insert was found to be stable for 1 month at stored conditions.At diffusion studies where diffusion cells were used with dialysis membrane, drug permeation to the receptor phase has been found. A little amount of drug diffusion such as 0.7 - 3.5 % of drug was seen when the corneal tissue was used instead of dialysis membrane. Diffusion was not found at inserts which contain chitosan.Under microbiological studies, the sterility of the obtained formulations was checked and were found to be sterile for application to eye. Minimum effective concentrations of OFXagainst S. aureus and E. coli were investigated and were found as 0.78 and 0.39 mg / mL, respectively. Disc diffusion test was performed in order to investigate the in vitro antibacterial activity of the formulations. When the formulations were compared, it was understood that there has been a chitosan contribution to the antibacterial property and the formulations containing chitosan had higher efficacy than the formulations do not contain chitosan. In addition, the alginate insert formulation was found to be also effective against E. coli, however ineffective to S. aureus.The residance time of the formulations on the eye were compared at rabbits. NH34 formulation achieved to stay 1 hour at the surface of the eye, so able to stay the longest time at the eye surface. Commercial formulation which is type of solution was found to dissappear from the eye surface at 10 minute. Inserts containing alginate achieved to stay in 3 hours, inserts containing chitosan have been identified to stay in the cul de sac during a 24-hour period.Keratitis induced rabbits were treated for 1 week and the activities of the formulations were compared. All of the formulations are observed to be effective in the treatment. The quantification of aqueous humor was made and aqueous humor concentrations were found to be higher than the minimum effective concentrations.As a result, to have an effective keratitis therapy with OFX topical microemulsions, nano-structured lipid carrier and insert the formulations were designed successfully and fullfilled the desired ophthalmic characteristics. The patient compliance could be increased by the long time residence of the inserts and the application time could be lessened. 420